Summary
Het doel van dit protocol is om de voorbereiding, de cultuur, de behandeling en het immunostaining van neonatale muizencochleaire explantanten aan te tonen. De techniek kan gebruikt worden als een in vitro screening tool bij het horen onderzoek.
Abstract
Hoewel er in de afgelopen decennia merkwaardige vooruitgang is geweest bij het horen van onderzoek, is er nog steeds geen remedie voor Sensorineural Hearing Loss (SNHL), een aandoening die typisch schade aan of verlies van de delicate mechanosensorische structuren van het binnenoor meebrengt. Geavanceerde in vitro en ex vivo assays zijn in de afgelopen jaren opgetreden, waardoor het mogelijk is om een steeds groter aantal potentiële therapeutische verbindingen te screenen, terwijl de middelen minder worden en de inspanningen om SNHL te ontwikkelen, worden versneld. Hoewel homogene culturen van bepaalde celtypes een belangrijke rol spelen in het huidige onderzoek, zijn veel wetenschappers nu gebaseerd op complexere organotypische culturen van muizen innerlijke oren, ook wel cochleaire explanteren genoemd. Het behoud van georganiseerde cellulaire structuren in het binnenoor vergemakkelijkt de in-situ evaluatie van verschillende componenten van de cochleaire infrastructuur, met inbegrip van binnen- en buitenhaarcellen, spirale ganglionneuronen, neurItes en ondersteunende cellen. Hier presenteren wij de voorbereiding, de cultuur, de behandeling en het immunostaining van neonatale muizencochleaire explantanten. De zorgvuldige voorbereiding van deze explanteren vergemakkelijkt de identificatie van mechanismen die bijdragen aan SNHL en vormen een waardevol hulpmiddel voor de gehooronderzoeksgemeenschap.
Introduction
Sensorineurale gehoorverlies (SNHL) weerspiegelt schade aan het binnenoor of oplopende auditieve weg. Terwijl gehoorverlies het meest voorkomende sensorische tekort bij mensen 1 is , zijn er nog geen genezende therapieën 2 . Hoewel cochleaire of auditieve hersenstamimplantaten een zekere mate van gehoor kunnen herstellen voor patiënten met ernstige tot diepgaande SNHL, is de gehoor die door deze apparaten wordt geleverd nog steeds heel anders dan 'natuurlijk' gehoor, vooral tijdens pogingen om spraak in geluid te begrijpen of muziek te luisteren.
Hoewel de degeneratie van de haarcellen al lang is beschouwd als het belangrijkste gevolg van traumatische auditieve gebeurtenissen ( bijv. Blootstelling aan luid geluid), is er steeds meer bewijs dat de synaptes die informatie overdragen van haarcellen naar de auditieve zenuw ten minste zo kwetsbaar zijn voor akoestisch trauma 3 , 4 , 5 > , 6 . Aangezien menselijke audiometrische drempels, de huidige gouden standaard voor de evaluatie van de gehoorfunctie, geen specifieke cellulaire schade in het binnenoor voorspellen, zijn er meer verfijnde gereedschappen nodig om de degeneratie van de cel zo snel mogelijk te detecteren en adequate behandeling te starten 7 .
Veelbelovende farmaceutische behandelingen voor gehoorverlies worden vaak getest op homogene celculturen in vitro , maar dergelijke systemen passen de cochleaire micro-omgeving niet nauwkeurig aan. Cochleaire cellen zijn bekend om trofische factoren te scheiden die andere celtypen binnen de cochlea 8 , 9 beïnvloeden, een cruciaal in vivo proces dat verloren gaat wanneer het orgaan van Corti 10 , 11 of Spiral Ganglion Neurons (SGNs) 12 afzonderlijk wordt gekweekt of wanneer Moleculaire markers worden geanalyseerdEf "> 13. In vivo studies die nodig zijn voor de validatie van in vitro data om nieuwe, gepersonaliseerde behandelingen voor gehoorverlies in het nastreven van" precisie geneeskunde "te ontwikkelen, vereisen echter aanzienlijke middelen en tijd. Dit is vooral relevant bij het overwegen van Hoeveel inspanning nodig is om de middenoor- of ronde-venstermembraaninjecties te perfectioneren en uit te voeren met gehoorproeven en de daaropvolgende dissectie van cochleaire full-mounts. De efficiënte screening van veelbelovende verbindingen in organotypische ex vivo culturen, bekend als cochleaire explantanten, biedt een economisch en betrouwbaar alternatief 14 , 15 , 16 , 17 .
In dit artikel wordt een protocol beschreven waarmee u behandelde cochleairexplants kan genereren, onderhouden en evalueren. Specifieke toepassingen voor dit model worden benadrukt, inclusief het gebruik ervan bij het screenenVan potentieel therapeutische verbindingen en de vergelijkende evaluatie van virale vectoren voor gentherapie. Een ex vivo explantieve benadering laat onderzoekers toe om de effecten van een gegeven behandeling op verschillende celpopulaties in situ te visualiseren, waardoor de identificatie van celltypespecifieke mechanismen en de daaropvolgende verfijning van gerichte therapeutica wordt vergemakkelijkt.
Over het geheel genomen biedt deze techniek een model om de cochlea ex vivo te bestuderen, terwijl vitale kruisbesprekingen tussen de veel verschillende celsoorten die in de cochlea bestaan, behouden blijven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het studieprotocol werd goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Massachusetts Eye and Ear. Experimenten werden uitgevoerd volgens de Code of Ethics van de World Medical Association.
1. De Dissection voorbereiden
- Het voorbereiden van de chirurgische tafel
- Gebruik 70% ethanol om de chirurgische tafel te desinfecteren.
- Plaats twee nonsteriele prep pads naast de microscoop.
- Bereid de instrumentenlade voor, met inbegrip van warmte-gesteriliseerde bedieningsschaar, een scalpel handvat, een micromes en tang (twee elk van # 4 & # 55). Plaats de instrumentenlade en een 50 mm, opgeruimde, glasbodemde petrischaal op een niet-steriele paneel.
- Verkrijg een steriele # 15 scalpel blade; Een afdichtbare plastic zak of container (om de karkassen in overeenstemming te brengen met de institutionele richtlijnen); Ijs in een emmer; En koude, steriele Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Plaats deze items op deAnder nonsteriel pad.
- Breng de HBSS in een 50 ml plastic laboratoriumbuis en zet het op ijs.
- Voorbereiding van de cultuur
- Bereid alle materialen in een laminaire stroomkap. Voor elke vier monsters plaatst u vier geautoclaveerde 10 mm ronde glazen deksels in de vier inlays van de petroleumschotel met 35 mm 4-putjes.
- Voor elke 4 monsters meng een totaal volume van 300 μL bestaande uit het volgende in een microcentrifugebuis: 10 μl weefsellijm, 285 μL NaHC03 en 5 μL NaOH.
- Zet 45 μL van de resulterende oplossing op elke afdekkap en laat het gedurende minstens 20 minuten bij RT liggen; Deze oplossing kan enkele uren op de deklaag liggen, maar kan niet overblijven O / N.
- Plaats een of twee 35 mm 4-putjes petrienschotels in een 10 cm Petri-schotel om twee barrières tegen verontreiniging te creëren.
- Bereid kweekmedium dat 98% van Dulbecco's gemodificeerde adelaar bevat (98%)DMEM), 1% N-2 en 1% ampicilline (65 μl per putje in een (micro) centrifugebuis). Verwarm de oplossing tot 25 ° C voor gebruik.
2. Murine Cochlear Explant Dissection
- Ontsteking van de neonatale muis
- Verkrijg een 60 mm plastic petri schotel en spuit 70% ethanol in het deksel zodat het oppervlak nat is.
- Giet koude HBSS uit de plastic laboratoriumbuis in het onderste gedeelte van de 60 mm kunststof en de 50 mm schuine, glasbodemende petrischaal. Bewaar de plastic laboratoriumbuis en beide petrischalen op ijs om het weefsel koud te houden wanneer het niet wordt gescheiden.
- Plaats een P3-P5-verouderde neonatale muis op ijs in een snijvinger van een latexhandschoen en wacht tot de hypothermie een bewusteloosheid veroorzaakt (ongeveer 1-3 minuten).
- Ontdek de muis snel met een werkende schaar en verwijder het lichaam in de afdichtbare plastic zak. Zet het gescheurde neonate hoofd in de70% ethanol in het deksel van de 60 mm plastic petri schotel.
- Macroscopische dissectie van het temporale bot
- Verwijder de huid van de schedel door middel van een oppervlakkige snede van het voorste naar het achterste uiteinde (direct boven de sagittale hechting) met behulp van het schelpblad.
- Snijd beide externe auditieve kanalen met het scalpelblad en vouw de huid voorkant om het hele cranium bloot te leggen.
OPMERKING: Hoewel er geen dissectiemicroscoop voor deze stap nodig is, kan deze worden gebruikt voor verbeterde visualisatie. - Open het kranium langs de sagittale hechting met behulp van het # 15 scalpelblad. Zorg ervoor dat u het krans snijdt door het mes voorzichtig naar achteren omhoog en omlaag te verplaatsen om compressie van de cochleae te vermijden.
OPMERKING: Het cranium mag op deze leeftijd niet worden vergiftigd en zou gemakkelijk moeten snijden. - Verwijder en verwijder de snuit door een verticale snede rechtstreeks achter de banden te maken met behulp van de # 15 scalpelblad.
OPMERKING: Het achterste gedeelte van de schedel moet nog steeds de hersenen en cochleae bevatten. - Verwijder het voorhoofd, cerebellum en hersenstam door middel van stompe dissectie met # 4 tang.
- Microscopische extractie van de cochleae
- Pas de microscoop (6.5X vergroting) en lichtbron aan door middel van tangen onder het bereik en optimalisatie van de verlichting en focus.
- Plaats de twee helften van het kraan in de 60 mm plastic petri schaal, gevuld met koude HBSS.
- Stel de cochlea / e volledig bloot aan de nabijheid van de omliggende stapediale arterie (een kronkelende slagader binnen het temporale bot) en scheid het orgaan los van het temporale bot met behulp van # 4 tang.
- Breng de cochlea over in de 50 mm, schuine, glasbodemende petrischaal en plaats de schotel onder de microscoop.
- Plaats de 60 mm plastic petri schotel met de andere helft van het kranium op ijs. Verwijder de cochlea uit het vestibulaire systeem en dissel de cochleaire otic capsule (typisch kraakbeenachtig op deze leeftijd) zorgvuldig op met # 4 tang. Gebruik # 55 tang voor alle verdere stappen.
- Laatste stappen van weefselverwerking
- Ga door met de verwerking van het binnenoorweefsel door het spiraalvormige ligament aan te sluiten dat aan het orgaan van Corti is gekoppeld van de rest van de cochlea en de modiolus met behulp van het micromes of twee tang.
- Snijd in het donkerder doorzichtige gebied in de spleet tussen het spiraalvormige ligament en het haarcelgebied en ga door naar de daaropvolgende verwijdering van het spiraalvormige ligament door het op het meest basale aspect te grijpen en het voorzichtig af te wikkelen terwijl u apic beweegt.
- Plaats het monster om een longitudinale, sagittale weergave van de cochlea te krijgen en snijd de cochlea in twee tot drie secties met behulp van het micromes, waarbij deze secties worden ingedeeld als de apicale, middelste en bAsale bochten. Verwijder het weefsel superieur en inferieur aan de werkelijke laag van haarcellen en neurieten om een cochleair explant stuk te verkrijgen dat horizontaal op de petrischaal kan liggen.
OPMERKING: een passende grootte voor stabiele hechting aan de kweekschotel is ongeveer de helft van een cochleaire draai. - Verwijder het tectoriale membraan, een zeer dunne doorschijnende laag die onmiddellijk superieur is aan het orgaan van Corti, door het voorzichtig af te plakken met tang.
- Verwijder het membraan van Reissner, onmiddellijk superieur aan de SGN's, door het aan te pakken met pincet aan beide kanten en af te plakken.
OPMERKING: Verwijder eventuele zijdelingse beschadigde haarcellen, door ze met het micromes weg te snijden.
- Ga door met de verwerking van het binnenoorweefsel door het spiraalvormige ligament aan te sluiten dat aan het orgaan van Corti is gekoppeld van de rest van de cochlea en de modiolus met behulp van het micromes of twee tang.
3. Overdracht van specimens naar de cultuurplaten
- Verwijder de 45 μL weefselkleefstofoplossing van de vier deklagen. Was elke deklaag met 50 μL steriele H 2 O. Was het water aan.
- Pak de 1 ml pipet op. Vet de pipettip met ongeveer 120 μL DMEM om te voorkomen dat het monster aan de binnenkant van de punt hecht.
- Breng de monsters afzonderlijk over met de 1 ml pipet. Pipet maximaal 70 μL van de HBSS-gevulde, kleine, weggebroken, glasbodemende petrischaaltje en plaats het monster samen met de vloeistof op een van de 4 inlays (bereid met deksels) in de 4-putjes petrischotel .
- Controleer onder de microscoop (50X vergroting) dat het exemplaar in de juiste richting staat. Zorg ervoor dat het gebied van haarcellen waaruit het tectoriale membraan is verwijderd, naar boven gericht is. Zorg ervoor dat het basilair membraan, samen met het getrimde, basale deel van de modiolus, naar beneden gericht wordt en vasthoudt aan de deklaag.
- Als het monster ondersteboven wordt georiënteerd, dient u de HBSS in te stellen die in de pipetstip in de inleg blijft, en verplaats het stuk totdat het correct is georiënteerd.
NEETE: Dit voorkomt dat haarcellen zweven in kweekmedium zonder structurele ondersteuning van de deklaag, wat kan leiden tot degeneratie.
- Als het monster ondersteboven wordt georiënteerd, dient u de HBSS in te stellen die in de pipetstip in de inleg blijft, en verplaats het stuk totdat het correct is georiënteerd.
- Aspireren overmaat HBSS met behulp van de 1 ml pipet. Wacht tot 15 s.
- Pipetteer 60 μl van het bereid warm kweekmedium (98% DMEM, 1% N-2 en 1% ampicilline) direct op het monster. Zorg ervoor dat u het monster niet met de pipet aanraakt. Vervang de binnen- en buitenste petri-schaaldeksels en incubeer O / N bij 37 ° C.
- Zet alle voorraadoplossingen terug op hun goede plaatsen, verwijder karkassen en restafval, ontleed de chirurgische tafel volgens de institutionele richtlijnen ( bv. Met ethanol of hypochloriet), reinig de instrumenten en autoklaaf de scharen in de juiste container .
4. Het toevoegen van definitieve cultuurmedia en belangstellende stoffen
OPMERKING: Cochleaire explantaten zijn klaar voor gebruik 10-16 uur later.
- Bereid een mengsel voor1% N-2 en 1% ampicilline (65 μL per putje in een microcentrifuge-buis, 97% DMEM, 1% foetaal runderserum, 1% N-2, en verwarm de oplossing tot 25 ° C voor gebruik).
- Voeg andere stoffen toe die interessant zijn voor de oplossingen voor de respectieve behandelingsgroepen. Als fluorescerende stoffen worden toegevoegd ( bijv. Groene fluorescerende eiwitten (GFP) -uitdrukkende virussen. In een recente publicatie werd een concentratie van 10 10 GC Adeno-Geassocieerde Virussen (AAV's) gedurende 48 uur in 50 μl gebruikt) 18 , beschermen tegen licht.
- Breng de cochleaire explanthoudende petrischalen uit de incubator over en plaats ze onder de laminarstromkap.
- Aspireer het oude kweekmedium (w / o FBS) met de pipet uit de inlays.
- Voeg 60 μl per putje toe van het bereid warmtecultuur (behandelingsmedium) (97% DMEM, 1% FBS, 1% N-2, 1% ampicilline en de stoffen van belang).
- Plaats de petrischaal terug in de incubator (37 ° C).
- Bekijk rEgulair onder de microscoop om tekenen van verontreiniging, cellulaire migratie of loslating van de cochleaire explant te identificeren en kleur na maximaal 7 dagen uit te voeren.
5. Immunofluorescentie - Dag 1
- Bereid blokkerende oplossing (94% fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS), 5% normaal geiten- of paardserum (NGS / NHS, afhankelijk van de secundaire antilichamen) en 1% niet-ionogene oppervlakteactieve stof (zie de Tabel van Materialen ) Antilichaamoplossing (98,6% PBS, 1% NHS en 0,4% niet-ionische oppervlakteactieve stof met de respectieve antilichamen).
OPMERKING: Antilichamen omvatten konijn anti-Myo7A in een concentratie van 1: 400+ (myosine 7A, voor binnen- en buitenhaarcellen) en anti-TuJ1 1: 200+ (p-tubulin, voor SGN's) of muis anti-TuJ1 -CtBP2 1: 200+ (post-epileptische dichtheid voor postsynaps) en kip anti-NF-H 1: 1000+ (neurofilament, Voor SGN's en zenuwvezels). "+" MeaNs "of hoger." - Aspireer het kweekmedium met behulp van een pipet. Zorg ervoor dat u het monster niet aanraakt.
- Spoel de cochleairexplanten tweemaal met steriele PBS onder de laminaire stromende kap, waarbij de exemplaren 5 minuten na elke was op een shaker worden geplaatst.
- Fix het weefsel in 4% paraformaldehyde (PFA - CAUTION) gedurende 20 minuten op de shaker (onder de kap). Aspireer de PFA.
- Breng 60 μL PBS aan op de cochleaire explantanten en plaats de petrischaaltje gedurende 5 minuten op een shaker. Aspireer de PBS. Herhaal 3x.
- Plaats de cochleairexplants in de voorbereide blokkeringsoplossing (94% PBS, 5% NHS en 1% niet-ionogene oppervlakteactieve stof) gedurende 30 minuten op een shaker.
- Plaats de cochleairexplants in een voorbereide voorraad antilichaamoplossing (98,6% PBS, 1% NHS en 0,4% niet-ionogene oppervlakteactieve stof) met de respectieve primaire antilichamen (vortex voor gebruik) O / N op een teller bij RT.
OPMERKING: Pak de petrischalen met vochtige papieren handdoeken in plastic wrap (of aluminiumfolie als de toegevoegde oplossingIonen bevat fluorescerende materialen zoals GFP-expressieve virussen) om de afwasmiddelen vochtig te houden en om verdamping van de antilichaamoplossing O / N te voorkomen.
6. Immunofluorescentie - Dag 2
- Bereid de 4 ', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) vlek (300 nM) op en gebruik de voorraad antilichaamoplossing om de juiste secundaire antilichaammengsels te verkrijgen, die complementair zijn met de primaire antilichamen in stap 5.1. ( Bijv . Geiten-anti-konijn 488 1: 200+ en geiten-anti-muis 568 1: 200+ OF geiten-anti-muis (IgG1) 568 1: 1000+, geit anti-muis (IgG2a) 488 1: 500+, En geitenkip 647 1: 200+ OF Phalloidin 568 1: 200+ (voor binnen- en buitenhaarcellen)).
- Aspireer de primaire antilichaamoplossing.
- Breng 60 μL PBS aan op de cochleaire explantanten en plaats de petrischaaltje gedurende 5 minuten op een shaker. Aspireer de PBS. Herhaal 3x.
- Plaats de cochleairexplants in een voorbereide voorraad antilichaamoplossing (98,6% PBS, 1% NHS en 0,4% niet-ionogene oppervlakteactieve stof) met de resPectieve secundaire antilichamen (vortex voor gebruik) gedurende 1,5 uur op een teller en tegen licht beschermen.
- Aspireer de secundaire antilichaamoplossing en spoel de cochleairexplanteren met een DAPI-vlek (plaats 1 shaker op 1 minuut en laat daarna aspireren).
- Breng 60 μL PBS aan op de cochleaire explantanten en plaats de petrischaaltje gedurende 5 minuten op een shaker. Aspireer de PBS. Herhaal 3x.
- Gebruik pincet om de dekglazen te verwijderen met specimens van de 4-putjesplaat, doe ze in een ontvanger gevuld met gedestilleerde H 2 O, en droog de dekglazen door verticaal in contact te brengen met papieren handdoeken.
- Plaats een druppel antifade montagemedium op de microscoopschuif en draai de deklipjes omlaag om het naar beneden gericht weefsel in het medium te onderdompelen.
- Verzegel de deklip met behulp van duidelijke nagellak om de rand om de rand te omringen (zonder het specimen onder het glas te verpletteren). Laat de glijbanen vlak in een overdekt gebied liggen, weg van het licht gedurende 15 - 20 minuten tot droog en thEn plaats ze in een doos of onder de confocale microscoop.
OPMERKING: Fluorescerende kleuring wordt het best bewaard door de glijbanen op 4 of -20 ° C op te slaan.
7. Confocal Imaging
- Verkrijg een overzicht en ingezoomde foto's voor het orgaan van Corti-regio, inclusief neurieten en SGN's.
OPMERKING: Standaardinstellingen voor het beeldvormingsproces: Formaat van 1.024 x 1.024 pixels, snelheid van 400 Hz, kadergemiddelde van 3, 20% totale laserintensiteit, en meestal 20X en 63X lens met olieonderdompeling (mogelijk gecombineerd met 2X digitale zoom). Channel instellingen voor het DAPI, Myo7A en TuJ1 kleuring protocol zijn hierboven beschreven: 405 5% DAPI, Smart Gain 766.8V, Smart Offset 0,0% - 488 15% Fluoresceïne Isothiocyanaat (FITC), Smart Gain 622.2V , "Smart Offset" 0,0% - 561 13% tetramethylrhomadine isothiocyanaat (TRITC), "Smart Gain" 562,4V, "Smart Offset" 0,0%. - Voeg de afbeeldingen samen in een z-stack met behulp van deSoftware om een z-as projectie te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Terwijl veel protocollen zich richten op organs van Corti-explanteren, probeert deze techniek de anatomie van de gehele cochleaire beurt te behouden, inclusief de SGN's. Dit geeft onderzoekers de mogelijkheid om, naast het orgaan van Corti, de effecten van een bepaalde behandeling op neurieten en somata van SGN's te analyseren. Het uitvoeren van een dissectie die een deel van de modiolus behoudt, zoals hier beschreven, is meer technisch uitdagend dan het expliceren van het orgaan van Corti alleen. Het neuriet- en SGN-gebied is echter belangrijk, omdat in deze regio significante pathologische effecten werden waargenomen na toepassing van vestibulaire schwannomafscheidingen ( Figuur 1 ) en extracellulaire blaasjes in twee recente publicaties onder dezelfde methodologie 19 , 20 . Dergelijke veranderingen zouden niet kunnen zijn geopenbaard door gebruik te maken van een geïsoleerd orgaan van Corti-explanteren.
thE kwantificering van beschadigde of GFP-expresserende cellen voor binnen- en buitenhaarcellen, ondersteunende cellen en SGN's kunnen worden uitgevoerd door handmatig tellen of met een geautomatiseerd proces, zoals die in de ImageJ-plugin NeuronJ is ingebouwd. Representatieve gebieden voor deze tellingen kunnen worden vastgesteld na bevestiging van hun correlatie met totale tellingen. 3D reconstructies zijn bijzonder nuttig om overlay-effecten uit te sluiten in de z-as projecties van SGN's. Fiber organisatie, aantal SGN's per gegeven gebied, en SGN soma gebied kunnen worden beoordeeld. De kleuring en het tellen van synapsen, haarcellen en neurieten is afgebeeld in figuur 2 ; Hetzelfde protocol kan ook worden gebruikt voor cochleaire gehele mounts en is aangetoond dat dit een betrouwbaar model is voor deze doeleinden 17 , 21 , 22 . Andere onderzoekers hebben elegante alternatieve methodes vastgesteld die ook in experimentele paradigma's kunnen worden opgenomen 23 </ Sup> , 24 .
De maximale lengte van de cultuur is gewoonlijk beperkt door het begin van de cellulaire migratie en hangt af van de concentratie van FBS in het kweekmedium. Wanneer het percentage FBS van vijf procent tot drie procent of een procent was verminderd, werd de periode voor het behoud van een anatomisch intacte cochleaire explantie verlengd tot ongeveer een week ( Figuur 3 ).
Figuur 4 toont GFP-positieve cochleaire explantieve cellen na transductie met de synthetische adeno-geassocieerde virusvector Anc80 gedurende 48 uur 25 . Inner haarcellen, buitenste haarcellen en ondersteunende cellen kunnen in deze weergave worden gekwantificeerd, terwijl een 3D reconstructie kan helpen bij het kwantificeren van GFP-positieve cellen in het SGN-gebied. Verschillende virale serotypes kunnen worden vergeleken in termen van hun transductie-efficiëntie in bepaalde ceLl typen met behulp van de geschetste methodologie 18 .
Figuur 1: Representatieve Confocal Microscopie Beelden van Cochleaire Explanten uit de Apische en Basale Regio's na Incubatie met Afscheidingen van Grote Auricale Nerven of Vestibulaire Schwannomen gedurende 48 uur . ( A ) Overzicht afbeelding van een explant. De rechthoek markeert het gebied in close-upbeelden. Schaalbalk = 200 μm. ( B - E ) Inzoomen van haarcellen en neurieten. Schaalbalk = 50 μm. Groen = Myosin 7A (Myo7A), vlekken haarcellen; Rood = klasse III beta-tubuline (Tuj1), vlekken neuronale structuren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Confocal Microscopy Afbeelding van het Cochlear Explant Hair Cell Region. ( A ) Intacte synapses kunnen worden beoordeeld door middel van het labelen van presynaptische (C-terminale bindende eiwitten, rood) en postsynaptische (postsynaptische dichtheid-95, groene) eiwitten, samen met de kleuring van neuronale structuren (neurofilament, blauw). OHC, buitenste haarcellen; IHC, innerlijke haarcellen. Schaalbalk = 10 μm. ( B ) Focus op het binnenste haarcelgebied met de telling van binnenste haarcellen (rode pijlpunten) en neurieten (blauwe pijlpunten). Door de verankering van de neuronale structuren is het belangrijk om de afstand van de binnenste haarcellen te standaardiseren tijdens het tellen (gemarkeerd met het witte kader, direct verbonden met de synaptes). Schaalbalk = 5 μm. ( C ) Close-up van afzonderlijke synaptes (2 pre- en postsynaptische paren gemarkeerd met witte pijlpunten). Schaalbalk = 1 & # 181; m. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve Confocal Microscopie Beelden van Apische en Basale Cochleaire Explantanten na 7 d in Cultuur met 3% of 1% FBS. ( A en B ) Cellen geïncubeerd in 3% FBS beginnen migreren tussen 4 en 5 dagen (lichtgrijze pijlen voor haarcellen, rode pijlen voor neurieten), ( C en D ) Explanten in 1% FBS behouden organisatorische integriteit tot dag 7. Lichtgrijs: Myosin 7A (Myo7A), vlekken alle haarcellen; Rood: klasse III beta-tubuline (Tuj1), vlekken neuronale structuren. OHC, buitenste haarcellen; IHC, innerlijke haarcellen. Schaalbalk = 100 μm, toegepast op alle panelen.Iles / ftp_upload / 55704 / 55704fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 4: Confocal Microscopy Afbeelding van een Cochleaire Explant na blootstelling aan de Synthetische Adeno-geassocieerde Virus Vector Anc80 gedurende 48 uur. Transduceerde cellen expresseren GFP (groen). Myosin 7A (Myo7A, blauw) vlekken Outer Hair Cells (OHC) en Inner Hair Cells (IHC); Klasse III beta-tubuline (Tuj1, rood) vlekken neuronale structuren. Supp .: gebied van Sox2-positieve ondersteunende cellen; SGN, spirale ganglion neuronen. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onderzoekers moeten de dissectietechniek perfect maken voordat ze experimenten uitvoeren met cochleaire explanteren. Haarcellen worden doorgaans beschadigd tijdens dissecties die vroeger in de leercurve worden uitgevoerd. Een bijzonder problematisch moment voor hun integriteit is het verwijderen van het tectoriale membraan, dat vaste handen, juiste gereedschappen en ervaring vereist. Om tijd en middelen te besparen, dient een visuele controle onder de dissectiemicroscoop te worden uitgevoerd en moet eventueel beschadigde gebieden worden genoteerd. In plaats van dure primaire en secundaire antilichamen te gebruiken, zijn goedkopere reagentia zoals phalloidin beter geschikt voor voorlopige experimenten. Licht beschadigde explanteren kunnen potentieel nog steeds gebruikt worden als controles in bepaalde experimenten (analyse van secties die niet zijn getroffen) of voor het testen van nieuwe combinaties van antilichamen.
Overdracht van de specimens is ook bijzonder belangrijk, omdat men de stukken moet garanderenZijn niet georiënteerd ondersteboven ("drijvend" haarcellen zonder de begeleiding van de gecoate deklaag vaak gedegenereerd). Een centrale positie op de deklip vergemakkelijkt alle verdere pipetteringstappen.
Voor negatieve besturingsexperimenten waarbij nieuwe verbindingen betrokken zijn (dat duidelijk moet oplosbaar zijn in het kweekmedium), is het belangrijk om het juiste vehikel aan de explanteren toe te passen en niet uitsluitend te richten op onbehandelde explanteren. Bijvoorbeeld, als een commercieel geneesmiddel naast het actieve ingrediënt natriumcitraat bevat, moet natriumcitraat toegevoegd worden aan de negatieve controle cochleaire explantanten omdat natriumcitraat zelf een effect kan hebben.
Beperkingen op het gebruik van cochleaire explanteren omvatten het feit dat deze organotypische culturen typisch afkomstig zijn van jonge pups die nog steeds postnatale ontwikkelingsveranderingen ondergaan en dat er een gebrek aan ionische gradiënt over het explant is, dat essentieel is voor normaalIn vivo hoort. Het nut van het protocol wordt echter in een recente publicatie met betrekking tot AAV's 18 overtuigend getoond. Hoewel deze groep vectoren beperkt is tot ongeveer 4,7 kb verpakkingscapaciteit, is het een belangrijke bron geworden voor de therapie van verscheidene menselijke syndromen 26 . Met behulp van het cochleaire explantiemodel bleek de bovengenoemde publicatie dat het Anc80-virus de traditionele AAV-serotypes beter presteerde bij de transductie van een verscheidenheid aan cochleaire cellen, waaronder haarcellen en SGN's. Deze in vitro bevindingen werden vervolgens bevestigd door de meest veelbelovende kandidaten voor injectie door het ronde venster in muispups in vivo te kiezen . Het ex vivo model biedt een manier om de anatomie van de cochlea succesvol te herhalen, waardoor de tijd en middelen die nodig zijn voor het uitvoeren van in vivo werk 27 verminderen.
Een ander voordeel van de ex vIvo model is het potentieel voor toepassing op de studie van specifieke cellulaire mechanismen die bijdragen aan SNHL. Door het toepassen van verbindingen die in de tumor micro-omgeving gevonden worden ( bijv. Menselijke tumorafscheidingen) naar een explant, kan het effect van deze verbindingen op de cochlea direct worden geïllustreerd en wordt de werkzaamheid of toxiciteit van potentiële geneesmiddelentherapieën beoordeeld. Dit is belangrijk omdat de menselijke cochlea niet biopsie kan worden, en de cellen daarbinnen kunnen niet in vivo worden geïllustreerd. Zo heeft een recente publicatie het ototoxische potentieel van eiwitten afgescheiden van vestibulaire schwannomen onderzocht, die intracraniale tumoren zijn die voortvloeien uit de vestibulaire zenuwen en leiden tot gehoorverlies bij 95% van de patiënten. Toepassing van menselijke tumorafscheidingen op cochleaire explantaten, in vergelijking met afscheidingen van controle gezonde menselijke zenuwen, bevestigde de toxische effecten van deze afzettingen op de cochlea 19 . Hetzelfde experiment zou moeilijk kunnen zijn in een in vivo replicatieModel als gevolg van het immunogene respons tegen humane eiwitten die zouden ontstaan in een immunocompetente muis.
Samengevat presenteert dit manuscript een techniek die de gelijktijdige studie van cochleaire haarcellen, synaptes, neurieten en neuronen in een ex vivo- model mogelijk maakt. Dit model kan bijdragen tot inzicht in de werkingsmechanismen van moleculen die nieuw zijn aan de cochlea 28 , met inbegrip van factoren in menselijke afscheidingen 19 , 20 , terwijl potentiële versnelling van de screening van kandidaat therapeutische verbindingen 18 voorafgaand aan hun in vivo testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Nationale Instituut voor Doofheid en Andere Communicatie Stoornissen, subsidies R01DC015824 (KMS) en T32DC00038 (SD ondersteunend), het ministerie van Defensie-subsidie W81XWH-15-1-0472 (KMS), de Bertarelli Foundation (KMS) Nancy Sayles Day Foundation (KMS) en het Lauder Tinnitus Research Center (KMS). Wij danken Jessica E. Sagers, BA voor inzichtige opmerkingen over het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin, Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | |
| anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
| anti-Myo7A antibody, rabbit | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| anti-NF-H antibody, chicken | EMD Millipore | AB5539 | |
| anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) | Antibodies Inc. | 75-028 | |
| anti-TuJ1 antibody, mouse | BioLegend | 801202 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg | Corning | 354241 | |
| CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner rings | Greiner Bio-One | 627170 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Clear Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50 x 7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
| Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mm | Ted Pella Inc. | 260368 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Distilled water, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 Forceps (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer |
| goat anti-chicken-647 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
| goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
| goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
| goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| goat anti-rabbit-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
| H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Instrument Tray with Lid Stainless Steel | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
| Micro (dissecting) knife – angled 30° | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 | VWR | 16004-382 | |
| N-2 Supplement (100X), 5 mL | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| NaOH, sodium hydroxide solution, 1 L | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Normal Horse Serum (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
| Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
| Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Phalloidin, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Prep Pad, Non Sterile | Medline | 05136CS | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Scalpel Blades - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| TCS SP5 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton-X (non-ionic surfactant) | Integra | T756.30.30 | |
| VectaShield antifade mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6'' - 2 mm thick | Zipline | 0609132541599 |
References
- Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf (2000).
- Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062 (2014).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones. J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).
- Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice. PLoS One. 10 (5), (2015).
- Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear. Hear Res. , 83-93 (2016).
- Wang, H. C., et al. Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells. Cell. 163 (6), 1348-1359 (2015).
- Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, (2011).
- Dinh, C., et al. Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants. Otolaryngol Head Neck Surg. 148 (5), 834-840 (2013).
- Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti. Neurosci Lett. 501 (2), 67-71 (2011).
- Kao, S. Y., et al. Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss. Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).
- Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry. J Vis Exp. (58), e3432 (2011).
- Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation. J Vis Exp. (95), e52260 (2015).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), (2010).
- Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants. J Vis Exp. (93), e52101 (2014).
- Wang, Q., Green, S. H. Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro. J Neurosci. 31 (21), 7938-7949 (2011).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
- Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. , (2016).
- Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).
- Yuan, Y., et al. Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy. J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).
- Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).
- Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea. Neuroscience. , 50-62 (2016).
- Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
- Shu, Y., et al. Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes. Hum Gene Ther. , (2016).
- Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear. Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).
