Summary
Målet med detta protokoll är att demonstrera beredning, kultur, behandling och immunostaining av neonatala murina cochleära explanter. Tekniken kan användas som ett in vitro- screeningsverktyg vid hörselforskning.
Abstract
Även om det har förekommit märkliga framsteg när det gäller att höra forskning under de senaste decennierna, finns det fortfarande ingen bot för Sensorineural Hearing Loss (SNHL), ett tillstånd som vanligtvis innebär skada på eller förlust av de ömma mekanosensoriska strukturerna i det inre örat. Sofistikerade in vitro- och ex vivo- analyser har uppstått under de senaste åren, vilket möjliggjorde screening av ett ökande antal potentiellt terapeutiska föreningar samtidigt som resurserna minimeras och påskyndas för att utveckla botemedel för SNHL. Även om homogena kulturer av vissa celltyper fortsätter att spela en viktig roll i nuvarande forskning, bygger många forskare nu på mer komplexa organotypa kulturer av murinöron, även kända som cochleära explanter. Behållandet av organiska cellulära strukturer inom inre örat underlättar in situ utvärdering av olika komponenter i den cochleära infrastrukturen, inklusive inre och yttre hårceller, spiral ganglion neuroner, neurItes och stödande celler. Här presenterar vi beredning, odling, behandling och immunostaining av neonatala murina cochleära explanter. Den försiktiga förberedelsen av dessa explants underlättar identifieringen av mekanismer som bidrar till SNHL och utgör ett värdefullt verktyg för hörselforskningsgruppen.
Introduction
Sensorinär hörselnedsättning (SNHL) återspeglar skador på inre örat eller stigande hörselvägen. Medan hörselnedsättning är det vanligaste sensoriska underskottet hos människor 1 , finns inte läkande terapier 2 . Även om cochleära eller auditiva hjärnstammarimplantat kan återställa en viss grad av hörsel för patienter med svårt till djupt SNHL, är hörseln som tillhandahålls av dessa enheter fortfarande väldigt annorlunda än "naturlig" hörsel, särskilt under försök att förstå tal i ljud eller att lyssna på musik.
Medan hårcellsdegenerering länge har ansetts vara den primära följden av traumatiska hörselhändelser ( t.ex. exponering för högt brus) finns det växande bevis på att synapserna som överför information från hårceller till hörselnerven är åtminstone lika utsatta för akustisk trauma 3 , 4 , 5 > , 6 . Eftersom de mänskliga audiometriska tröskelvärdena, den nuvarande guldstandarden för utvärdering av hörselfunktionen, inte förutsäger specifik cellulär skada i inre örat behövs mer raffinerade verktyg för att detektera cellulär degenerering så snart som möjligt och att initiera adekvat behandling 7 .
Lovande farmaceutiska behandlingar för hörselnedsättning testas ofta på homogena cellkulturer in vitro , men sådana system modellerar inte exakt den cochleära mikromiljön. Cochleära celler är kända för att utsöndra trofiska faktorer som påverkar andra celltyper inom cochlea 8 , 9 , en avgörande in vivo- process som går förlorad när organ i Corti 10 , 11 eller Spiral Ganglion Neurons (SGNs) 12 odlas isolerat eller när Molekylära markörer analyserasEf "> 13. In vivo- studier som kan vara nödvändiga för validering av in vitro- data för att skapa nya personliga behandlingar för hörselnedsättning i strävan efter" precisionsmedicin "kräver betydande resurser och tid. Detta är särskilt relevant när man överväger Hur mycket ansträngning krävs för att perfekta och utföra mellersta öra eller runda fönstermembraninjektioner med hörselprov och efterföljande dissektion av cochleära helmottagningar. Effektiv screening av lovande föreningar i organotypa ex vivo kulturer som kallas cochlear explants ger ett ekonomiskt och tillförlitligt alternativ 14 , 15 , 16 , 17 .
I denna artikel beskrivs ett protokoll för att generera, underhålla och utvärdera behandlade cochleära explanteringar. Specifika applikationer för denna modell betonas, inklusive dess användning vid screeningenAv potentiellt terapeutiska föreningar och den jämförande utvärderingen av virala vektorer för genterapi. En ex vivo explant-metod ger forskare möjlighet att visualisera effekterna av en given behandling på olika cellpopulationer in situ , underlätta identifieringen av celltypsspecifika mekanismer och efterföljande förfining av riktade terapeutiska medel.
Sammantaget ger denna teknik en modell för att studera cochlea ex vivo samtidigt som man behåller vitala samtal mellan de väldigt olika celltyperna som existerar i cochlea.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studieprotokollet godkändes av Institutionen för djurvård och användningskommitté (IACUC) i Massachusetts Eye and Ear. Experiment utfördes enligt World Medical Association.
1. Förbereda upplösningen
- Förbereda kirurgiska bordet
- Använd 70% etanol för att desinficera det kirurgiska bordet.
- Placera två nonsterile prep pads bredvid mikroskopet.
- Förbered instrumentbrickan, inklusive värmestabiliserade operationsaxlar, ett skalpellhandtag, en mikrokniv och tång (två vardera av # 4 & # 55). Placera instrumentbrickan och en 50 mm, klarväggad, glasbaserad petriskål på en icke-steril dyna.
- Skaffa en steril # 15 skalpellblad; En tätbar plastpåse eller behållare (för att kassera slaktkroppen i enlighet med institutionella riktlinjer) Is i en hink; Och kall, steril Hank Balanced Salt Solution (HBSS). Placera dessa objekt påAnnan icke-steril kudde.
- Överför HBSS till ett 50 ml plastlaboratoriumrör och sätt det på is.
- Förbereda kulturen
- Förbered allt material i en laminär flödeskåpa. För varje fyra exemplar lägger du fyra autoklaverade 10 mm runda glaslockslister i de fyra inläggen på 35 mm 4-brunns petriskålen.
- För varje 4 exemplar, blanda en total volym av 300 μL bestående av följande i ett mikrocentrifugrör: 10 | il vävnadsbindemedel, 285 | il NaHCOs och 5 | il NaOH.
- Placera 45 μL av den resulterande lösningen på varje lock och lämna den där i minst 20 minuter vid RT; Denna lösning kan lämnas på täckglaset i flera timmar men kan inte lämnas O / N.
- Placera en eller två 35 mm 4-brunns petriskål i en 10 cm petriskål för att skapa två hinder mot kontaminering.
- Beredda odlingsmedium innehållande 98% Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1% N-2 och 1% ampicillin (65 | il per brunn i ett (mikro) centrifugrör). Värm lösningen till 25 ° C före användning.
2. Murine Cochlear Explant Dissection
- Dekapitation av neonatalmusen
- Skaffa en 60 mm plast petriskål och spraya 70% etanol i locket så att ytan är våt.
- Häll kall HBSS från plastlaboratorröret i botten av 60 mm plast och 50 mm klarväggad, glasbaserad petriskål. Förvara plastlaboratoriet och båda petriskålarna på is för att hålla vävnaden kall när den inte dissekeras.
- Placera en P3 - P5-åldrad neonatalmus på is i ett cutofffinger i en latexhandske och vänta tills hypotermin inducerar förlust av medvetande (ca 1-3 min).
- Avsluta musen snabbt med saksax och släng av kroppen i den tätbara plastpåsen. Sätt det avbrutna neonate huvudet i70% etanol i locket på 60 mm plast petriskålen.
- Makroskopisk dissektion av det tidsmässiga benet
- Ta bort skalskinnets hud genom att göra ett ytligt snitt från framsidan till bakre änden (direkt ovanpå sagittal suturen) med skalpelsbladet.
- Skär båda yttre hörselkanalerna med skalpskivan och vika huden förbi för att exponera hela kraniet.
OBS! Även om inget dissektionsmikroskop normalt behövs för detta steg kan det användas för förbättrad visualisering. - Öppna kraniet längs sagittal suturen med # 15 skalpellbladet. Se till att klippa kranen genom att försiktigt flytta bladet upp och ner från främre till bakre sida för att undvika komprimering av cochleae.
OBS: Kranen bör inte förgasas vid denna ålder och bör lätt klippas. - Ta bort och kassera snuten genom att göra ett vertikalt snitt direkt bakom banorna med # 15 skalpellanblad.
OBS: Den bakre delen av skallen ska fortfarande innehålla hjärnan och cochleae. - Kassera förkärnan, hjärnbenen och hjärnstammen genom trubbig dissektion med # 4 tångar.
- Mikroskopisk extraktion av cochleae
- Justera mikroskopet (6.5X förstoringen) och ljuskällan genom att placera tång under omfånget och optimera belysningen och fokuseringen.
- Placera kranens två halvor i 60 mm plast petriskålen fylld med kall HBSS.
- Fullständigt exponera cochlea / e, identifierbar som att vara intill den omgivande stapediala artären (en tortuous artär i det tidiga benet) och separera ordet oralt från det temporära benet med hjälp av # 4 tångar.
- Överför cochlea in i 50 mm, klarväggig, glasbaserad petriskål och placera skålen under mikroskopet.
- Placera 60 mm plast petriskålen med den andra halvan av kranen på is. Ta bort cochlea från vestibulärsystemet och dissekera noga den cochlear otic kapseln (vanligen broskig vid denna ålder) med # 4 tångar. Använd # 55 pincett för alla ytterligare steg.
- Slutliga steg i vävnadsbehandling
- Fortsätt med bearbetningen av den inre öratvävnaden genom att försiktigt separera spiralbandet som är vidhäftande med Corti-organet från resten av cochlea och modiolusen med hjälp av mikrokniven eller två tångar.
- Skär in i det mörkare, genomskinliga området vid spalten mellan spiralbandet och hårcellsregionen och fortsätt till efterföljande avlägsnande av spiralbandet genom att greppa det vid den mest basala aspekten och försiktigt lindra det medan det rör sig apikalt.
- Placera provet för att få en longitudinell, sagittal vy av cochlea och skär cochlea i två till tre sektioner med hjälp av mikrokniven, klassificera dessa sektioner som apical, (middle) och bAsa varv. Ta bort vävnaden överlägsen och sämre än det faktiska lagret av hårceller och neuriter för att uppnå en cochlear explant bit som kan ligga horisontellt på petriskålen.
OBS: En lämplig storlek för stabil vidhäftning till odlingsskålen är ungefär hälften av en cochleär sväng. - Ta bort tectorialmembranet, ett mycket tunt genomskinligt skikt som är omedelbart överlägsen Corti-organet, genom att försiktigt peeling bort det med tångar.
- Ta bort Reissners membran, omedelbart överlägsen SGN: erna, genom att röra den med tång på båda sidor och peeling bort det.
OBS: Ta bort eventuella sidoplatsade skadade hårcellsområden genom att skära bort dem med mikrokniven.
- Fortsätt med bearbetningen av den inre öratvävnaden genom att försiktigt separera spiralbandet som är vidhäftande med Corti-organet från resten av cochlea och modiolusen med hjälp av mikrokniven eller två tångar.
3. Överföring av prov till kulturplattorna
- Ta bort 45 μL vävnadshäftande lösning från de fyra täckglasen. Tvätta varje skyddsplatta med 50 μL steril H2O . Aspirera vattnet.
- Plocka upp 1 ml pipetten. Våt pipettspetsen med ca 120 μL DMEM för att förhindra att provet klibbar på insidan av spetsen.
- Överför proverna individuellt med 1 ml pipetten. Pipettera högst 70 μL från den HBSS-fyllda, lilla, väggmurade, glasbundna petriskålen och placera provet tillsammans med vätskan på en av de 4 inläggen (tillagd med täckplåtar) i 4-brunns petriskålen .
- Kontrollera under mikroskopet (50X förstoring) att provet är i rätt riktning. Se till att området hårceller från vilka det tectoriella membranet avlägsnades vetter uppåt. Se till att det basilära membranet, tillsammans med den trimmade, basala delen av modiolus, vetter nedåt och klistrar på täckglaset.
- Om provet är orienterat upp och ner vid inspektion, sätt in den HBSS som återstår i pipettens spets i inlägget och lägg in stycket tills det är korrekt orienterat.
NEJTE: Detta förhindrar att hårceller flyter i odlingsmedium utan strukturellt stöd från täckglaset, vilket kan leda till degenerering.
- Om provet är orienterat upp och ner vid inspektion, sätt in den HBSS som återstår i pipettens spets i inlägget och lägg in stycket tills det är korrekt orienterat.
- Aspirera överskott av HBSS med hjälp av 1 ml pipetten. Vänta i 15 s.
- Pipettera 60 μl av det beredda varma odlingsmediet (98% DMEM, 1% N-2 och 1% ampicillin) direkt på provet. Var försiktig så att du inte rör provet med pipetten. Byt ut de inre och yttre petriskålarna och inkubera O / N vid 37 ° C.
- Lossa alla lagerlösningar på rätt ställen, kassera slaktkroppar och resterande avfall, avfetta det kirurgiska bordet enligt institutionella riktlinjer ( t.ex. med etanol eller hypoklorit), rengör och autoklavera instrumenten och kassera skarvarna i lämplig behållare .
4. Lägga till slutkulturmedia och ämnen av intresse
OBS: Cochlear Explants kommer att vara klara att användas 10-16 timmar senare.
- Förbered en blandning9% DMEM, 1% fetalt bovint serum (FBS), 1% N-2 och 1% ampicillin (65 μl per brunn i ett mikrocentrifugrör, värm lösningen till 25 ° C före användning).
- Lägg till andra ämnen av intresse för lösningarna för respektive behandlingsgrupp. Om fluorescerande ämnen tillsätts ( t.ex. grön fluorescerande protein (GFP) -expressande virus, i en nyligen publicerad publikation användes en koncentration av 10 10 GC adeno-associerade virus (AAV) i 48 h i 50 | il) 18 , skydda mot ljus.
- Överför de cochleära explant-innehållande petriskålarna från inkubatorn och placera dem under laminärflödeskåpan.
- Aspirera det gamla odlingsmediet (w / o FBS) med pipetten från inläggen.
- Tillsätt 60 μl per brunn av det beredda varmkulturmediet (behandlingsmedium) (97% DMEM, 1% FBS, 1% N-2, 1% ampicillin och de ämnen av intresse).
- Placera petriskålen i inkubatorn (37 ° C).
- Visa rEgulärt under mikroskopet för att identifiera tecken på kontaminering, cellmigrering eller avlägsnande av cochlear explant och utföra färgning efter högst 7 dagar.
5. Immunofluorescens - Dag 1
- Förbered blockeringslösning (94% fosfatbuffrad saltlösning (PBS), 5% normalt get- eller hästserum (NGS / NHS, beroende på sekundära antikroppar) och 1% icke-joniskt ytaktivt ämne (se tabell över material ) Antikroppslösning (98,6% PBS, 1% NHS och 0,4% icke-joniskt ytaktivt ämne med respektive antikroppar).
OBS: Antikroppar innefattar kanin-anti-Myo7A i en koncentration av 1: 400 + (myosin 7A, för inre och yttre hårceller) och mus anti-TuJ1 1: 200+ (p-tubulin, för SGNs) ELLER mus (IgGl) -CtBP2 1: 200+ (c-terminalt bindande protein, för presynaps), mus (IgG2a) anti-PSD95 1: 50+ (postsynaptisk densitet, för postsynaps) och kyckling anti-NF-H 1: 1000+ (neurofilament, För SGN och nervfibrer). "+" MeaNs "eller högre." - Aspirera odlingsmediet med användning av en pipett. Var försiktig så att du inte rör provet.
- Under laminarflödeshuven sköljer de cochleära explanterna två gånger med sterilt PBS, varvid proven placeras på en skakare i 5 minuter efter varje tvätt.
- Fixa vävnaden i 4% paraformaldehyd (PFA - CAUTION) i 20 minuter på skakan (under huven). Aspirera PFA.
- Applicera 60 μL PBS på cochlearexplanteringsmedlen och placera petriskålen på en skakare under 5 minuter. Aspirera PBS. Upprepa 3x.
- Placera cochlearexplanteringsmedlen i preparerad blockeringslösning (94% PBS, 5% NHS och 1% icke-joniskt ytaktivt ämne) i 30 min på skakapparat.
- Placera de cochleära eksplanteringsmedlen i en beredd lager antikroppslösning (98,6% PBS, 1% NHS och 0,4% icke-joniskt ytaktivt medel) med respektive primära antikroppar (virvel före användning) O / N på en räknare vid RT.
OBS! Vik petriskålen med fuktiga pappershanddukar i plastfolie (eller aluminiumfolie om den tillsatta lösningenJon innehåller fluorescerande material såsom GFP-uttryckande virus) för att hålla disken fuktig och förhindra förångning av antikroppslösningen O / N.
6. Immunofluorescens - Dag 2
- Förbered 4'-, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) fläcken (300 nM) och använd stockantikropplösningen för att erhålla de korrekta sekundära antikroppsblandningarna, komplementära till de primära antikropparna i steg 5.1. (T ex get-anti-kanin 488 1: 200+ och get-anti-mus 568 1: 200+ eller get-anti-mus (IgG1) 568 1: 1000+, get anti-mus (IgG2a) 488 1: 500+, Och get-kyckling 647 1: 200+ ELLER Phalloidin 568 1: 200+ (för inre och yttre hårceller)).
- Aspirera den primära antikroppslösningen.
- Applicera 60 μL PBS på cochlearexplanteringsmedlen och placera petriskålen på en skakare under 5 minuter. Aspirera PBS. Upprepa 3x.
- Placera de cochleära eksplanteringsmedlen i preparerad lagerantikropplösning (98,6% PBS, 1% NHS och 0,4% icke-joniskt ytaktivt medel) med resternaPektiva sekundära antikroppar (virvel före användning) i 1,5 h på en räknare och skydda mot ljus.
- Aspirera den sekundära antikroppslösningen och skölj de cochleära explantanterna med en DAPI-fläck (placera på en skakare i 1 minut och sedan aspirera).
- Applicera 60 μL PBS på cochlearexplanteringsmedlen och placera petriskålen på en skakare under 5 minuter. Aspirera PBS. Upprepa 3x.
- Använd tång för att ta bort täckglas med prov från 4-brunnsplattan, doppa dem till en mottagare fylld med destillerad H 2 O, och torka täckglasen genom att vertikalt föra dem i kontakt med pappershanddukar.
- Placera en droppe antifadmonteringsmedium på mikroskopglaset och vänd täckglasen för att fördjupa den nedåtvända vävnaden i mediet.
- Täta täckglaset genom att använda tydligt nagellack runt kanten (utan att krossa provet under glaset). Låt glidbanorna ligga platt i ett täckt område bort från ljuset i 15-20 minuter tills det är torrt och thPlacera dem i en låda eller undersök under konfokalmikroskopet.
OBS! Fluorescerande färgning bäst bevaras genom att förvara glidorna vid 4 eller -20 ° C.
7. Confocal Imaging
- Hämta en översikt och inzoade bilder för organ i Corti-regionen, inklusive neuriter och SGN.
OBS! Standardinställningar för bildbehandling: Format på 1.024 x 1.024 pixlar, hastighet på 400 Hz, rammedelvärde av 3, 20% övergripande laserintensitet och vanligtvis 20X och 63X-objektiv med oljedämpning (potentiellt kombinerad med 2X digital zoom). Kanalinställningarna för DAPI, Myo7A och TuJ1-färgprotokollet beskrivs ovan: 405 5% DAPI, "Smart Gain" 766.8V, "Smart Offset" 0,0% - 488 15% fluoresceinisotiocyanat (FITC), "Smart Gain" 622.2V , "Smart Offset" 0,0% - 561 13% tetrametylrhomadinisotiocyanat (TRITC), "Smart Gain" 562,4V, "Smart Offset" 0,0%. - Slå samman bilderna i en z-stack med hjälp avMjukvara för att få en z-axelprojektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Medan många protokoll är inriktade på organ av Corti-explanter, försöker denna teknik att bevara anatomin hos hela cochlear-svängen, inklusive SGN: erna. Detta ger forskare möjlighet att analysera effekterna av en given behandling på neuriter och somata av SGNs förutom Corti-organet. Att utföra en dissektion som bevarar en del av modiolus, som beskrivs här, är mer tekniskt utmanande än att explantera Corti ens organ. Neurit- och SGN-området är dock viktigt, eftersom signifikanta patologiska effekter observerades i denna region efter applicering av vestibulära schwannom-sekretioner ( Figur 1 ) och extracellulära vesiklar i två nyligen publicerade publikationer med användning av samma metod 19 , 20 . Sådana förändringar kunde inte ha uppenbarats genom att använda isolerat organ av Corti-explanter.
thE kvantifiering av skadade eller GFP-uttryckande celler för inre och yttre hårceller, stödjande celler och SGNs kan utföras manuellt eller med en automatiserad process, såsom den som är inbyggd i ImageJ-pluginet NeuronJ. Representativa områden för dessa räkningar kan fastställas efter att ha bekräftat deras korrelation med totala räkningar. 3D-rekonstruktioner är särskilt användbara för att utesluta överläggseffekter i z-axelprojektionerna av SGN. Fiberorganisation, antal SGN per given område och SGN soma-område kan utvärderas. Färgningen och räkningen av synapser, hårceller och neuriter är avbildad i figur 2 ; Samma protokoll kan också användas för cochlear hela fästen och har visat sig vara en pålitlig modell för dessa ändamål 17 , 21 , 22 . Andra forskare har etablerat eleganta alternativa metoder som också kan införlivas i experimentella paradigmer 23 </ Sup> , 24 .
Den maximala längden av odlingen begränsas vanligtvis av starten av cellulär migration och beror på koncentrationen av FBS i odlingsmediet. När andelen FBS reducerades från fem procent till tre procent eller en procent förlängdes tidsperioden för upprätthållande av en anatomiskt intakt kolkleär explant till ungefär en vecka ( Figur 3 ).
Figur 4 demonstrerar GFP-positiva cochleära explantceller efter transduktion med den syntetiska adenoassocierade virusvektorn Anc80 i 48 h 25 . Inre hårceller, yttre hårceller och bärande celler kan kvantifieras i denna vy, medan en 3D-rekonstruktion kan hjälpa till att kvantifiera GFP-positiva celler i SGN-området. Olika virala serotyper kan jämföras med avseende på deras transduktionseffektivitet i vissa ceLl typer med hjälp av den skisserade metoden 18 .
Figur 1: Representativ konfokalmikroskopi Bilder av kochleära Explants från de apikala och basala regionerna efter inkubation med sekretioner från stora Auricular Nerves eller Vestibular Schwannom i 48 timmar . ( A ) Översikt bild av en explant. Rektangeln markerar området i närbilder. Skalstång = 200 μm. ( B - E ) Inzoomade syn på hårceller och neuriter. Skala bar = 50 μm. Grön = Myosin 7A (Myo7A), fläckar hårceller; Röd = klass III beta-tubulin (Tuj1), fläckar neuronala strukturer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Konfokusmikroskopi Bild av den kolchära utforskande hårcellsregionen. ( A ) Inakta synapser kan bedömas genom märkning av presynaptiska (C-terminala bindande proteiner, röda) och postsynaptiska (postsynaptiska densitet-95, gröna) proteiner tillsammans med färgning av neuronala strukturer (neurofilament, blå). OHC, yttre hårceller; IHC, inre hårceller. Skala bar = 10 μm. ( B ) Fokusera på den inre hårcellsregionen med antalet inre hårceller (röda pilhuvud) och neuriter (blå pilhuvud). På grund av förgreningen av neuronstrukturerna är det viktigt att standardisera avståndet från de inre hårcellerna under räkning (markerad med den vita ramen, direkt kopplad till synapserna). Skala bar = 5 μm. ( C ) Närbild av separata synapser (2 pre- och postsynaptiska par märkta med vita pilhuvud). Skala bar = 1 & # 181; m. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa konfokala mikroskopi Bilder av apikala och basala cochleära Explants efter 7 d i kultur med antingen 3% eller 1% FBS. ( A och B ) Celler inkuberade i 3% FBS börjar migrera mellan 4 och 5 dagar (ljusgråa pilar för hårceller, röda pilar för neuriter), ( C och D ) Explants i 1% FBS behåller organisatorisk integritet fram till dag 7. Ljusgrå: Myosin 7A (Myo7A), fläckar alla hårceller; Röd: klass III beta-tubulin (Tuj1), fläckar neuronala strukturer. OHC, yttre hårceller; IHC, inre hårceller. Skalstång = 100 μm, applicerad på alla paneler.Iles / ftp_upload / 55704 / 55704fig3large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Konfokalmikroskopi Bild av en kolchär Explant efter exponering för den syntetiska Adeno-associerade Virusvektorn Anc80 i 48 timmar. Transducerade celler uttrycker GFP (grönt). Myosin 7A (Myo7A, blå) fläckar Yttre hårceller (OHC) och inre hårceller (IHC); Klass III beta-tubulin (Tuj1, röd) fläckar neuronala strukturer. Supp .: område av Sox2-positiva bärande celler; SGN, spiral ganglion neuroner. Skalstång: 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskare måste perfekta dissektionstekniken innan de utför experiment som involverar cochleära explanter. Hårceller är vanligtvis skadade under dissektioner som utförs tidigt i inlärningskurvan, och ett särskilt problematiskt ögonblick för deras integritet är avlägsnandet av det tectoriella membranet, vilket kräver stabila händer, lämpliga verktyg och erfarenhet. För att spara tid och resurser bör en visuell kontroll utföras under dissektionsmikroskopet och eventuellt skadade områden bör noteras. I stället för att använda dyra primära och sekundära antikroppar är billigare reagens som phalloidin lämpligare för preliminära experiment. Lite skadade explanter kan potentiellt fortfarande användas som kontroller i vissa experiment (analys av sektioner som inte har påverkats) eller för testning av nya antikroppskombinationer.
Överföring av proverna är också särskilt viktigt, eftersom man måste garantera att bitarnaÄr inte orienterade upp och ner ("flytande" hårceller utan vägledning av det belagda täckglaset ofta degenererat). Ett centralt läge på täckglaset underlättar alla ytterligare pipetteringssteg.
För negativa kontrollexperiment som involverar nya föreningar (som uppenbarligen måste vara lösliga i odlingsmediet) är det viktigt att tillämpa lämpligt vehikel på explanter och att inte fokusera exklusivt på obehandlade explanteringar. Till exempel, om ett kommersiellt läkemedel innefattar natriumcitrat utöver den aktiva beståndsdelen, bör natriumcitrat sättas till de negativa kontrollkochleära explanterna eftersom natriumcitrat i sig själv kan ha en effekt.
Begränsningar för användningen av cochleära explants innefattar det faktum att dessa organotypiska kulturer typiskt härrör från unga valpar som fortfarande genomgår postnatala utvecklingsförändringar och att det saknas en jonisk gradient över explantet, vilket är nödvändigt för normalHöra in vivo . Användningsområdet för protokollet är emellertid övertygande visat i en ny publikation angående AAVs 18 . Medan denna grupp av vektorer är begränsad till cirka 4,7 kb förpackningskapacitet, har den blivit en viktig resurs för behandlingen av flera humana syndrom 26 . Med hjälp av den cochleära explantmodellen visade ovannämnda publikation att Anc80-viruset överträffade de traditionella AAV-serotyperna vid transduktionen av en mängd olika kochleära celler, inklusive hårceller och SGN. Dessa in vitro- fynd bekräftades därefter genom att välja de mest lovande kandidaterna för injektion genom runda fönstret hos muspuppar in vivo . Ex vivo- modellen ger ett sätt att framgångsrikt rekapitulera cochleas anatomi, vilket minskar tiden och resurserna som behövs för att utföra in vivo- arbete 27 .
En annan fördel med ex vIvo-modellen är dess potential för tillämpning på studien av specifika cellulära mekanismer som bidrar till SNHL. Genom att applicera föreningar som finns i tumörmikromiljön ( t.ex. humana tumörsekretioner) till en explant, kan effekten av dessa föreningar på cochlea direkt visualiseras och effekten eller toxiciteten hos potentiella läkemedelsterapier utvärderas. Detta är viktigt eftersom den humana kochlean inte kan biopsieras och cellerna inuti den kan inte visualiseras in vivo . En nyligen publicerad undersökning undersökte exempelvis den ototoxiska potentialen hos proteiner utsöndrade från vestibulära schwannomer, vilka är intrakraniella tumörer som uppstår från de vestibulära nerverna och orsakar hörselnedsättning hos 95% av patienterna. Applicering av humana tumörsekretioner till cochleära explanter, jämfört med utsöndringar från kontrolla friska humana nerver, bekräftade de toxiska effekterna av dessa sekretioner på cochlea 19 . Samma experiment skulle vara svårt att replikera i en in vivoModell på grund av det immunogena svaret mot humana proteiner som skulle uppstå i en immunokompetent mus.
Sammanfattningsvis presenterar detta manuskript en teknik som möjliggör samtidig studie av kochleära hårceller, synapser, neuriter och neuroner i en ex vivo- modell. Denna modell kan bidra till att ge insikt i verkningsmekanismerna hos molekyler som är nya till cochlea 28 , inklusive faktorer i humana utsöndringar 19 , 20 , medan potentiellt accelererar screeningen av kandidat-terapeutiska föreningar 18 före deras testning in vivo .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institute of Deafness och andra kommunikationsstörningar som ger R01DC015824 (KMS) och T32DC00038 (stödja SD), försvarsministeriet W81XWH-15-1-0472 (KMS), Bertarelli Foundation (KMS), Nancy Sayles Day Foundation (KMS) och Lauer Tinnitus Research Center (KMS). Vi tackar Jessica E. Sagers, BA för insiktsfulla kommentarer på manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin, Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | |
| anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
| anti-Myo7A antibody, rabbit | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| anti-NF-H antibody, chicken | EMD Millipore | AB5539 | |
| anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) | Antibodies Inc. | 75-028 | |
| anti-TuJ1 antibody, mouse | BioLegend | 801202 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg | Corning | 354241 | |
| CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner rings | Greiner Bio-One | 627170 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Clear Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50 x 7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
| Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mm | Ted Pella Inc. | 260368 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Distilled water, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 Forceps (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer |
| goat anti-chicken-647 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
| goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
| goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
| goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| goat anti-rabbit-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
| H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Instrument Tray with Lid Stainless Steel | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
| Micro (dissecting) knife – angled 30° | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 | VWR | 16004-382 | |
| N-2 Supplement (100X), 5 mL | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| NaOH, sodium hydroxide solution, 1 L | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Normal Horse Serum (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
| Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
| Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Phalloidin, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Prep Pad, Non Sterile | Medline | 05136CS | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Scalpel Blades - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| TCS SP5 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton-X (non-ionic surfactant) | Integra | T756.30.30 | |
| VectaShield antifade mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6'' - 2 mm thick | Zipline | 0609132541599 |
References
- Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf (2000).
- Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062 (2014).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones. J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).
- Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice. PLoS One. 10 (5), (2015).
- Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear. Hear Res. , 83-93 (2016).
- Wang, H. C., et al. Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells. Cell. 163 (6), 1348-1359 (2015).
- Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, (2011).
- Dinh, C., et al. Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants. Otolaryngol Head Neck Surg. 148 (5), 834-840 (2013).
- Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti. Neurosci Lett. 501 (2), 67-71 (2011).
- Kao, S. Y., et al. Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss. Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).
- Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry. J Vis Exp. (58), e3432 (2011).
- Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation. J Vis Exp. (95), e52260 (2015).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), (2010).
- Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants. J Vis Exp. (93), e52101 (2014).
- Wang, Q., Green, S. H. Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro. J Neurosci. 31 (21), 7938-7949 (2011).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
- Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. , (2016).
- Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).
- Yuan, Y., et al. Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy. J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).
- Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).
- Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea. Neuroscience. , 50-62 (2016).
- Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
- Shu, Y., et al. Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes. Hum Gene Ther. , (2016).
- Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear. Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).
