Summary
El objetivo de este protocolo es demostrar la preparación, cultivo, tratamiento e inmunotinción de los explantes cocleares murinos neonatales. La técnica puede utilizarse como una herramienta de cribado in vitro en la investigación auditiva.
Abstract
Aunque ha habido notables avances en la investigación auditiva durante las últimas décadas, todavía no hay cura para la Pérdida de la Audición Sensorineural (SNHL), una condición que típicamente implica daño o pérdida de las delicadas estructuras mecanosensoriales del oído interno. Los ensayos sofisticados in vitro y ex vivo han surgido en los últimos años, permitiendo la selección de un número creciente de compuestos potencialmente terapéuticos, al tiempo que se minimizan los recursos y se aceleran los esfuerzos para desarrollar curas para SNHL. Aunque los cultivos homogéneos de ciertos tipos de células siguen desempeñando un papel importante en la investigación actual, muchos científicos ahora se basan en cultivos organotípicos más complejos de orejas internas murinas, también conocidas como explantes cocleares. La preservación de estructuras celulares organizadas dentro del oído interno facilita la evaluación in situ de diversos componentes de la infraestructura coclear, incluyendo las células ciliadas internas y externas, neuronas ganglionares espirales, neuronasItes y células de soporte. Aquí presentamos la preparación, cultivo, tratamiento e inmunotinción de los explantes cocleares murinos neonatales. La cuidadosa preparación de estos explantes facilita la identificación de mecanismos que contribuyen al SNHL y constituye una herramienta valiosa para la comunidad de investigadores de audición.
Introduction
La Pérdida Auditiva Sensorineural (SNHL) refleja daños en el oído interno o en la vía auditiva ascendente. Mientras que la pérdida auditiva es el déficit sensorial más común en los seres humanos 1 , las terapias curativas aún no existen 2 . Aunque los implantes cocleares o auditivos del tronco encefálico pueden restaurar un cierto grado de audición a los pacientes con SNHL severa a profunda, la audición proporcionada por estos dispositivos sigue siendo muy diferente de la audición "natural", especialmente durante los intentos de entender el habla o escuchar música.
Si bien la degeneración de las células ciliadas se ha considerado durante mucho tiempo como la consecuencia primaria de los eventos auditivos traumáticos ( por ejemplo, la exposición a ruidos fuertes), existe una creciente evidencia de que las sinapsis que transmiten información de las células capilares al nervio auditivo son al menos tan vulnerables al trauma acústico 3 , 4 , 5 > , 6 . Dado que los umbrales audiométricos humanos, el patrón oro actual para la evaluación de la función auditiva, no predicen daño celular específico en el oído interno, se necesitan herramientas más refinadas para detectar la degeneración celular lo antes posible e iniciar un tratamiento adecuado 7 .
Los tratamientos farmacológicos prometedores para la pérdida auditiva se prueban a menudo en cultivos celulares homogéneos in vitro , pero estos sistemas no modelan con precisión el microambiente coclear. Se sabe que las células cocleares segregan factores tróficos que influyen en otros tipos de células dentro de la cóclea 8 , 9 , un proceso crucial in vivo que se pierde cuando el órgano de Corti 10 , 11 o neuronas ganglionares espirales (SGN) 12 se cultivan en aislamiento o cuando Se analizan marcadores molecularesSin embargo, los estudios in vivo que pueden ser necesarios para la validación de datos in vitro para establecer nuevos tratamientos personalizados para la pérdida auditiva en la búsqueda de "medicina de precisión" requieren recursos y tiempo significativos, lo que es especialmente relevante cuando se considera Cuánto esfuerzo se requiere para perfeccionar y realizar las inyecciones de membrana de oído medio o de ventana redonda con pruebas auditivas y la subsiguiente disección de monturas cocleares enteras El cribado eficiente de compuestos prometedores en cultivos organotípicos ex vivo conocidos como explantes cocleares proporciona una alternativa económica y confiable 14 , 15 , 16 , 17 .
Este artículo detalla un protocolo para generar, mantener y evaluar explantes cocleares tratados. Se destacan las aplicaciones específicas para este modelo, incluyendo su uso en elDe compuestos potencialmente terapéuticos y la evaluación comparativa de vectores virales para la terapia génica. Un ex vivo explante enfoque permite a los investigadores para visualizar los efectos de un determinado tratamiento en diferentes poblaciones celulares in situ , lo que facilita la identificación de los tipos de células específicas de los mecanismos y el posterior perfeccionamiento de la terapéutica objetivo.
En general, esta técnica proporciona un modelo para estudiar la cóclea ex vivo, a la vez que preserva vital cruce entre los diferentes tipos de células que coexisten dentro de la cóclea.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Massachusetts Eye and Ear. Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial.
1. Preparación de la disección
- Preparación de la mesa quirúrgica
- Use etanol al 70% para desinfectar la mesa quirúrgica.
- Coloque dos almohadillas de preparación no estériles junto al microscopio.
- Prepare la bandeja del instrumento, incluyendo tijeras de operación esterilizadas por calor, una manija de bisturí, un cuchillo micro, y fórceps (dos de cada uno de # 4 y # 55). Coloque la bandeja del instrumento y una placa de petri de 50 mm de paredes claras con fondo de vidrio sobre una almohadilla no estéril.
- Obtenga una cuchilla de bisturí estéril # 15; Una bolsa o recipiente de plástico sellable (para disponer de las canales de acuerdo con las directrices institucionales); Hielo en un cubo; Y solución de sal equilibrada, fría y estéril Hank (HBSS). Coloque estos elementos en elOtra almohadilla no estéril.
- Transfiera el HBSS en un tubo de laboratorio plástico de 50 ml y colóquelo en hielo.
- Preparando el cultivo
- Prepare todos los materiales en una campana de flujo laminar. Por cada cuatro muestras, coloque cuatro tapas de vidrio redondo de 10 mm en autoclave en las cuatro incrustaciones de la placa de Petri de 4 pocillos de 35 mm.
- Para cada 4 muestras, mezcle un volumen total de 300 μL que conste de lo siguiente en un tubo de microcentrífuga: 10 μl de adhesivo tisular, 285 μL de NaHCO3 y 5 μL de NaOH.
- Colocar 45 μL de la solución resultante en cada cubreobjetos y dejarlo allí durante al menos 20 minutos a TA; Esta solución se puede dejar en el cubreobjeto durante varias horas, pero no se puede dejar O / N.
- Coloque una o dos placas Petri de 4 pocillos de 35 mm en una placa de Petri de 10 cm para crear dos barreras contra la contaminación.
- Preparar un medio de cultivo que contenga 98% de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), 1% de N - 2 y 1% de ampicilina (65 μL por pocillo en un tubo (micro) centrífugo). Calentar la solución a 25 ° C antes de su uso.
2. Dissección del explante coclear murino
- Decapitación del ratón neonatal
- Obtenga una placa de Petri de plástico de 60 mm y rocíe 70% de etanol en su tapa para que la superficie esté mojada.
- Vierta HBSS frío del tubo de laboratorio de plástico en la parte inferior del plástico de 60 mm y la placa de petri de fondo transparente de 50 mm de paredes claras. Guarde el tubo de laboratorio de plástico y las dos placas de Petri sobre hielo para mantener el tejido frío siempre que no se esté disectando.
- Coloque un ratón neonatal de edad P3 - P5 sobre hielo en un dedo de corte de un guante de látex y espere hasta que la hipotermia induzca pérdida de conciencia (aproximadamente 1-3 minutos).
- Decapitar el ratón rápidamente con las tijeras de funcionamiento y disponer del cuerpo en la bolsa de plástico sellable. Coloque la cabeza cortada del recién nacido70% de etanol en la tapa de la placa de petri plástica de 60 mm.
- Disección macroscópica del hueso temporal
- Retire la piel del cráneo haciendo un corte superficial desde el extremo anterior al posterior (directamente sobre la sutura sagital) usando la cuchilla del bisturí.
- Cortar ambos canales auditivos externos con la cuchilla del bisturí y doblar la piel anteriormente para exponer el cráneo entero.
NOTA: Aunque normalmente no se necesita un microscopio de disección para este paso, se puede utilizar para una mejor visualización. - Abra el cráneo a lo largo de la sutura sagital usando la cuchilla # 15 del escalpelo. Asegúrese de cortar el cráneo moviendo suavemente la hoja hacia arriba y hacia abajo desde la parte anterior a la posterior para evitar la compresión de las cócleas.
NOTA: El cráneo no debe ser osificado a esta edad y debe cortarse fácilmente. - Retire y deseche el hocico haciendo un corte vertical directamente posterior a las órbitas usando el escalpelo # 15espada.
NOTA: La parte posterior del cráneo debe todavía contener el cerebro y las cócleas. - Deseche el cerebro anterior, el cerebelo y el tronco encefálico mediante disección romo con pinzas # 4.
- Extracción microscópica de las cócleas
- Ajuste el microscopio (ampliación de 6,5X) y la fuente de luz colocando pinzas bajo el alcance y optimizando la iluminación y el enfoque.
- Coloque las dos mitades del cráneo en la placa de petri de plástico de 60 mm llena de HBSS frío.
- Exponga completamente la cóclea, identificable como adyacente a la arteria estapedial circundante (una arteria tortuosa dentro del hueso temporal), y separe sin rodeos el órgano del hueso temporal usando una pinza # 4.
- Transferir la cóclea en la placa de 50 mm, de paredes claras, de fondo de vidrio petri y la posición del plato bajo el microscopio.
- Coloque la placa de petri de 60 mm de plástico con la otra mitad del cráneo sobre hielo. Retire la cóclea del sistema vestibular y disecar cuidadosamente la cápsula otica coclear (típicamente cartilaginosa a esta edad) con una pinza # 4. Utilice fórceps # 55 para todos los pasos adicionales.
- Continuar con el procesamiento del tejido del oído interno separando cuidadosamente el ligamento espiral adherente al órgano de Corti del resto de la cóclea y el modiolo usando el micro cuchillo o dos fórceps.
- Corte en el área más oscura y translúcida en la grieta entre el ligamento espiral y la región de la célula del pelo y proceda a la subsiguiente eliminación del ligamento espiral agarrándolo en el aspecto más basal y desenrollándolo suavemente mientras se mueve apical.
- Coloque la muestra para obtener una vista longitudinal y sagital de la cóclea y corte la cóclea en dos o tres secciones utilizando el micro cuchillo, clasificando estas secciones como apical, (medio,) ybSe vuelve Quitar el tejido superior e inferior a la capa real de las células ciliadas y neurites con el fin de lograr una pieza de coclear explante que puede colocar horizontalmente en la placa de Petri.
NOTA: Un tamaño apropiado para la adhesión estable al plato de cultivo es aproximadamente la mitad de un giro coclear. - Retire la membrana tectorial, una capa translúcida muy delgada inmediatamente superior al órgano de Corti, suavemente pelándola con fórceps.
- Quitar la membrana de Reissner, inmediatamente superior a los SGN, por tocarla con fórceps en ambos lados y pelar lejos.
NOTA: Retire las áreas de las células del cabello dañadas lateralmente localizadas cortándolas con el micro cuchillo.
3. Transferencia de especímenes a las placas de cultivo
- Retire los 45 μl de solución de adhesivo tisular de los cuatro cubreobjetos. Lavar cada cubreobjetos con 50 μl de H 2 O estéril. Aspirar el agua.
- Recoja la pipeta de 1 ml. Humedezca la punta de la pipeta con aproximadamente 120 μL de DMEM para evitar que la muestra se adhiera al interior de la punta.
- Transferir los especímenes individualmente usando la pipeta de 1 ml. Pipetear un máximo de 70 μL de la placa petri pequeña, de paredes claras, de fondo de vidrio y coloque la muestra junto con el líquido en una de las 4 incrustaciones (preparadas con tapas) en la placa de petri de 4 pocillos .
- Compruebe bajo el microscopio (ampliación 50X) que la muestra está en la orientación correcta. Asegúrese de que el área de las células capilares a partir de la cual se retiró la membrana tectorial está orientada hacia arriba. Asegúrese de que la membrana basilar, junto con la parte basal recortada del modiolo, esté orientada hacia abajo y se adhiera al cubreobjetos.
- Si el espécimen está orientado al revés tras la inspección, deposite el HBSS que permanece en la punta de la pipeta en la incrustación y reposicione la pieza hasta que esté correctamente orientada.
NOTE: Esto evitará que las células capilares floten en el medio de cultivo sin el apoyo estructural de la cubreobjetos, lo que podría conducir a la degeneración.
- Si el espécimen está orientado al revés tras la inspección, deposite el HBSS que permanece en la punta de la pipeta en la incrustación y reposicione la pieza hasta que esté correctamente orientada.
- Aspirar el exceso de HBSS usando la pipeta de 1 ml. Espere 15 s.
- Pipetar 60 μL del medio de cultivo caliente preparado (98% de DMEM, 1% de N-2 y 1% de ampicilina) directamente sobre la muestra. Tenga cuidado de no tocar el espécimen con la pipeta. Reemplazar las cubiertas de la placa de petri interior y exterior e incubar O / N a 37 ° C.
- Coloque todas las soluciones madre en sus lugares apropiados, deseche las canales y los residuos residuales, descontaminar la tabla quirúrgica de acuerdo con las directrices institucionales ( por ejemplo, utilizando etanol o hipoclorito), limpiar y esterilizar en autoclave los instrumentos y descartar los objetos punzocortantes en el recipiente apropiado .
4. Adición de medios de cultivo finales y sustancias de interés
NOTA: Los explantes cocleares estarán listos para su uso 10-16 h después.
- Preparar una mezcla(97% de DMEM, 1% de suero bovino fetal (FBS), 1% de N-2 y 1% de ampicilina (65 μL por pocillo en un tubo de microcentrífuga, calentar la solución a 25 ° C antes de su uso).
- Añadir otras sustancias de interés para las soluciones para los grupos de tratamiento respectivos. Si se añaden sustancias fluorescentes ( por ejemplo, los virus que expresan la proteína fluorescente verde (GFP), en una publicación reciente, se utilizó una concentración de 10 10 GC de virus adeno-asociados (AAV) durante 48 h en 50 μl) 18 , ligero.
- Transferir las placas petri que contienen el explante coclear de la incubadora y colocarlas debajo de la campana de flujo laminar.
- Aspirar el medio de cultivo antiguo (sin FBS) con la pipeta de las incrustaciones.
- Añadir 60 μL por pocillo del medio de cultivo caliente (tratamiento) preparado (97% de DMEM, 1% de FBS, 1% de N-2, 1% de ampicilina y las sustancias de interés).
- Coloque la placa de Petri de nuevo en la incubadora (37 ° C).
- Vista rPor ejemplo, bajo el microscopio para identificar signos de contaminación, migración celular o desprendimiento del explante coclear y realizar tinción después de un máximo de 7 días.
5. Inmunofluorescencia - Día 1
- Preparar una solución de bloqueo (solución salina tamponada con fosfato al 94% (PBS), suero normal de cabra o caballo al 5% (NGS / NHS, dependiendo de los anticuerpos secundarios) y un 1% de tensioactivo no iónico (véase la tabla de materiales ) (98,6% de PBS, 1% de NHS y 0,4% de tensioactivo no iónico con los respectivos anticuerpos).
NOTA: Los anticuerpos incluyen anti-Myo7A de conejo a una concentración de 1: 400+ (miosina 7A, para células ciliadas interiores y exteriores) y ratón anti-TuJ1 1: 200+ (β-tubulina, para SGNs) OR ratón (IgG1) anti 1: 50+ (densidad postsináptica, para postsinapse), y pollo anti - NF - H 1: 1000+ (neurofilamento, proteína de unión c - terminal para presinapse) Para SGNs y fibras nerviosas). MeaNs "o superior." - Aspirar el medio de cultivo con una pipeta. Tenga cuidado de no tocar la muestra.
- Bajo la campana de flujo laminar, enjuague los explantes cocleares dos veces con PBS estéril, colocando los especímenes en un agitador durante 5 min después de cada lavado.
- Fijar el tejido en 4% de paraformaldehído (PFA - PRECAUCIÓN) durante 20 minutos en el agitador (debajo de la campana). Aspirar la PFA.
- Aplique 60 μL de PBS a los explantes cocleares y coloque la placa de Petri en un agitador durante 5 min. Aspirar el PBS. Repita 3x.
- Colocar los explantes cocleares en una solución de bloqueo preparada (94% de PBS, 5% de NHS y 1% de tensioactivo no iónico) durante 30 minutos en el agitador.
- Colocar los explantes cocleares en una solución de anticuerpo de reserva preparada (98,6% de PBS, 1% de NHS y 0,4% de tensioactivo no iónico) con los respectivos anticuerpos primarios (vórtice antes del uso) O / N en un contador a RT.
NOTA: Envuelva las placas de Petri con toallas de papel húmedas envueltas en una envoltura de plástico (o papel de aluminio si la solución agregadaIon contiene materiales fluorescentes tales como virus que expresan GFP) para mantener los platos húmedos y para evitar la evaporación de la solución de anticuerpos O / N.
6. Inmunofluorescencia - Día 2
- Preparar la tinción 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (300 nM) y utilizar la solución madre de anticuerpo para obtener las mezclas secundarias de anticuerpos correctas, complementarias de los anticuerpos primarios en la etapa 5.1. ( P. Ej ., Cabra anti-ratón 488 1: 200+ y cabra anti-ratón 568 1: 200+ O cabra anti-ratón (IgG1) 568 1: 1000+, cabra anti-ratón (IgG2a) 488 1: 500+, Y cabra anti-pollo 647 1: 200+ OR Phalloidin 568 1: 200+ (para las células ciliadas interiores y exteriores)).
- Aspirar la solución de anticuerpos primarios.
- Aplique 60 μL de PBS a los explantes cocleares y coloque la placa de Petri en un agitador durante 5 min. Aspirar el PBS. Repita 3x.
- Colocar los explantes cocleares en solución madre de anticuerpo preparada (98,6% de PBS, 1% de NHS y 0,4% de tensioactivo no iónico) con la res(Vórtice antes del uso) durante 1,5 h en un mostrador y protegerse de la luz.
- Aspirar la solución de anticuerpos secundarios y enjuagar los explantes cocleares con una tinción DAPI (colocar en un agitador durante 1 min y luego aspirar).
- Aplique 60 μL de PBS a los explantes cocleares y coloque la placa de Petri en un agitador durante 5 min. Aspirar el PBS. Repita 3x.
- Use una pinza para quitar cubreobjetos con muestras de la placa de 4 pocillos, sumerja en un recipiente lleno de H2O destilada y seque los cubreobjetos poniéndolos en contacto vertical con las toallas de papel.
- Coloque una gota de medio de montaje antifade en el portaobjetos del microscopio e invierta los cubreobjetos para sumergir el tejido hacia abajo en el medio.
- Selle el cubreobjetos utilizando un esmalte transparente que cubre circunferencialmente el borde (sin aplastar el espécimen debajo del cristal). Deje las diapositivas acostadas en un área cubierta lejos de la luz durante 15 - 20 min hasta que se sequEn lugar de ellos en una caja o examinar bajo el microscopio confocal.
NOTA: La tinción fluorescente se conserva mejor almacenando los portaobjetos a 4 o -20 ° C.
7. Imágenes confocales
- Obtenga una visión general y imágenes ampliadas para el órgano de la región de Corti, incluyendo neuritas y SGNs.
NOTA: Ajustes estándar para el proceso de imagen: Formato de 1.024 x 1.024 píxeles, velocidad de 400 Hz, promedio de fotogramas de 3, 20% de intensidad total del láser y, usualmente, lentes de 20X y 63X con inmersión en aceite (potencialmente combinado con zoom digital de 2X). Los ajustes de canal para el protocolo de tinción DAPI, Myo7A y TuJ1 se describen anteriormente: 405 5% DAPI, "Smart Gain" 766,8V, "Smart Offset" 0,0% - 488 15% isotiocianato de fluoresceína (FITC), "Smart Gain" 622.2V , "Smart Offset" 0,0% - 561 13% de isotiocianato de tetrametilrhomadina (TRITC), "Smart Gain" 562,4V, "Smart Offset" 0,0%. - Combina las imágenes en una pila z con laSoftware para obtener una proyección del eje z.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mientras muchos protocolos se centran en el órgano de los explantes de Corti, esta técnica intenta preservar la anatomía de todo el giro coclear, incluyendo los SGN. Esto da a los investigadores la oportunidad de analizar los efectos de un determinado tratamiento en neurites y somata de SGNs además del órgano de Corti. Realizar una disección que conserva parte del modiolo, como se describe aquí, es técnicamente más difícil que explantar el órgano de Corti solo. Sin embargo, la neurita y SGN área es importante, porque importantes efectos patológicos se observaron en esta región después de la aplicación vestibular schwannoma secreciones ( Figura 1 ] y vesículas extracelulares en dos publicaciones recientes utilizando la misma metodología [ 19 , 20] . Tales cambios no podrían haber sido revelados usando el órgano aislado de los explantes de Corti.
ThLa cuantificación de células dañadas o que expresan GFP para células ciliadas internas y externas, células de soporte y SGN se puede realizar por recuento manual o mediante un proceso automatizado, como el construido en el plugin ImageJ NeuronJ. Las áreas representativas para estos conteos se pueden establecer después de confirmar su correlación con los recuentos totales. Las reconstrucciones 3D son particularmente útiles para excluir los efectos de superposición en las proyecciones del eje z de los SGN. Se puede evaluar la organización de la fibra, el número de SGN por área dada y el área de SGN soma. La tinción y el recuento de sinapsis, células ciliadas y neuritas se representa en la Figura 2 ; El mismo protocolo también se puede utilizar para montajes cocleares enteros y se ha demostrado ser un modelo confiable para estos propósitos 17 , 21 , 22 . Otros investigadores han establecido métodos alternativos elegantes que también pueden ser incorporados en paradigmas experimentales 23 </ Sup> , 24 .
La longitud máxima de cultivo está normalmente limitada por el inicio de la migración celular y depende de la concentración de FBS en el medio de cultivo. Cuando la proporción de FBS se redujo de cinco por ciento a tres por ciento o un por ciento, el período de tiempo para mantener un explante coclear anatómicamente intacto se extendió a aproximadamente una semana ( Figura 3 ].
La Figura 4 muestra células de explante coclear positivas para GFP después de la transducción con el vector de virus adeno-asociado sintético Anc80 durante 48 h 25 . Las células ciliadas internas, las células ciliadas externas y las células de soporte pueden cuantificarse en esta vista, mientras que una reconstrucción 3D puede ayudar a cuantificar las células GFP positivas en el área SGN. Diferentes serotipos virales pueden compararse en términos de su eficiencia de transducción enLl tipos utilizando la metodología esbozada 18 .
Figura 1: Imágenes microscópicas confocales representativas de los explantes cocleares de las regiones apical y basal después de la incubación con secreciones de grandes nervios auriculares o de Schwannomas vestibulares durante 48 h . ( A ) Imagen general de un explante. El rectángulo marca el área en imágenes de primer plano. Barra de escala = 200 μm. ( B - E ) Vistas ampliadas de las células ciliadas y neuritas. Barra de escala = 50 μm. Verde = Miosina 7A (Myo7A), mancha las células ciliadas; Rojo = clase III beta-tubulina (Tuj1), manchas estructuras neuronales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imagen de Microscopía Confocal de la Región de la Célula Célula de Explicación Coclear. ( A ) Las sinapsis intactas pueden ser evaluadas marcando proteínas presinápticas (proteínas de unión C-terminal, rojo) y postsinápticas (densidad postsináptica-95, verde) junto con la tinción de estructuras neuronales (neurofilamento, azul). OHC, células de cabello exterior; IHC, células ciliadas internas. Barra de escala = 10 μm. ( B ) Enfoque en la región de la célula ciliada interna con el recuento de células ciliadas internas (puntas de flecha rojas) y neuritas (puntas de flecha azules). Debido a la ramificación de las estructuras neuronales, es importante estandarizar la distancia desde las células ciliadas internas durante el recuento (destacado con el marco blanco, directamente conectado a las sinapsis). Barra de escala = 5 μm. ( C ) Primer plano de sinapsis separadas (2 pares pre y postsinápticos marcados con puntas de flecha blancas). Barra de escala = 1 & # 181; m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes de microscopía confocal representativa de explantes cocleares apicales y basales después de 7 d en cultivo con FBS al 3% o 1%. ( A y B ) Las células incubadas en FBS al 3% comienzan a migrar entre 4 y 5 días (flechas de color gris claro para las células ciliadas, flechas rojas para las neuritas), ( C y D ) Explantes en FBS al 1% mantienen la integridad organizacional hasta el día 7. Gris claro: Miosina 7A (Myo7A), mancha todas las células ciliadas; Rojo: clase III beta-tubulina (Tuj1), manchas estructuras neuronales. OHC, células de cabello exterior; IHC, células ciliadas internas. Barra de escala = 100 μm, aplicada a todos los paneles.Iles / ftp_upload / 55704 / 55704fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imagen de microscopía confocal de un explante coclear después de la exposición al vector sintético Adeno-associated Virus Anc80 durante 48 h. Las células transducidas expresan GFP (verde). Miosina 7A (Myo7A, azul) tiñe las células del pelo exterior (OHC) y las células del pelo interno (IHC); Clase III beta-tubulina (Tuj1, rojo) tiñe las estructuras neuronales. Suplemento: área de células de apoyo Sox2-positivas; SGN, neuronas del ganglio espiral. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Los investigadores deben perfeccionar la técnica de disección antes de llevar a cabo experimentos relacionados con explantes cocleares. Las células ciliadas son comúnmente dañadas durante las disecciones realizadas en las primeras etapas de la curva de aprendizaje, y un momento particularmente problemático para su integridad es la eliminación de la membrana tectorial, que requiere manos estables, herramientas adecuadas y experiencia. Para ahorrar tiempo y recursos, se debe realizar un control visual bajo el microscopio de disección y se deben anotar áreas potencialmente dañadas. En lugar de utilizar anticuerpos primarios y secundarios costosos, los reactivos más baratos como la faloidina son más apropiados para los experimentos preliminares. Los explantes ligeramente dañados pueden potencialmente seguir siendo utilizados como controles en ciertos experimentos (análisis de secciones que no han sido afectadas) o para la prueba de nuevas combinaciones de anticuerpos.
La transferencia de los especímenes es también particularmente importante, porque se debe garantizar que las piezasNo están orientadas al revés ("flotando" las células ciliadas sin la guía del cubreobjetos revestidos a menudo degeneran). Una posición central en el cubreobjetos facilita todas las etapas de pipeteo adicionales.
Para los experimentos de control negativo que implican nuevos compuestos (que obviamente deben ser solubles en el medio de cultivo), es importante aplicar el vehículo apropiado a los explantes y no centrarse exclusivamente en explantes no tratados. Por ejemplo, si un fármaco comercial incluye citrato de sodio además del ingrediente activo, entonces se debe añadir citrato de sodio a los explantes cocleares de control negativo porque el citrato sódico podría tener un efecto.
Las limitaciones al uso de explantes cocleares incluyen el hecho de que estos cultivos organotípicos se derivan típicamente de cachorros jóvenes que todavía están sufriendo cambios de desarrollo posnatal y que hay una falta de un gradiente iónico a través del explante, que es esencial para la normalidadAudición in vivo . Sin embargo, la utilidad del protocolo se muestra convincentemente en una publicación reciente sobre AAV [ 18] . Si bien este grupo de vectores se limita a alrededor de 4,7 kb de capacidad de envasado, se ha convertido en un recurso importante para la terapia de varios síndromes humanos [ 26] . Usando el modelo de explante coclear, la publicación mencionada anteriormente demostró que el virus Anc80 superó a los serotipos tradicionales de AAV en la transducción de una variedad de células cocleares, incluyendo células capilares y SGNs. Estos hallazgos in vitro se confirmaron posteriormente eligiendo los candidatos más prometedores para la inyección a través de la ventana redonda en cachorros de ratón in vivo . El modelo ex vivo proporciona una forma de recapitular con éxito la anatomía de la cóclea, disminuyendo el tiempo y los recursos necesarios para realizar el trabajo in vivo 27 .
Otra ventaja de la ex vIvo es su potencial de aplicación al estudio de mecanismos celulares específicos que contribuyen al SNHL. Mediante la aplicación de compuestos encontrados en el microambiente tumoral ( por ejemplo, secreciones tumorales humanas) a un explante, el efecto de estos compuestos sobre la cóclea puede visualizarse directamente y se evalúa la eficacia o toxicidad de los tratamientos farmacológicos potenciales. Esto es importante porque la cóclea humana no puede ser biopsiada, y las células en su interior no pueden visualizarse in vivo . Por ejemplo, una publicación reciente examinó el potencial ototóxico de las proteínas secretadas de los schwannomas vestibulares, que son tumores intracraneales que surgen de los nervios vestibulares y causan pérdida auditiva en el 95% de los pacientes. La aplicación de secreciones tumorales humanas a los explantes cocleares, en comparación con las secreciones de control de los nervios humanos sanos, confirmó los efectos tóxicos de estas secreciones en la cóclea [ 19] . El mismo experimento sería difícil de replicar en un ensayo in vivoDebido a la respuesta inmunogénica contra proteínas humanas que surgirían en un ratón inmunocompetente.
En resumen, este manuscrito presenta una técnica que permite el estudio simultáneo de células ciliadas cocleares, sinapsis, neuritas y neuronas en un modelo ex vivo . Este modelo puede ayudar a proporcionar una visión de los mecanismos de acción de las moléculas nuevas en la cóclea 28 , incluidos los factores en las secreciones humanas 19 , 20 , mientras que potencialmente acelerar el cribado de candidatos compuestos terapéuticos 18 antes de su prueba in vivo .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Sordera y otros trastornos de la comunicación subvenciones R01DC015824 (KMS) y T32DC00038 (apoyo SD), el Departamento de Defensa W81XWH-15-1-0472 (KMS), la Fundación Bertarelli (KMS), el Nancy Sayles Day Foundation (KMS) y el Lauer Tinnitus Research Center (KMS). Damos las gracias a Jessica E. Sagers, BA por comentarios perspicaces sobre el manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin, Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | |
| anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
| anti-Myo7A antibody, rabbit | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| anti-NF-H antibody, chicken | EMD Millipore | AB5539 | |
| anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) | Antibodies Inc. | 75-028 | |
| anti-TuJ1 antibody, mouse | BioLegend | 801202 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg | Corning | 354241 | |
| CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner rings | Greiner Bio-One | 627170 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Clear Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50 x 7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
| Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mm | Ted Pella Inc. | 260368 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Distilled water, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 Forceps (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer |
| goat anti-chicken-647 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
| goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
| goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
| goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| goat anti-rabbit-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
| H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Instrument Tray with Lid Stainless Steel | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
| Micro (dissecting) knife – angled 30° | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 | VWR | 16004-382 | |
| N-2 Supplement (100X), 5 mL | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| NaOH, sodium hydroxide solution, 1 L | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Normal Horse Serum (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
| Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
| Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Phalloidin, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Prep Pad, Non Sterile | Medline | 05136CS | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Scalpel Blades - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| TCS SP5 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton-X (non-ionic surfactant) | Integra | T756.30.30 | |
| VectaShield antifade mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6'' - 2 mm thick | Zipline | 0609132541599 |
References
- Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf (2000).
- Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062 (2014).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones. J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).
- Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice. PLoS One. 10 (5), (2015).
- Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear. Hear Res. , 83-93 (2016).
- Wang, H. C., et al. Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells. Cell. 163 (6), 1348-1359 (2015).
- Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, (2011).
- Dinh, C., et al. Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants. Otolaryngol Head Neck Surg. 148 (5), 834-840 (2013).
- Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti. Neurosci Lett. 501 (2), 67-71 (2011).
- Kao, S. Y., et al. Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss. Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).
- Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry. J Vis Exp. (58), e3432 (2011).
- Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation. J Vis Exp. (95), e52260 (2015).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), (2010).
- Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants. J Vis Exp. (93), e52101 (2014).
- Wang, Q., Green, S. H. Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro. J Neurosci. 31 (21), 7938-7949 (2011).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
- Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. , (2016).
- Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).
- Yuan, Y., et al. Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy. J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).
- Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).
- Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea. Neuroscience. , 50-62 (2016).
- Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
- Shu, Y., et al. Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes. Hum Gene Ther. , (2016).
- Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear. Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).
