Summary
L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare la preparazione, la cultura, il trattamento e l'immunostaining di esplosivi cochleari murine neonatali. La tecnica può essere utilizzata come uno strumento di screening in vitro nella ricerca uditiva.
Abstract
Mentre negli ultimi decenni sono stati notevoli progressi nella ricerca uditiva, non esiste ancora cura per la perdita di udito sensoriale (SNHL), una condizione che tipicamente comporta danni o perdite delle delicate strutture meccanosensoriali dell'orecchio interno. Nel corso degli ultimi anni sono emersi sofisticati esami in vitro e ex vivo, che hanno permesso lo screening di un numero crescente di composti potenzialmente terapeutici, minimizzando le risorse e accelerando gli sforzi per sviluppare cure per SNHL. Sebbene colture omogenee di alcuni tipi di cellule continuino a svolgere un ruolo importante nella ricerca attuale, molti scienziati ora si affidano a culture organotipiche più complesse di orecchie interne murine, noti anche come esplorazioni cochleari. La conservazione delle strutture cellulari organizzate all'interno dell'orecchio interno facilita la valutazione in situ di vari componenti dell'infrastruttura coclea, comprese le cellule dei capelli interni ed esterni, i neuroni dei gangli spirali, i neurE supportare le cellule. Qui presentiamo la preparazione, la cultura, il trattamento e l'immunostaining di esplosioni cochleari murine neonatali. L'attenta preparazione di questi esplosivi facilita l'individuazione di meccanismi che contribuiscono alla SNHL e costituisce uno strumento prezioso per la comunità di ricerca uditiva.
Introduction
Perdita uditiva sensoriale (SNHL) riflette danni all'orecchio interno o al percorso uditivo ascendente. Mentre la perdita dell'udito è il disordine sensoriale più comune nell'uomo 1 , non esistono ancora terapie curative 2 . Sebbene gli impianti cerebrali cocleari o uditivi possono ristabilire un certo grado di udito ai pazienti con SNHL grave o profonda, l'udienza fornita da questi dispositivi è ancora molto diversa da quella uditiva "naturale", specialmente durante i tentativi di comprendere il rumore del suono o di ascoltare la musica.
Mentre la degenerazione delle cellule di capelli è da tempo considerata la principale conseguenza degli eventi uditivi traumatici ( es. Esposizione a rumori elevati), vi è una crescente evidenza che le sinapsi che trasmettono informazioni dalle cellule dei capelli al nervo uditivo sono almeno altrettanto vulnerabili al trauma acustico 3 , 4 , 5 > , 6 . Poiché le soglie audiometriche umane, l'attuale standard oro per la valutazione della funzione uditiva, non prevedono danni cellulari specifici nell'orecchio interno, sono necessari strumenti più raffinati per rilevare la degenerazione cellulare quanto prima e per avviare un trattamento adeguato 7 .
I trattamenti farmaceutici promettenti per la perdita dell'udito sono spesso testati in culture cellulari omogenee in vitro , ma tali sistemi non modellano in modo preciso il microambiente cocleare. Le cellule cochleari sono noti per secernere fattori trofici che influenzano altri tipi di cellule all'interno della coclea 8 , 9 , un processo cruciale in vivo che si perde quando l'organo di Corti 10 , 11 o Neuroni Ganglionici Spirali (SGNs) 12 viene coltivato in isolamento o quando Vengono analizzati i marcatori molecolariTuttavia, studi in vivo che possono essere necessari per la convalida dei dati in vitro per stabilire nuovi trattamenti personalizzati per la perdita dell'udito nel perseguimento della "medicina di precisione" richiedono risorse e tempi significativi. Quanto sforzo è necessario per perfezionare e realizzare iniezioni a membrana di orecchio medio o rotondo con test uditivi e la successiva dissezione di cochleari integrali. L'efficace screening dei composti promettenti nelle colture ex vivo organotipiche noti come esplosioni cochleari fornisce un'alternativa economica e affidabile 14 , 15 , 16 , 17 .
Questo articolo descrive un protocollo per generare, mantenere e valutare gli esplosivi cocleari trattati. Le applicazioni specifiche per questo modello vengono enfatizzate, tra cui l'utilizzo nell'ambito dello screeningDi composti potenzialmente terapeutici e la valutazione comparativa dei vettori virali per la terapia genica. Un approccio esplosivo ex vivo consente ai ricercatori di visualizzare gli effetti di un dato trattamento su diverse popolazioni cellulari in situ , facilitando l'identificazione dei meccanismi specifici di tipo cellulare e la successiva affinamento di terapie mirate.
Nel complesso, questa tecnica fornisce un modello per studiare la coclea ex vivo , preservando la conversazione vitale tra i diversi tipi di cellule che coesistono all'interno della coclea.
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Protocol
Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Istituzionale di Assistenza e Assistenza Civile (IACUC) di Massachusetts Eye and Ear. Gli esperimenti sono stati condotti secondo il Codice Etico dell'Associazione Medica Mondiale.
1. Preparazione della dissezione
- Preparazione del tavolo chirurgico
- Usa il 70% di etanolo per disinfettare il tavolo chirurgico.
- Posizionare due pasticci nonsterili accanto al microscopio.
- Preparare il vassoio strumenti, forbici operative a caldo sterilizzato, una maniglia per bisturi, un micro coltello e una pinza (due ciascuno di # 4 & # 55). Posizionare il vassoio dello strumento e un piatto di petri da 50 mm, chiaro a parete, in vetro, su un tampone non sterile.
- Ottenere una lama sterile # 15 a bisturi; Un sacchetto o contenitore di plastica sigillabile (per smaltire le carcasse in linea con gli orientamenti istituzionali); Ghiaccio in un secchio; E fredda, sterile Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Posizionare questi elementi sulAltro tampone nonsterile.
- Trasferire l'HBSS in un tubo di laboratorio di plastica da 50 ml e metterlo su ghiaccio.
- Preparazione della cultura
- Preparare tutti i materiali in un cappuccio flusso laminare. Per ogni quattro esemplari, mettere quattro vetri autoclavati di vetro da 10 mm scivolano nei quattro inlay del piatto da Petri di 4 pozzetti da 35 mm.
- Per ogni 4 esemplari, miscelare un volume totale di 300 μL composto di seguito in un tubo di microcentrifuga: 10 μL di adesivo tissutale, 285 μL di NaHCO3 e 5 μL di NaOH.
- Mettere 45 μL della soluzione risultante su ciascuna copertura di copertura e lasciarla lì per almeno 20 minuti a RT; Questa soluzione può essere lasciata sul coperchio per diverse ore ma non può essere lasciata O / N.
- Posizionare uno o due piatti da Petri da 4 canali da 35 mm all'interno di un piatto di Petri da 10 cm al fine di creare due barriere contro la contaminazione.
- Preparare il mezzo di coltura contenente il 98% di Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1% N-2 e 1% ampicillina (65 μL per pozzetto in un tubo centrifugo (micro)). Riscaldare la soluzione a 25 ° C prima dell'uso.
2. Dissezione Explorante Cochlear Murina
- Decapitazione del mouse neonatale
- Ottenete un piatto di petri di plastica da 60 millimetri e spruzzate il 70% di etanolo nel suo coperchio in modo che la superficie sia bagnata.
- Versare il freddo HBSS dal tubo di laboratorio in plastica nella parte inferiore della plastica da 60 mm e dal piatto di Petri da 50 mm a parete chiara a vetro. Conservare il tubo di laboratorio in plastica e entrambi i piatti di Petri su ghiaccio per mantenere freddo il tessuto ogni volta che non viene disciolto.
- Posizionare un mouse neonatale di età P3 - P5 in ghiaccio in un dito tagliente di un guanto di lattice e attendere che l'ipotermia induca perdita di coscienza (circa 1-3 minuti).
- Decapitate rapidamente il mouse con forbici operative e smalti il corpo nel sacchetto di plastica sigillabile. Mettere la testa di neonato tagliata nella70% di etanolo nel coperchio del piatto di petri di plastica da 60 mm.
- Sezione macroscopica dell'osso temporale
- Rimuove la pelle del cranio facendo un taglio superficiale dall'anteriore all'estremità posteriore (direttamente sulla sutura sagittale) usando la lama del bisturi.
- Tagliare entrambi i canali uditivi esterni con la lama del bisturi e piegare la pelle anteriormente per esporre tutto il cranio.
NOTA: sebbene non sia necessario un microscopio di dissezione per questo passaggio, può essere utilizzato per una migliore visualizzazione. - Aprire il cranio lungo la sutura sagittale utilizzando la lama # 15 a bisturi. Assicurarsi di tagliare il cranio spingendo delicatamente la lama su e giù da anteriore a posteriore per evitare la compressione delle coclee.
NOTA: Il cranio non deve essere ossificato in questa età e dovrebbe tagliarsi facilmente. - Rimuovere e scartare il muso facendo un taglio verticale direttamente posteriore alle orbite usando il bisturi # 15lama.
NOTA: la parte posteriore del cranio dovrebbe comunque contenere il cervello e le coclee. - Smaltire il forebrain, il cervelletto e il tronco cerebrale attraverso una dissezione sbarrata con # 4 pinze.
- Estrazione microscopica delle coclee
- Regolare il microscopio (ingrandimento 6.5X) e la sorgente luminosa mettendo la pinza sotto il campo di applicazione e ottimizzando l'illuminazione e la messa a fuoco.
- Posizionare le due metà del cranio nel piatto di petri di 60 mm riempito con HBSS freddo.
- Completamente esporre la coclea / e, identificabile come adiacente all'arteria stapediale circostante (un'arteria tortuosa all'interno dell'osso temporale) e separare l'organo esternamente dall'oscurità temporale utilizzando # 4 pinze.
- Trasferire la coclea nel piatto di Petri a 50 mm di fondo chiaro e posizionare il piatto sotto il microscopio.
- Posizionare il piatto di petri di plastica da 60 mm con l'altra metà del cranio sul ghiaccio. Rimuovere la coclea dal sistema vestibolare e disciparle attentamente la capsula otterica coclea (tipicamente cartilaginea a questa età) con # 4 pinze. Usa # 55 pinze per tutti i passi successivi.
- Fasi finali dell'elaborazione dei tessuti
- Continuare con l'elaborazione del tessuto interno dell'orecchio separando con attenzione il legamento a spirale aderente all'organo di Corti dal resto della cochlea e dal modiolus usando il micro coltello o due pinze.
- Tagliare nella zona più scura e traslucida alla fessura tra il legamento a spirale e la regione delle cellule dei capelli e procedere alla successiva rimozione del legamento a spirale afferrandola all'aspetto più basale e delicatamente svolgendola mentre si muove apicamente.
- Posizionare il campione per ottenere una vista longitudinale e sagittale della coclea e tagliare la coclea in due o tre sezioni usando il micro coltello, classificando queste sezioni come apicali, (medio) e bAsal gira. Rimuovere il tessuto superiore e inferiore allo strato effettivo di cellule e neuriti di capelli per ottenere un pezzo esplante cocleare che può giacere orizzontalmente sul piatto di Petri.
NOTA: Una dimensione appropriata per un'adeguata adesione al piatto di coltura è di circa metà di un giro cocholare. - Rimuovere la membrana tectoriale, un sottile strato traslucido immediatamente superiore all'organo di Corti, levigandolo delicatamente con le pinze.
- Rimuovere la membrana di Reissner, immediatamente superiori agli SGN, toccandola con le pinze da entrambi i lati e sbucciarla.
NOTA: Rimuovere le zone celle danneggiate poste in posizione laterale tagliandole con il micro coltello.
- Continuare con l'elaborazione del tessuto interno dell'orecchio separando con attenzione il legamento a spirale aderente all'organo di Corti dal resto della cochlea e dal modiolus usando il micro coltello o due pinze.
3. Trasferimento di esemplari ai piatti della coltura
- Rimuovere le 45 μL di soluzione adesiva tissutale dai quattro scivoloni di copertura. Lavare ogni copertura con 50 μl di H 2 O sterile. Aspirare l'acqua.
- Prendere la pipetta da 1 ml. Bagnare la punta della pipetta con circa 120 μL di DMEM per evitare che il campione si aderisca all'interno della punta.
- Trasferire i campioni individualmente usando la pipetta da 1 ml. Pipettate un massimo di 70 μl dal piatto petri a base di vetro pieno e parzialmente pieno, chiuso a tinta unita, e posizionare il campione insieme al liquido su uno dei 4 inlay (preparati con coperture) nel piatto Petri da 4 pozzetti .
- Controllare sotto il microscopio (ingrandimento 50X) che il campione è nell'orientamento corretto. Assicurarsi che l'area delle cellule di capelli da cui è stata rimossa la membrana tectoriale sia rivolta verso l'alto. Assicurarsi che la membrana basilare, insieme alla parte basale del modiolus, sia rivestita verso il basso e aderisce alla copertura.
- Se il campione è orientato verso l'alto durante l'ispezione, depositare l'HBSS che rimane nella punta della pipetta nell'intarsio e riposizionare il pezzo finché non è correttamente orientato.
NOTE: Questo impedirà le cellule di capelli di galleggiare nel mezzo di coltura senza supporto strutturale dalla copertura, che potrebbe portare alla degenerazione.
- Se il campione è orientato verso l'alto durante l'ispezione, depositare l'HBSS che rimane nella punta della pipetta nell'intarsio e riposizionare il pezzo finché non è correttamente orientato.
- Aspirare l'eccesso di HBSS utilizzando la pipetta da 1 ml. Attendere 15 s.
- Pipettare direttamente sul campione 60 μl del mezzo di coltura caldo preparato (98% DMEM, 1% N-2 e 1% ampicillina). Fare attenzione a non toccare il campione con la pipetta. Sostituire i coperchi piatti di Petri interni ed esterni e incubare O / N a 37 ° C.
- Riporre tutte le soluzioni di riserva nei propri luoghi, smaltire carcasse e residui di rifiuti, decontaminare il tavolo chirurgico secondo linee guida istituzionali ( ad esempio, utilizzando etanolo o ipoclorito), pulire e autoclave gli strumenti e scartare gli arnesi nel contenitore appropriato .
4. Aggiunta di Media Finale e Sostanze di Interesse
NOTA: Gli esplosivi cochleari saranno pronti per l'uso dopo 10-16 h.
- Preparare un miscuglio1% di N-2 e 1% di ampicillina (65 μl per pozzetto in un tubo di microcentrifuga, riscaldare la soluzione a 25 ° C prima dell'uso), del 97% DMEM, 1% di siero di fegato fetale (FBS).
- Aggiungere altre sostanze di interesse alle soluzioni per i rispettivi gruppi di trattamento. Se vengono aggiunte sostanze fluorescenti ( ad es. Virus che esprimono GFP), in una recente pubblicazione è stata utilizzata una concentrazione di 10 10 GC di virus adeno-associati (AAVs) per 48 h in 50 μL) 18 , proteggere da leggero.
- Trasferire dall'incubatore i piatti petri contenenti esplosivi cocleari e posizionarli sotto il cappuccio flusso laminare.
- Aspirare il vecchio mezzo di coltura (senza FBS) con la pipetta dalle intarsi.
- Aggiungere 60 μl per pozzetto del mezzo di preparazione (trattamento) caldo preparato (97% DMEM, 1% FBS, 1% N-2, 1% ampicillina e le sostanze di interesse).
- Posizionare il piatto di Petri nell'incubatore (37 ° C).
- Visualizza rEgularmente sotto il microscopio per individuare segni di contaminazione, migrazione cellulare o distacco dell'esplosione cochleare e eseguire la colorazione dopo un massimo di 7 giorni.
5. Immunofluorescenza - Giorno 1
- Preparare la soluzione di blocco (94% di fosfato-tamponato salino (PBS), 5% normale caprino o cavallo di cavallo (NGS / NHS, a seconda degli anticorpi secondari) e 1% di tensioattivo non ionico (vedi tabella dei materiali ) Soluzione anticorpale (98,6% PBS, 1% NHS e 0,4% tensioattivo non ionico con i rispettivi anticorpi).
NOTA: Gli anticorpi comprendono anti-Myo7A coniglio a una concentrazione di 1: 400+ (miosina 7A, per le cellule dei capelli interne ed esterne) e mouse anti-TuJ1 1: 200+ (β-tubulina, per SGNs) o topo (IgG1) anti (Densità postsinaptica, per postsynapse) e pollo anti-NF-H 1: 1000+ (neurofilamento, anti-NF-H 1: Per SGN e fibre nervose). "+" MeaNs "o superiore". - Aspirare il mezzo di coltura usando una pipetta. Fare attenzione a non toccare il campione.
- Sotto la cappa a flusso laminare, risciacquare due esplosioni cochleari con PBS sterile, posizionando gli esemplari su un agitatore per 5 minuti dopo ogni lavaggio.
- Fissare il tessuto in 4% di paraformaldeide (PFA - CAUTION) per 20 minuti sull'agitatore (sotto la cappa). Aspirare il PFA.
- Applicare 60 μL di PBS agli esplosivi cocleari e posizionare il piatto di Petri su un agitatore per 5 min. Aspirare il PBS. Ripeti 3x.
- Posizionare gli esplosivi cochleari in soluzione di bloccaggio preparato (94% PBS, 5% NHS e 1% di tensioattivo non ionico) per 30 minuti in agitatore.
- Posizionare gli esplosivi cochleari in una soluzione anticorpale di riserva preparata (98,6% PBS, 1% NHS e 0,4% tensioattivo non ionico) con i rispettivi anticorpi primari (vortex prima dell'uso) O / N su un contatore a RT.
NOTA: avvolgere i piatti di Petri con gli asciugamani umidi chiusi in un involucro di plastica (o foglio di alluminio se la soluzione aggiuntaIon contiene materiali fluorescenti come i virus che esprimono GFP) per mantenere i piatti umidi e per prevenire l'evaporazione della soluzione anticorpale O / N.
6. Immunofluorescenza - Giorno 2
- Preparare la macchia di 4 ', 6-diammino-2-fenilindolo (DAPI) (300 nM) e utilizzare la soluzione anticorpale di riserva per ottenere le corrette miscele anticorpali secondarie complementari agli anticorpi primari del punto 5.1. ( Ad esempio , anti-coniglio caprino 488 1: 200+ e anti-topo caprino 568 1: 200+ ovvero anti-mouse caprino (IgG1) 568 1: 1000+, anti-mouse caprino (IgG2a) 488 1: 500+, E anti-pollo caprino 647 1: 200+ O Phalloidin 568 1: 200+ (per cellule capelli interne ed esterne)).
- Aspirare la soluzione anticorpale primaria.
- Applicare 60 μL di PBS agli esplosivi cocleari e posizionare il piatto di Petri su un agitatore per 5 min. Aspirare il PBS. Ripeti 3x.
- Posizionare gli esplosivi cocleari in soluzione anticorpale di riserva preparata (98,6% PBS, 1% NHS e 0,4% non tensioattivo) con le resAnticorpi secondari pectivi (vortex prima dell'uso) per 1,5 ore su un contatore e proteggendoli dalla luce.
- Aspirare la soluzione anticorpale secondaria e sciacquare gli esplosivi cochleari con una macchia DAPI (mettere su un agitatore per 1 min e poi aspirare).
- Applicare 60 μL di PBS agli esplosivi cocleari e posizionare il piatto di Petri su un agitatore per 5 min. Aspirare il PBS. Ripeti 3x.
- Usare le pinze per rimuovere le copertine con i campioni provenienti dalla piastra a 4 pozzetti, immergetele in un recipiente riempito di H 2 O distillato e asciugare le copertine verticalmente portandole a contatto con gli asciugamani.
- Posizionare una goccia di mezzo di montaggio antifade sullo scivolo del microscopio e invertire le copertine per immergere il tessuto rivolto verso il basso nel mezzo.
- Sigillare la copertura con un lucido chiodo che copre circonferenzialmente il bordo (senza schiacciare il campione sotto il vetro). Lasciare le diapositive che si trovano in una zona coperta lontano dalla luce per 15 - 20 minuti fino a quando non si asciugaLi metterli in una scatola o esaminare sotto il microscopio confocale.
NOTA: La colorazione fluorescente è meglio conservata conservando le diapositive a 4 o -20 ° C.
7. Confocal Imaging
- Ottieni una panoramica e immagini ingrandite per l'organo della regione Corti, comprese le neuriti e gli SGN.
NOTA: Impostazioni standard per il processo di imaging: formato di 1.024 x 1.024 pixel, velocità di 400 Hz, media frame di 3, 20% di intensità laser complessiva e di solito 20X e 63X con immersione in olio (potenzialmente combinata con zoom digitale 2X). Le impostazioni dei canali per il protocollo di colorazione DAPI, Myo7A e TuJ1 sono descritte in precedenza: 405 5% DAPI, "Smart Gain" 766,8V, "Smart Offset" 0,0% - 488 15% fluoresceina isotiocianato (FITC), Smart Gain 622,2V , "Smart Offset" 0,0% - 561 13% tetrametilrhomadina isotiocianato (TRITC), "Smart Gain" 562,4V, "Smart Offset" 0,0%. - Unire le immagini in una z-stack usando il tastoSoftware per ottenere una proiezione di asse z.
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Representative Results
Mentre molti protocolli si concentrano sull'organo di Corti explants, questa tecnica tenta di preservare l'anatomia dell'intero turno cochleare, inclusi gli SGN. Questo dà ai ricercatori l'opportunità di analizzare gli effetti di un dato trattamento sulle neuriti e sulla somata di SGN oltre all'organo di Corti. Effettuare una dissezione che conserva parte del modiolus, come descritto qui, è più tecnicamente impegnativo che esplodere l'organo di Corti da solo. Tuttavia, l'area neurita e SGN è importante, in quanto in questa regione sono stati osservati effetti patologici significativi dopo l'applicazione di secrezioni di schwannoma vestibolare ( Figura 1 ) e vescicole extracellulari in due pubblicazioni recenti usando la stessa metodologia 19 , 20 . Tali modifiche non potrebbero essere state rivelate usando l'organo isolato di Corti explants.
thLa quantificazione delle cellule danneggiate o GFP-espresse per le cellule dei capelli interne ed esterne, le cellule di supporto e le SGN possono essere eseguite con conteggio manuale o con un processo automatizzato, come quello incorporato nel plug-in ImageJ NeuronJ. Le aree rappresentative di questi conteggi possono essere stabilite dopo aver confermato la loro correlazione con i conteggi totali. Le ricostruzioni 3D sono particolarmente utili per escludere gli effetti sovrapposti nelle proiezioni degli assi z delle SGN. L'organizzazione delle fibre, il numero di SGNs per area determinata e la zona SGN soma possono essere valutate. La colorazione e il conteggio delle sinapsi, delle cellule e dei neuriti sono descritti in Figura 2 ; Lo stesso protocollo può essere utilizzato anche per i montanti interi cochleari ed è stato dimostrato di essere un modello affidabile per questi scopi 17 , 21 , 22 . Altri ricercatori hanno stabilito metodi alternativi eleganti che possono anche essere incorporati in paradigmi sperimentali 23 </ Sup> , 24 .
La lunghezza massima della coltura è di solito limitata dall'inizio della migrazione cellulare e dipende dalla concentrazione di FBS nel mezzo di coltura. Quando la percentuale di FBS è stata ridotta dal 5% al 3% o 1%, il periodo di mantenimento di un esplosivo cocleare intatto anatomicamente è stato esteso a circa una settimana ( Figura 3 ).
La Figura 4 mostra le cellule di esplorazione cocleare GFP positive dopo la trasduzione con il virus antigenico associato adeno-associato Anc80 per 48 h 25 . In questa prospettiva possono essere quantificate le cellule di capelli interne, le cellule dei capelli esterne e le cellule di supporto, mentre una ricostruzione 3D può contribuire a quantificare le cellule GFP positive nell'area SGN. Si possono confrontare diversi tipi di sierotipi virali in termini di efficienza di trasduzione in certe ceLl tipo utilizzando la metodologia descritta 18 .
Figura 1: Immagini rappresentative di microscopi confocali di esploratori cochleari dalle regioni apicali e basali dopo l'incubazione con secretioni da grandi nervi auricolari o schwannomi vestibolari per 48 h . ( A ) Panoramica immagine di un esplante. Il rettangolo contrassegna l'area nelle immagini ravvicinate. Barra di scala = 200 μm. ( B - E ) Vista ingrandita delle cellule dei capelli e delle neurite. Barra di scala = 50 μm. Verde = Myosin 7A (Myo7A), macchia di cellule dei capelli; Rosso = beta-tubulina di classe III (Tuj1), macchie neuronali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagine microscopica confocale della regione delle cellule capelli coarsili. ( A ) Le sinapsi intatte possono essere valutate mediante etichettatura di proteine presinaptiche (proteina legante C-terminale, rossa) e postsinaptica (densità postinaptica-95, verde) insieme alla colorazione delle strutture neuronali (neurofilamento, azzurro). OHC, cellule capelli esterne; IHC, cellule dei capelli interni. Barra di scala = 10 μm. ( B ) Focus sulla regione interna delle cellule dei capelli con il conteggio delle cellule di capelli interne (frecce rosse) e dei neuriti (frecce blu). A causa della ramificazione delle strutture neuronali, è importante standardizzare la distanza dalle cellule dei capelli interne durante il conteggio (evidenziata con il telaio bianco, direttamente collegato alle sinapsi). Barra di scala = 5 μm. ( C ) Close-up di sinapsi separati (2 coppie pre- e post-sinaptiche contrassegnate da frecce bianche). Barra di scala = 1 & # 181; m. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini rappresentative di microscopi confocali di esploratori cocleari apici e basali dopo 7 d in cultura con il 3% o l'1% di FBS. ( A e B ) Le cellule incubate nel 3% di FBS iniziano a migrare tra 4 e 5 giorni (frecce grigio chiaro per le cellule dei capelli, frecce rosse per neuriti), ( C e D ). Esploranti nell'1% FBS mantengono l'integrità organizzativa fino al giorno 7. Grigio chiaro: Myosin 7A (Myo7A), macchia tutte le cellule dei capelli; Rosso: beta-tubulina di classe III (Tuj1), macchie neuronali. OHC, cellule capelli esterne; IHC, cellule dei capelli interni. Barra di scala = 100 μm, applicata a tutti i pannelli.Iles / ftp_upload / 55704 / 55704fig3large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagine microscopica confocale di un esplosivo cochleare dopo l'esposizione al virus sintetico Adeno associato Ancandro virus per 48 h. Le cellule trasdurate esprimono GFP (verde). Myosin 7A (Myo7A, blu) macchia le cellule dei capelli esterni (OHC) e le cellule dei capelli interni (IHC); La beta-tubulina di classe III (Tuj1, rosso) macchia le strutture neuronali. Supporto: area di cellule Sox2-positive; SGN, neuroni gangliali a spirale. Barra di scala: 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I ricercatori devono perfezionare la tecnica di dissezione prima di effettuare esperimenti che implicano esplosioni cochleari. Le cellule dei capelli sono comunemente danneggiate durante le dissezione eseguite presto nella curva di apprendimento e un momento particolarmente problematico per la loro integrità è la rimozione della membrana tectoria, che richiede mani costanti, strumenti e esperienze adeguate. Per risparmiare tempo e risorse, è necessario eseguire un controllo visivo sotto il microscopio di dissezione e si dovrebbero notare aree potenzialmente danneggiate. Invece di utilizzare costose anticorpi primari e secondari, i reagenti più economici come il phalloidin sono più appropriati per esperimenti preliminari. Spiegazioni leggermente danneggiate possono ancora essere utilizzate come controlli in alcuni esperimenti (analisi di sezioni che non sono state interessate) o per la sperimentazione di nuove combinazioni di anticorpi.
Il trasferimento degli esemplari è particolarmente importante, perché si deve garantire che i pezziNon sono orientate verso l'alto (le cellule dei capelli "galleggianti" senza la guida della copertura rivestita spesso degenerano). Una posizione centrale sul coperchio facilita tutte le ulteriori operazioni di pipettamento.
Per esperimenti di controllo negativo che coinvolgono nuovi composti (che ovviamente devono essere solubili nel terreno di coltura), è importante applicare il veicolo appropriato agli esplanti e non concentrarsi esclusivamente su esplanti non trattati. Ad esempio, se un farmaco commerciale include il citrato di sodio oltre al principio attivo, allora il citrato di sodio dovrebbe essere aggiunto alle esplosioni cochleari del controllo negativo perché il citrato di sodio potrebbe avere un effetto.
Le limitazioni all'uso di esplosioni cochleari includono il fatto che queste culture organotipiche sono tipicamente derivate da giovani cuccioli che sono ancora in fase di cambiamento di sviluppo postnatale e che esiste una mancanza di gradiente ionico attraverso l'esplante, che è essenziale per la normaleUdito in vivo . Tuttavia, l'utilità del protocollo è compiutamente dimostrata in una recente pubblicazione riguardante AAVs 18 . Mentre questo gruppo di vettori è limitato a circa 4,7 kb di capacità di confezionamento, è diventato una risorsa importante per la terapia di più sindromi umane 26 . Utilizzando il modello di esplorazione cochleare, la pubblicazione di cui sopra ha dimostrato che il virus Anc80 ha superato i serotipi tradizionali AAV nella trasduzione di una varietà di cellule coclee, comprese le cellule di capelli e SGNs. Questi risultati in vitro sono stati successivamente confermati scegliendo i candidati più promettenti per l'iniezione attraverso la finestra rotonda nei cuccioli di topo in vivo . Il modello ex vivo fornisce un modo per ricapitolare con successo l'anatomia della coclea, riducendo il tempo e le risorse necessarie per condurre il lavoro in vivo 27 .
Un altro vantaggio dell'ex vIl modello ivo è il suo potenziale per l'applicazione allo studio di meccanismi cellulari specifici che contribuiscono a SNHL. Applicando composti trovati nel microambiente tumorale ( es. Secrezioni tumorali umane) ad un esplante, l'effetto di questi composti sulla cochlea può essere direttamente visualizzato e valutato l'efficacia o la tossicità delle potenziali terapie farmacologiche. Questo è importante perché la cochlea umana non può essere biopsied e le cellule all'interno di esso non possono essere visualizzate in vivo . Ad esempio, una recente pubblicazione ha esaminato il potenziale ototossico delle proteine secretuite da schwannomi vestibolari, che sono tumori intracranici che provengono dai nervi vestibolari e causano la perdita dell'udito nel 95% dei pazienti. Applicare le secrezioni tumorali umane a esplosioni cochleari, confrontate con le secrezioni dai nervi umani controllati in salute, hanno confermato gli effetti tossici di queste secrezioni sulla cochlea 19 . Lo stesso esperimento sarebbe difficile da replicare in un in vivoModello dovuto alla risposta immunogenica contro le proteine umane che sorgerebbero in un topo immunocompetente.
In sintesi, questo manoscritto presenta una tecnica che consente lo studio simultaneo delle cellule dei capelli cochleari, delle sinapsi, dei neuriti e dei neuroni in un modello ex vivo . Questo modello può contribuire a fornire un'informazione sui meccanismi di azione delle molecole nuove alla cochlea 28 , compresi fattori nelle secrezioni umane 19 e 20 , potenzialmente accelerando lo screening dei composti terapeutici candidati 18 prima della loro sperimentazione in vivo .
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto Nazionale di Sordità e altri Disturbi della Comunicazione con sovvenzioni R01DC015824 (KMS) e T32DC00038 (supporto SD), il Dipartimento della Difesa concede la W81XWH-15-1-0472 (KMS), la Fondazione Bertarelli (KMS) La Fondazione di Nancy Sayles Day (KMS) e il Centro di ricerca di tinnito di Lauer (KMS). Ringraziamo Jessica E. Sagers, BA per commenti insightful sul manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin, Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | |
| anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
| anti-Myo7A antibody, rabbit | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| anti-NF-H antibody, chicken | EMD Millipore | AB5539 | |
| anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) | Antibodies Inc. | 75-028 | |
| anti-TuJ1 antibody, mouse | BioLegend | 801202 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg | Corning | 354241 | |
| CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner rings | Greiner Bio-One | 627170 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Clear Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50 x 7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
| Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mm | Ted Pella Inc. | 260368 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Distilled water, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 Forceps (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer |
| goat anti-chicken-647 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
| goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
| goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
| goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| goat anti-rabbit-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
| H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Instrument Tray with Lid Stainless Steel | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
| Micro (dissecting) knife – angled 30° | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 | VWR | 16004-382 | |
| N-2 Supplement (100X), 5 mL | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| NaOH, sodium hydroxide solution, 1 L | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Normal Horse Serum (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
| Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
| Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Phalloidin, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Prep Pad, Non Sterile | Medline | 05136CS | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Scalpel Blades - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| TCS SP5 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton-X (non-ionic surfactant) | Integra | T756.30.30 | |
| VectaShield antifade mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6'' - 2 mm thick | Zipline | 0609132541599 |
References
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