Summary
Bu protokolün amacı, yenidoğan murin koklear eksplantlarının hazırlanması, kültürü, tedavisi ve immün boyanmasını göstermektir. Bu teknik, işitme araştırmalarında in vitro bir tarama aracı olarak kullanılabilir.
Abstract
Son birkaç on yılda yapılan işitme araştırmalarında dikkate değer ilerlemeler kaydedilmesine rağmen, tipik olarak iç kulaktaki hassas mekano-algılama yapılarına hasar veren veya kaybedilen bir durum olan Sensorineural İşitme Kaybı (SNHL) için herhangi bir tedavi yoktur. Son yıllarda sofistike in vitro ve ex vivo testler ortaya çıkmış ve kaynakları azaltmak ve SNHL için iyileştirme çabalarını hızlandırırken potansiyel olarak terapötik bileşiklerin sayısının artmasını mümkün kılmıştır. Bazı hücre türlerinin homojen kültürleri günümüz araştırmalarında önemli rol oynamaya devam etse de, birçok bilim adamı şimdi koklear eksplant olarak da bilinen daha kompleks organometalik faregiller arası kulak kültürlerine güveniyor. Organik hücresel yapıların iç kulak içinde korunması, iç ve dış kıl hücreleri, spiral ganglion nöronları, sinir hücreleriItes ve destekleyici hücreler. Burada neonatal farelerde koklear eksplantların hazırlanması, kültürü, tedavisi ve immün boyanması sunulmuştur. Bu eksplantların dikkatli bir şekilde hazırlanması, SNHL'ye katkıda bulunan mekanizmaların tanımlanmasını kolaylaştırır ve işitme araştırmaları topluluğu için değerli bir araç teşkil eder.
Introduction
Sensorinöral İşitme Kaybı (SNHL), iç kulakta veya artan işitme yolunda hasar olduğunu gösterir. İşitme kaybı, insanlardaki en yaygın duyusal eksiklik iken, küratif terapiler henüz mevcut değildir 2 . Koklear veya işitsel beyin sapı implantları ağır derecede derinlemesine SNHL olan hastalara bir dereceye kadar işitme becerisi kazandırabilmesine rağmen, özellikle de sesli konuşmayı anlamaya veya müzik dinlemeye çalışırken, bu cihazların sağladığı işitme "doğal" işitme durumundan çok farklıdır.
Saç hücresi dejenerasyonu, uzun süredir travmatik işitsel olayların ( örneğin, yüksek gürültüye maruz kalma) birincil sonuç olarak düşünülürken , bilginin saç hücrelerinden işitme sinirine iletildiği sinapsların en azından akustik travmaya karşı savunmasız olduğu yönünde artan bir kanıt vardır 3 , 4 , 5 > , 6 . İşitsel işlevi değerlendirmek için kullanılan altın standart olan insan odyometrik eşikleri, iç kulaktaki belirli hücresel hasarı öngörmemektedir, mümkün olduğunca çabuk hücresel dejenerasyonu saptamak ve uygun tedaviyi başlatmak için daha rafine edilmiş araçlar gerekmektedir.
İşitme kaybı için umut verici farmasötik tedaviler genellikle homojen hücre kültürleri üzerinde in vitro olarak denenir, ancak bu tür sistemler koklear mikro çevreyi doğru bir şekilde modellememektedir. Koklear hücrelerin Corti 10 , 11 ya da Spiral Ganglion Nöronları (SGNs) 12 organı izole edildiğinde ya da ne zaman ne de olsa, koklea 8 , 9 içindeki diğer hücre tiplerini etkileyen trofik faktörleri salgılarlar. Moleküler belirteçler analiz edilirEf "> 13. Bununla birlikte," hassas tıp "arayışında işitme kaybı için yeni ve kişiselleştirilmiş tedaviler oluşturmak için in vitro verilerin geçerliliği için gerekli olabilecek in vivo çalışmalar önemli kaynaklara ve zamana ihtiyaç duymaktadır. Işitme testleri ve müteakip koklear tüm montajların diseksiyonu ile orta kulak veya yuvarlak pencere membran enjeksiyonlarını mükemmelleştirmek ve gerçekleştirmek için ne kadar çaba gerekir? Koklear eksplant olarak bilinen organotipik ex vivo kültürlerde umut verici bileşiklerin verimli taranması, ekonomik ve güvenilir bir alternatif sağlar 14 , 15 , 16 , 17 .
Bu makalede, tedavi edilen koklear eksplantların üretilmesi, sürdürülmesi ve değerlendirilmesi için kullanılan bir protokol açıklanmaktadır. Taramada kullanımı da dahil olmak üzere, bu model için özel uygulamalar vurgulanmaktadırPotansiyel olarak terapötik bileşikler ve gen terapisi için viral vektörlerin karşılaştırmalı değerlendirmesi. Bir ex vivo eksplant yaklaşımı, araştırmacıların belirli bir tedavinin etkilerini , in situ olarak farklı hücre popülasyonları üzerinde görselleştirmesini ve hücre tipine özgü mekanizmaların tanımlanmasını ve daha sonra hedeflenen terapötiklerin arıtılmasını kolaylaştırır.
Genel olarak, bu teknik, kokleada bir arada bulunan çok çeşitli hücre tipleri arasındaki yaşamsal çapraz konuşmayı korurken, kokleayı ex vivo çalışmak için bir model sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışma protokolü, Massachusetts Eye and Ear'ın Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Deneyler, Dünya Tıp Birliği Etik Kurallarına göre gerçekleştirildi.
1. Diseksiyonun Hazırlanması
- Cerrahi masanın hazırlanması
- Cerrahi masayı dezenfekte etmek için% 70 etanol kullanın.
- Mikroskop yanında iki steril olmayan hazırlık yastıkları yerleştirin.
- Isı sterilize edilmiş ameliyat makası, bir bistüri sapı, bir mikro bıçak ve forseps (# 4 & # 55 her biri iki) de dahil olmak üzere alet tablasını hazırlayın. Alet tablasını ve 50 mm'lik, açık cidarlı, cam altı petri kabını steril olmayan bir pedin üzerine koyun.
- Steril # 15 neşter bıçağı elde edin; Mühürlenebilir bir plastik torba veya konteynır (karkaları kurumsal kurallara uygun olarak atmak için); Kova içinde buz; Ve soğuk, steril Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS). Bu maddeleriDiğer steril olmayan ped.
- HBSS'yi 50 mL plastik bir laboratuar tüpüne aktarın ve buz üzerine koyun.
- Kültür hazırlama
- Tüm malzemeleri bir laminer akış davlumbazına hazırlayın. Her dört numune için, dört adet otoklavlanmış 10 mm yuvarlak cam kapak fişini 35 mm'lik 4 oyuklu petri kabının dört girintisine koyun.
- Her 4 numune için, mikrosantrifüj tüpünde aşağıdakilerden oluşan toplam 300 μL'lik bir hacim karıştırın: 10 μL doku yapıştırıcısı, 285 μL NaHCO 3 ve 5 μL NaOH.
- Elde edilen çözeltinin 45 μL'sini her kaplama kağıdına koyun ve oda sıcaklığında en az 20 dakika bekletin; Bu çözüm birkaç saat boyunca lamel kalmış olabilir ancak O / N bırakılamaz.
- Kirlenmeye karşı iki bariyeri oluşturmak için bir veya iki 35 mm'lik 4 oyuklu petri tabağını 10 cm'lik bir Petri kabının içine yerleştirin.
- % 98 Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM),% 1 N-2 ve% 1 ampisilin (bir (mikro) santrifüj tüpünde oyuk başına 65 uL) ilave edildi. Çözümü kullanımdan önce 25 ° C'ye ısıtın.
2. Murin Koklear Explant Diseksiyonu
- Yenidoğan faresinin kesilmesi
- 60 mm plastik petri kabını alın ve yüzeyi ıslak olacak şekilde kapağına% 70 etanol püskürtün.
- Soğuk HBSS'yi plastik laboratuar tüpünden 60 mm plastik ve 50 mm net duvarlı, cam tabanlı petri tabağının alt kısmına dökün. Doku ayrılmadığı zaman soğuk tutmak için plastik laboratuar tüpünü ve her iki petri tabağını da buz üzerinde saklayın.
- Bir lateks eldiveninin bir kesme parmağında buz üzerinde bir P3 - P5 yaşlı yenidoğan faresi yerleştirin ve hipotermi bilinç kaybına neden olana kadar bekleyin (yaklaşık 1-3 dakika).
- Çalıştırma makası ile fare hızla kesilir ve gövdeyi mühürlenebilir plastik torbaya atın. Ayrılan yenidoğan kafasını60 mm plastik petri kapağının kapağında% 70 etanol.
- Temporal kemiğin makroskobik diseksiyonu
- Bıçak bıçağını kullanarak arka ucun önünden (doğrudan sajital dikişin üstünde) yüzeysel bir kesim yaparak kafatasının derisini çıkarın.
- Her iki dış ses kanallarını bisturi bıçağıyla kesin ve craniumun tamamını ortaya çıkarmak için öne katlayın.
NOT: Bu adım için genellikle bir diseksiyon mikroskopu gerekli olmasa da, gelişmiş görselleştirme için kullanılabilir. - # 15 Bıçak bıçağını kullanarak sajital sütür boyunca kafatası açın. Kokleanın sıkıştırılmasını önlemek için, bacıyı anteriordan posteriora hafifçe yukarı ve aşağı hareket ettirerek kafatasını kesdiğinizden emin olun.
NOT: Kafatası o yaşta kemikleşmemelidir ve kolaylıkla kesilmelidir. - # 15 Dankel iğnesi kullanarak yörüngelere direkt olarak arka arkaya dikey keserek burun çıkarın ve atınBıçak.
NOT: Kafatasının arka kısmı hala beyin ve kokleae içermelidir. - Önbeyin, beyincik ve beyin sapını # 4 forseps ile künt diseksiyon yoluyla atın.
- Kochleae'nin mikroskobik ekstraksiyonu
- Mikroskopı (6.5X büyütme) ve ışık kaynağını, forsepsi kapsamın altına yerleştirerek ve aydınlatmayı ve odaklamayı optimize ederek ayarlayın.
- Kraniumun iki yarısını soğuk HBSS ile dolu 60 mm plastik petri kabına yerleştirin.
- Çevreleyen stapedial artere bitişik olarak bulunan kokleanın / e'nin (temporal kemiğin içinde dolambaçlı bir arter) komple olarak ortaya çıkmasını sağlayın ve organı temporal kemiğe # 4 forseps kullanarak açıkça ayırın.
- Kokleayı 50 mm, açık duvarlı, cam tabanlı petri kabına aktarın ve çanağı mikroskop altında konumlandırın.
- 60 mm plastik petri kabuğunun diğer yarısı buz üzerine yerleştirilir. Kokleayı vestibüler sistemden çıkarın ve koklear otik kapsülü (tipik olarak bu yaştaki kıkırdaklı) # 4 forsepsle dikkatlice parçalayın. Diğer tüm adımlar için # 55 forseps kullanın.
- Doku işleme son adımları
- İç kulak dokusunun işlenmesine devam etmek için, mikro bıçak veya iki forseps kullanarak, kokleanın geri kalanından ve modiyolustan Corti organına yapışmış spiral ligament dikkatlice ayrılmalıdır.
- Spiral bağ ve saç hücresi bölgesi arasındaki aralıktaki daha koyu, yarı saydam bölüme doğru kesin ve spiral bağın en temel kısmını kavrayarak ve apikal hareket ederken hafifçe çözerek ilerlemeye devam edin.
- Kokleanın uzunlamasına, sagital bir görünümünü elde etmek için numuneyi konumlandırın ve mikro bıçağı kullanarak kokleayı iki ila üç bölüme kesin, bu kısımları apikal (orta,) ve b olarak sınıflandırınAsal dönüyor. Petri kabında yatay olarak yerleşebilen bir koklear eksplant parçası elde etmek için, doku üstünü ve alttaki saç hücrelerinin ve nevrit tabakasını aşağı kaldırın.
NOT: Kültür çanağına kararlı yapışma için uygun bir boyut, bir koklear dönüşün yaklaşık yarısı kadardır. - Cortsi organının hemen üstündeki çok ince bir saydam katman olan ince doku zarını forsepsle hafifçe soyarak çıkarın.
- Reissner'ın membranını, SGN'lerin hemen üstünde, her iki yanında da forsepsle dokunup soyarak çıkarın.
NOT: Yanal olarak bulunan hasarlı saç hücresi alanlarını mikro bıçakla keserek çıkarın.
- İç kulak dokusunun işlenmesine devam etmek için, mikro bıçak veya iki forseps kullanarak, kokleanın geri kalanından ve modiyolustan Corti organına yapışmış spiral ligament dikkatlice ayrılmalıdır.
3. Örneklerin Kültür Plakalarına Aktarılması
- Dört kapak fişinden 45 μL doku yapıştırıcı solüsyonu çıkarın. Her kapak kaymasını 50 μL steril H 2 O ile yıkayın. Suyu aspire edin.
- 1 mL'lik pipeti al. Numunenin içerisine yapışmasını önlemek için pipet ucunu yaklaşık 120 μL DMEM ile ıslatın.
- Numuneleri 1 mL pipet kullanarak ayrı ayrı aktarın. HBSS dolu, küçük, açık duvarlı, cam tabanlı petri kabından azami 70 mcL pipetleyin ve numuneyi, 4-kuyu petri kabında (kapak fişleri ile hazırlanmış) 4 kakmandan birinde sıvı ile birlikte yerleştirin .
- Mikroskop (50X büyütme) altında numunenin doğru yönde olduğunu kontrol edin. Tectorial membranın çıkarıldığı saç hücrelerinin alanının yukarı baktığından emin olun. Baziler membranın, modiyolüsün kesilmiş, bazal kısmı ile birlikte aşağı baktığından ve lameline yapıştığından emin olun.
- Muayene üzerine numune ters çevrilmişse, pipet ucunda kalmış olan HBSS'yi kılıfın içine yerleştirin ve doğru şekilde yönlendirilene kadar parçayı yeniden konumlandırın.
YOK HAYIRTE: Bu, saç hücrelerinin, lamesten yapısal olarak destek almadan kültür ortamında yüzmesini önleyerek dejenerasyona neden olabilir.
- Muayene üzerine numune ters çevrilmişse, pipet ucunda kalmış olan HBSS'yi kılıfın içine yerleştirin ve doğru şekilde yönlendirilene kadar parçayı yeniden konumlandırın.
- 1 mL'lik pipeti kullanarak fazla HBSS'yi aspire edin. 15 saniye bekleyin.
- Hazırlanan sıcak kültür ortamından (% 98 DMEM,% 1 N-2 ve% 1 ampisilin) doğrudan doğruya örnek üzerine pipetleyin. Numuneye pipet ile dokunmamaya dikkat edin. İç ve dış petri kapaklarını değiştirin ve O / N'yi 37 ° C'de inkübe edin.
- Stok çözümlerinin tümünü uygun yerlerine geri koyun, karkasları ve kalıntı atıkları imha edin, cerrahi masayı kurumsal talimatlara ( örn., Etanol veya hipoklorit) göre dezenfekte edin, aletleri temizleyin ve otoklavlayın ve kesikleri uygun kutuda atın .
4. Nihai Kültür Ortamı ve Çıkan Maddeleri Ekleme
NOT: Koklear eksplantlar 10-16 saat sonra kullanıma hazır hale gelecektir.
- Bir karışık hazırla% 1 DMEM,% 1 sığır fetüsü serumu (FBS),% 1 N-2 ve% 1 ampisilin (bir mikro santrifüj tüpünde oyuk başına 65 uL; kullanımdan önce çözeltiyi 25 ° C'ye ısıtın).
- İlgili tedavi gruplarının çözümlerine diğer ilgi maddelerini ekleyin. Floresan maddeler eklenirse ( örneğin, yeşil flüoresan proteini (GFP) ifade eden virüsler; son yayında, 50 μL'de 48 saat boyunca 10 10 GC Adeno-İlişkili Virüsler (AAVs) konsantrasyonu kullanıldı. Işık.
- Kuluçkadan koklear eksplant içeren petri kaplarını aktarın ve bunları laminer akış kaputunun altına yerleştirin.
- Eski kültür ortamını (w / o FBS) pipetlerle kakmalara aspire edin.
- Hazırlanmış sıcak kültür (tedavi) ortamı (% 97 DMEM,% 1 FBS,% 1 N-2,% 1 ampisilin ve ilgi konusu maddeler) başına oyuk başına 60 mcL ekleyin.
- Petri kabını tekrar kuluçka makinesine yerleştirin (37 ° C).
- Görüntüle rHücresel göç veya koklear eksplantın ayrılması belirtilerini belirlemek ve en fazla 7 gün sonra boyama yapmak için mikroskop altında egularly kullanın.
5. İmmünofloresans - Gün 1
- Bloke edici çözelti hazırlayın (% 94 Fosfat Tamponlu Tuz (PBS),% 5 normal keçi veya at serumu (ikincil antikorlara bağlı olarak NGS / NHS) ve% 1 noniyonik sürfaktan (Malzeme Tablosuna bakın) ve stok Antikor çözeltisi (% 98.6 PBS,% 1 NHS ve ilgili antikorlar ile% 0.4 non-iyonik yüzeyaktif madde).
NOT: Antikorlar, 1: 400+ (iç ve dış saç hücreleri için miyozin 7A) ve fare anti-TuJ1 1: 200+ (β-tubulin, SGN'ler için) VEYA fare (IgG1) anti konsantrasyonunda tavşan anti-Myo7A'yı içerir 1: 50+ (postsinaps için postsinaptik yoğunluk) ve tavuk anti-NF-H1: 1000+ (nevrofilament, anti-PSD95 1: 200+ (presynap için c-terminal bağlama proteini), fare (IgG2a) SGN'ler ve sinir lifleri için). "+" MeaNs "veya daha yüksek." - Bir pipet kullanarak kültür ortamı aspire. Numuneye dokunmamaya özen gösterin.
- Laminer akış kaputunun altında, koklear eksplantları steril PBS ile iki kez durulayın, her yıkamadan sonra 5 dakika boyunca çalkalayıcıya numuneler koyun.
- Çalkalayıcıda (kaputun altında) 20 dakika% 4 paraformaldehid (PFA - DİKKAT) içindeki dokuyu düzeltin. PFA'yı aspire edin.
- Koklear eksplantlara 60 μL PBS uygulayın ve 5 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde petri kabı yerleştirin. PBS'yi aspire. 3 kez tekrarlayın.
- Koklear eksplantları çalkalayıcıda 30 dakika boyunca hazırlanmış bloke etme çözeltisine (% 94 PBS,% 5 NHS ve% 1 noniyonik yüzeyaktif madde) yerleştirin.
- Koklear eksplantlar RT'de bir sayaçta O / N ilgili primer antikorlar (vorteks) kullanılmadan hazırlanmış bir stok antikor çözeltisine (% 98.6 PBS,% 1 NHS ve% 0.4 noniyonik sürfaktan) yerleştirin.
NOT: Petri kaplarını nemli kağıt havluyla plastik sargıyla sarın (veya eklenen çözelti alüminyum folyoya sarınIyon, bulaşıkları nemli tutmak ve O / N antikor çözeltisinin buharlaşmasını önlemek için, GFP ifade eden virüsler gibi floresan materyalleri içerir).
6. İmmünofloresan - 2. Gün
- Adım 5.1'de birincil antikorları tamamlayan doğru ikincil antikor karışımlarını elde etmek için 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) leke (300 nM) hazırlayın ve stok antikor çözeltisini kullanın. (IgG1) 568 1: 1000+, keçi anti-fare (IgG2a) 488 1: 500+, keçi anti-fare (IgG1) 568 1: 200+ ve keçi anti- Ve keçi anti-tavuk 647 1: 200+ VEYA Phalloidin 568 1: 200+ (iç ve dış saç hücreleri için)).
- Birincil antikor çözeltisini aspire edin.
- Koklear eksplantlara 60 μL PBS uygulayın ve 5 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde petri kabı yerleştirin. PBS'yi aspire. 3 kez tekrarlayın.
- Koklear eksplantlar hazır stok antikor çözeltisine (% 98.6 PBS,% 1 NHS ve% 0.4 non-iyonik yüzeyaktif madde) res ile yerleştirinSekonder antikorları (kullanımdan önce girdaplı) 1.5 saatlik bir sayaç üzerinde tutun ve ışığa karşı koruyun.
- İkincil antikor çözeltisini aspire edin ve koklear eksplantları DAPI lekesi ile durulayın (1 dakika çalkalayıcıya yerleştirin ve daha sonra aspire edin).
- Koklear eksplantlara 60 μL PBS uygulayın ve 5 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde petri kabı yerleştirin. PBS'yi aspire. 3 kez tekrarlayın.
- 4 yuvalı plakadan örneklerle lamelleri çıkarmak için forseps kullanın, damıtılmış H 2 O ile dolu bir alıcıya batırın ve lamelleri dikey olarak kağıt havluyla temas ettirerek kurutun.
- Mikroskop slayt üzerine antifade bir orta montaj bir damla yerleştirin ve orta aşağı doğru bakan doku batırın lamelleri ters çevirin.
- Kenarları çevresel olarak temizleyen (camın altındaki örneği ezmeden) temiz tırnak cilasını kullanarak lamelleri mühürle. Slaydları, ışıktan uzakta kapalı bir alanda düz durarak bırakın ve 15 ila 20 dakika kuruyana kadar bekleyin.Bunları bir kutuya yerleştirin veya konfokal mikroskop altında inceleyin.
NOT: Floresan boyama, slaytları 4 veya -20 ° C'de saklayarak en iyi korunur.
7. Konfokal Görüntüleme
- Nöritleri ve SGN'leri içeren Corti bölgesinin organı için genel bir bakış ve yakınlaştırılmış resimler elde edin.
NOT: Görüntüleme işlemi için standart ayarlar: 1,024 x 1,024 piksel, 400 Hz hızı, 3 çerçeve ortalaması,% 20 toplam lazer yoğunluğu ve genellikle 20X ve 63X'lık yağ daldırma lensi (potansiyel olarak 2X dijital zoom ile birlikte). DAPI, Myo7A ve TuJ1 boyama protokolü için kanal ayarları yukarıda özetlenmiştir: 405% 5 DAPI, "Akıllı Kazanç" 766,8V, "Akıllı Ofset"% 0,0 -% 488 15% floresan izotiyosiyanat (FITC), "Akıllı Kazanç" 622,2V , "Akıllı Ofset"% 0.0 -% 561 13 tetrametilhomadin izotiyosiyanat (TRITC), "Akıllı Kazanç" 562.4V, "Akıllı Ofset"% 0.0. - Resimleri kullanarak z-yığınını birleştirin.Yazılımı kullanarak z-ekseni projeksiyonu elde edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Birçok protokol Corti eksplant organına odaklanırken, bu teknik SGN'ler de dahil olmak üzere tüm koklear dönüşün anatomisini korumaya çalışmaktadır. Bu, araştırmacılara belirli bir tedavinin Corti organına ek olarak SGN'lerin nöritleri ve somatları üzerindeki etkilerini analiz etme olanağı sağlar. Modülün bir bölümünü koruyan bir diseksiyon gerçekleştirmek, burada açıklandığı gibi, yalnızca Corti organını eksprese etmekten daha teknik açıdan zorlayıcıdır. Bununla birlikte, nörit ve SGN alanı önemlidir, çünkü aynı metodolojiyi kullanarak 19,20 iki yayında vestibüler schwannoma sekresyonlarını ( Şekil 1 ) ve ekstraselüler vezikülleri uyguladıktan sonra bu bölgede belirgin patolojik etkiler gözlemlenmiştir. Bu değişiklikler, Corti eksplantlarının izole organı kullanılarak açığa çıkarılamaz.
thHasar gören veya GFP ifade hücrelerini, iç hücreleri ve dış saç hücrelerini, destekleyici hücreleri ve SGN'leri belirlemek, manuel sayımla veya ImageJ eklentisi NeuronJ'de yerleşik olan gibi otomatik bir işlemle gerçekleştirilebilir. Bu sayımların temsili alanları toplam sayımlarla korelasyonunu teyit ettikten sonra oluşturulabilir. 3D rekonstrüksiyonlar, SGN'lerin z-ekseni projeksiyonlarındaki bindirme etkilerini hariç tutmak için özellikle yararlıdır. Fiber organizasyonu, verilen alan başına SGN sayısı ve SGN soma alanı değerlendirilebilir. Sinapslar, saç hücreleri ve nevritlerin boyanması ve sayımı Şekil 2'de gösterilmektedir; Aynı protokol koklear tüm montajlar için de kullanılabilir ve bu amaçlar için güvenilir bir model olarak gösterilmiştir 17 , 21 , 22 . Diğer araştırmacılar deneysel paradigmalara da dahil olabilecek zarif alternatif yöntemler geliştirmiştir 23 </ Sup> , 24 .
Kültür maksimum uzunluğu genellikle hücresel göç başlangıcı ile sınırlıdır ve kültür ortamında FBS konsantrasyonuna bağlıdır. FBS oranı yüzde beşten üç ya da yüzde bir'e düştüğünde, anatomik olarak bozulmamış bir koklear eksplantın sürdürülmesi için süre yaklaşık bir haftadır uzatıldı ( Şekil 3 ).
Şekil 4 , 48 saat boyunca Anc80 sentetik adeno ilişkili virüs vektörü ile transdüksiyon sonrası GFP pozitif koklear eksplant hücrelerini göstermektedir. 3D yeniden yapılanma, SGN alanında GFP pozitif hücrelerin miktarının belirlenmesine yardımcı olabilirken, iç saç hücreleri, dış saç hücreleri ve destekleyici hücreler bu görünümde nicelleştirilebilir. Farklı viral serotipler, bazı ülkelerdeki transdüksiyon etkinliği bakımından karşılaştırılabilirAnlatılan metodolojiyi kullanarak yazın 18 .
Şekil 1: Büyük Aurikular Sinirler veya Vestibüler Schwannomalardan 48 saat boyunca Sekresyonlarla Kuluçka Sonrası Apikal ve Bazal Bölgelerden Koklear Eksplantların Temsilcisi Konfokal Mikroskopi Görüntüleri . ( A ) Bir eksplantın genel görünüşü. Dikdörtgen yakın çekim görüntülerinde alanı işaretler. Ölçek çubuğu = 200 μm. Saç hücrelerinin ve nevritlerin büyütülmüş görüntüleri ( B - E ). Ölçek çubuğu = 50 μm. Yeşil = Myosin 7A (Myo7A), saç hücrelerini lekeler; Kırmızı = sınıf III beta-tubulin (Tujl) lekeleri nöronal yapıları. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Koklear Eksplant Saç Hücresi Bölgesinin Konfokal Mikroskopi Görüntüsü. ( A ) bozulmamış sinapslar, sinirsel yapıların (nevrofilament, mavi) boyanması ile birlikte presinaptik (C-terminal bağlayıcı protein, kırmızı) ve postsinaptik (postsinaptik yoğunluk-95, yeşil) proteinleri etiketleyerek değerlendirilebilir. OHC, dış saç hücreleri; IHC, iç saç hücreleri. Ölçek çubuğu = 10 μm. ( B ) İç saç hücreleri (kırmızı ok kafa) ve nevrit (mavi ok kafa) sayısı ile iç saç hücresi bölgesine odaklanın. Nöronal yapıların ayrışması nedeniyle, sayım sırasında iç saç hücrelerinden mesafeyi standartlaştırmak önemlidir (beyaz çerçeveyle vurgulanarak doğrudan sinapslara bağlı). Ölçek çubuğu = 5 μm. ( C ) Ayrı sinapsların yakınlığı (beyaz ön ok işaretli iki pre ve postsinaptik çift). Ölçek çubuğu = 1 & 181. m. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Kültürde 7 gün sonra% 3 veya% 1 FBS ile Apikal ve Bazal Koklear Eksplantların Temsilci Konfokal Mikroskopi Görüntüleri. ( A ve B )% 3 FBS ile inkübe edilen hücreler 4 ila 5 gün arasında (gövde hücreleri için açık gri oklar, nevritler için kırmızı oklar), ( C ve D ) göç etmeye başlarlar.% 1 FBS'deki eksplantlar 7. güne kadar örgütsel bütünlüğü korurlar. Açık gri: Myosin 7A (Myo7A), tüm saç hücrelerini boyar; Kırmızı: sınıf III beta-tubulin (Tujl) lekeleri nöronal yapıları. OHC, dış saç hücreleri; IHC, iç saç hücreleri. Ölçek çubuğu = 100 μm, tüm panellere uygulanır.Iles / ftp_upload / 55704 / 55704fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürden daha büyük sürümünü görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: Sentetik Adeno-ilişkili Virüs Vektörü Anc80'ye 48 saat maruz bırakıldıktan sonra bir Koklear Eksplant'un Konfokal Mikroskopi Görüntüsü. Transduced hücreler GFP'yi ifade eder (yeşil). Myosin 7A (Myo7A, mavi) lekeleri Dış Saç Hücreleri (OHC) ve İç Saç Hücrelerini (IHC); Sınıf III beta-tubulin (Tuj1, kırmızı) lekeleri nöronal yapıları. Supp .: Sox2-pozitif destekleyici hücrelerin alanı; SGN, spiral ganglion nöronları. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Araştırmacılar, koklear eksplantları içeren deneyleri yapmadan önce diseksiyon tekniğini mükemmelleştirmelidirler. Saç hücreleri, öğrenme eğrisinin başlarında gerçekleştirilen diseksiyonlar sırasında sıklıkla hasar görürler ve bütünlüğü için özellikle sorunlu bir an, sabit eller, uygun araçlar ve deneyim gerektiren, tectorial membranın çıkarılmasıdır. Zamandan ve kaynaklardan kazanmak için diseksiyon mikroskopu altında görsel bir kontrol yapılmalı ve potansiyel olarak hasar gören alanlar belirtilmelidir. Pahalı primer ve sekonder antikorları kullanmak yerine, phalloidin gibi daha ucuz reaktifler ön deneyler için daha uygundur. Hafif hasar görmüş eksplantlar potansiyel olarak bazı deneylerde kontrollerden (etkilenmemiş bölümlerin analizi) veya yeni antikor kombinasyonlarının test edilmesi için kullanılabilir.
Numunelerin transferi de özellikle önemlidir, ünkü parçaların("Kayan" saç hücreleri, kaplamalı lamellerin yönlendirilmesi olmadan genellikle dejenere olmaz) ters çevrilmemiştir. Lamel üzerindeki merkezi bir konum, tüm diğer pipetleme adımlarını kolaylaştırır.
Yeni bileşikler içeren negatif kontrol denemeleri için (bu besiyerinin açıkça çözünür olması gerekir), eksplantlara uygun aracı uygulamak ve sadece muamele edilmemiş eksplantlara odaklanmamak önemlidir. Örneğin, ticari bir ilaç aktif maddenin yanı sıra sodyum sitrat içeriyorsa, sodyum sitrat negatif kontrol koklear eksplantlarına eklenmelidir, çünkü sodyum sitratın bir etkisi olabilir.
Koklear eksplantların kullanımıyla ilgili sınırlamalar arasında, bu organotipik kültürlerin tipik olarak postnatal gelişimsel değişiklikler geçiren genç yavrulardan türetilmesi ve eksplant boyunca iyonik bir gradyan eksikliğinin normal için gerekli olduğu gerçeğini içermektedirIn vivo işitme. Bununla birlikte, protokolün faydası AAV'ler 18 ile ilgili yakın tarihli bir yayında zorlayıcı bir şekilde gösterilmiştir. Bu vektör grubu, yaklaşık 4.7 kb ambalajlama kapasitesiyle sınırlı iken, birkaç insan sendromunun tedavisinde önemli bir kaynak haline gelmiştir26. Koklear eksplant modelini kullanarak, yukarıda anılan yayın, Anc80 virüsünün, saç hücreleri ve SGN'ler de dahil olmak üzere çeşitli koklear hücrelerin transdüksiyonunda geleneksel AAV serotiplerinden daha iyi performans gösterdiğini ortaya koydu. Bu in vitro bulgular daha sonra in vivo fare yavrularında yuvarlak pencere aracılığıyla en umut verici adayları seçerek teyit edildi. Ex vivo modeli, kokleanın anatomisini başarıyla tekrar elde etmenin bir yolunu sağlar, böylece in vivo çalışma için gerekli zaman ve kaynakları azaltır 27 .
Ex v'nin bir diğer avantajıIvo modeli, SNHL'ye katkıda bulunan spesifik hücresel mekanizmaların çalışmasına uygulanma potansiyelidir. Tümör mikro ortamında bulunan bileşikleri ( örn., Insan tümörü salgıları) bir eksplanta uygulayarak, bu bileşiklerin kokleaya etkisi doğrudan görselleştirilebilir ve potansiyel ilaç terapilerinin etkinliği veya toksisitesi değerlendirilebilir. Bu önemlidir, çünkü insan kokleası biyopsi edilemez ve içindeki hücreler canlı olarak görülemez. Örneğin, yakın tarihli bir yayın, vestibüler sinirlerden kaynaklanan ve hastaların% 95'inde işitme kaybına neden olan intrakranyal tümörler olan vestibüler schwannomalardan salınan proteinlerin ototoksik potansiyelini incelemiştir. Koklear eksplantlara insan tümör sekresyonları uygulamak, kontrollü sağlıklı insan sinirlerinden elde edilen salgılarla karşılaştırıldığında, bu sekresyonların koklea 19 üzerindeki toksik etkilerini doğrulamıştır. Aynı deney, bir in vivo tekrarlamak zordurModel, bir immünokompetan farede ortaya çıkacak olan insan proteinlerine karşı immünojenik tepki nedeniyle ortaya çıkmaktadır.
Özetle, bu el yazması, ex vivo modelde koklear saç hücrelerinin, sinapsların, nevritlerin ve nöronların eş zamanlı çalışılmasını sağlayan bir teknik sunmaktadır. Bu model, in vivo olarak test edilmeden önce aday terapötik bileşiklerin 18 taranmasını potansiyel olarak hızlandırırken insan serumu 19 , 20'deki faktörler de dahil olmak üzere, kokleaya 28 yeni moleküllerin etki mekanizmalarını anlama konusunda yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Ulusal Araştırma Enstitüsü tarafından R01DC015824 (KMS) ve T32DC00038 (SD'yi destekliyor), Savunma Bakanlığı hibe W81XWH-15-1-0472 (KMS), Bertarelli Vakfı (KMS) tarafından desteklenmiştir. Nancy Sayles Day Vakfı (KMS) ve Lauer Tinnitus Araştırma Merkezi (KMS). Yazı hakkında anlayışlı yorumlar için BA'ya Jessica E. Sagers'e teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin, Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | |
| anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
| anti-Myo7A antibody, rabbit | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| anti-NF-H antibody, chicken | EMD Millipore | AB5539 | |
| anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) | Antibodies Inc. | 75-028 | |
| anti-TuJ1 antibody, mouse | BioLegend | 801202 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg | Corning | 354241 | |
| CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner rings | Greiner Bio-One | 627170 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Clear Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50 x 7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
| Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mm | Ted Pella Inc. | 260368 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Distilled water, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 Forceps (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer |
| goat anti-chicken-647 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
| goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
| goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
| goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| goat anti-rabbit-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
| H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Instrument Tray with Lid Stainless Steel | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
| Micro (dissecting) knife – angled 30° | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 | VWR | 16004-382 | |
| N-2 Supplement (100X), 5 mL | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| NaOH, sodium hydroxide solution, 1 L | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Normal Horse Serum (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
| Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
| Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Phalloidin, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Prep Pad, Non Sterile | Medline | 05136CS | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Scalpel Blades - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| TCS SP5 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton-X (non-ionic surfactant) | Integra | T756.30.30 | |
| VectaShield antifade mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6'' - 2 mm thick | Zipline | 0609132541599 |
References
- Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf (2000).
- Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062 (2014).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones. J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).
- Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice. PLoS One. 10 (5), (2015).
- Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear. Hear Res. , 83-93 (2016).
- Wang, H. C., et al. Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells. Cell. 163 (6), 1348-1359 (2015).
- Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, (2011).
- Dinh, C., et al. Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants. Otolaryngol Head Neck Surg. 148 (5), 834-840 (2013).
- Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti. Neurosci Lett. 501 (2), 67-71 (2011).
- Kao, S. Y., et al. Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss. Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).
- Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry. J Vis Exp. (58), e3432 (2011).
- Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation. J Vis Exp. (95), e52260 (2015).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), (2010).
- Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants. J Vis Exp. (93), e52101 (2014).
- Wang, Q., Green, S. H. Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro. J Neurosci. 31 (21), 7938-7949 (2011).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
- Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. , (2016).
- Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).
- Yuan, Y., et al. Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy. J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).
- Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).
- Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea. Neuroscience. , 50-62 (2016).
- Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
- Shu, Y., et al. Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes. Hum Gene Ther. , (2016).
- Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear. Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).
