Summary
وتستخدم المقايسات المنافسة الببتيد على نطاق واسع في مجموعة متنوعة من التجارب الجزيئية والمناعية. هذه الورقة تصف طريقة مفصلة لفي المختبر أوليغوببتيد-تنافس فحص كيناز وإجراءات المصادقة المرتبطة بها، والتي قد تكون مفيدة للعثور على مواقع الفسفرة محددة.
Abstract
فسفرة البروتين في مواقع محددة يحدد التشكل والتفاعل مع جزيئات أخرى. وهكذا، يؤثر الفسفرة البروتينية على الوظائف البيولوجية وخصائص الخلية. حاليا، الأسلوب الأكثر شيوعا لاكتشاف مواقع الفسفرة هو التحليل اللوني السائل / قياس الطيف الكتلي (لك / مس)، طريقة سريعة وحساسة. ومع ذلك، غالبا ما يتم الإفراج عن شظايا الفوسفات خفيف نسبيا من فوسفوببتيدس خلال خطوة تجزئة، والتي غالبا ما تعطي إشارات سلبية كاذبة. في مثل هذه الحالات، فإن مقايسة كيناز التقليدية في المختبر باستخدام المسوخ الموجهة للموقع تكون أكثر دقة، ولكن هذه الطريقة شاقة وتستغرق وقتا طويلا. ولذلك، فإن طريقة بديلة باستخدام المنافسة الببتيد قد تكون مفيدة. تم إنشاء عزر الاعتراف بالإجماع من 5 'كينوس الأدينوزين أحادي الفوسفات كيناز (أمك) 1 وتم التحقق من صحة باستخدام الموضعية مسح الببتيد مكتبة الحمارأي 2 . وهكذا، يمكن توقع مواقع الفسفرة أمك لركيزة الرواية وأكدت من قبل المقايسات المنافسة الببتيد. في هذا التقرير، ونحن تصف الخطوات والإجراءات التفصيلية للالمختبر في أوليغوبيبتيد تنافس مقايسة كيناز من خلال توضيح أمك عامل بوساطة النووية إريثرويد 2 ذات الصلة عامل 2 (Nrf2) الفسفرة. لمصادقة موقع الفسفرة، قمنا بتنفيذ متتابعة في المختبر فحص كيناز باستخدام متحولة موقع محدد. وعموما، يوفر فحص المنافسة الببتيد طريقة لفحص مواقع الفسفرة المحتملة متعددة وتحديد المواقع للتحقق من قبل المسوخ الفسفرة.
Introduction
فوسفهوريلات البروتين في بقايا محددة يلعب دورا هاما في مجموعة واسعة من العمليات الخلوية. وهكذا، يتطلب فهم شبكات التشوير تحديد مواقع فسفرة معينة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن موقع الفسفرة يحدد تأثير على وظيفة البروتين لأن المجالات الفردية داخل البروتين تمتلك هياكل ووظائف مختلفة. نشاط العامل النووي 2 عامل ذات الصلة 2 (Nrf2)، عامل النسخ المضادة للأكسدة الرئيسية، هو ثنائي الاتجاه ينظم من خلال الفسفرة في مواقع مختلفة. وقد ركزت دراساتنا على الكينازات التي تحفز الفسفرة من Nrf2. استجابة الضغط من Nrf2 ضد التحدي التأكسدي يحدث بسرعة، وذلك أساسا من خلال الفسفرة في سيرين 40 و بوساطة بروتين كيناز C (ييك) -δ، الذي ينشط Nrf2 3 ، 4 . على العكس، فان يحفز الفسفرة المثبطة من Nrf2 في التيروزين 568 للرقابة الصارمة على النشاط 5 .
الطريقة الأكثر شيوعا المستخدمة لاكتشاف مواقع الفسفرة هي التحليل اللوني السائل / قياس الطيف الكتلي (لك / مس). يمكن إنشاء بيانات رسم الخرائط الموقع الفسفوري السريع وحساسة للغاية بهذه الطريقة. ومع ذلك، فقد العديد من القيود التقنية، وغالبا ما تولد إشارات سلبية كاذبة. وغالبا ما يحدث تغطية متوالية ضعيفة في تحليل لك / مس. لتحديد مواقع الفسفرة، مطلوب معلومات عن أقصى تغطية الأحماض الأمينية للبروتين 6 . انحلال البروتين من الاهتمام مع العديد من البروتياز خلال خطوة الهضم قد يكون من المساعدة في تحسين تغطية تسلسل. عقبة أخرى لتحديد بقايا الفسفرة هو فقدان الوجه من حامض الفوسفوريك التي كثيرا ما لوحظ لببتيدات السيرين و ثريونين فسفوريلاتد 6 ، 7 . غالبا ما تكون شقوق الفوسفات المعويةصدر من فوسفوببتيدس خلال عملية تجزئة 7 . الخيار الثاني عند البحث عن مواقع الفسفرة يستخدم طريقة ميكروأري الببتيد. فمن الممكن للشاشة للمواقع المستهدفة كيناز باستخدام شريحة ميكروأري تحتوي على شظايا الببتيد المستمدة من بروتين من الفائدة. ومع ذلك، ويرجع ذلك إلى متطلبات المعدات لإنتاج والكشف عن رقاقة ميكروأري، وتعتبر طريقة ميكروأري الببتيد تستغرق وقتا طويلا ومكلفة.
للتغلب على هذه التحديات، يمكن أن تستخدم في المختبر أوليغوبيبتيد تنافس مقايسة كيناز لكيناز البروتين مع زخارف معروفة الاعتراف. إذا تم إنشاء عزر الاعتراف بالإجماع من كيناز، يمكن توقع مواقع فسفوريلاتيون المفترضة من الركيزة مرشح، ويمكن التحقق من صحة المواقع. الطريقة الأكثر إقناعا لهذا الإجراء هو إظهار إلغاء الفسفرة في بروتين متحولة التي التنبؤد بقايا مع حمض أميني غير فسفوري ( أي سيرين أو ثريونين إلى ألانين؛ التيروزين إلى فينيل ألانين). ومع ذلك، فإن إنتاج وعزلة البروتينات متحولة تستغرق وقتا طويلا. كبديل في المرحلة الأولى من البحث، والببتيد اختبار كيناز الببتيد هو واضح ومريح. هنا، نحن تصف بروتوكول لفي المختبر فحص الببتيد المنافسة وللتحقق من موقع الفسفرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. السلامة
تنبيه: يستخدم هذا البروتوكول [γ- 32 P] -ATP لتقييم نشاط أمك. الفوسفور -32 هو نظير مشع، ينبعث منها إلى حد كبير الإشعاع بيتا. وبما أن حجم الجسيمات بيتا صغير للغاية، فإنه يمكن بسهولة اختراق الملابس والجلد. قد يكون التعرض الخارجي والداخلي للإشعاع بيتا ضارا بصحة الإنسان، بما في ذلك عن طريق التسبب في حروق الجلد وتلف الأنسجة.
- قم بتنفيذ جميع الخطوات التي تتطلب استخدام [γ- 32 P] -ATP باستخدام الحماية المناسبة، مثل التدريع الاكريليك.
- التأكد من أن جميع الموظفين مجهزين بمقاييس الجرعات الإلكترونية الإلكترونية (إبد) لمراقبة مدى التعرض للإشعاع الضار خلال جميع الإجراءات.
- التعامل مع الإشعاع المصدر المفتوح فقط بعد التدريب المناسب والموافقة التنظيمية.
ملاحظة: هنا، أجريت جميع التجارب بعد الانتهاء من التدريب على استخدام المصادر المفتوحة للإشعاع في جامعة سيول الوطنيةوإقرار الحكومة الكورية (nssc.go.kr/nssc/en). - التخلص من النفايات المشعة وفقا للوائح المحلية.
ملاحظة: هنا، اتبعت توجيهات من معهد حماية البيئة والسلامة من جامعة سيول الوطنية. وفيما يلي قائمة بالمنظمين في الولايات المتحدة والبلدان الأوروبية: الولايات المتحدة الأمريكية، لجنة الولايات المتحدة التنظيمية النووية (http://www.nrc.gov/)؛ المملكة المتحدة، الصحة والسلامة التنفيذية (هس) (http://www.hse.gov.uk)؛ فرنسا، Autorité دي sûreté نوكليير (https://www.asn.fr/)؛ وألمانيا، والوزارة الاتحادية للبيئة، وحفظ الطبيعة، والبناء والسلامة النووية (http://www.bmu.de).
2. في المختبر تنافسية كيناس الفحص
- بناء الببتيدات التنافسية
- تحديد عزم الإجماع الفسفوريلاتد من قبل أمك.
ملاحظة: تعترف أمك عزر الإجماع،# 934؛ - [X، β] -XX-سر / منتدى المجالس الرومانسية-XXX-Φ. في تسلسل الإجماع، Φ يمثل الأحماض الأمينية مسعور ( أي فالين [V]، ليوسين [L]، ميثيونين [M]، والأيزولوسين [I]) و β يمثل الأحماض الأمينية الأساسية ( أي ليسين [K]، أرجينين [ R]، والحامض الاميني [H]) 1 . - حدد سيرين أو بقايا ثريونين من تسلسل الهدف وفقا لعزر الإجماع أعلاه. استخدام ثلاثة مواقع المفترضة من Nrf2 الإنسان (# 1، 148-157 تتألف من Ser153، # 2، 330-339 تتألف من Ser335، و # 3، 553-562 تتألف من Ser558) 8 .
- تجاريا توليف 10-الببتيدات بقايا التي تحاكي المواقع المفترضة. الحصول على المنتج توليفها كما مسحوق مجفف بالتجميد مع نقاء أكبر من 98٪ لكل الببتيد.
- حل الببتيدات باستخدام العازلة كيناز لتحقيق تركيز 71.667 جم / لتر. إذا الببتيد غير قابل للذوبان في المخزن المؤقت كيناز، حله في 20٪ دمسو. إذا كان لا يزال غير قابل للذوبان، والببتيد محاكاة وضعيمكن توسيع موقع أكتيف لزيادة الذوبان.
- تحديد عزم الإجماع الفسفوريلاتد من قبل أمك.
- في المختبر تنافسية أمك كيناز الفحص
- إعداد 5 × كيناز العازلة على النحو التالي: 100 ملي هيبيس، ودرجة الحموضة 7.4. 25 ملي مغكل 2 ؛ 5 ملي إغتا؛ 5 ملي دت؛ 125 ملي β-غليسيروفوسفهات (سيرين / ثريونين الفوسفاتيز المانع). 5 ملي نا 3 فو 4 (التيروزين فوسفاتيز المانع). 0.5٪ (الخامس / الخامس) بروتياز مثبط كوكتيل مجموعة الثالث، 1 ملي أتب الباردة. و 500 ميكرومتر أمب.
ملاحظة: أمب هو عنصر أساسي من العازلة كيناز لاختبار نشاط أمك. يمكن استخدام المخزن المؤقت لقياس نشاط كل من سيرين / ثريونين كينازس و كينازات التيروزين. - ذوبان الجليد البروتين المؤتلف التالية والببتيدات الاصطناعية على الجليد: أمك. Nrf2. و أوليغوببتيدس # 1، # 2، و # 3.
- إعداد المخزن المؤقت رد فعل على الجليد: 0.15 ميكروغرام من أمك، 0.4 ميكروغرام من Nrf2 (~ 4 بمول)، 0.43 ملغ من أوليغوببتيد (~ 300 نانومول)، و 6 ميكرولتر من 5 × كيناز العازلة. ادجوست الحجم النهائي إلى 30 ميكرولتر مع الماء المقطر المعقم (دو).
ملاحظة: إضافة [γ- 32 P] -ATP بعد إعداد المخزن المؤقت رد فعل قد يقلل من إشارة مشعة بسبب الكيناز الفوسفورية الذاتية.
- إعداد 5 × كيناز العازلة على النحو التالي: 100 ملي هيبيس، ودرجة الحموضة 7.4. 25 ملي مغكل 2 ؛ 5 ملي إغتا؛ 5 ملي دت؛ 125 ملي β-غليسيروفوسفهات (سيرين / ثريونين الفوسفاتيز المانع). 5 ملي نا 3 فو 4 (التيروزين فوسفاتيز المانع). 0.5٪ (الخامس / الخامس) بروتياز مثبط كوكتيل مجموعة الثالث، 1 ملي أتب الباردة. و 500 ميكرومتر أمب.
- تشغيل رياكتانتس
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع العمليات أدناه تحت الحماية مع درع الاكريليك، رف، أو كتلة، فضلا عن معدات الوقاية الشخصية المناسبة.- تعيين كتل التدفئة إلى 30 درجة مئوية قبل بدء التجربة.
- إضافة 1 ميكرولتر من [γ- 32 P] -ATP (1 μCi) إلى أنابيب التفاعل على الجليد. مزيج المخزن المؤقت رد فعل من قبل بيبتينغ صعودا وهبوطا عدة مرات.
ملاحظة: النشاط الإشعاعي من 32 P لديه نصف عمر قصير من حوالي 14 يوما 9 . ضبط مستوى الصوت من خلال النظر في نصف عمر (على سبيل المثال، بعد شهر واحد من إنتاج [γ- 32 P] -ATP، إضافة 4 ميكرولتر من [γ- 32 P]-ATP لجعل 1 μCi). - احتضان العينة في كتلة التدفئة في 30 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة. خلال هذه الخطوة، وإعداد 7.5٪ دوديسيل الصوديوم بولي أكريلاميد هلام الكهربائي (سدز-بادج) المواد الهلامية. ضبط نسبة الجل وفقا لحجم البروتين المستهدف.
- وقف رد فعل كيناز عن طريق إضافة 3 ميكرولتر من 10 × سدز عينة عازلة (10٪ (V / V) الجلسرين، و 20٪ (ث / ت) سدز، 15.42٪ (ث / ت) ديثيوثريتول، 90٪ (ت / ت) 0.5 M تريس-هكل (الرقم الهيدروجيني 6.8)، و 0.02٪ (ث / ت) بروموفينول الأزرق). مزيج المخزن المؤقت رد فعل من قبل بيبتينغ صعودا وهبوطا عدة مرات.
- تشغيل العينات في هلام سدز-بادج 7.5٪ في 70 V لمدة 20 دقيقة وبشكل مستمر في 140 V لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: الخط الأزرق بروموفينول في نهاية هلام يحتوي على إشارات إشعاعية عالية للغاية. فمن المستحسن لإزالة هلام تحت الخط الأزرق قبل الشروع في الخطوة التالية للحد من إشارات الخلفية. - بعد سدز-بادج، بلطف إزالة هلام من العجلات. ضع الجل في الزجاج tأوب للخطوة التالية.
- إصلاح هلام مع العازلة التثبيت لمدة 20 دقيقة (50٪ الميثانول و 10٪ حمض الخليك الجليدي).
- حرك بلطف هلام على ورق الترشيح وتغطيته مع المجمع شفافة. لاحظ أن الجل يمكن مزقها بسهولة في هذه الخطوة. تجفيف هلام مع مجفف هلام فراغ في 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- تصور
- فضح الجل إما إلى شاشة الفوسفور أو فيلم الأشعة السينية بين عشية وضحاها (عادة لمدة 16 ساعة تقريبا).
ملاحظة: يمكن إعادة استخدام شاشة الفوسفور بعد التعرض للضوء الزائد. عندما يتم استخدام فيلم الأشعة السينية، فضح الجل على مدى يومين. أفلام الأشعة السينية لديها حساسيات أقل من شاشات الفوسفور. - مسح شاشة الفوسفور مع تصوير الفوسفور. قم بتصدير الصورة كملف تيف عالي الدقة أو ملف صورة نقطية.
- بعد التصور، نقل هلام إلى الزجاج أو حاوية بلاستيكية ل كوماسي الزرقاء الرائعة (كبب) تلطيخ.
- غسل هلام مع دو. تجاهل دو وصمة عار ثe هلام مع كاشف تلطيخ لمدة 1 ساعة.
- تجاهل كاشف وإزالة هلام مع دو لمدة 1 ساعة أو بين عشية وضحاها. وضع الجل بين الأفلام البلاستيكية الشفاف (أو ما يعادلها) لمسح مع الماسح الضوئي المكتب.
- فضح الجل إما إلى شاشة الفوسفور أو فيلم الأشعة السينية بين عشية وضحاها (عادة لمدة 16 ساعة تقريبا).
3. في المختبر كيناز الفحص باستخدام المسوخ محدد الموقع
- التوجهات الموقع الموجهة من بيكس-Nrf2
- تصميم الطفرة التمهيدي
ملاحظة: تصميم الاشعال المطفرة المناسبة أمر بالغ الأهمية لنجاح نتيجة الطفرات. وفيما يلي بعض الاعتبارات لتصميم الاشعال الطفرات. إنشاء التمهيدي يتكون من 25 إلى 45 قواعد، مع الطفرة المطلوبة في منتصف التمهيدي. يجب أن يكون التمهيدي محتوى غ 40-60٪ وإنهاء مع واحد أو أكثر من قواعد G أو C. تأكد من أن T متر من التمهيدي يساوي 78 درجة مئوية أو أكبر وفقا للصيغة [T م = 81.5 + 0.41 (٪ غ) - (675 / طول القواعد) -٪ عدم تطابق].
ملاحظة: تنقيةالتمهيدي لأن نقائها مهم لفعالية الطفرة. هناك العديد من المواقع لتصميم الاشعال المطفرة.- افتح برنامج تصميم التمهيدي ل "تصميم الاشعال للطفرات الموجهة للموقع" (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp).
- لصق الإنسان تسلسل الحمض النووي Nrf2 (الوصول رقم NM_006164.4) وحدد زر "تحميل ترجم".
- حدد بقايا سيرين 558 من تسلسل الأحماض الأمينية المترجمة ليتم تغييرها إلى ألانين. باستخدام التمهيدي المطفرة، استبدال كودون لسيرين من أغك إلى غك، لالانين.
- النظر في طول التمهيدي، T م ، ومحتوى غ.
ملاحظة: تم تصميم التمهيدي الطفرة في نهاية المطاف كما 5'-كتايتجااكاكاك غك أكتاتاتكتساغ-3 '.
- رد فعل لتوليف حبلا متحولة باستخدام تفاعل البوليميراز سلسلة (ير)
- إعداد خليط التفاعل ير على الجليد: 10 × رد فعل رد فعل، 50 نانوغرام منبغكس-غست-Nrf2، 125 نانوغرام من التمهيدي إلى الأمام، 125 نانوغرام من التمهيدي العكسي، 1 ميكرولتر من مزيج دنتب (10 ملم كل)، 2.5 U بفو دنا البلمرة، و دو العقيمة إلى 50 ميكرولتر.
- تشغيل ير ل بيكس-غست-Nrf2-متحولة حبلا التوليف مع برنامج الدراجات التالية: 1 دورة في 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. 18 دورات في 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، عند 55 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، وعند 68 درجة مئوية لمدة 90 ثانية. و 1 دورة في 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: اعتمادا على طول البلازميد، قد يتم تغيير المعلمات الدراجات. - وضعه على الجليد لمدة 2 دقيقة لتبريد المواد المتفاعلة للخطوة التالية. بدلا من ذلك، تخزينها في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- دبن I الهضم واختيار البلازميد متحولة
- إضافة 1 ميكرولتر من دبن I انزيم تقييد (10 U / ميكرولتر) لكل من المواد المتفاعلة بعد التبريد. مزيج جيدا وبلطف بواسطة بيبتينغ وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة.
- احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لهضم الوالدين بغكس-غست-Nrf2 مزدوج-الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل.
- بلطف ذوبان الجليد DH5 α الخلايا الفائقة على الجليد.
- إضافة 50 ميكرولتر من المتفاعلات إلى 150 ميكرولتر من الخلايا المبردة مسبقا α5 المبردة α و احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- نقل الأنابيب إلى كتلة التدفئة مسخن إلى 42 درجة مئوية وتركها لمدة 90 ثانية. وضعها على الجليد لمدة 2 دقيقة.
- إضافة ما قبل تحسنت الميسوجين مرق (لب) لخلايا DH5 α تحول واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع اهتزاز في 180 دورة في الدقيقة.
- نشر الخلايا المحولة على لوحات أجار لب-أمبيسيلين واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يتم استخدام الأمبيسلين للاختيار منذ البلازميد جيكس-غست-Nrf2 لديه علامة المقاومة الأمبيسلين. استخدام المضادات الحيوية المناسبة، اعتمادا على علامة المقاومة للبلازميد المطفرة. - اختيار مستعمرة واحدة من لوحة، ونقله إلى 5 مل من LB- الأمبيسلين، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 180 دورة في الدقيقة.للتحقق من تسلسل الطفرات، وتقييم ما لا يقل عن ثلاث مستعمرات.
- استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة دنا مينيبريب لتحليل تسلسل الحمض النووي. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة.
- التحقق من تسلسل الحمض النووي الطفرات باستخدام محلل تسلسل الحمض النووي التلقائي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. استخدام 200 نانوغرام على الأقل من بناء الحمض النووي للتحقق من تسلسل متحولة.
- تصميم الطفرة التمهيدي
- تنقية المؤتلف غست-Nrf2 البروتين
- التعبير عن الطفرات غست-Nrf2 البروتين الانصهار في الإشريكية القولونية
- تحويل الطفرات بغيكس-غست-Nrf2 الطفرات في خلايا BL21 . تطعيم مستعمرة واحدة في 25 مل من مرق لب تحتوي على الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) واحتضان عند 37 درجة مئوية على المدورة بين عشية وضحاها.
- تطعيم الخلايا المستزرعة في 100 مل من مرق لب تحتوي على الأمبيسلين (100 ميكروغرام / مل) بنسبة 1: 100 التخفيف.
- احتضان عند 37 درجة مئوية على دوارأو حتى تصل الامتصاصية في 600 نانومتر حوالي 0.4-0.8 (حوالي 4 ح).
- إضافة 100 ميكرولتر من 1 M إيبت إلى 100 مل من الخلايا المستزرعة لإعداد تركيز النهائي من 1 ملي إيبت.
- احتضان الخلايا في 30 درجة مئوية على المدورة لمدة 6 ساعات أو بين عشية وضحاها لتعبير البروتين.
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 5000 x ج لمدة 20 دقيقة و ريسوسبيند الكريات الخلية مع 1 مل من العازلة تحلل البكتيرية (25 ملي هيبيس، 5 ملي إدتا، 2 ملي دت، 0.1٪ تشابس، 1 ميكروغرام / مل بيبستاتين، 0.5 ميكروغرام / مل ليوبيبتين، و 1 ملم بمسف) على الجليد.
- ليس الكريات الخلية باستخدام الخالط بالموجات فوق الصوتية مع فترات 2-ثانية لمدة 2 دقيقة في 50٪ من انتاج الطاقة القصوى.
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 12000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية وجمع طاف.
- تنقية المؤتلف غست-Nrf2 البروتين
- إعداد 200 ميكرولتر من 50٪ (ت / ت) الخرز الجلوتاثيون الاغاروز وغسل مع 1 مل بس (الرقم الهيدروجيني 7.3؛ 140 ملي كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 4 ، و 1.8 ملي خ 2 بو 4 ). جمع الخرز بواسطة الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 1 دقيقة. كرر خطوة الغسيل ثلاث مرات.
- إضافة ليسيت الخلية إلى 200 ميكرولتر أعدت من 50٪ (الخامس / الخامس) الجلوتاثيون والأغاروز الخرز واحتضان عند 4 درجات مئوية على نهاية نهاية المدورة لمدة 2 ساعة.
- جمع حبات الجلوتاثيون أغاروس جنبا إلى جنب مع غست-Nrf2 البروتين بواسطة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 1 دقيقة. إزالة طاف باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة G 31.
- غسل الخرز مع 1 مل من برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.3)، كما هو الحال في الخطوة 1.
- إضافة 500 ميكرولتر من العازلة شطف (50 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك و 10 ملي الجلوتاثيون خفض، ودرجة الحموضة 8.0) إلى الخرز الجلوتاثيون والأغاروز جنبا إلى جنب مع غست-Nrf2. احتضان في 4 درجات مئوية على نهاية نهاية أكثر من المدورة لمدة 30 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 1 دقيقة وجمع طاف.
- مرة أخرى إضافة 300 ميكرولتر من العازلة شطف إلى الخرز وكرر الخطوات 3.2.2.5-3.2.2.6 مرتين.
- تأكيد بروتين غست-Nrf2 النقي
- إعداد 5 ميكرولتر من العينة لتصور كمية البروتين مع 0.5 ميكروغرام من البروتين بسا القياسية.
- تشغيل العينات في هلام سدز-بادج 7.5٪ في 70 V لمدة 20 دقيقة ثم في 140 V لمدة 60 دقيقة.
- وصمة عار هلام مع 0.1٪ بنك البحرين المركزي تلطيخ الحل (0.1 غرام من مصرف البحرين المركزي R250، 40 مل من 99٪ الميثانول، 10 مل من حمض الخليك الجليدي، و 50 مل من H 2 O التقطير) لمدة 2 ساعة و ديستين (30 مل من الميثانول، 10 مل من حمض الخليك الجليدي، و 60 مل من H 2 O المقطر) حتى تظهر بشكل واضح العصابات.
- وضع هلام الميت على ورقة الترشيح وتغطي مع المجمع شفافة. تجفيف هلام مع مجفف هلام فراغ في 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- تحديد كمية من متحولة غست-Nrf2 البروتين مع قياس كثافة لفحص المختبر أمك كيناز في المختبر .
- التعبير عن الطفرات غست-Nrf2 البروتين الانصهار في الإشريكية القولونية
- في المختبر أمك نشاط الفحص مع مسوخ محددة الموقع
ليسE: يتم إجراء فحص فيك أمبك كيناز وفقا للخطوات 2،2-2،4، وذلك باستخدام 0.4 ميكروغرام من ويلديب المنقى غست-Nrf2 أو متحولة غست-Nrf2-S558A دون مثبطات الببتيد. اتبع جميع إرشادات السلامة الإشعاعية الموصوفة في الخطوة 1.- إعداد المخزن المؤقت رد فعل على الجليد مع 0.15 ميكروغرام من أمك، 0.4 ميكروغرام من متحولة أو ويلديب غست-Nrf2، و 6 ميكرولتر من 5 العازلة كيناز. ملء ما يصل إلى 30 ميكرولتر مع دو العقيمة.
- إضافة 1 ميكرولتر من [γ- 32 P] -ATP (1 μCi / ميكرولتر) إلى أنابيب التفاعل على الجليد. خلط المخزن المؤقت رد فعل من قبل بيبتينغ صعودا وهبوطا عدة مرات وأجهزة الطرد المركزي.
- احتضان العينات في كتلة التدفئة عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- وقف رد فعل كيناز بإضافة 3 ميكرولتر من 10 × سدز عينة عازلة.
- تشغيل في هلام سدز-بادج 7.5٪ في 70 V لمدة 20 دقيقة ثم في 140 V لمدة 1 ساعة.
- إصلاح هلام مع العازلة التثبيت لمدة 20 دقيقة، نقله على ورقة الترشيح، وتغطية هلام مع شفافةداخل المجمع.
- تجفيف هلام مع مجفف هلام فراغ في 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ثم كشفها بين عشية وضحاها إما إلى شاشة الفوسفور أو فيلم الأشعة السينية.
- مسح شاشة الفوسفور مع تصوير الفوسفور ونقل هلام إلى أنبوب زجاجي لتلطيخ مصرف البحرين المركزي بعد التصور وفقا للخطوة 2.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 والشكل 2 نتائج التجارب المتكررة في ورقة ذكرت سابقا 8 . وقد تم تجميع ثلاثة أوليغوببتيدس من 10 مخلفات متبقية تقليد المواقع المستهدفة من أمك (رقم 1، 148-157 تتألف من Ser153، رقم 2، 330-339 التي تتألف من Ser335، و # 3، 553-562 التي تضم Ser558) وتستخدم كمنافسين في فيترو كيناز الفحص. وقد تقلص إلى حد كبير الفسفرة من Nrf2 من قبل أمك في وجود أوليغوببتيد # 3 ( الشكل 1 ). بعد ذلك، تم إجراء فحص الطفرات الموجهة للموقع للتحقق من صحة نتيجة التجربة ببتيدوميمتيك. وبالنظر إلى تأثير مثبط أوليغوببتيد رقم 3 على الفسفرة بوساطة أمك من Nrf2 ( الشكل 1 )، أنشأنا متحولة S558A-Nrf2. تم مقارنة مستويات الفسفرة بين ويلديب Nrf2 و S558A متحولة باستخدام في المختبر أمك كيناز الفحص. منع الأحماض الأمينية أحادية من Nrf2 (سر → علاء في 558) أمك من الفسفوريت Nrf2، مشيرا إلى أن أمك فوسفهوريلاتس مباشرة Nrf2 في Ser558 ( الشكل 2 ).
الشكل 1: في المختبر تنافسية أمك كيناز الفحص. أجريت مقايسات كيناز في المختبر في وجود أوليغوببتيدس المشار إليها (رقم 1، 148-157 تتألف من Ser153؛ رقم 2، 330-339 التي تضم Ser335، و # 3، 553-562 التي تضم Ser558).
الشكل 2: في المختبر أمك كيناز فحص باستخدام بروتين متحولة محددة الموقع. تم إجراء فحوص كيناز في المختبر في وجود ويلدتيب غست-Nrf2 أو متحولة S558A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كطريقة بسيطة ومريحة لتقييم أصالة مواقع الفسفرة المتوقعة بوساطة أمك، هنا نحن تصف في المختبر فحص كيناز التي يمكن استخدامها لاكتشاف موقع فسفرة معينة باستخدام الببتيدات تنافسية والتحقق من ذلك باستخدام متحولة موقع معين . البيانات التمثيلية التي تم الحصول عليها من في المختبر تنافسية أمك مقايسة النشاط مطابقة النتائج من مقايسة باستخدام بروتين متحولة الموجهة للموقع، مشيرا إلى أن فحص الببتيد المنافسة هو أداة مفيدة لتحديد موقع الفسفرة. وقد استخدمت هذه الطريقة أيضا في دراسة تحديد موقع معين فوسفهوريلاتد PKCδ، الذي فسفوريلات Nrf2 في سيرين 40 3 . منذ الببتيدات ربط تنافسي لبروتين، ويمكن أيضا أن تطبق المبدأ على فحص المختبر غست المنسدلة لتحديد عزر ملزم 10 ، 11 . وعلاوة على ذلك، هذا ببتيدوميميويمكن أيضا أن تطبق طريقة تيك على تحديد التعديلات ما بعد متعدية أخرى، مثل الأسيتلات في بقايا ليسين.
باستخدام هذا البروتوكول، قد يكون من الصعب حل بعض الببتيدات مسعور. إذا كان الببتيد غير قابلة للذوبان في المخزن المؤقت كيناز، قد يكون حله في 20٪ دمسو مفيدة. حل الببتيدات مسعور للغاية، أول محاولة لإذابة في 100٪ دمسو ثم تمييع الحل مع العازلة كيناز. سونيكاتيون قد تكون أيضا من المساعدة في حل الببتيدات. إذا كان لا يزال غير قابل للذوبان، وينبغي تمديد الببتيد محاكاة الموقع المفترض لزيادة الذوبان.
بروتوكول عرض في هذه الورقة يصف " في النظام المختبر " التي يتم ردها كيناز المنقى والركيزة. في النظام في المختبر ، والاختلافات الصغيرة في تركيز الببتيدات تنافسية لن تؤثر على النتائج إلا إذا كان التركيز أقل من البروتين الركيزة. و r(إيسولت) التي تم الحصول عليها من تجربة في المختبر يتضمن الإمكانية الكامنة لكونها حدث تمثيلي ينتج عن القرب الاصطناعي والتركيز العالي للمفاعلات. وللقضاء على هذا الاحتمال، ينبغي أن يقترن تفسير البيانات بنتائج التجارب المستندة إلى الخلايا. احتمال آخر للحصول على نتائج إيجابية كاذبة باستخدام الببتيدات قد يكون راجعا إلى التغيرات في التشكل الركيزة و / أو الاعتراف كيناز. لاستبعاد هذا الاحتمال، فمن الضروري القيام بتجارب تأكيد مع البروتينات متحولة.
من ناحية أخرى، يمكن أيضا أن تنتج بيانات سلبية كاذبة من هذا النظام. العديد من كيناز تعمل كمجمعات البروتين داخل السياق الخلوي وتتطلب العوامل المشتركة للحصول على وظائف كاملة. أمك هو ممثل البروتين كيناز معقدة تتألف من AMPKα، AMPKβ و AMPKγ الوحدات الفرعية، وتجليد أمب إلى الوحدة الفرعية AMPK is ضروري لتفعيل كيناز. في الواقع، أمكلم فوسفهوريلات Nrf2 في المخزن المؤقت كيناز أمب خالية (لا تظهر البيانات). وهكذا، تجدر الإشارة إلى أن أمب يجب حله في المخزن المؤقت رد فعل كيناز لنجاح الفحص في المختبر .
استخدام مطياف الكتلة لتحديد مواقع الفسفرة، الأسلوب الأكثر شعبية، لديها العديد من القيود التقنية، وغالبا ما تولد إشارات سلبية كاذبة من فقدان الوجه من حمض الفوسفوريك خلال عملية تجزئة 7 . طريقة ميكروأري الببتيد يمكن أن يكون الخيار الثاني للبحث عن مواقع الفسفرة. ومع ذلك، تعتبر هذه الطريقة تستغرق وقتا طويلا ومكلفة. كطريقة بديلة لفحص مواقع الفسفرة المفترضة، قد تكون طريقة الببتيد تنافسية وسيلة مريحة وغير مكلفة للحصول على نظرة ثاقبة طبيعة موقع الفسفرة المفترضة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة البحوث الوطنية من كوريا منحة بتمويل من الحكومة الكورية (مسيب) (رقم 2015R1A2A1A10052663 ورقم 2014M1A3A3A02034698).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem, Nottingham, UK | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, Taipei City, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32P]-ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| EZblue staining reagent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polymerase | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | Avoid multiple thaw and freezing cycle |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB broth | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands | L1704 | |
| Ampicillin | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarose LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Bovine Serum Albumin | Bovogen Biologicals, Victoria, Australia | BSA100 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare, Marlborough, MA | 17-0756-01 | |
| Acetic Acid glacial | Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea | ||
| Methyl alcohol |
Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea | 5558-4410 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| SDS-PAGE kit | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 1658001FC | |
| Vacuum pump | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| Gel dryer | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| Dancing shaker | FINEPCR, Seoul, Korea | CR300 | The machine is needed for washing step |
| PCR machine | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | |
| Incubator/shakers | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea | NB-205L | |
| Microcentrifuges | LABOGENE, Seoul, Korea | 1730R | |
| Chromatography columns | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 732-1010 |
References
- Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs. Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).
- Gwinn, D. M., et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint. Mol Cell. 30, 214-226 (2008).
- Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription. J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).
- Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance. J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).
- Jain, A. K., Jaiswal, A. K. GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2. J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).
- Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements. Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).
- Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).
- Joo, M. S., et al. AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550. Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).
- Sinclair, W. K., Holloway, A. F. Half-lives of some radioactive isotopes. Nature. 167 (4244), 365 (1951).
- Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1. J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).
- Smith, L., et al. RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).
