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Medicine

신생아 쥐의 달팽이관 Explant 기법으로 doi: 10.3791/55704 Published: June 8, 2017

Summary

이 프로토콜의 목표는 신생아 생쥐 달팽이 explants의 준비, 문화, 치료 및 immunostaining를 입증하는 것입니다. 이 기술은 청각 연구 에서 체외 선별 도구로 활용 될 수 있습니다.

Abstract

지난 수십 년 동안 청력 연구가 눈에 띄게 발전했지만, 내이의 민감한 mechanosensory 구조를 손상 시키거나 손상시키는 감각 신경성 청력 손실 (SNHL)에 대한 치료법은 아직 없습니다. 정교한 in vitroex vivo 분석법이 최근 수년간 출현하여 SNHL 치료법 개발을위한 자원을 최소화하고 치료 노력을 가속화하면서 잠재적으로 치료 화합물의 증가를 시험 할 수있게되었습니다. 특정 세포 유형의 균질 배양이 현재의 연구에서 중요한 역할을 계속하고 있지만, 많은 과학자들은 이제 달팽이 외식 편으로 알려진보다 복잡한 기관 내 배양에 의존합니다. 내이에서 조직화 된 세포 구조를 보존하면 내외부 유모 세포, 나선형 신경절 뉴런, 신경 세포를 포함한 달팽이관 인프라의 다양한 구성 요소를 현장에서 평가할 수 있습니다.ites 및 지원 세포. 여기에서는 신생아 생쥐 달팽이 explants의 준비, 문화, 치료 및 immunostaining을 제시합니다. 이러한 explants의주의 깊은 준비는 SNHL에 기여하는 메커니즘의 식별을 용이하게하고 청각 연구 커뮤니티를위한 중요한 도구를 구성합니다.

Introduction

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Sensorineural Hearing Loss (SNHL)은 내이 또는 오름차순 청각 경로의 손상을 나타냅니다. 청력 상실은 인간 1 에서 가장 흔한 감각 결손이지만 치유 요법은 아직 존재하지 않습니다 2 . 인공 와우 또는 청각의 뇌간 이식 물이 심한 SNHL 환자의 청력을 어느 정도 회복시킬 수는 있지만, 이러한 장치가 제공하는 청력은 특히 자연스러운 청력과는 매우 다르며 특히 소음의 말을 이해하거나 음악을 듣는 동안 매우 다릅니다.

유모 세포 변성은 오랫동안 외상성 청각 사건 ( 예 : 시끄러운 소음에 노출)의 주요 결과로 간주되어 왔지만, 유모 세포에서 청각 신경으로 정보를 전송하는 시냅스가 적어도 음향 외상에 취약한 증거가 증가하고 있습니다 3 , 4 , 5 > , 6 . 청각 기능 평가를위한 현재의 금 표준 인 인간의 청력 역치는 내이의 특정 세포 손상을 예측하지 않기 때문에 가능한 한 빨리 세포 변성을 감지하고 적절한 치료를 시작하기 위해보다 정교한 도구가 필요합니다.

청력 상실에 대한 유망한 약제 처리법 은 시험 관내 에서 균질 세포 배양 물 에서 종종 시험되지만, 그러한 시스템은 달팽이 미세 환경을 정확하게 모델링하지 않습니다. Cochlear 세포는 Corti 10 , 11 또는 Spiral Ganglion Neurons (SGNs) 12 의 기관을 분리하여 또는 배양 할 때 손실되는 중요한 생체 내 과정 인 달팽이관 8,9 에서 다른 세포 유형에 영향을주는 영양 요소를 분비하는 것으로 알려져 있습니다 분자 마커를 분석그러나 "정밀 의학"을 추구하기 위해 생체 외 데이터를 검증하여 청력 상실에 대한 새로운 개인 맞춤 치료법을 확립하는 데 필요한 생체 내 연구는 상당한 자원과 시간을 필요로합니다. 이는 특히 고려할 때 적합합니다 청력 검사와 이어지는 인공 와우의 절개를 통해 중이 중이거나 둥근 창 막 주입을 완벽하게 수행하고 수행하는 데 얼마나 많은 노력이 필요한가 인공 와우로 알려진 체외의 체외 배양에서 유망한 화합물을 효율적으로 스크리닝하는 것은 경제적이며 신뢰할 수있는 대안을 제공합니다 14 , 15 , 16 , 17 .

이 기사에서는 치료 된 달팽이 외식편을 생성, 유지 및 평가하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 모델의 특정 응용 프로그램은 심사에서의 사용을 포함하여 강조됩니다.유전자 치료를위한 바이러스 성 벡터의 비교 평가를 포함한다. ex vivo explant approach는 연구자들이 주어진 세포 치료법 다른 세포 집단 미치는 영향을 그 자리 에서 가시화 할 수있게하여 세포 유형별 메커니즘의 확인과 그 이후의 목표 화 된 치료법의 정제를 용이하게한다.

전반적으로,이 기술은 달팽이관 에서 공존하는 매우 다른 세포 유형 사이의 중요한 혼선을 보존하면서 생체 내 에서 달팽이관을 연구 할 수있는 모델을 제공합니다.

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Protocol

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연구 프로토콜은 매사추세츠의 눈과 귀의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. 실험은 세계 의학 협회의 윤리 강령에 따라 수행되었습니다.

1. 절개 준비

  1. 외과 테이블 준비하기
    1. 수술 테이블을 소독하기 위해 70 % 에탄올을 사용하십시오.
    2. 현미경 옆에 두 개의 nonsterile prep pad를 놓습니다.
    3. 가열 살균 된 작동 가위, 메스칼 핸들, 마이크로 나이프 및 포셉 (# 4 및 # 55 각각 2 개)을 포함하여 도구 트레이를 준비합니다. 악기 쟁반과 50mm의 깨끗한 벽으로 된 유리 바닥의 페트리 접시를 비 살균 패드 위에 놓습니다.
    4. 살균 된 # 15 메스 블레이드를 얻습니다. 밀봉 가능한 비닐 봉지 또는 용기 (기관 지침에 따라 도체를 처리하는 것); 양동이에 얼음; 및 감기, 무균 행크스 균형 소금 솔루션 (HBSS). 이 항목을다른 비 스테로이드 패드.
    5. 50 ML 플라스틱 실험실 튜브에 HBSS를 전송하고 얼음에 넣어.
  2. 문화 준비
    1. 모든 물질을 층류 후드에서 준비하십시오. 4 개의 시편마다 35mm 4-well petri dish의 4 개의 인레이에 4 개의 오토 클레이브 된 10mm 둥근 유리 커버 슬립을 놓습니다.
    2. 매 4 개의 시편에 대해 microcentrifuge tube에 다음과 같이 구성된 300 μL의 총 부피를 섞으십시오 : 조직 접착제 10 μL, NaHCO 3 285 μL 및 NaOH 5 μL.
    3. 모든 커버 슬립에 결과 용액 45 μL를 넣고 RT에서 최소 20 분 동안 그대로 두십시오. 이 솔루션은 몇 시간 동안 coverslip에 남아있을 수 있지만 O / N을 남길 수 없습니다.
    4. 오염에 대한 두 가지 장벽을 만들기 위해 하나 또는 두 개의 35mm 4 잘 배양 접시 (10) 페트리 접시 안에 놓습니다.
    5. 98 % Dulbecco 수정 된 이글의 배지 (DMEM), 1 % N-2 및 1 % 암피실린 ((마이크로) 원심 분리 튜브 내 웰 당 65μL)로 처리 하였다. 사용하기 전에 용액을 25 ° C로 예열하십시오.

2. 마우스 달팽이관 Explant의 해부

  1. 신생아 마우스의 목을 베다.
    1. 60mm 플라스틱 페트리 접시를 얻고 뚜껑에 70 % 에탄올을 뿌려 표면이 젖도록하십시오.
    2. 차가운 HBSS를 플라스틱 실험실 튜브에서 60mm 플라스틱의 바닥 부분과 50mm 벽으로 덮인 유리 바닥 페트리 접시에 붓는다. 절개하지 않을 때마다 조직을 차가운 상태로 유지하기 위해 플라스틱 실험실 튜브와 두 페트리 접시를 얼음에 보관하십시오.
    3. P3 - P5 세 신생아 마우스를 라텍스 장갑의 절단 손가락에 얼음 위에 놓고 저체온증이 의식 상실을 유발할 때까지 기다립니다 (약 1-3 분).
    4. 작동 가위로 마우스를 신속하게 처치하고 몸체를 밀봉 가능한 플라스틱 백에 폐기하십시오. 절단 된 신생아 머리를60mm 플라스틱 페트리 접시의 뚜껑에 70 % 에탄올.
  2. 측두골의 거시적 절제술
    1. 메스 블레이드를 사용하여 전방에서 후방 끝으로 (표면 봉합 바로 위에) 표면 절단을하여 두개골의 피부를 제거합니다.
    2. 외이도를 메스 칼로 모두 자르고 피부를 앞쪽으로 접어서 전체 두개골을 드러내십시오.
      참고 : 해부 현미경은 일반적으로이 단계에 필요하지 않지만 시각화를 개선하는 데 사용할 수 있습니다.
    3. # 15 메스 블레이드를 사용하여 화살 봉합을 따라 두개골을 엽니 다. 달팽이관의 압축을 피하기 위해 칼날을 앞뒤로 부드럽게 움직여서 두개골을 자르십시오.
      참고 : 두개골은이 나이에 골화되어서는 안되며 쉽게 절단해야합니다.
    4. # 15 메스를 사용하여 궤도 바로 뒤쪽에서 수직으로 절단하여 주둥이를 제거하고 버립니다.잎.
      참고 : 두개골의 후부에는 여전히 뇌와 달팽이가 있어야합니다.
    5. # 4 포셉으로 무딘 절개를 통해 forebrain, 소뇌, 그리고 brainstem의 처분.
  3. 달팽이관의 현미경 적 추출
    1. 범위 아래에 집게를 놓고 조명과 초점을 최적화하여 현미경 (배율 6.5X) 및 광원을 조정합니다.
    2. 차가운 HBSS로 가득 찬 60mm 플라스틱 페트리 접시에 두개골의 두 반쪽을 놓습니다.
    3. 주위의 stapedial artery (측두골 내의 구불 구불 한 동맥)에 인접한 것으로 확인되는 달팽이관 / e를 완전히 노출시키고 # 4 포셉을 사용하여 뼈를 일시적으로 뼈에서 분리합니다.
    4. 달팽이관을 50mm의 유리 벽으로 덮인 유리 바닥 페트리 접시에 옮기고 접시를 현미경에 놓습니다.
    5. 얼음에 두개의 다른 절반과 60mm 플라스틱 페트리 접시를 놓습니다. vestibular 시스템에서 달팽이관을 제거하고 조심스럽게 # 4 포 셉와 달팽이관 (이 연령대의 연골) 캡슐을 해부. 모든 추가 단계에 # 55 포셉을 사용하십시오.
  4. 조직 처리의 최종 단계
    1. 조심스럽게 코티의 장기에 부착 된 나선형 인대와 마이크로 나이프 또는 2 개의 집게를 사용하여 modiolus를 분리하여 내이 조직을 가공합니다.
      1. 나선형 인대와 유모 세포 영역 사이의 틈새에있는 더 어둡고 반투명 한 부분을 잘라내어 가장 기초적인 부분을 잡고 부드럽게 풀어서 나선형 인대를 제거합니다.
    2. 표본을 배치하여 달팽이관의 길이 방향, 시상면을 얻은 다음 마이크로 나이프를 사용하여 달팽이관을 2 개에서 3 개 섹션으로 잘라 내고이 섹션을 꼭지점, (중간,) 및 basal turns. 페트리 접시에 수평으로 놓일 수있는 달팽이 explant 조각을 달성하기 위해 유모 세포와 신경 돌의 실제 레이어로 상사와 하체를 제거합니다.
      참고 : 배양 접시에 안정적으로 접착하기에 적합한 크기는 달팽이관 회선의 약 절반입니다.
    3. tortial 멤브레인, 코르티의 기관에 즉시 우수한 매우 얇은 반투명 레이어 제거, 부드럽게 포 셉와 멀리 벗겨.
    4. Reissner의 멤브레인을 SGN 바로 위에 놓고 양쪽에 집게를 씌우고 벗겨냅니다.
      참고 : 옆으로 위치한 손상된 헤어 셀 영역을 마이크로 나이프로 잘라서 제거하십시오.

3. 표본의 문화 플레이트로의 이전

  1. 네 커버 슬립에서 조직 접착제 솔루션 45 μL를 제거합니다. 멸균 H 2 O 50 μL로 각 커버 슬립을 씻으십시오. 물을 기음.
  2. 1 ML 피펫을 들어. 표본이 팁 내부에 달라 붙지 않도록 DMEM 약 120 μL로 피펫 팁을 적셔주십시오.
  3. 1 ML 피펫을 사용하여 개별적으로 표본을 전송하십시오. HBSS로 채워진 작고 투명한 벽이있는 유리 바닥 페트리 접시에서 최대 70 μL를 피펫으로 추출한 다음 4 웰 배양 접시에있는 4 개의 인레이 (커버 슬립으로 준비) 중 하나에 시편을 액체와 함께 놓으십시오 .
  4. 현미경 (배율 50 배)에서 시편의 방향이 올바른지 확인하십시오. tectorial 막이 제거 된 유모 세포의 영역이 위쪽을 향하고 있는지 확인하십시오. modilarus의 기본 부분과 함께 basilar 막이 아래쪽을 향하게하고 coverslip에 붙어 있는지 확인하십시오.
    1. 시험편을 거꾸로 뒤집어 놓은 경우 피펫 팁에 남아있는 HBSS를 인레이에 넣고 올바른 방향이 될 때까지 조각의 위치를 ​​변경합니다.
      아니TE : 이것은 퇴화로 이어질 수있는 coverslip에서 구조적 지원없이 유모 세포가 문화 매체에 떠 다니는 것을 방지합니다.
  5. 1 ML 피펫을 사용하여 초과 HBSS를 대기음. 15 초를 기다리십시오.
  6. 준비된 따뜻한 문화 매체 (98 % DMEM, 1 % N - 2, 1 % 암피실린) 60 μL를 표본에 직접 피펫. 피펫으로 시료를 만지지 않도록주의하십시오. 내부 및 외부 페트리 접시 커버를 교체하고 37 ° C에서 O / N 품어.
  7. 스톡 용액을 모두 적당한 곳에 다시 채우고 시체와 잔여 폐기물을 처분하고 기관 지침 ( 예 : 에탄올이나 차아 염소산염을 사용)에 따라 수술 테이블을 오염 제거하고기구를 세척하고 고압으로 멸균 한 다음 적절한 용기에 날카로운 물건을 버리십시오 .

4. 최종 배양 배지 및 관심 대상 물질 추가

참고 : Cochlear explants는 10-16 시간 후에 사용할 준비가됩니다.

  1. 믹스 룸 준비하기97 % DMEM, 1 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % N-2 및 1 % 암피실린 (마이크로 원심 분리 관에서 1 웰 당 65μL; 사용 전에 25 ℃로 가열).
  2. 해당 치료 그룹의 솔루션에 관심있는 다른 물질을 추가하십시오. 형광 물질이 첨가 된 경우 ( 예 : 녹색 형광 단백질 (GFP) 발현 바이러스, 최근 발표에서는 50 μL에서 48 시간 동안 10 10 GC의 Adeno-Associated Virus (AAV) 농도가 사용됨) 18 , 빛.
  3. 인큐베이터에서 달팽이 explant 포함 petri 접시를 전송하고 층류 후드 아래에 놓으십시오.
  4. 인레이에서 피펫으로 오래된 문화 매체 (FBS 제외)를 대기음.
  5. 준비된 따뜻한 문화 (치료) 매체 (97 % DMEM, 1 % FBS, 1 % N - 2, 1 % 암피실린 및 관심 물질)의 잘 당 60 μL를 추가합니다.
  6. 인큐베이터 (37 ° C)에 페트리 접시를 다시 놓습니다.
  7. 보기 r악성 종양, 세포 이동 또는 달팽이 해부 체의 박리를 확인하고 최대 7 일 후에 염색을 수행하기 위해 현미경하에 egularly 수행합니다.

5. 면역 형광법 - 1 일째

  1. 차단 용액 (94 % 인산 완충 식염수 (PBS), 5 % 정상 염소 또는 말 혈청 (2 차 항체에 따라 NGS / NHS), 1 % 비이 온성 계면 활성제 ( 표 2 참조) 항체 용액 (98.6 % PBS, 1 % NHS 및 각각의 항체와 함께 0.4 % 비이 온성 계면 활성제)를 첨가 하였다.
    참고 : 항체에는 1 : 400+ (myosin 7A, 내외부 유모 세포 용) 및 mouse anti-TuJ1 1 : 200+ (SGNs 용 β-tubulin) 또는 마우스 (IgG1) 항생제의 농도에서 토끼 항 -Myo7A (postsynapse density), postsynapse의 경우 postsynaptic density) 및 닭 항 -NF-H1 : 1000+ (neurofilament, anti-NF-H1 : SGN 및 신경 섬유의 경우). "+"means "이상이어야합니다.
  2. 피펫을 사용하여 문화 매체를 대기음. 시험편을 만지지 않도록주의하십시오.
  3. 층류 후드 아래, 멸균 PBS로 달팽이 explants 두 번 씻어 각 세탁 후 5 분 동안 표본을 쉐이커에 배치.
  4. 쉐이커 (후드 아래)에서 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA -주의)에 조직을 고정시킵니다. PFA를 흡인하십시오.
  5. 달팽이 explants에 PBS 60 μL를 적용하고 5 분 동안 쉐이커에 배양 접시를 놓습니다. PBS를 대기음. 3 배 반복.
  6. 인공 호흡기를 준비된 차단 용액 (94 % PBS, 5 % NHS 및 1 % 비이 온성 계면 활성제)에 쉐이커에서 30 분간 놓습니다.
  7. RT에서 카운터에 각각의 기본 항체 (사용하기 전에 소용돌이) O / N와 준비 주식 항체 솔루션 (98.6 % PBS, 1 % NHS 및 0.4 % 비 이온 계면 활성제)에 달팽이 explants를 놓으십시오.
    참고 : 젖은 종이 타월로 플라스틱 포장 (또는 추가 된 solut 경우 알루미늄 호일)로 묶인 페트리 접시를 포장하십시오이온은 GFP 발현 바이러스와 같은 형광 물질을 포함하고 있습니다)을 사용하여 접시를 습기있게 유지하고 항체 용액 O / N의 증발을 방지합니다.

6. 면역 형광법 - 2 일차

  1. 4 ', 6 - diamidino - 2 - phenylindole (DAPI) 얼룩 (300 nm)을 준비하고 단계 5.1에서 기본 항체에 보완 올바른 올바른 보조 항체 혼합물을 얻기 위해 재고 항체 솔루션을 사용합니다. ( 예 : 염소 항 토끼 488 1 : 200+ 및 염소 항 마우스 568 1 : 200+ 또는 염소 항 마우스 (IgG1) 568 1 : 1000+, 염소 항 마우스 (IgG2a) 488 1 : 500+, 및 염소 항 - 치킨 647 1 : 200+ 또는 Phalloidin 568 1 : 200+ (내외부 유모 세포 용)).
  2. 일차 항체 용액을 대기음.
  3. 달팽이 explants에 PBS 60 μL를 적용하고 5 분 동안 쉐이커에 배양 접시를 놓습니다. PBS를 대기음. 3 배 반복.
  4. 인공 호흡기를 준비된 항체 용액 (98.6 % PBS, 1 % NHS 및 0.4 % 비이 온성 계면 활성제)에 놓고카운터에 1.5 시간 동안 이차 항체 (사용 전 와류)를 가하고 빛으로부터 보호하십시오.
  5. 2 차 항체 용액을 흡인하고 DAPI 얼룩 (1 분간 진탕 기 위에 놓은 후 흡인)로 달팽이 외식 편을 씻어냅니다.
  6. 달팽이 explants에 PBS 60 μL를 적용하고 5 분 동안 쉐이커에 배양 접시를 놓습니다. PBS를 대기음. 3 배 반복.
  7. 포 셉을 사용하여 4 - 웰 플레이트에서 표본과 coverslips를 제거하고, 증류수 H 2 O로 가득한받는 사람에 그들을 찍어, 그리고 종이 수건과 접촉하여 coverslips을 수직으로 가져 와서 건조.
  8. 현미경 슬라이드에 삽입 방지 매체 한 방울을 놓고 커버 슬립을 거꾸로 뒤집어서 매체에 묻힌 조직을 담그십시오.
  9. 유리 아래에 시편을 분쇄하지 않고 가장자리를 원주 방향으로 덮는 깨끗한 손톱 광택을 사용하여 coverslip을 봉인합니다. 슬라이드를 15 ~ 20 분 동안 빛이 닿지 않는 곳에 덮고 평평하게 놓고 건조한 상태로 놓습니다.상자에 넣거나 공 촛점 현미경으로 검사하십시오.
    참고 : 형광 염색은 슬라이드를 4 ° C 또는 -20 ° C에 보관하여 보존하는 것이 가장 좋습니다.

7. 공 촛점 이미징

  1. 신경 돌기와 SGN을 포함하여 Corti 지역의 기관에 대한 개요와 확대 된 그림을 얻습니다.
    참고 : 이미징 프로세스의 표준 설정 : 1,024 x 1,024 픽셀, 400 Hz의 속도, 프레임 평균 3, 전체 레이저 강도 20 %, 오일 침지 (일반적으로 2 배 디지털 줌과 결합 된) 20X 및 63X 렌즈의 형식. DAPI, Myo7A 및 TuJ1 염색 프로토콜에 대한 채널 설정은 위에 요약되어 있습니다. 405 5 % DAPI, "Smart Gain"766.8V, "Smart Offset"0.0 % - 488 15 % FITC (fluorescein isothiocyanate), "Smart Gain"622.2V , "스마트 오프셋"0.0 % - 561 13 % 테트라 메틸로 마틴 이소 티오 시아 네이트 (TRITC), "스마트 게인"562.4V, "스마트 오프셋"0.0 %.
  2. 이미지를 z 스택에 병합하려면소프트웨어를 사용하여 z 축 투영을 얻습니다.

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Representative Results

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많은 프로토콜이 Corti 체외 이식편의 기관에 초점을 맞추고 있지만이 기술은 SGNs를 포함하여 전체 달팽이관의 해부학 구조를 보존하려고 시도합니다. 이것은 연구자들에게 Corti 기관뿐만 아니라 SGNs의 신경 돌기 및 somata에 대한 주어진 치료의 효과를 분석 할 수있는 기회를 제공합니다. 여기에 설명 된 것처럼 모 틸리 움의 일부를 보존하는 절개를 수행하는 것은 Corti만의 기관을 외과 적으로 외과하는 것보다 기술적으로 어렵습니다. 그러나 같은 방법론 19 , 20을 사용하여 2 개의 최근 논문에서 전정 신경초종 분비물 ( 그림 1 )과 세포 외 소포를 적용한 후이 부위에서 유의 한 병리학 적 효과가 관찰 되었기 때문에 신경 돌기와 SGN 영역이 중요합니다. 이러한 변화는 Corti explants의 격리 된 기관을 사용하여 밝혀 낼 수 없었습니다.

Th내부 세포와 외부 유모 세포,지지 세포 및 SGN에 대한 손상된 세포 또는 GFP 발현 세포의 정량은 수작업으로하거나 ImageJ Plugin NeuronJ에 내장 된 자동화 공정으로 수행 할 수 있습니다. 이 카운트의 대표 영역은 총 카운트와의 상관 관계를 확인한 후에 설정할 수 있습니다. 3D 재구성은 특히 SGN의 z 축 투영에서 오버레이 효과를 제외하는 데 유용합니다. 광섬유 구성, 주어진 영역 당 SGN 수 및 SGN 소마 영역을 평가할 수 있습니다. 시냅스, 유모 세포 및 신경 돌기의 염색 및 계수는 그림 2나와 있습니다 . 동일한 프로토콜이 달팽이 전체 마운트에도 사용될 수 있으며 이러한 목적을 위해 신뢰할 수있는 모델 인 것으로 나타났습니다 17 , 21 , 22 . 다른 연구자들은 또한 실험적 패러다임에 통합 될 수있는 우아한 대체 방법을 확립했습니다 23 </ sup> , 24 .

배양의 최대 길이는 보통 세포 이동의 시작에 의해 제한되며 배양 배지에서 FBS의 농도에 의존한다. FBS의 비율이 5 %에서 3 % 또는 1 %로 감소되었을 때, 해부학 적으로 손상이없는 인공 수정란을 유지하는 기간은 약 1 주까지 연장되었습니다 ( 그림 3 ).

도 4 는 48 시간 동안 합성 아데노 - 관련 바이러스 벡터 Anc80로 형질 도입 한 후의 GFP 양성 달팽이 체 외식 세포를 나타낸다. 3D 셀 재구성은 SGN 영역에서 GFP 양성 세포를 정량화하는 데 도움이되는 반면, 내부 유모 세포, 외부 유모 세포 및지지 세포를이보기에서 정량화 할 수 있습니다. 다른 바이러스 성 혈청 형은 특정 ce에서의 형질 도입 효율면에서 비교 될 수있다설명 된 방법론을 사용하여 유형을 지정합니다.

그림 1
그림 1 : 48 시간 동안 중대한 청각 신경 또는 전정 신경총에서 분비물과 부화 후 Apical과 Basal 지역의 달팽이관 explants의 대표 공 촛점 현미경 이미지 . explant의 ( A ) 개요 이미지. 사각형은 클로즈업 이미지의 영역을 표시합니다. 스케일 바 = 200 μm. 유모 세포와 신경 돌기의 확대 된 뷰 ( B - E ). 스케일 바 = 50 μm. 녹색 = Myosin 7A (Myo7A), 유모 세포; 빨간색 = 클래스 III 베타 - 튜 불린 (Tuj1), 연결 구조를 얼룩. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : Cochlear Explant Hair Cell Region의 공 촛점 현미경 이미지. ( A ) 손상되지 않은 시냅스는 presynaptic (C - 터미널 바인딩 단백질, 빨강) 및 postsynaptic (postsynaptic 밀도 - 95, 녹색) 단백질을 연결 구조 (neurofilament, 파란색)의 얼룩과 함께 표시하여 평가하실 수 있습니다. OHC, 바깥 털 세포; IHC, 내면의 유모 세포. 눈금 막대 = 10 μm. ( B ) 안쪽 유모 세포 (빨간 화살촉)와 신경 돌 (파란색 화살촉)의 개수로 내부 유모 세포 지역에 집중하십시오. 연결 구조의 분지로 인해, 계산하는 동안 내부의 유모 세포로부터 거리를 표준화하는 것이 중요합니다 (시냅스에 직접 연결된 흰색 프레임으로 강조 표시). 스케일 바 = 5 μm. ( C ) 별도의 시냅스 클로즈업 (흰색 화살촉으로 표시된 2 개의 사전 및 시냅스 후 쌍). 스케일 바 = 1 & # 181; 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 3 % 또는 1 % FBS 배양 7 d 후 Apical과 Basal Cochlear Explants의 대표 공 초점 현미경 이미지. ( AB ) 3 % FBS에서 배양 한 세포는 4 일에서 5 일 사이에 마이 그 레이션을 시작합니다 (유모 세포는 밝은 회색 화살표, 신경 돌은 빨간색 화살표). 1 % FBS에서 Explants는 7 일째까지 조직의 무결성을 유지합니다. 밝은 회색 : Myosin 7A (Myo7A)는 모든 유모 세포를 얼룩지게합니다. 적색 : III 종 베타 - 튜 불린 (Tuj1)은 신경 조직을 얼룩지게합니다. OHC, 바깥 털 세포; IHC, 내면의 유모 세포. 스케일 바 = 100 μm, 모든 패널에 적용.iles / ftp_upload / 55704 / 55704fig3large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 48 시간 동안 합성 Adeno 관련 바이러스 벡터 Anc80에 노출 된 후의 달팽이관 Explant의 공 촛점 현미경 이미지. 형질 도입 된 세포는 GFP (녹색)를 발현한다. Myosin 7A (Myo7A, blue)는 외부 털 세포 (OHC)와 내부 털 세포 (IHC)를 얼룩지게합니다. 클래스 III 베타 - 튜 불린 (Tuj1, 적색)은 신경 조직을 얼룩지게한다. Supp .: Sox2 양성지지 세포의 면적; SGN, 나선형 신경절 뉴런 스케일 바 : 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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연구원은 달팽이관 외식에 관련된 실험을하기 전에 해부 기술을 완벽하게해야합니다. 유모 세포는 일반적으로 학습 곡선에서 초기에 수행되는 해부 중에 손상되며, 완전 무결 한 특히 문제가되는 순간은 안정적인 손, 적절한 도구 및 경험이 필요한 tectorial membrane의 제거입니다. 시간과 자원을 절약하기 위해 해부 현미경으로 시각 제어를 수행해야하며 잠재적으로 손상된 부위를 기록해야합니다. 값 비싼 1 차 및 2 차 항체를 사용하는 대신 phalloidin과 같은 값싼 시약이 예비 실험에 더 적합합니다. 약간의 손상된 explants 잠재적으로 여전히 실험 (영향을받지 않은 섹션 분석) 또는 항체의 새로운 조합의 테스트에 대한 컨트롤로 사용할 수 있습니다.

표본을 옮기는 것은 특히 중요합니다. 왜냐하면 표본의 조각이거꾸로되어 있지 않습니다 (코팅 된 커버 슬립의 안내없이 종종 "떠 다니는"유모 세포가 퇴화 됨). coverslip의 중앙 위치는 모든 추가 pipetting 단계를 용이하게합니다.

새로운 화합물 (분명히 배양 배지에 용해되어야 함)을 포함하는 음성 대조 실험의 경우, 적절한 배양액을 체외 이식편에 적용하고 치료되지 않은 체외 이식편에만 집중하지 않는 것이 중요합니다. 예를 들어, 시판 약품에 활성 성분 이외에 구연산 나트륨이 포함되어있는 경우 구연산 나트륨 자체가 효과를 나타낼 수 있기 때문에 음이온 제어 달팽이 제거제에 구연산 나트륨을 첨가해야합니다.

달팽이 explants의 사용에 제한 이러한 organotypic 문화는 일반적으로 아직 출생 후의 발달 변화를 겪고있는 어린 강아지에서 파생 된 있으며 explant 걸쳐 이온 성 그라데이션의 부족, 이는 정상적인 필수입니다 포함생체 내 청력. 그러나 프로토콜의 유용성은 AAVs 18 에 관한 최근의 간행물에 강하게 나와 있습니다. 이 벡터 그룹은 약 4.7kb의 포장 능력으로 제한되어 있지만 여러 사람의 증후군 치료에 중요한 자원이되었습니다. Cochlear explant model을 사용하여, 위에서 언급 한 논문은 Anc80 바이러스가 유모 세포와 SGNs를 포함한 다양한 달팽이 세포의 형질 도입에서 전통적인 AAV 혈청 형보다 우월하다는 것을 보여 주었다. 이 생체 외 결과는 마우스 생쥐의 원형 창문을 통해 가장 유망한 주사제를 선택함으로써 확인되었습니다. 생체 외 모델은 달팽이관의 해부학 적 구조를 성공적으로 요약 할 수있는 방법을 제공하여 생체 내 작업을 수행 하는 데 필요한 시간과 자원을 줄 입니다 .

ex v 의 또 다른 이점ivo 모델은 SNHL에 기여하는 특정 세포 메커니즘의 연구에 응용 가능성이 있습니다. 종양 미세 환경 ( 예 : 인간 종양 분비물)에서 발견 된 화합물을 체외 이식편에 적용함으로써 달팽이관에 대한 이들 화합물의 영향을 직접 시각화하고 잠재적 인 약물 요법의 효능 또는 독성을 평가할 수 있습니다. 이것은 인간 달팽이관을 생체 검사 할 수 없기 때문에 중요하며, 그 안의 세포 는 생체 내에서 시각화 될 수 없기 때문에 중요합니다. 예를 들어, 최근 논문은 vestibular schwannomas에서 분비 된 단백질의이 독성 잠재력을 조사했습니다. 이는 전정 신경에서 발생하여 95 %의 환자에서 난청을 일으키는 두개 내 종양입니다. 인간의 종양 분비물을 달팽이 체외 이식편에 적용하면 건강한 사람의 신경에서 분비되는 것과 비교하여 이들 분비물이 달팽이관에 미치는 독성 영향이 확인되었습니다. 똑같은 실험은 생체 내 에서 복제하기가 어려울 것이다.모델은 면역 수용성 마우스에서 발생할 수있는 인간 단백질에 대한 면역 원성 반응으로 인한 것이다.

요약하면,이 원고는 ex vivo 모델에서 달팽이 머리카락 세포, 시냅스, 신경 돌기 및 뉴런의 동시 연구를 가능하게하는 기술을 제시합니다. 이 모델은 인간의 분비물 19 , 20의 인자를 포함하여 달팽이관 28에 새로운 분자의 작용 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 한편 생체 내에서 시험하기 전에 잠재적으로 후보 치료 화합물 18 의 스크리닝을 가속화하는 것을 도울 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 국립 청각 장애 및 기타 의사 소통 장애 보조원 R01DC015824 (KMS) 및 T32DC00038 (SD 지원), 국방부의 W81XWH-15-1-0472 (KMS), Bertarelli Foundation (KMS), Nancy Sayles Day Foundation (KMS), Lauer 이명 연구 센터 (KMS) 등이 있습니다. Jessica E. Sagers, 원고에 대한 통찰력있는 의견에 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin, Sodium Salt Invitrogen 11593-027
anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) BD Transduction Laboratories 612044
anti-Myo7A antibody, rabbit Proteus Biosciences 25-6790
anti-NF-H antibody, chicken EMD Millipore AB5539
anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) Antibodies Inc. 75-028
anti-TuJ1 antibody, mouse BioLegend 801202
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg Corning 354241
CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile Greiner Bio-One 188161
CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mm Greiner Bio-One 664160
CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner rings Greiner Bio-One 627170
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mm Greiner Bio-One 628160
CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile Greiner Bio-One 227261
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50 x 7 mm Ted Pella Inc. 14027-20
Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mm Ted Pella Inc. 260368
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306
Distilled water, 500 mL Thermo Fisher Scientific 15230-162 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10313-039
Dumont #4 Forceps Fine Science Tools 11241-30
Dumont #55 Forceps (Dumostar) Fine Science Tools 11295-51
Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% Sigma-Aldrich 459836-1L
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10437-028  Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer
goat anti-chicken-647 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21469
goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-11004
goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21124
goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21131
goat anti-rabbit-488 secondary antibody Thermo Fisher Scientific R37116
H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL EMD Millipore TMS-006-B
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mL Thermo Fisher Scientific 14025-092
Instrument Tray with Lid Stainless Steel Mountainside Medical TechMed4255
Micro (dissecting) knife – angled 30° Fine Science Tools 10056-12
Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 VWR 16004-382
N-2 Supplement (100X), 5 mL Thermo Fisher Scientific 17502-048
NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mL Thermo Fisher Scientific 25080-094
NaOH, sodium hydroxide solution, 1 L Thermo Fisher Scientific SS266-1
Normal Horse Serum (NHS) Invitrogen 16050130
Operating scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6806
Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, Crystalline Sigma-Aldrich P6148 Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online
PBS, pH 7.4, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10010-023  Autoclave prior to use
Phalloidin, Alexa Fluor 568  Thermo Fisher Scientific A12380
Prep Pad, Non Sterile  Medline 05136CS
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL Eppendorf 022363719 Autoclave prior to use
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL Eppendorf 022363204 Autoclave prior to use
Scalpel Blades - #15 Fine Science Tools 10015-00
Scalpel Handle - #4 Fine Science Tools 10004-13
Stemi 2000-C Stereo Microscope Zeiss  000000-1106-133
TCS SP5 confocal microscope Leica N/A
Triton-X (non-ionic surfactant) Integra T756.30.30
VectaShield antifade mounting medium for fluorescence Vector Laboratories, Inc. H-1000
Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6'' - 2 mm thick Zipline 0609132541599

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References

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신생아 쥐의 달팽이관 Explant 기법으로<em&gt; 체외에서</em&gt; 청력 연구의 스크리닝 도구
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Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. J. Vis. Exp. (124), e55704, doi:10.3791/55704 (2017).More

Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. J. Vis. Exp. (124), e55704, doi:10.3791/55704 (2017).

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