Summary
该方案的目的是证明新生儿鼠耳蜗外植体的制备，培养，治疗和免疫染色。该技术可用作听力研究中的体外筛选工具。
Abstract
虽然在过去几十年的听力研究方面取得了显着的进步，但仍然没有治疗感觉神经性听力损失（SNHL），这种情况通常涉及损伤或丧失内耳微妙的机械感觉结构。近年来出现了复杂的体外和离体测定，能够筛选越来越多的潜在治疗性化合物，同时最大限度地减少资源并加快努力开发SNHL的治疗。虽然某些细胞类型的同源文化在当前的研究中继续发挥重要作用，但许多科学家现在依赖于更复杂的鼠内耳的器官型培养物，也称为耳蜗外植体。内耳中有组织的细胞结构的保存促进耳蜗基础设施的各种成分的原位评估，包括内外毛细胞，螺旋神经节神经元，神经元ites和支持细胞。在这里，我们介绍新生儿鼠耳蜗外植体的制备，培养，治疗和免疫染色。仔细准备这些外植体有助于识别有助于SNHL的机制，并为听力研究界提供宝贵的工具。
Introduction
感觉神经性听力损失（SNHL）反映内耳损伤或上升听觉通路。听力损失是人类最常见的感觉缺陷1 ，疗效尚不存在2 。虽然耳蜗或听觉脑干植入物可以恢复对严重到深刻的SNHL的患者的某种程度的听力，但是由这些装置提供的听力仍然与“自然”听觉非常不同，特别是在理解噪音或听音乐的尝试期间。
虽然毛细胞变性长期以来被认为是创伤性听觉事件（ 例如暴露于大声）的主要后果，但越来越多的证据表明，将信息从毛细胞传播到听觉神经的突触至少与声学创伤一样容易3 ， 4，5 > ， 6 。由于人类听力阈值，目前用于评估听力功能的黄金标准，不预测内耳特异性细胞损伤，需要更精细的工具来尽快检测细胞变性并开始适当的治疗7 。
听力损失的有希望的药物治疗通常在体外在同质细胞培养物上测试，但是这样的系统不能准确地模拟人工耳蜗的微环境。已知耳蜗细胞分泌影响耳蜗内其他细胞类型的营养因子8,9 ，当Corti 10,11或螺旋神经节神经元（SGN） 12的器官被隔离培养或当时分析分子标记然而， 对 体外数据验证可能需要的体内研究可能需要大量的资源和时间，这在体外数据验证方面需要大量的资源和时间，这在考虑时尤为重要需要多少努力才能完成和进行听力测试的中耳或圆窗膜注射和随后的人工耳蜗解剖。有效筛选被称为耳蜗外植体的器官型离体培养物中有希望的化合物提供了经济和可靠的替代物14，15，16，17 。
本文详细介绍了一种用于产生，维护和评估治疗耳蜗外植体的方案。强调了该模型的具体应用，包括其在筛选中的应用的潜在治疗化合物和用于基因治疗的病毒载体的比较评估。 离体外植体方法允许研究人员将给定治疗对原位不同细胞群体的影响视觉化，促进细胞类型特异性机制的鉴定和随后的靶向治疗的改进。
总的来说，这种技术提供了一种离体研究耳蜗的模型，同时保持耳蜗内共存的巨大不同细胞类型之间的重要串扰。
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Protocol
研究方案由马萨诸塞州眼科和耳朵的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。根据世界医学协会道德守则进行实验。
1.准备解剖
- 准备手术台
- 使用70％乙醇消毒手术台。
- 在显微镜旁边放置两个无菌制剂垫。
- 准备仪器托盘，包括热灭菌的操作剪刀，手术刀手柄，微型刀和镊子（＃4＃＃两个）。将仪器托盘和一个50毫米，透明玻璃的玻璃培养皿放在一个非消毒垫上。
- 获得无菌＃15手术刀刀片;可密封的塑料袋或容器（根据制度准则处置屠体）;一桶冰和冷的，无菌的汉克平衡盐溶液（HBSS）。将这些物品放在其他无菌垫。
- 将HBSS转移到50 mL塑料实验室管中，并放在冰上。
- 准备文化
- 准备层流罩中的所有材料。对于每四个样品，将四个高压灭菌的10毫米圆形玻璃盖玻片放入35毫米4孔培养皿的四个镶嵌中。
- 对于每4个样品，将总量为300μL的微量混合物在微量离心管中混合：10μL组织粘合剂，285μLNaHCO 3和5μLNaOH。
- 将45μL所得溶液放在每个盖板上，并在室温下放置至少20分钟;该解决方案可以留在盖玻片上几个小时，但不能留下O / N。
- 将一个或两个35毫米4孔培养皿放在10厘米培养皿内，以产生两个防止污染的屏障。
- 制备含有98％Dulbecco's Modified Eagle's Medium的培养基（DMEM），1％N-2和1％氨苄青霉素（在微量离心管中每孔65μL）。使用前将溶液温热至25°C。
小鼠人工耳蜗解剖
- 斩首新生儿小鼠
- 获得一个60毫米塑料培养皿，并在其盖子上喷洒70％乙醇，使表面湿润。
- 将冷的HBSS从塑料实验室管倒入60毫米塑料的底部和50毫米透明的玻璃底培养皿中。将塑料实验室管和两个陪替氏培养皿存放在冰上，以便在不解剖时保持组织冷。
- 将P3-P5年龄的新生儿小鼠放在乳胶手套的切断手指上的冰上，并等到低温引起意识丧失（约1-3分钟）。
- 用操作剪刀快速拆卸鼠标，将身体处理在可密封的塑料袋中。将切断的新生儿头部放在70％乙醇在60毫米塑料培养皿的盖子上。
- 颞骨的宏观解剖
- 通过使用手术刀刀片从前端到后端（直接在矢状缝合线顶部）进行表面切割，去除头骨的皮肤。
- 用手术刀切割两个外耳道并将皮肤向前折叠以暴露整个头颅。
注意：虽然此步骤通常不需要夹层显微镜，但可用于改进可视化。 - 使用＃15手术刀刀片沿着矢状缝线打开颅骨。确保通过从前到后轻轻地移动刀片来切割颅骨，以避免耳蜗的压缩。
注意：颅骨在这个年龄时不应该僵硬，应该很容易切开。 - 使用＃15手术刀通过在轨道的正后方进行垂直切割，去除并丢弃鼻子刀。
注意：头骨的后部应该还包含脑和耳蜗。 - 用＃4镊子通过钝性解剖处理前脑，小脑和脑干。
- 微观提取耳蜗
- 通过将镊子放在范围内并优化照明和聚焦，调整显微镜（6.5倍放大）和光源。
- 将颅骨的两半放入装有冷HBSS的60 mm塑料培养皿中。
- 完全暴露耳蜗/ e，可以识别为邻近周围的手腕动脉（颞骨内的曲折动脉），并使用＃4镊子将器官与颞骨平坦分离。
- 将耳蜗转移到50毫米，透明的，玻璃底的陪替氏培养皿中，并将盘定位在显微镜下。
- 将60毫米塑料培养皿与颅骨的另一半放在冰上。 从前庭系统中取出耳蜗，用＃4镊子仔细解剖耳蜗耳蜗胶囊（通常在此年龄为软骨）。使用＃55镊子进行所有进一步的步骤。
- 组织处理的最后步骤
- 通过使用微刀或两个镊子仔细分离粘附到Corti器官的螺旋韧带与耳蜗的其余部分和组织，继续处理内耳组织。
- 切入螺旋韧带和毛细胞区域之间的缝隙处的较暗，半透明的区域，并通过在最基础的方面抓住螺旋韧带并继续移除，并在顶端移动时轻轻地展开。
- 将样品放置以获得耳蜗的纵向矢状视图，并使用微型刀将耳蜗切成两至三个部分，将这些部分分类为顶端（中间）和basal转。去除组织上下不同于毛细胞和神经突的实际层，以便实现可以水平放置在培养皿上的耳蜗外植体片。
注意：用于稳定粘附培养皿的适当尺寸大约是一个人工耳蜗的一半。 - 去除胸膜，一个非常薄的半透明层，立即高于Corti的器官，用镊子轻轻剥去。
- 通过用镊子触摸两侧的剥离器，将Reissner的膜立即脱离SGN，然后将其剥离。
注意：用微型刀将其切割掉，以清除任何横向位置受损的毛细胞区域。
- 通过使用微刀或两个镊子仔细分离粘附到Corti器官的螺旋韧带与耳蜗的其余部分和组织，继续处理内耳组织。
3.将标本转移到文化板上
- 从四个盖玻片中取出45μL的组织粘合剂溶液。用50μL无菌H 2 O清洗每个盖子，吸水。
- 拿起1毫升移液器。用大约120μL的DMEM将吸液管吸湿，以防止样品粘附在尖端内部。
- 使用1 mL移液管单独转移标本。从装有HBSS，小而透明的玻璃底的陪替氏培养皿中取出最多70μL，将样品与液体一起放在4孔培养皿中的4个镶嵌（用盖子盖子制成）之一上。
- 在显微镜下（50倍放大）检查样品处于正确的方向。确保去除胸膜的毛细胞面积向上。确保基底膜与修剪的基部部分面朝下并粘附在盖玻片上。
- 如果样品在检查时上下颠倒定位，则将残留在移液管尖端的HBSS沉积在嵌体中，并重新定位该片，直到其正确定向。
没有TE：这样可以防止毛细胞漂浮在培养基中，而不需要盖玻片的结构支撑，这可能导致退化。
- 如果样品在检查时上下颠倒定位，则将残留在移液管尖端的HBSS沉积在嵌体中，并重新定位该片，直到其正确定向。
- 使用1 mL移液管吸出过量的HBSS。等待15秒。
- 将60μL制备的温育培养基（98％DMEM，1％N-2和1％氨苄青霉素）直接吸取到样品上。小心不要用吸液管接触标本。更换内外培养皿盖，并在37°C孵育O / N。
- 将所有储备溶液放回适当位置，处理屠体和残留废物，根据制度指导（ 例如使用乙醇或次氯酸盐）去除外科手术台，清洁并高压灭菌器具，并丢弃相应容器中的尖锐物。
4.添加最终文化媒体和兴趣物质
注意：耳蜗外植体将在10-16小时后使用。
- 准备一个mixtu重复使用97％DMEM，1％胎牛血清（FBS），1％N-2和1％氨苄青霉素（在微量离心管中每孔65μL;在使用前将溶液温热至25℃）。
- 在各个治疗组的溶液中加入感兴趣的其他物质。如果添加荧光物质（ 如绿色荧光蛋白（GFP））表达病毒;最近的出版物中，使用浓度为10 10 GC的腺相关病毒（AAV）48小时，50μL） 18 ，保护光。
- 将来自培养箱的含耳蜗外植体培养皿转移到层流罩下。
- 用吸液管从嵌体中吸出旧培养基（不含FBS）。
- 加入60μL/孔的制备的温育培养（处理）培养基（97％DMEM，1％FBS，1％N-2,1％氨苄青霉素和目标物质）。
- 将培养皿放回培养箱（37℃）。
- 查看r在显微镜下显微镜观察以识别污染，细胞迁移或耳蜗外植体脱落的迹象，并在最多7天后进行染色。
5.免疫荧光 - 第1天
- 制备封闭溶液（94％磷酸盐缓冲盐水（PBS），5％正常山羊或马血清（NGS / NHS，取决于第二抗体）和1％非离子表面活性剂（参见材料表 ））和储备抗体溶液（98.6％PBS，1％NHS和0.4％非离子表面活性剂与相应的抗体）。
注意：抗体包括浓度为1:400+的兔抗Myo7A（肌球蛋白7A，内外毛细胞）和小鼠抗TuJ1 1:200+（β-微管蛋白，SGN）或小鼠（IgG1）抗体-CtBP2 1:200+（c-末端结合蛋白，用于突触前），小鼠（IgG2a）抗PSD95 1:50+（突触后密度，用于突触后）和鸡抗NF-H 1：1000+（神经丝，用于SGN和神经纤维）。 “+”means“或更高”。 - 用移液管吸出培养基。小心不要触摸标本。
- 在层流罩下，用无菌PBS冲洗耳蜗外植体两次，每次洗涤后将样品置于振荡器上5分钟。
- 在4％多聚甲醛（PFA - 注意）中将组织固定在摇床上（罩下）20分钟。吸取PFA。
- 将60μLPBS加入耳蜗外植体，将培养皿置于摇床上5分钟。吸出PBS。重复3次。
- 将耳蜗外植体置于制备的阻塞溶液（94％PBS，5％NHS和1％非离子表面活性剂）中30分钟。
- 将耳蜗外植体置于制备的储备抗体溶液（98.6％PBS，1％NHS和0.4％非离子表面活性剂）中，与RT相同的一抗（使用前漩涡）O / N。
注意：用缠绕在塑料包装中的湿纸巾（或铝箔，如果添加的溶液）包裹陪替氏培养皿离子含有诸如GFP表达病毒的荧光材料）以保持培养皿的潮湿并防止溶液O / N的蒸发。
6.免疫荧光 - 第2天
- 制备4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色剂（300nM），并使用库存抗体溶液获得与步骤5.1中的一抗互补的正确的二抗混合物。 （ 例如 ，山羊抗兔488 1:200+和山羊抗小鼠568 1:200+或山羊抗小鼠（IgG1）568 1：1000+，山羊抗小鼠（IgG2a）488 1:500+，和山羊抗鸡647 1：200+或鬼笔环蛋白568 1：200+（用于内外毛细胞））。
- 吸出一抗溶液。
- 将60μLPBS加入耳蜗外植体，将培养皿置于摇床上5分钟。吸出PBS。重复3次。
- 将耳蜗外植体置于制备的储备抗体溶液（98.6％PBS，1％NHS和0.4％非离子表面活性剂）中，果实二次抗体（使用前旋涡）在柜台上1.5小时，防止光照。
- 吸出第二抗体溶液，并用DAPI染色剂（置于振荡器上1分钟然后抽吸）冲洗耳蜗外植体。
- 将60μLPBS加入耳蜗外植体，将培养皿置于摇床上5分钟。吸出PBS。重复3次。
- 使用镊子从4孔板中取出标本，将其浸入装有蒸馏水的接收器中，并垂直使其与纸巾接触，干燥盖玻片。
- 将一滴抗衰老的安装介质放在显微镜载玻片上并倒置盖玻片，将向下的组织浸入介质中。
- 使用透明的指甲油密封盖玻片，周向覆盖边缘（不在玻璃下破碎样品）。将幻灯片平放放置在远离光线的覆盖区域15 - 20分钟，直到干燥将它们放在盒子中或在共焦显微镜下检查。
注意：通过将载玻片存放在4或-20°C下，荧光染色最好保存。
共焦成像
- 获取Corti地区器官的概览和放大图片，包括神经突和神经元。
注意：成像过程的标准设置：1,024 x 1,024像素的格式，速度为400 Hz，帧平均为3,20％的整体激光强度，通常为20X和63X透镜（含有2X数码变焦）。 DAPI，Myo7A和TuJ1染色方案的通道设置如下：405 5％DAPI“Smart Gain”766.8V“Smart Offset”0.0％ - 488 15％异硫氰酸荧光素（FITC），“Smart Gain”622.2V ，“智能偏移”0.0％ - 561 13％四异氰酸异硫氰酸四甲酯（TRITC），“智能增益”562.4V，“智能偏移”0.0％。 - 使用z-stack合并图像软件获得z轴投影。
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Representative Results
虽然许多协议集中在Corti外植体的器官，但是这种技术试图保留包括SGN在内的整个耳蜗转向的解剖学。这使得研究人员有机会分析给药治疗对神经突和神经元的体细胞除了科尔蒂的器官之外。如本文所述，进行保留部分梗阻的解剖在技术上更具挑战性，而不是仅仅去除皮质的器官。然而，神经突和SGN区域是重要的，因为在应用前庭神经鞘瘤分泌物（ 图1 ）和细胞外囊泡的两个最近出版物中使用相同的方法19,20后 ，在该区域观察到显着的病理作用。通过使用Corti外植体的分离器官，不可能揭示这种变化。
钍内部和外部毛细胞，支持细胞和SGN的损伤或GFP表达细胞的量化可以通过手动计数或通过自动化过程进行，例如内置于ImageJ插件NeuronJ中的自动化过程。在确定其与总计数的相关性之后，可以建立这些计数的代表性领域。 3D重建对SGN的z轴投影中排除叠加效果特别有用。纤维组织，每个给定区域的SGN数量和SGN soma区域可以进行评估。突触，毛细胞和神经突的染色和计数如图2所示 ;相同的方案也可以用于耳蜗整体安装，并且已经被证明是用于这些目的的可靠模型17,21,22 。其他研究人员已经建立了优雅的替代方法，也可以纳入实验范式23/ sup> ， 24 。
培养的最大长度通常受到细胞迁移开始的限制，取决于培养基中FBS的浓度。当FBS的比例从5％降低到3％或1％时，维持解剖学上完整的耳蜗外植体的时间延长到约1周（ 图3 ）。
图4显示用合成腺相关病毒载体Anc80转导48小时25后的GFP阳性耳蜗外植体细胞。在这个视图中可以量化内毛细胞，外毛细胞和支持细胞，而3D重建可以帮助定量SGN区域中的GFP阳性细胞。不同的病毒血清型可以在某些ce的转导效率方面进行比较ll类型使用概述的方法18 。
图1： 来自大耳廓神经或前庭神经鞘瘤分泌物的顶端和基底区域的耳蜗外植体的代表性共焦显微镜图像48小时 。 （ A ）外植体的概述图像。矩形标记特写图像中的区域。比例尺= 200μm。 （ B - E ）放大毛细胞和神经突的视图。刻度棒=50μm。绿色=肌球蛋白7A（Myo7A），污染毛细胞;红色= III类β微管蛋白（Tuj1），污染神经元结构。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2： 人工耳蜗毛细胞区域的共焦显微镜图像。 （ A ）可以通过将突触前（C-末端结合蛋白，红色）和突触后（突触后密度-95，绿色）蛋白与神经元结构（神经丝，蓝色）的染色标记来评估完整的突触。 OHC，外毛细胞; IHC，内毛细胞。刻度棒=10μm。 （ B ）以内毛细胞（红色箭头）和神经突（蓝色箭头）计数，聚焦于内毛细胞区域。由于神经元结构的分化，重要的是在计数期间标准化内毛细胞的距离（用白框突出显示，直接连接到突触）。刻度棒=5μm。 （ C ）单独突触的特写（2个用白色箭头标记的突触前和突触后对）。比例尺= 1＆ ＃181;米。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3： 用3％或1％FBS培养7天后顶端和基底耳蜗外植体的代表性共焦显微镜图像。 （ A和B ）在3％FBS中孵育的细胞开始在4和5天之间迁移（毛细胞的浅灰色箭头，神经突的红色箭头），（ C和D ）1％FBS中的外植体保持组织完整性，直到第7天。浅灰色：肌球蛋白7A（Myo7A），染色所有毛细胞;红色：III类β微管蛋白（Tuj1），污染神经元结构。 OHC，外毛细胞; IHC，内毛细胞。比例尺= 100μm，适用于所有面板。iles / ftp_upload / 55704 / 55704fig3large.jpg“target =”_ blank“>请点击此处查看此图的较大版本。
图4： 暴露于合成腺相关病毒载体Anc80 48小时后的人工耳蜗的共焦显微镜图像。转导细胞表达GFP（绿色）。肌球蛋白7A（Myo7A，蓝色）染色外毛细胞（OHC）和内毛细胞（IHC）; III类β微管蛋白（Tuj1，红色）污染神经元结构。 Supp .: Sox2阳性支持细胞的面积; SGN，螺旋神经节神经元。刻度棒：100μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在进行耳蜗外植体实验之前，研究人员必须完善解剖技术。毛细胞通常在学习曲线早期进行的解剖过程中被破坏，并且其完整性的一个特别有问题的时刻是去除胸膜，这需要稳定的手，适当的工具和经验。为了节省时间和资源，应在夹层显微镜下进行视觉控制，并注意潜在的损伤区域。代替使用昂贵的一级和二级抗体，更便宜的试剂如鬼笔环肽更适用于初步实验。在某些实验（分析未受影响的部分）或抗体的新组合的测试中，稍微损伤的外植体仍然可以用作对照。
标本的转移也是特别重要的，因为必须保证碎片不是上下颠倒（“漂浮”的毛细胞没有涂覆的盖玻片的引导通常会退化）。盖玻片上的中心位置便于进一步的移液步骤。
对于涉及新化合物（显然必须可溶于培养基）的阴性对照实验，重要的是将适当的载体施用于外植体，并且不专注于未处理的外植体。例如，如果商业药物除了活性成分之外还包括柠檬酸钠，则柠檬酸钠应该被添加到阴性对照耳蜗外植体中，因为柠檬酸钠本身可能具有效果。
使用耳蜗外植体的局限性包括这些器官型培养物通常来源于仍然经历出生后发育变化的幼崽，并且在外植体上缺乏离子梯度，这对于正常的是重要的体内听觉。然而，协议的效用在最近关于AAV 18的出版物中得到了强烈的证实。虽然这组载体限制在约4.7 kb的包装能力，它已成为治疗几种人类综合征26的重要资源。使用耳蜗外植体模型，上述出版物证明，Anc80病毒在包括毛细胞和SGNs在内的多种耳蜗细胞的转导中优于传统的AAV血清型。这些体外研究结果随后通过在体内小鼠幼崽的圆窗中选择最有希望的注射候选物来证实 。 离体模型提供了一种成功重现耳蜗解剖学的方法，减少了进行体内工作所需的时间和资源27 。
ex v 。的另一个优点ivo模型是其应用于研究有助于SNHL的特定细胞机制的潜力。通过将在肿瘤微环境中发现的化合物（ 例如，人类肿瘤分泌物）应用于外植体，可以直接观察这些化合物对耳蜗的影响，并评估潜在药物治疗的功效或毒性。这是重要的，因为人耳蜗不能活检，其内部的细胞不能在体内可视化 。例如，最近的出版物检查了从前庭神经鞘瘤分泌的蛋白质的耳毒性潜力，这是由前庭神经引起的颅内肿瘤，并导致95％患者的听力损失。将人肿瘤分泌物应用于耳蜗外植体，与对照健康人类神经的分泌物相比，证实了这些分泌物对耳蜗的毒性作用19 。相同的实验将难以在体内复制由于对免疫活性小鼠中会出现的针对人类蛋白质的免疫原性反应，模型。
总之，这份手稿提出了一种能够在离体模型中同时研究耳蜗毛细胞，突触，神经突和神经元的技术。该模型可以帮助提供洞察新生的耳蜗分子的作用机制，包括人类分泌物19,20 中的因素，同时潜在地加速候选治疗化合物18 在体内测试之前的筛选。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家失聪和其他传播障碍研究所资助的R01DC015824（KMS）和T32DC00038（支持SD），国防部授予W81XWH-15-1-0472（KMS），贝塔雷利基金会（KMS）， Nancy Sayles Day基金会（KMS）和Lauer耳鸣研究中心（KMS）。感谢Jessica E. Sagers，BA对稿件的深刻见解。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin, Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | |
| anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
| anti-Myo7A antibody, rabbit | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| anti-NF-H antibody, chicken | EMD Millipore | AB5539 | |
| anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) | Antibodies Inc. | 75-028 | |
| anti-TuJ1 antibody, mouse | BioLegend | 801202 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg | Corning | 354241 | |
| CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner rings | Greiner Bio-One | 627170 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Clear Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50 x 7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
| Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mm | Ted Pella Inc. | 260368 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Distilled water, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 Forceps (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer |
| goat anti-chicken-647 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
| goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
| goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
| goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| goat anti-rabbit-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
| H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Instrument Tray with Lid Stainless Steel | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
| Micro (dissecting) knife – angled 30° | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 | VWR | 16004-382 | |
| N-2 Supplement (100X), 5 mL | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| NaOH, sodium hydroxide solution, 1 L | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Normal Horse Serum (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
| Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
| Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Phalloidin, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Prep Pad, Non Sterile | Medline | 05136CS | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Scalpel Blades - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| TCS SP5 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton-X (non-ionic surfactant) | Integra | T756.30.30 | |
| VectaShield antifade mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6'' - 2 mm thick | Zipline | 0609132541599 |
References
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