Summary
Le but de ce protocole est de démontrer la préparation, la culture, le traitement et l'immunocoloration des explants cochléaires murins néonataux. La technique peut être utilisée comme outil de dépistage in vitro dans la recherche auditive.
Abstract
Bien qu'il y ait eu des progrès remarquables dans la recherche de l'ouïe au cours des dernières décennies, il n'y a toujours pas de remède contre la perte d'audition sensorielle (SNHL), une affection qui entraîne généralement une perte ou une perte des structures mécanosensorielles délicates de l'oreille interne. Des essais sophistiqués in vitro et ex vivo ont émergé ces dernières années, ce qui a permis de dépister un nombre croissant de composés potentiellement thérapeutiques tout en minimisant les ressources et en accélérant les efforts pour développer des remèdes pour SNHL. Bien que les cultures homogènes de certains types de cellules continuent à jouer un rôle important dans la recherche actuelle, de nombreux scientifiques s'appuient maintenant sur des cultures organotypiques plus complexes d'oreilles internes murines, également connues sous le nom d'explants cochléaires. La préservation des structures cellulaires organisées à l'intérieur de l'oreille interne facilite l'évaluation in situ de divers composants de l'infrastructure cochléaire, y compris les cellules capillaires interne et externe, les neurones ganglionnaires en spirale, les neuronesItes, et les cellules de soutien. Nous présentons ici la préparation, la culture, le traitement et l'immunocoloration des explants cochléaires murins néonataux. La préparation minutieuse de ces explants facilite l'identification des mécanismes qui contribuent au SNHL et constituent un outil précieux pour la communauté de la recherche auditive.
Introduction
La perte auditive sensorielle (SNHL) reflète les dommages causés à l'oreille interne ou à la voie auditive ascendante. Bien que la perte auditive soit le déficit sensoriel le plus fréquent chez les humains 1 , les traitements curatifs n'existent pas encore 2 . Bien que les implants cochléaires ou auditifs du tronc cérébral puissent rétablir un certain degré d'audition chez les patients atteints de SNHL grave à profond, l'audition fournie par ces dispositifs est encore très différente de l'audition "naturelle", en particulier lors des tentatives de compréhension de la parole dans le bruit ou de l'écoute musicale.
Bien que la dégénérescence des cellules capillaires ait longtemps été considérée comme la conséquence principale des événements auditifs traumatiques ( p. Ex., Exposition au bruit élevé), il existe de plus en plus de preuves que les synapses transmettant l'information des cellules capillaires au nerf auditif sont au moins aussi vulnérables aux traumatismes acoustiques 3 , 4 , 5 > , 6 . Étant donné que les seuils audiométriques humains, l'étalon-or actuel pour l'évaluation de la fonction auditive, ne prédisent pas un dommage cellulaire spécifique dans l'oreille interne, des outils plus raffinés sont nécessaires pour détecter la dégénérescence cellulaire dès que possible et pour initier un traitement adéquat 7 .
Des traitements pharmaceutiques prometteurs pour la perte d'audition sont souvent testés sur des cultures cellulaires homogènes in vitro , mais de tels systèmes ne modélisent pas précisément le micro-environnement cochléaire. On sait que les cellules cochléaires sécrètent des facteurs trophiques qui influent sur d'autres types de cellules dans la cochlée 8 , 9 , un processus crucial in vivo qui se perd lorsque l'organe de Corti 10 , 11 ou Spiral Ganglion Neurons (SGN) 12 est cultivé isolément ou lorsque Les marqueurs moléculaires sont analysésLes études in vivo qui peuvent être nécessaires pour la validation des données in vitro pour établir de nouveaux traitements personnalisés pour la perte d'audition dans la poursuite de la «médecine de précision» nécessitent des ressources et des temps importants. Cela est particulièrement important lorsque l'on considère Combien d'effort est nécessaire pour parfaire et effectuer des injections membranaires de l'oreille moyenne ou des fenêtres rondes avec des tests auditifs et la dissection subséquente de la totalité des cochléaires. Le criblage efficace de composés prometteurs dans des cultures organotypiques ex vivo connues sous le nom d'explants cochléaires fournit une alternative économique et fiable 14 , 15 , 16 , 17 .
Cet article décrit un protocole permettant de générer, de maintenir et d'évaluer des explants cochléaires traités. Les applications spécifiques pour ce modèle sont soulignées, y compris son utilisation dans le dépistageDe composés potentiellement thérapeutiques et l'évaluation comparative de vecteurs viraux pour la thérapie génique. Une approche d'explant ex vivo permet aux chercheurs de visualiser les effets d'un traitement donné sur différentes populations cellulaires in situ , en facilitant l'identification des mécanismes spécifiques du type cellulaire et le raffinement ultérieur des thérapies ciblées.
Dans l'ensemble, cette technique fournit un modèle pour étudier la cochlée ex vivo tout en préservant les interférences vitales entre les types de cellules très différents qui coexistent dans la cochlée.
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Protocol
Le protocole d'étude a été approuvé par le Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux (IACUC) du Massachusetts Eye and Ear. Les expériences ont été réalisées selon le Code de déontologie de l'Association médicale mondiale.
1. Préparation de la dissection
- Préparation de la table chirurgicale
- Utilisez 70% d'éthanol pour désinfecter la table chirurgicale.
- Placez deux plaques de préparation non stériles à côté du microscope.
- Préparez le tiroir à instruments, y compris les ciseaux opératoires stérilisés par la chaleur, une poignée de scalpel, un micro-couteau et une pince (deux de chacun des # 4 et # 55). Placez le tiroir à instruments et une boîte de Pétri à fond de verre de 50 mm, à paroi claire, sur un tampon non stérile.
- Obtenir une lame de scalpel stérile # 15; Un sac en plastique scellable ou un récipient (pour éliminer les carcasses conformément aux directives institutionnelles); Glace dans un seau; Et la solution stérile stérile Hank's Balanced Salt (HBSS). Placez ces objets sur leAutre caisse non stérile.
- Transférer le HBSS dans un tube de laboratoire plastique de 50 mL et le mettre sur de la glace.
- Préparer la culture
- Préparez tous les matériaux dans un capot à flux laminaire. Pour chaque quatre spécimens, mettez quatre patins de verre ronds à 10 mm en plaques autoclavées dans les quatre incrustations de la boîte de Petri 35 mm à 4 puits.
- Pour chaque 4 spécimens, mélangez un volume total de 300 μL composé de ce qui suit dans un tube de microcentrifugeuse: 10 μL d'adhésif tissulaire, 285 μL de NaHC03 et 5 μL de NaOH.
- Mettez 45 μL de la solution résultante sur chaque patte de recouvrement et laissez-le pendant au moins 20 min à la RT; Cette solution peut être laissée sur la lamelle pendant plusieurs heures mais ne peut pas être laissée O / N.
- Placez une ou deux boîtes de pétri à 4 po de 35 mm à l'intérieur d'une boîte de Petri de 10 cm afin de créer deux barrières contre la contamination.
- Préparer un milieu de culture contenant 98% de milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM), 1% de N-2 et 1% d'ampicilline (65 μL par puits dans un tube de (micro) centrifugeuse). Réchauffer la solution à 25 ° C avant l'utilisation.
2. Dissection de l'échantillon de cochléaire murin
- Décapitation de la souris néonatale
- Obtenir une boîte de Petri en plastique de 60 mm et vaporiser 70% d'éthanol dans son couvercle afin que la surface soit humide.
- Versez le HBSS froid du tube de laboratoire en plastique dans la partie inférieure du plastique de 60 mm et la boîte de Petri à fond transparent et à paroi transparente de 50 mm. Rangez le tube de laboratoire en plastique et les deux boîtes de pétri sur glace pour garder le tissu à froid chaque fois qu'il ne se dissipe pas.
- Placez une souris néonatale P3-P5 sur glace dans un doigt de coupure d'un gant latex et attendez jusqu'à ce que l'hypothermie induit une perte de conscience (environ 1 à 3 minutes).
- Détachez la souris rapidement avec des ciseaux opérationnels et jetez le corps dans le sac en plastique scellable. Mettez la tête de neonate coupée dans le70% d'éthanol dans le couvercle de la boîte en Petri en plastique de 60 mm.
- Dissection macroscopique de l'os temporel
- Retirer la peau du crâne en faisant une coupe superficielle de l'extrémité antérieure à l'extrémité postérieure (directement sur le suture sagittale) en utilisant la lame du scalpel.
- Coupez les deux canaux auditifs externes avec la lame du scalpel et pliez la peau avant pour exposer le crâne entier.
REMARQUE: Bien qu'aucun microscope à dissection ne soit habituellement nécessaire pour cette étape, il peut être utilisé pour une meilleure visualisation. - Ouvrez le crâne le long de la suture sagittale en utilisant la lame de scalpel # 15. Assurez-vous de couper le crâne en déplaçant doucement la lame vers le haut et vers le bas de l'avant vers la postérieure pour éviter la compression des cochlées.
REMARQUE: Le crâne ne devrait pas être ossifié à cet âge et devrait être facilement coupé. - Retirer et jeter le museau en faisant une coupe verticale directement postérieure aux orbites en utilisant le scalpel # 15lame.
NOTE: La partie postérieure du crâne doit encore contenir le cerveau et les cochlées. - Éliminer le cerveau antérieur, le cervelet et le tronc cérébral par une dissection émoussée avec une pince # 4.
- Extraction microscopique des cochlées
- Ajustez le microscope (grossissement 6,5 x) et la source lumineuse en plaçant la pince sous la portée et en optimisant l'éclairage et la mise au point.
- Placez les deux moitiés du crâne dans la boîte à pétales en plastique de 60 mm remplie de HBSS froid.
- Expliquez complètement la cochlée / e, identifiable comme étant adjacente à l'artère stapédiale environnante (une artère tortueuse dans l'os temporel) et séparez manifestement l'organe de l'os temporel en utilisant des pinces n ° 4.
- Transférer la cochlée dans la boîte de Petri à 50 mm, à paroi claire et à fond de verre et positionner le plat sous le microscope.
- Placez la boîte en Petri en plastique de 60 mm avec l'autre moitié du crâne sur la glace. Retirez la cochlée du système vestibulaire et dissérez soigneusement la capsule oculaire cochléaire (typiquement cartilagineuse à cet âge) avec une pince # 4. Utilisez les pince # 55 pour toutes les étapes supplémentaires.
- Etapes finales du traitement des tissus
- Continuer avec le traitement du tissu de l'oreille interne en séparant soigneusement le ligament spirale adhérent à l'organe de Corti du reste de la cochlée et du modiolus à l'aide du micro-couteau ou de deux pinces.
- Couper dans la zone plus sombre et translucide à la crevasse entre le ligament spirale et la région des cellules capillaires et procéder à l'élimination subséquente du ligament spirale en le saisissant à l'aspect le plus bas et en le dégageant doucement en se déplaçant apicalement.
- Placez l'échantillon pour obtenir une vue longitudinale et sagittale de la cochlée et coupez la cochlée en deux à trois sections en utilisant le micro-couteau, en classant ces sections comme apical, (moyen,) et bTour d'horizon. Retirez le tissu supérieur et inférieur à la couche réelle de cellules capillaires et de neurites afin d'obtenir une pièce d'explant cochléaire qui peut être placée horizontalement sur la boîte à pétrole.
REMARQUE: une taille appropriée pour une adhérence stable au plat de culture est approximativement de moitié d'un tour cochléaire. - Retirer la membrane tectoriale, une couche translucide très mince immédiatement supérieure à l'organe de Corti, en la pelant doucement avec une pince.
- Retirez la membrane de Reissner, immédiatement supérieure aux SGN, en la touchant avec une pince des deux côtés et en l'épluchant.
REMARQUE: Retirez les zones de cellules capillaires endommagées situées latéralement en les coupant avec le micro-couteau.
- Continuer avec le traitement du tissu de l'oreille interne en séparant soigneusement le ligament spirale adhérent à l'organe de Corti du reste de la cochlée et du modiolus à l'aide du micro-couteau ou de deux pinces.
3. Transfert de spécimens aux plaques de culture
- Enlevez les 45 μl de solution adhésive tissulaire des quatre pattes de recouvrement. Lavez chaque patte de couverture avec 50 μL d'H 2 O stérile. Aspirez l'eau.
- Prenez la pipette de 1 mL. Mouiller la pointe de la pipette avec environ 120 μL de DMEM pour empêcher l'échantillon d'adhérer à l'intérieur de la pointe.
- Transférer les spécimens individuellement à l'aide de la pipette de 1 mL. Pipettez un maximum de 70 μL de la boîte à pétales à fond de verre, petit, à paroi clochée et à fond clair, et placez l'échantillon avec le liquide sur l'une des 4 inlays (préparé avec des pattes de recouvrement) dans la boîte à pétre de 4 puits .
- Vérifiez sous le microscope (grossissement 50X) que l'échantillon est dans l'orientation correcte. Assurez-vous que la zone des cellules ciliées à partir de laquelle la membrane tectoriale a été retirée est orientée vers le haut. Assurez-vous que la membrane basilaire, avec la partie basale basée du modiolus, fait face vers le bas et adhère à la lamelle.
- Si l'échantillon est orienté à l'envers lors de l'inspection, déposez le HBSS qui reste dans la pointe de la pipette dans l'incrustation et repositionnez la pièce jusqu'à ce qu'elle soit correctement orientée.
NONTE: Cela empêchera les cellules capillaires de flotter en milieu de culture sans support structurel de la lamelle, ce qui pourrait entraîner une dégénérescence.
- Si l'échantillon est orienté à l'envers lors de l'inspection, déposez le HBSS qui reste dans la pointe de la pipette dans l'incrustation et repositionnez la pièce jusqu'à ce qu'elle soit correctement orientée.
- Aspirer l'excès de HBSS en utilisant la pipette de 1 mL. Attendre 15 s.
- Pipetter 60 μL du milieu de culture chaud préparé (98% de DMEM, 1% de N-2 et 1% d'ampicilline) directement sur l'échantillon. Veillez à ne pas toucher l'échantillon avec la pipette. Remplacer les couvercles intérieurs et extérieurs des boîtes de pétri et incuber O / N à 37 ° C.
- Remettre toutes les solutions stockées dans leurs endroits appropriés, éliminer les carcasses et les déchets résiduels, décontaminer la table chirurgicale selon les directives institutionnelles ( par exemple, utiliser de l'éthanol ou de l'hypochlorite), nettoyer et autoclaver les instruments et jeter les objets tranchants dans le récipient approprié .
4. Ajout de culture finale Médias et substances intéressantes
REMARQUE: Les explants cochléaires seront prêts à être utilisés 10 à 16 heures plus tard.
- Préparer un mixtuRe 97% de DMEM, 1% de sérum bovin fœtal (FBS), 1% de N-2 et 1% d'ampicilline (65 μL par puits dans un tube de microcentrifugeuse, chauffez la solution à 25 ° C avant l'utilisation).
- Ajoutez d'autres substances intéressantes aux solutions pour les groupes de traitement respectifs. Si des substances fluorescentes sont ajoutées ( p. Ex. Virus de la fluorescence verte (GFP) -expressing virus, dans une publication récente, une concentration de 10 10 GC de virus Adeno-Associés (AAV) a été utilisée pendant 48 h dans 50 μL) 18 , protégez-vous contre lumière.
- Transférer les boîtes de Petri contenant l'explantée cochléaire de l'incubateur et les placer sous la hotte à flux laminaire.
- Aspirez l'ancien milieu de culture (sans FBS) avec la pipette des inlays.
- Ajouter 60 μl par puits du milieu de culture chaude (traitement) préparé (97% de DMEM, 1% de FBS, 1% de N-2, 1% d'ampicilline et les substances intéressantes).
- Remettre la boîte de Petri dans l'incubateur (37 ° C).
- View rPar exemple au microscope pour identifier les signes de contamination, la migration cellulaire ou le détachement de l'explant cochléaire et effectuer une coloration après un maximum de 7 jours.
5. Immunofluorescence - Jour 1
- Préparez la solution de blocage (94% de solution salée tamponnée au phosphate (PBS), 5% de sérum normal de chèvre ou de cheval (NGS / NHS, selon les anticorps secondaires) et 1% de tensioactif non ionique (voir le tableau des matériaux )) et le stock Une solution d'anticorps (98,6% de PBS, 1% de NHS et 0,4% de tensioactif non ionique avec les anticorps respectifs).
NOTE: Les anticorps comprennent le lapin anti-Myo7A à une concentration de 1: 400+ (myosine 7A, pour les cellules capillaires interne et externe) et anti-TuJ1 de souris 1: 200+ (β-tubuline, pour SGN) OU souris (IgG1) anti -CtBP2 1: 200+ (protéine de liaison c-terminale, pour présynapse), souris (IgG2a) anti-PSD95 1: 50+ (densité postsynaptique, post-synapse) et anti-NF-H 1: 1000+ (neurofilament, Pour SGN et fibres nerveuses). "+" MeaNs "ou plus haut." - Aspirez le milieu de culture à l'aide d'une pipette. Veillez à ne pas toucher l'échantillon.
- Sous le capot de flux laminaire, rincer les explosifs cochléaires deux fois avec du PBS stérile, en plaçant les échantillons sur un agitateur pendant 5 min après chaque lavage.
- Fixez le tissu dans du paraformaldéhyde à 4% (PFA - ATTENTION) pendant 20 minutes sur le shaker (sous le capot). Aspirez le PFA.
- Appliquer 60 μL de PBS sur les explants cochléaires et placer la boîte de Petri sur un agitateur pendant 5 min. Aspirez le PBS. Répétez 3x.
- Placez les explants cochléaires dans une solution de blocage préparée (94% de PBS, 5% de NHS et 1% de tensioactif non ionique) pendant 30 minutes sur l'agitateur.
- Placez les explants cochléaires dans une solution d'anticorps stock préparée (98,6% de PBS, 1% de NHS et 0,4% de tensioactif non ionique) avec les anticorps primaires respectifs (vortex avant utilisation) O / N sur un compteur à la RT.
REMARQUE: Enrouler les boîtes de Petri avec des serviettes en papier humide enfermées dans une pellicule en plastique (ou une feuille d'aluminium si le solut ajoutéIon contient des matériaux fluorescents tels que des virus exprimeurs de GFP) pour garder la vaisselle humide et pour éviter l'évaporation de la solution d'anticorps O / N.
6. Immunofluorescence - Jour 2
- Préparer la tache 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (300 nM) et utiliser la solution d'anticorps stock pour obtenir les mélanges d'anticorps secondaires appropriés, complémentaires aux anticorps primaires à l'étape 5.1. ( P. Ex ., Chèvre anti-lapin 488 1: 200+ et chèvre anti-souris 568 1: 200+ OU chèvre anti-souris (IgG1) 568 1: 1000+, chèvre anti-souris (IgG2a) 488 1: 500+, Et chèvre anti-poulet 647 1: 200+ OU Phalloidine 568 1: 200+ (pour les cellules capillaires interne et externe)).
- Aspirer la solution primaire d'anticorps.
- Appliquer 60 μL de PBS sur les explants cochléaires et placer la boîte de Petri sur un agitateur pendant 5 min. Aspirez le PBS. Répétez 3x.
- Placez les explants cochléaires dans une solution d'anticorps stock préparée (98,6% de PBS, 1% de NHS et 0,4% de tensioactif non ionique) avec les resAnticorps secondaires pectifs (vortex avant utilisation) pendant 1,5 h sur un comptoir et protéger contre la lumière.
- Aspirer la solution d'anticorps secondaire et rincer les explants cochléaires avec une tache DAPI (placer sur un agitateur pendant 1 min puis aspirer).
- Appliquer 60 μL de PBS sur les explants cochléaires et placer la boîte de Petri sur un agitateur pendant 5 min. Aspirez le PBS. Répétez 3x.
- Utilisez une pince pour retirer les lamelles avec des échantillons de la plaque à 4 puits, les immerger dans un récipient rempli d'H 2 O distillé et sécher les lamelles en les mettant verticalement en contact avec des serviettes en papier.
- Placez une goutte de support de protection antifade sur la glissière du microscope et inversez les lamelles pour immerger le tissu tourné vers le bas dans le milieu.
- Scellez la lamelle en utilisant un vernis à ongles transparent couvrant le bord (sans écraser l'échantillon sous le verre). Laisser les lames situées à plat dans une zone couverte, loin de la lumière pendant 15 à 20 min jusqu'à ce qu'elles soient sèches et froides.Placez-les dans une boîte ou examinez-le sous le microscope confocal.
REMARQUE: la coloration fluorescente est mieux conservée en stockant les diapositives à 4 ou -20 ° C.
7. Confocal Imaging
- Obtenez une vue d'ensemble et des images agrandies pour l'organe de la région de Corti, y compris les neurites et les SGN.
REMARQUE: Paramètres standard pour le processus d'imagerie: Format de 1 024 x 1 024 pixels, vitesse de 400 Hz, image moyenne de 3, 20% d'intensité laser globale, et habituellement lentille 20X et 63X avec immersion à l'huile (potentiellement combinée avec un zoom numérique 2X). Les paramètres de canal pour le protocole de coloration DAPI, Myo7A et TuJ1 sont décrits ci-dessus: 405 5% DAPI, "Smart Gain" 766.8V, "Smart Offset" 0.0% - 488 15% isothiocyanate de fluorescéine (FITC), "Smart Gain" 622.2V , "Smart Offset" 0,0% - 561 13% d'isothiocyanate de tétraméthylrhomadine (TRITC), "Smart Gain" 562,4V, "Smart Offset" 0,0%. - Fusionnez les images dans une pile z en utilisant leLogiciel pour obtenir une projection d'axe z.
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Representative Results
Bien que de nombreux protocoles se concentrent sur l'organe des explants de Corti, cette technique tente de préserver l'anatomie de l'ensemble du tournant cochléaire, y compris les SGN. Cela donne aux chercheurs la possibilité d'analyser les effets d'un traitement donné sur les neurites et somata des SGN en plus de l'organe de Corti. Effectuer une dissection qui conserve une partie du modiolus, comme décrit ici, est plus difficile à utiliser que l'explantation de l'organe de Corti seul. Cependant, la région des neurites et de la SGN est importante, car des effets pathologiques importants ont été observés dans cette région après l'application de sécrétions de schwannome vestibulaire ( Figure 1 ) et des vésicules extracellulaires dans deux publications récentes selon la même méthode 19 , 20 . De tels changements n'auraient pas été révélés en utilisant un organe isolé d'explants de Corti.
ThLa quantification des cellules endommagées ou GFP qui expriment les cellules capillaires interne et externe, les cellules de soutien et les SGN peuvent être effectuées par un compte manuel ou par un processus automatisé tel que celui intégré au plugin ImageJ NeuronJ. Les zones représentatives pour ces comptes peuvent être établies après avoir confirmé leur corrélation avec le nombre total. Les reconstructions en 3D sont particulièrement utiles pour exclure les effets de superposition dans les projections d'axe z des SGN. L'organisation des fibres, le nombre de SGN par zone donnée et la zone SGOM peuvent être évalués. La coloration et le comptage des synapses, des cellules ciliées et des neurites est représenté à la figure 2 ; Le même protocole peut également être utilisé pour les montages intégrés cochléaires et s'est avéré être un modèle fiable à ces fins 17 , 21 , 22 . D'autres chercheurs ont établi des méthodes alternatives élégantes qui peuvent également être incorporées dans des paradigmes expérimentaux 23 </ Sup> , 24 .
La longueur maximale de la culture est généralement limitée par le début de la migration cellulaire et dépend de la concentration de FBS dans le milieu de culture. Lorsque la proportion de FBS a été réduite de cinq pour cent à trois pour cent ou d'un pour cent, la durée de maintien d'un explant cochléaire anatomiquement intact a été prolongée à environ une semaine ( figure 3 ).
La figure 4 démontre des cellules d'explants cochléaires positives à la GFP après transduction avec le vecteur de virus adéno-associé synthétique Anc80 pendant 48 h 25 . Les cellules capillaires intérieures, les cellules ciliées extérieures et les cellules support peuvent être quantifiées dans cette vue, alors qu'une reconstruction en 3D peut aider à quantifier les cellules GFP positives dans la zone SGN. Différents sérotypes viraux peuvent être comparés en fonction de leur efficacité de transduction dans certains domaines11 types en utilisant la méthodologie décrite 18 .
Figure 1: Microscopie Confocale représentative d'Explosifs Cochléaires des Régions Apicales et Basales Après Incubation avec Des Sécrétions de Nerves Auriculaires ou de Schwannomes Vestibulaires pendant 48 h . ( A ) Aperçu de l'image d'un explant. Le rectangle marque la zone dans des images rapprochées. Barre d'échelle = 200 μm. ( B - E ) Zoom sur les cellules capillaires et les neurites. Barre d'échelle = 50 μm. Vert = Myosine 7A (Myo7A), tache les cellules ciliées; Rouge = classe III bêta-tubuline (Tuj1), taches structures neuronales. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Microscopie confocale Image de la région cellulaire capillaire de Cochlear. ( A ) Les synapses intactes peuvent être évaluées en étiquetant les protéines pré-synaptiques (protéines de liaison C-terminales, rouge) et post-synaptique (densité postsynaptique-95, vert) ainsi que la coloration des structures neuronales (neurofilament, bleu). OHC, cellules capillaires externes; IHC, cellules capillaires intérieures. Barre d'échelle = 10 μm. ( B ) Concentrez-vous sur la région des cellules capillaires intérieures avec le nombre de cellules capillaires intérieures (pointes de flèches rouges) et les neurites (pointes de flèches bleues). En raison de la ramification des structures neuronales, il est important de normaliser la distance des cellules capillaires internes pendant le comptage (en surbrillance avec le cadre blanc, directement connecté aux synapses). Barre d'échelle = 5 μm. ( C ) Gros plan de synapses séparées (2 paires pré et postsynaptiques marquées par des pointes de flèches blanches). Barre d'échelle = 1 & # 181; m. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Microscopie confocale représentative Images d'explicateurs apiculaires et basiques cochléaires après 7 jours de culture avec 3% ou 1% de FBS. ( A et B ) Les cellules incubées dans 3% de FBS commencent à migrer entre 4 et 5 jours (flèches gris clair pour les cellules ciliées, flèches rouges pour les neurites), ( C et D ). Les explications dans 1% FBS maintiennent l'intégrité organisationnelle jusqu'au jour 7. Gris clair: Myosine 7A (Myo7A), tache toutes les cellules capillaires; Rouge: classe III bêta-tubuline (Tuj1), tache les structures neuronales. OHC, cellules capillaires externes; IHC, cellules capillaires intérieures. Barre d'échelle = 100 μm, appliquée sur tous les panneaux.Iles / ftp_upload / 55704 / 55704fig3large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: Microscopie Confocale Image d'un Explicateur Cochléaire Après Exposition au Vecteur de Virus Adéno-Synthétique Anc80 pendant 48 h. Les cellules transduites expriment GFP (vert). Myosine 7A (Myo7A, bleu) tache les cellules capillaires externes (OHC) et les cellules capillaires intérieures (IHC); Les structures neuronales des tumeurs bêta-tubulines de classe III (Tuj1, rouge). Supp.: Zone de cellules de support positives Sox2; SGN, neurones ganglionnaires en spirale. Barre d'échelle: 100 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les chercheurs doivent perfectionner la technique de dissection avant d'effectuer des expériences impliquant des explants cochléaires. Les cellules ciliées sont généralement endommagées lors des dissections effectuées au début de la courbe d'apprentissage, et un moment particulièrement problématique pour leur intégrité est l'élimination de la membrane tectoriale, qui nécessite des mains régulières, des outils appropriés et une expérience. Pour économiser du temps et des ressources, un contrôle visuel devrait être effectué sous le microscope à dissection et les zones potentiellement endommagées devraient être notées. Au lieu d'utiliser des anticorps primaires et secondaires chers, des réactifs moins chers comme la phalloidine sont plus appropriés pour des expériences préliminaires. Les explants légèrement endommagés peuvent encore être utilisés comme témoins dans certaines expériences (analyse des sections qui n'ont pas été affectées) ou pour le test de nouvelles combinaisons d'anticorps.
Le transfert des spécimens est également particulièrement important, car il faut garantir que les piècesNe sont pas orientés à l'envers (les cellules céraculaires "flottantes" sans le guidage de la lamelle enduit souvent dégénérées). Une position centrale sur la lamelle couvre toute autre étape de pipettage.
Pour les expériences de contrôle négatif impliquant de nouveaux composés (qui doivent évidemment être solubles dans le milieu de culture), il est important d'appliquer le véhicule approprié aux explants et de ne pas se concentrer exclusivement sur les explants non traités. Par exemple, si un médicament commercial comprend du citrate de sodium en plus de l'ingrédient actif, le citrate de sodium devrait être ajouté aux explants cochléaires témoins négatifs, car le citrate de sodium pourrait lui-même avoir un effet.
Les limites de l'utilisation des explants cochléaires comprennent le fait que ces cultures organotypiques sont généralement dérivées de jeunes chiots qui subissent encore des changements de développement postnatal et qu'il y a un manque de gradient ionique à travers l'explant, ce qui est essentiel pour la normaleL'ouïe in vivo . Cependant, l'utilité du protocole est démontrée de manière convaincante dans une publication récente concernant les AAV 18 . Alors que ce groupe de vecteurs est limité à environ 4,7 kb de capacité d'emballage, il est devenu une ressource importante pour la thérapie de plusieurs syndromes humains 26 . En utilisant le modèle d'explant cochléaire, la publication susmentionnée a démontré que le virus Anc80 a surpassé les sérotypes traditionnels de l'AAV dans la transduction de diverses cellules cochléaires, y compris les cellules ciliées et les SGN. Ces résultats in vitro ont ensuite été confirmés en choisissant les candidats les plus prometteurs à injecter à travers la fenêtre ronde chez les chiots de souris in vivo . Le modèle ex vivo fournit un moyen de récapituler avec succès l'anatomie de la cochlée, en diminuant le temps et les ressources nécessaires à la réalisation du travail in vivo 27 .
Un autre avantage de l' ex vLe modèle ivo est son potentiel d'application à l'étude de mécanismes cellulaires spécifiques qui contribuent à la SNHL. En appliquant des composés trouvés dans le micro-environnement de la tumeur ( p. Ex., Des sécrétions tumorales humaines) à un explant, l'effet de ces composés sur la cochlée peut être directement visualisé et l'efficacité ou la toxicité des thérapies potentielles évaluées. Ceci est important car la cochlée humaine ne peut pas être biopsiée et les cellules à l'intérieur ne peuvent pas être visualisées in vivo . Par exemple, une publication récente a examiné le potentiel ototoxique des protéines sécrétées à partir de schwannomes vestibulaires, qui sont des tumeurs intracrâniennes qui proviennent des nerfs vestibulaires et causent une perte auditive chez 95% des patients. L'application de sécrétions de tumeurs humaines à des explants cochléaires, par rapport aux sécrétions du contrôle des nerfs humains sains, a confirmé les effets toxiques de ces sécrétions sur la cochlée 19 . La même expérience serait difficile à reproduire in vivoModèle en raison de la réponse immunogène contre les protéines humaines qui apparaîtrait sur une souris immunocompétente.
En résumé, ce manuscrit présente une technique qui permet l'étude simultanée des cellules cochléaires, des synapses, des neurites et des neurones dans un modèle ex vivo . Ce modèle peut aider à donner un aperçu des mécanismes d'action des molécules nouvelles dans la cochlée 28 , y compris les facteurs dans les sécrétions humaines 19 , 20 , tout en accélérant potentiellement le dépistage des composés thérapeutiques candidats 18 avant leur test in vivo .
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les subventions du Département national de la surdité et des autres troubles de la communication, R01DC015824 (KMS) et T32DC00038 (soutenant SD), le ministère de la Défense accorde W81XWH-15-1-0472 (KMS), la Fondation Bertarelli (KMS) Nancy Sayles Day Foundation (KMS) et le Lauer Tinnitus Research Center (KMS). Nous remercions Jessica E. Sagers, BA pour des commentaires perspicaces sur le manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin, Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | |
| anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
| anti-Myo7A antibody, rabbit | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| anti-NF-H antibody, chicken | EMD Millipore | AB5539 | |
| anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) | Antibodies Inc. | 75-028 | |
| anti-TuJ1 antibody, mouse | BioLegend | 801202 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg | Corning | 354241 | |
| CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner rings | Greiner Bio-One | 627170 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Clear Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50 x 7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
| Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mm | Ted Pella Inc. | 260368 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Distilled water, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 Forceps (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer |
| goat anti-chicken-647 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
| goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
| goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
| goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| goat anti-rabbit-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
| H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Instrument Tray with Lid Stainless Steel | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
| Micro (dissecting) knife – angled 30° | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 | VWR | 16004-382 | |
| N-2 Supplement (100X), 5 mL | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| NaOH, sodium hydroxide solution, 1 L | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Normal Horse Serum (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
| Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
| Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Phalloidin, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Prep Pad, Non Sterile | Medline | 05136CS | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Scalpel Blades - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| TCS SP5 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton-X (non-ionic surfactant) | Integra | T756.30.30 | |
| VectaShield antifade mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6'' - 2 mm thick | Zipline | 0609132541599 |
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