Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Неонатальная мышь Метод Cochlear Explant Technique как Published: June 8, 2017 doi: 10.3791/55704
Automatic Translation
1,2,3, 1,4, 1,2,4
1Eaton Peabody Laboratories, Department of Otolaryngology, Massachusetts Eye and Ear, 2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School, 3Department of Otolaryngology, Vienna General Hospital, Medical University of Vienna, 4Harvard Program in Speech and Hearing Bioscience and Technology

Summary

Цель этого протокола - продемонстрировать подготовку, культуру, лечение и иммунизацию неонатальных мышечных эксплантов. Эта методика может быть использована в качестве инструмента для скрининга in vitro при исследовании слуха.

Abstract

Несмотря на то, что за последние несколько десятилетий были отмечены значительные успехи в проведении исследований в области слуха, до сих пор нет лечения от потери сенсорного слуха (SNHL), что обычно связано с повреждением или потерей чувствительных механосенсорных структур внутреннего уха. В последние годы появились сложные анализы in vitro и ex vivo , позволяющие скринировать все большее число потенциально терапевтических соединений, одновременно сводя к минимуму ресурсы и ускоряя усилия по разработке лечения SNHL. Хотя однородные культуры некоторых типов клеток продолжают играть важную роль в текущих исследованиях, многие ученые теперь полагаются на более сложные органотипические культуры внутренних ушей мыши, также известные как кохлеарные экспланты. Сохранение организованных ячеистых структур внутри внутреннего уха способствует оценке in situ различных компонентов инфраструктуры улитки, включая внутренние и внешние волосковые клетки, спиральные ганглиозные нейроны, нейронItes и поддерживающих ячеек. Здесь мы представляем препарат, культуру, лечение и иммуноокрашивание неонатальных эксплантов кохлеарных мышей. Тщательная подготовка этих эксплантов облегчает идентификацию механизмов, которые способствуют СНЛЛ, и представляет собой ценный инструмент для сообщества исследователей слуха.

Introduction

Sensorineural Hearing Loss (SNHL) отражает повреждение внутреннего уха или восходящего слухового пути. В то время как потеря слуха является наиболее распространенным сенсорным дефицитом у людей 1 , лечебная терапия еще не существует 2 . Хотя кохлеарные или слуховые имплантаты мозга могут восстановить некоторую степень слуха у пациентов с тяжелым глубоким СНЛ, слух, предоставляемый этими устройствами, по-прежнему сильно отличается от «естественного» слуха, особенно во время попыток понять речь в шуме или слушать музыку.

В то время как дегенерация волосяных клеток уже давно считается основным следствием травматических слуховых событий ( например, воздействие громкого шума), все больше доказательств того, что синапсы, передающие информацию от волосковых клеток к слуховому нерву, по меньшей мере так же уязвимы к акустической травме 3 , 4 , 5 > , 6 . Поскольку человеческие аудиометрические пороги, текущий золотой стандарт для оценки слуховой функции, не предсказывают специфическое повреждение клеток во внутреннем ухе, необходимы более совершенные инструменты, чтобы как можно скорее обнаружить клеточную дегенерацию и начать адекватное лечение. 7 .

Перспективные фармацевтические методы лечения потери слуха часто тестируются на гомогенных клеточных культурах in vitro , но такие системы не точно моделируют микросреды улитков. Известно, что кохлеарные клетки выделяют трофические факторы, которые влияют на другие типы клеток в улитке 8 , 9 , решающий процесс in vivo , который теряется, когда орган Corti 10 , 11 или спиральные ганглиозные нейроны (SGN) 12 культивируются изолированно или когда Анализируются молекулярные маркерыEf "> 13. Однако исследования in vivo, которые могут потребоваться для валидации данных in vitro для установления новых персонализированных методов лечения потери слуха в погоне за« прецизионной медициной », требуют значительных ресурсов и времени. Это особенно важно при рассмотрении Сколько усилий требуется для совершенствования и выполнения инъекций мембран среднего уха или круглого окна с помощью тестов на слух и последующего вскрытия кохлеарных целых креплений. Эффективный скрининг перспективных соединений в органотипических культурах ex vivo, известных как кохлеарные экспланты, обеспечивает экономическую и надежную альтернативу 14 , 15 , 16 , 17 .

В этой статье описывается протокол, позволяющий генерировать, поддерживать и оценивать обработанные кохлеарные экспланты. Подчеркиваются конкретные приложения для этой модели, в том числе ее использование в скринингеПотенциально терапевтических соединений и сравнительной оценки вирусных векторов для генной терапии. Эксвариантный подход ex vivo позволяет исследователям визуализировать эффекты данного лечения на разных популяциях клеток in situ , облегчая идентификацию механизмов типа клеток и последующее уточнение целевых терапевтических средств.

В целом, этот метод дает модель для изучения улитки ex vivo, сохраняя при этом жизненно важный перекрестный разговор между сильно различными типами клеток, которые сосуществуют внутри улитки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Протокол исследования был одобрен Институтом по уходу и использованию животных (IACUC) в Глаз и Ухе Массачусетса. Эксперименты проводились в соответствии с Кодексом этики Всемирной медицинской ассоциации.

1. Подготовка рассечения

  1. Подготовка хирургического стола
    1. Используйте 70% этанола для дезинфекции хирургического стола.
    2. Поместите две нестерильные подготовительные прокладки рядом с микроскопом.
    3. Подготовьте приборный лоток, в том числе ножницы с термостойкой стерилизацией, ручку скальпеля, микро нож и щипцы (по два каждого из № 4 и № 55). Поместите приборный лоток и 50-миллиметровую, прозрачную стеклянную чашку Петри на одну нестерильную подушку.
    4. Получите стерильный лезвие скальпели # 15; Герметичный полиэтиленовый пакет или контейнер (для утилизации туш в соответствии с институциональными руководящими принципами); Лед в ведре; И холодного, стерильного сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS). Поместите эти предметы наДругая нестерильная подушка.
    5. Перенесите HBSS в пластиковую лабораторную трубку емкостью 50 мл и положите ее на лед.
  2. Подготовка культуры
    1. Подготовьте все материалы в ламинарном вытяжном шкафу. Для каждых четырех образцов положите четыре автоклавированные круглые стеклянные крышки толщиной 10 мм в четыре вкладки 35-миллиметровой 4-луночной чашки Петри.
    2. На каждые 4 образца смешивают общий объем 300 мкл, состоящий из следующего в микроцентрифужной пробирке: 10 мкл тканевого клея, 285 мкл NaHCO 3 и 5 мкл NaOH.
    3. Положите 45 мкл полученного раствора на каждый покров и оставите его там, по крайней мере, на 20 мин при комнатной температуре; Это решение можно оставить на покровном стекле в течение нескольких часов, но не может быть оставлено O / N.
    4. Поместите одну или две 35-миллиметровые 4-луночные чашки Петри внутри 10-сантиметровой чашки Петри, чтобы создать два барьера против загрязнения.
    5. Подготовьте культуральную среду, содержащую 98% модифицированной Дульбекко среды Игла (DMEM), 1% N-2 и 1% ампициллина (65 мкл на лунку в (микро) центрифужной пробирке). Перед использованием нагрейте раствор до 25 ° C.

2. Мучнистая кохлеарная экспансивная рассечение

  1. Декапитация неонатальной мыши
    1. Получите 60-миллиметровую пластиковую чашку Петри и распылите 70% этанола на крышке, чтобы поверхность была влажной.
    2. Налейте холодный HBSS из пластиковой лабораторной трубки в нижнюю часть 60-мм пластика и 50-миллиметровую прозрачную стеклянную чашку Петри. Храните пластиковую лабораторную трубку и обе чашки Петри на льду, чтобы держать ткань холодной, когда она не рассечена.
    3. Поместите неонатальную мышь P3 - P5 на лету в обрезающий палец латексной перчатки и подождите, пока гипотермия не приведет к потере сознания (примерно 1-3 мин).
    4. Обезглавить мышь быстро с помощью рабочих ножниц и утилизировать тело в герметичном полиэтиленовом пакете. Поместите отрезанную голову новорожденного в70% этанола в крышке 60-миллиметровой пластиковой чашки Петри.
  2. Макроскопическая диссекция временной кости
    1. Удалите кожу черепа, сделав поверхностный разрез спереди от заднего конца (непосредственно поверх сагиттального шва), используя лезвие скальпеля.
    2. Отрежьте оба внешних слуховых канала лопаткой скальпеля и сложите кожу вперед, чтобы выставить весь череп.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Хотя для этого шага обычно не требуется микроскоп для рассечения, его можно использовать для улучшения визуализации.
    3. Откройте череп вдоль сагиттального шва, используя лезвие скальпеля # 15. Удостоверьтесь, чтобы разрезать череп, осторожно перемещая лезвие вверх и вниз от переднего к заднему, чтобы избежать сжатия улитков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: череп не должен быть окостенен в этом возрасте и должен легко срезаться.
    4. Удалите и выбросьте морду, сделав вертикальный разрез прямо по орбите с помощью скальпеля # 15лезвие.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Задняя часть черепа должна по-прежнему содержать мозг и улитки.
    5. Утилизируйте передний мозг, мозжечок и мозговой мозг через тупое рассечение с помощью щипцов № 4.
  3. Микроскопическое извлечение улиток
    1. Отрегулируйте микроскоп (увеличение 6,5X) и источник света, разместив щипцы под прицелом и оптимизируя освещение и фокусировку.
    2. Поместите две половины черепа в 60-миллиметровую пластиковую чашку Петри, заполненную холодным HBSS.
    3. Полностью разоблачите улицу / е, идентифицируемую как находящуюся рядом с окружающей стэпиальной артерией (извилистая артерия в височной кости), и тупо отделите орган от временной кости с помощью щипцов № 4.
    4. Перенесите улитку в 50-миллиметровую, прозрачную стеклянную чашку Петри и поместите блюдо под микроскоп.
    5. Поместите 60-миллиметровую пластиковую чашку Петри с другой половиной черепа на льду. Удалите улитку из вестибулярной системы и тщательно рассекайте кохлеарную ушную капсулу (обычно хрящевую в этом возрасте) с помощью пинцета №4. Используйте щипцы № 55 для всех дальнейших шагов.
  4. Заключительные этапы обработки тканей
    1. Продолжайте обрабатывать внутреннюю ткань уха, тщательно отделяя спиральную связующую связующую к органу Корти от остальной части улитки и модиолуса с помощью микроножа или двух щипцов.
      1. Вырезайте в более темную полупрозрачную область в щели между спиральной связкой и областью волосковых клеток и приступайте к последующему удалению спиральной связки, схватив ее в основном базальном аспекте и осторожно разматывая ее, перемещаясь апикально.
    2. Расположите образец, чтобы получить продольный сагиттальный вид улитки и разрезать улитку на две-три секции с использованием микроножа, классифицируя эти секции как апикальные (средние) и bАзальные обороты. Удалите ткань выше и ниже фактического слоя волосковых клеток и нейритов, чтобы получить кохлеарную часть эксплантов, которая может лежать горизонтально на чашке Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Соответствующий размер для стабильной адгезии к блюду для культуры составляет примерно половину одного кохлеарного оборота.
    3. Удалите текториальную мембрану, очень тонкий полупрозрачный слой, непосредственно превосходящий орган Корти, осторожно удаляя его пинцетом.
    4. Удалите мембрану Рейсснера, сразу же превосходящую SGN, прикоснувшись к ней щипцами с обеих сторон и отделив ее.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Удалите все поврежденные участки клеток волосяного покрова, вырезая их микроножкой.

3. Передача образцов на культуральные пластины

  1. Удалите 45 мкл тканевого адгезивного раствора из четырех чехла. Промойте каждую крышку с помощью 50 мкл стерильного H 2 O. Аспирируйте воду.
  2. Возьмите 1 мл пипетки. Смочите наконечник пипетки приблизительно 120 мкл DMEM для предотвращения прилипания образца к внутренней части наконечника.
  3. Перенесите образцы индивидуально с помощью 1 мл пипетки. Пипетируйте максимум 70 мкл из заполненной HBSS, маленькой, прозрачной, стеклянной посуды Петри и помещайте образец вместе с жидкостью на одну из 4 вкладок (подготовленных с помощью обложки) в 4-луночном чашке Петри ,
  4. Проверьте под микроскопом (увеличение 50X), что образец находится в правильной ориентации. Убедитесь, что область волосковых клеток, из которых удалена текториальная мембрана, обращена вверх. Убедитесь, что базилярная мембрана вместе с обрезанной основной частью модиолуса обращена вниз и прилипает к покровному стеклу.
    1. Если образец ориентирован вверх дном при осмотре, отложите HBSS, который остается в наконечнике пипетки, в инкрустацию и перемещайте деталь до тех пор, пока она не будет правильно ориентирована.
      НЕТTE: Это предотвратит плавление клеток волос в культуральной среде без структурной поддержки от покровного стекла, что может привести к дегенерации.
  5. Аспирируйте избыток HBSS с помощью 1 мл пипетки. Подождите 15 с.
  6. Внесите 60 мкл подготовленной теплой культуральной среды (98% DMEM, 1% N-2 и 1% ампициллина) непосредственно на образец. Не прикасайтесь к образцу пипеткой. Замените внутренние и наружные крышки чашки Петри и инкубируйте O / N при 37 ° C.
  7. Поместите все запасные растворы обратно в их надлежащие места, утилизируйте туши и остаточные отходы, дезактивируйте хирургический стол в соответствии с институциональными рекомендациями ( например, используя этанол или гипохлорит), очистите и автоклавируйте инструменты и выбросьте острые предметы в соответствующий контейнер ,

4. Добавление итоговых культурных материалов и интересующих веществ

ПРИМЕЧАНИЕ. Кохлеарные экспланты будут готовы к использованию через 10-16 часов.

  1. Подготовьте смесьRe из 97% DMEM, 1% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% N-2 и 1% ампициллина (65 мкл на лунку в микроцентрифужной пробирке, до использования раствора до 25 ° C до использования).
  2. Добавьте другие вещества, представляющие интерес для растворов для соответствующих групп лечения. Если добавить флуоресцентные вещества ( например, вирусы, экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок (GFP), в недавней публикации концентрация 10 10 GC аденоассоциированных вирусов (AAV) была использована в течение 48 ч в 50 мкл) 18 , защищать от легкий.
  3. Перенесите из инкубатора чашки Петри из кохлеарной экспланты и поместите их под ламинарный вытяжной шкаф.
  4. Аспирируйте старую культуральную среду (без FBS) с пипеткой из инкрустаций.
  5. Добавить 60 мкл на лунку готовой среды с теплой культурой (обработкой) (97% DMEM, 1% FBS, 1% N-2, 1% ампициллина и представляющих интерес веществ).
  6. Поместите чашку Петри обратно в инкубатор (37 ° C).
  7. Просмотреть rНапример, под микроскопом для выявления признаков заражения, клеточной миграции или отрыва кохлеарного эксплантов и окрашивания после максимум 7 дней.

5. Иммунофлюоресценция - 1-й день

  1. Подготовьте блокирующий раствор (94% фосфат-буферный солевой раствор (PBS), 5% нормальную козу или лошадиную сыворотку (NGS / NHS, в зависимости от вторичных антител) и 1% неионного поверхностно-активного вещества (см. Таблицу материалов )) и запасы (98,6% PBS, 1% NHS и 0,4% неионного поверхностно-активного вещества с соответствующими антителами).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Антитела включают кролик-анти-Myo7A в концентрации 1: 400+ (миозин 7A для внутренних и наружных волосковых клеток) и мышиный анти-TuJ1 1: 200+ (β-тубулин, для SGN) ИЛИ мышь (IgG1) -CtBP2 1: 200+ (c-концевой связывающий белок для пресинапса), мышиный (IgG2a) анти-PSD95 1: 50+ (постсинаптическая плотность для постсинапса) и куриный анти-NF-H 1: 1000+ (нейрофиламент, Для SGN и нервных волокон). "+" MeaNs "или выше."
  2. Аспирируйте культуральную среду с помощью пипетки. Не прикасайтесь к образцу.
  3. Под ламинарным вытяжным потоком дважды промывайте кохлеарные экспланты стерильным PBS, помещая образцы на шейкер в течение 5 минут после каждой промывки.
  4. Закрепите ткань в 4% параформальдегиде (PFA - ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ) в течение 20 минут на шейкере (под капотом). Аспирируйте PFA.
  5. Нанесите 60 мкл PBS на кохлеарные экспланты и поместите чашку Петри на шейкер в течение 5 мин. Аспирируйте PBS. Повторите 3 раза.
  6. Поместите кохлеарные экспланты в готовый блокирующий раствор (94% PBS, 5% NHS и 1% неионогенное поверхностно-активное вещество) в течение 30 мин на шейкере.
  7. Поместите кохлеарные эксплантаты в готовый раствор целевого антитела (98,6% PBS, 1% NHS и 0,4% неионогенного поверхностно-активного вещества) с соответствующими первичными антителами (перед использованием) перед использованием) O / N на счетчике при RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Оберните чашки Петри влажными бумажными полотенцами, заключенными в пластиковую пленку (или алюминиевую фольгу, если добавленный растворИон содержит флуоресцентные материалы, такие как GFP-экспрессирующие вирусы), чтобы держать посуду влажной и предотвращать испарение раствора антитела O / N.

6. Иммунофлуоресценция - второй день

  1. Подготовьте 4'-6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) пятно (300 нМ) и используйте раствор целевого антитела для получения правильных вторичных смесей антител, дополняющих первичные антитела на этапе 5.1. (IgG1) 568 1: 1000+, козьим антимышиным (IgG2a) 488 1: 500+, козьим анти-кроликом 488 1: 200 + И коза анти-цыпленка 647 1: 200+ или Phalloidin 568 1: 200+ (для внутренних и внешних волосковых клеток)).
  2. Аспирируйте раствор первичных антител.
  3. Нанесите 60 мкл PBS на кохлеарные экспланты и поместите чашку Петри на шейкер в течение 5 мин. Аспирируйте PBS. Повторите 3 раза.
  4. Поместите кохлеарные экспланты в раствор готового исходного антитела (98,6% PBS, 1% NHS и 0,4% неионного поверхностно-активного вещества) с разрешением(Вихрь перед употреблением) в течение 1,5 ч на счетчике и защищать от света.
  5. Аспирируйте раствор вторичных антител и промойте кохлеарные экспланты с помощью окрашивания DAPI (помещают в шейкер в течение 1 мин, а затем аспирируют).
  6. Нанесите 60 мкл PBS на кохлеарные экспланты и поместите чашку Петри на шейкер в течение 5 мин. Аспирируйте PBS. Повторите 3 раза.
  7. Используйте щипцы для снятия покровных с образцами из 4-луночного планшета, окуните их в получателя, заполненного дистиллированным H 2 O, и высушите покровные стекла вертикально, соединяя их с бумажными полотенцами.
  8. Поместите каплю антифазной монтажной среды на предметную скобу микроскопа и поверните покровные стекла, чтобы погружать ткань, направленную вниз, в среду.
  9. Запечатайте покровное покрытие, используя прозрачный лак для ногтей, по периметру, покрывающий край (без дробления образца под стеклом). Оставьте слайды, лежащие в закрытом помещении, вдали от света в течение 15-20 минут до высыхания иВставьте их в коробку или осмотрите под конфокальным микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Люминесцентное окрашивание лучше всего сохранять, сохраняя слайды при 4 или -20 ° C.

7. Конфокальная визуализация

  1. Получите обзор и увеличенные изображения для органа региона Корти, включая нейриты и SGN.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Стандартные настройки для процесса обработки изображений: формат 1024 × 1024 пикселей, скорость 400 Гц, средняя частота кадра 3, 20% общей интенсивности лазера и обычно 20X и 63X объектив с погружением в масло (потенциально в сочетании с 2-кратным цифровым зумом). Настройки канала для протокола окрашивания DAPI, Myo7A и TuJ1 описаны выше: 405 5% DAPI, «Умный выигрыш» 766,8 В, «Смарт Смещение» 0,0% - 488 15% изотиоцианата флуоресцеина (FITC), «Умный коэффициент усиления» 622,2 В , «Умное смещение» 0,0% - 561 13% тетраметиламиноизоцианата (TRITC), «Умный урон» 562,4 В, «Смарт Смещение» 0,0%.
  2. Объедините изображения в z-стеке, используяПрограммное обеспечение для получения проекции оси z.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Хотя многие протоколы сосредоточены на органе эксплантатов Корти, этот метод пытается сохранить анатомию всего кохлеарного разворота, включая SGN. Это дает исследователям возможность проанализировать влияние данного лечения на нейриты и соматы SGN в дополнение к органу Корти. Выполнение диссекции, которая сохраняет часть modiolus, как описано здесь, является более технически сложной задачей, чем эксплантация только органа Corti. Однако область нейритов и SGN важна, поскольку в этом регионе наблюдались значительные патологические эффекты после применения вестибулярных шванномальных секретов ( рис. 1 ) и внеклеточных везикул в двух последних публикациях с использованием той же методики 19 , 20 . Такие изменения не могли быть выявлены с использованием изолированного органа эксплантатов Корти.

ThE количественная оценка поврежденных или GFP-экспрессирующих клеток для внутренних и наружных волосковых клеток, поддерживающих клеток и SGN может быть выполнена путем ручного подсчета или с автоматизированным процессом, таким как встроенный в модуль ImageJ NeuronJ. Репрезентативные области для этих подсчетов могут быть установлены после подтверждения их корреляции с общим количеством баллов. 3D-реконструкции особенно полезны для исключения эффектов наложения в проекциях оси Z для SGN. Можно оценить организацию волокон, количество SGN на данную область и зону сомы SGN. Окрашивание и подсчет синапсов, волосковых клеток и нейритов показано на рисунке 2 ; Тот же протокол может также использоваться для кохлеарных целых креплений и, как было показано, является надежной моделью для этих целей 17 , 21 , 22 . Другие исследователи установили элегантные альтернативные методы, которые также могут быть включены в экспериментальные парадигмы 23 </ Sup> , 24 .

Максимальная длина культуры обычно ограничивается началом миграции клеток и зависит от концентрации FBS в культуральной среде. Когда доля FBS была снижена с пяти процентов до трех процентов или на один процент, период сохранения анатомически неповрежденного кохлеарного эксплантата был увеличен примерно до одной недели ( рисунок 3 ).

На рисунке 4 показаны GFP-позитивные кохлеарные эксплантические клетки после трансдукции синтетическим адено-ассоциированным вирусным вектором Anc80 в течение 48 ч 25 . В этой точке можно количественно определить внутренние волосковые клетки, внешние волосковые клетки и поддерживающие клетки, тогда как 3D-реконструкция может помочь количественно определить GFP-позитивные клетки в области SGN. Различные вирусные серотипы можно сравнить с точки зрения эффективности их трансдукции в определенных группахLl, используя изложенную методологию 18 .

Рисунок 1
Рисунок 1: Типичная конфокальная микроскопия Изображения кохлеарных эксплантов из апикальной и базальной областей после инкубации с выделениями из крупных аурикулярных нервов или вестибулярной шванномы в течение 48 ч . ( A ) Обзор изображения эксплантата. Прямоугольник отмечает область крупным планом. Шкала шкалы = 200 мкм. ( B - E ) Увеличенные изображения зрительных клеток и нейритов. Шкала шкалы = 50 мкм. Green = Myosin 7A (Myo7A), окрашивает волосяные клетки; Красный = бета-тубулин III класса (Tuj1), структуры нейронов пятен. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2: Изображение конфокальной микроскопии региона клеток кохлеарной осанки. ( A ) Интактные синапсы могут быть оценены путем маркировки пресинаптического (C-концевого связывающего белка, красного) и постсинаптического (постсинаптической плотности-95, зеленых) белков вместе с окрашиванием нейронных структур (нейрофиламент, синий). OHC, внешние волосковые клетки; IHC, внутренние волосковые клетки. Шкала шкалы = 10 мкм. ( B ) Сосредоточьтесь на внутренней области волосковых клеток с подсчетом внутренних волосковых клеток (красных наконечников стрел) и нейритов (синих наконечников стрел). Из-за ветвления нейронных структур важно стандартизировать расстояние от внутренних волосковых клеток во время подсчета (выделено белой рамкой, непосредственно связанной с синапсами). Шкала шкалы = 5 мкм. ( C ) Крупный план отдельных синапсов (две пред- и постсинаптические пары, отмеченные белыми стрелками). Шкала шкалы = 1 & # 181; м. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3: Типичная конфокальная микроскопия Изображения апикальных и базальных кохлеарных эксплантов после 7 дней в культуре с 3% или 1% FBS. ( A и B ) Клетки, инкубированные в 3% FBS, начинают мигрировать между 4 и 5 днями (светло-серые стрелки для волосковых клеток, красные стрелки для нейритов), ( C и D ) Экспланты в 1% FBS сохраняют организационную целостность до 7-го дня. Светло-серый: Myosin 7A (Myo7A), окрашивает все волосковые клетки; Красный: бета-тубулин класса III (Tuj1), структуры нейронов пятен. OHC, внешние волосковые клетки; IHC, внутренние волосковые клетки. Шкала шкалы = 100 мкм, применяется ко всем панелям.Iles / ftp_upload / 55704 / 55704fig3large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4
Рисунок 4: Изображение конфокальной микроскопии кохлеарного эксплантера после воздействия синтетического адрено-ассоциированного вирусного вектора Anc80 в течение 48 часов. Трансдуцированные клетки экспрессируют GFP (зеленый). Myosin 7A (Myo7A, синие) пятна Наружные волосковые клетки (OHC) и внутренние волосковые клетки (IHC); Бета-тубулин класса III (Tuj1, красный) окрашивает нейронные структуры. Supp .: площадь Sox2-положительных опорных клеток; SGN, спиральные ганглиозные нейроны. Шкала шкалы: 100 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Исследователи должны совершенствовать метод вскрытия перед проведением экспериментов с использованием кохлеарных эксплантов. Волосяные клетки обычно повреждаются во время вскрытий, выполненных на ранней стадии обучения, и особенно проблематичным моментом для их целостности является удаление текториальной мембраны, которая требует постоянных рук, правильных инструментов и опыта. Чтобы сэкономить время и ресурсы, визуальный контроль должен выполняться под микроскопом рассечения, и следует отметить потенциально поврежденные области. Вместо использования дорогих первичных и вторичных антител более дешевые реагенты, такие как фаллоидин, более подходят для предварительных экспериментов. Немного поврежденные экспланты потенциально могут по-прежнему использоваться в качестве контролей в определенных экспериментах (анализ участков, которые не были затронуты) или для тестирования новых комбинаций антител.

Особенно важна передача образцов, поскольку необходимо гарантировать, что кускиНе ориентированы вверх дном («плавающие» волосковые клетки без наведения покрытого покровного стекла часто вырождаются). Центральное положение покровного стекла облегчает все дальнейшие шаги по пипетированию.

Для экспериментов с отрицательным контролем с использованием новых соединений (которые, очевидно, должны быть растворимы в культуральной среде), важно применять соответствующий носитель к эксплантам и не фокусироваться исключительно на необработанных эксплантах. Например, если коммерческий препарат включает цитрат натрия в дополнение к активному ингредиенту, то цитрат натрия следует добавлять к эксплантам кохлеарного контроля с отрицательным контролем, потому что цитрат натрия сам по себе может иметь эффект.

Ограничения на использование кохлеарных эксплантов включают в себя тот факт, что эти органотипические культуры обычно происходят от молодых щенков, которые все еще подвергаются постнатальным изменениям в развитии, и что отсутствует отсутствие ионного градиента через эксплантат, что существенно для нормальныхСлух in vivo . Однако полезность протокола убедительно показана в недавней публикации, касающейся AAV 18 . Хотя эта группа векторов ограничена примерно 4,7 килобайтами упаковочной способности, она стала важным ресурсом для терапии нескольких человеческих синдромов 26 . Используя модель кохлеарной эксплантации, вышеупомянутая публикация продемонстрировала, что вирус Anc80 превосходит традиционные серотипы AAV при трансдукции различных кохлеарных клеток, включая волосковые клетки и SGN. Эти результаты in vitro были впоследствии подтверждены, выбирая наиболее перспективных кандидатов для инъекций через круглое окно щенков мыши in vivo . Модель ex vivo дает возможность успешно повторить анатомию улитки, уменьшая время и ресурсы, необходимые для проведения in vivo работы 27 .

Еще одно преимущество ex vIvo - его потенциал для применения к изучению специфических клеточных механизмов, которые способствуют СНЛ. Путем применения соединений, обнаруженных в микроокружении опухоли ( например, секреции опухолей человека), экспланту, эффект этих соединений на улитку может быть непосредственно визуализирован и оценена эффективность или токсичность потенциальных лекарственной терапии. Это важно, потому что человеческая улитка не может быть биопсией, а клетки внутри нее не могут быть визуализированы in vivo . Например, в недавней публикации исследовался ототоксический потенциал белков, выделяемых из вестибулярных шванномов, которые представляют собой внутричерепные опухоли, которые возникают из вестибулярных нервов и вызывают потерю слуха у 95% пациентов. Применение человеческих опухолевых секретов к кохлеарным эксплантам, по сравнению с выделениями из здоровых человеческих нервов, подтвердило токсическое действие этих секретов на улитку 19 . Тот же самый эксперимент будет трудно воспроизвести в in vivoИз-за иммуногенного ответа на человеческие белки, которые возникли бы у иммунокомпетентной мыши.

Таким образом, в этой рукописи представлен метод, который позволяет одновременно изучать кохлеарные волосковые клетки, синапсы, нейриты и нейроны в модели ex vivo . Эта модель может помочь обеспечить понимание механизмов действия новых молекул в улитке 28 , включая факторы в секретах 19 , 20 человека , при этом потенциально ускоряя скрининг кандидатов-терапевтических соединений 18 до их тестирования in vivo .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным институтом глухоты и других нарушений коммуникации грантами R01DC015824 (KMS) и T32DC00038 (поддержка SD), грантом Министерства обороны W81XWH-15-1-0472 (KMS), Фондом Бертарелли (KMS), Фонд Нэнси Сэйлса (KMS) и Исследовательский центр Lauer Tinnitus (KMS). Мы благодарим Джессику Э. Сэнгерс, Б.А. за проницательные комментарии к рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin, Sodium Salt Invitrogen 11593-027
anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) BD Transduction Laboratories 612044
anti-Myo7A antibody, rabbit Proteus Biosciences 25-6790
anti-NF-H antibody, chicken EMD Millipore AB5539
anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) Antibodies Inc. 75-028
anti-TuJ1 antibody, mouse BioLegend 801202
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg Corning 354241
CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile Greiner Bio-One 188161
CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mm Greiner Bio-One 664160
CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner rings Greiner Bio-One 627170
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mm Greiner Bio-One 628160
CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile Greiner Bio-One 227261
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50 x 7 mm Ted Pella Inc. 14027-20
Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mm Ted Pella Inc. 260368
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306
Distilled water, 500 mL Thermo Fisher Scientific 15230-162 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10313-039
Dumont #4 Forceps Fine Science Tools 11241-30
Dumont #55 Forceps (Dumostar) Fine Science Tools 11295-51
Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% Sigma-Aldrich 459836-1L
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10437-028  Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer
goat anti-chicken-647 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21469
goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-11004
goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21124
goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21131
goat anti-rabbit-488 secondary antibody Thermo Fisher Scientific R37116
H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL EMD Millipore TMS-006-B
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mL Thermo Fisher Scientific 14025-092
Instrument Tray with Lid Stainless Steel Mountainside Medical TechMed4255
Micro (dissecting) knife – angled 30° Fine Science Tools 10056-12
Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 VWR 16004-382
N-2 Supplement (100X), 5 mL Thermo Fisher Scientific 17502-048
NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mL Thermo Fisher Scientific 25080-094
NaOH, sodium hydroxide solution, 1 L Thermo Fisher Scientific SS266-1
Normal Horse Serum (NHS) Invitrogen 16050130
Operating scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6806
Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, Crystalline Sigma-Aldrich P6148 Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online
PBS, pH 7.4, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10010-023  Autoclave prior to use
Phalloidin, Alexa Fluor 568  Thermo Fisher Scientific A12380
Prep Pad, Non Sterile  Medline 05136CS
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL Eppendorf 022363719 Autoclave prior to use
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL Eppendorf 022363204 Autoclave prior to use
Scalpel Blades - #15 Fine Science Tools 10015-00
Scalpel Handle - #4 Fine Science Tools 10004-13
Stemi 2000-C Stereo Microscope Zeiss  000000-1106-133
TCS SP5 confocal microscope Leica N/A
Triton-X (non-ionic surfactant) Integra T756.30.30
VectaShield antifade mounting medium for fluorescence Vector Laboratories, Inc. H-1000
Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6'' - 2 mm thick Zipline 0609132541599

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf (2000).
  2. Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062 (2014).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
  4. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  5. Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones. J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).
  6. Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice. PLoS One. 10 (5), (2015).
  7. Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear. Hear Res. , 83-93 (2016).
  8. Wang, H. C., et al. Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells. Cell. 163 (6), 1348-1359 (2015).
  9. Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, (2011).
  10. Dinh, C., et al. Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants. Otolaryngol Head Neck Surg. 148 (5), 834-840 (2013).
  11. Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti. Neurosci Lett. 501 (2), 67-71 (2011).
  12. Kao, S. Y., et al. Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss. Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).
  13. Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry. J Vis Exp. (58), e3432 (2011).
  14. Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation. J Vis Exp. (95), e52260 (2015).
  15. Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), (2010).
  16. Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants. J Vis Exp. (93), e52101 (2014).
  17. Wang, Q., Green, S. H. Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro. J Neurosci. 31 (21), 7938-7949 (2011).
  18. Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
  19. Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
  20. Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. , (2016).
  21. Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).
  22. Yuan, Y., et al. Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy. J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).
  23. Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).
  24. Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea. Neuroscience. , 50-62 (2016).
  25. Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
  26. Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
  27. Shu, Y., et al. Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes. Hum Gene Ther. , (2016).
  28. Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear. Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).

Tags

Медицина выпуск 124 мышиный кохлеарный эксплантат органотипическая культура внутреннее ухо внешние волосковые клетки внутренние волосковые клетки спиральные ганглиозные нейроны слуховая синопатия адено-ассоциированный вирус
Неонатальная мышь Метод Cochlear Explant Technique как<em&gt; In Vitro</em&gt; Инструмент скрининга в исследованиях слуха
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landegger, L. D., Dilwali, S.,… More

Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research. J. Vis. Exp. (124), e55704, doi:10.3791/55704 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter