Summary
Peptide competitiebepalingen worden veel gebruikt in een verscheidenheid aan moleculaire en immunologische experimenten. Dit document beschrijft een gedetailleerde methode voor een in vitro oligopeptide-concurrerende kinase-analyse en de bijbehorende validatieprocedures, die nuttig kunnen zijn om specifieke fosforyleringsplaatsen te vinden.
Abstract
Proteïnefosforylering op specifieke locaties bepaalt zijn conformatie en interactie met andere moleculen. Zo beïnvloedt eiwitfosforylering biologische functies en eigenschappen van de cel. Momenteel is de meest voorkomende methode voor het ontdekken van fosforyleringsplaatsen door middel van vloeistofchromatografie / massaspectrometrie (LC / MS) analyse, een snelle en gevoelige methode. Echter, relatief labiele fosfaatdelen worden vaak vrijgemaakt van fosfopeptiden tijdens de fragmenteringsstap, die vaak valse negatieve signalen oplevert. In dergelijke gevallen zou een traditionele in-vitro- kinase-analyse die gebruik maakt van plaatsgerichte mutanten nauwkeuriger zijn, maar deze methode is moeizaam en tijdrovend. Daarom kan een alternatieve werkwijze die peptidekompetitie gebruikt, voordelig zijn. Het consensus herkenningsmotief van 5 'adenosine monofosfaat-geactiveerde proteïne kinase (AMPK) is vastgesteld 1 en werd gevalideerd met behulp van een positionele scan peptide bibliotheek assAy 2 . Zo kunnen AMPK-fosforyleringsplaatsen voor een nieuw substraat voorspeld en bevestigd worden door de peptide competitiebepalingen. In dit rapport beschrijven we de gedetailleerde stappen en procedures voor de in vitro oligopeptide-concurrerende kinase-analyse door AMPK-gemedieerde nucleaire factor erythroid 2-gerelateerde factor 2 (Nrf2) fosforylering te illustreren. Om de fosforyleringsplaats te authenticeren, voeren we een sequentiële in vitro kinase-analyse uit met behulp van een plaatsspecifieke mutant. In het algemeen verschaft de peptidecompetitiebepaling een methode om meerdere potentiële fosforyleringsplaatsen te screenen en sites te identificeren voor validatie door de fosforyleringsplaatsmutanten.
Introduction
Proteïnefosforylering bij een specifiek residu speelt een belangrijke rol in een breed scala aan cellulaire processen. Zo vereist een begrip van signaleringsnetwerken de identificatie van specifieke fosforyleringsplaatsen. Daarnaast bepaalt de fosforyleringsplaats het effect op de eiwitfunctie omdat individuele domeinen binnen een eiwit verschillende structuren en functies bezitten. De activiteit van erythroid 2-gerelateerde factor 2 (Nrf2), een belangrijke antioxidant transcriptiefactor, wordt tweerichtig geregeld door fosforylering op verschillende plaatsen. Onze studies hebben gericht op de kinases die de fosforylering van Nrf2 katalyseren. De stressrespons van Nrf2 tegen oxidatieve uitdaging komt snel voor, hoofdzakelijk door fosforylering bij serine 40 en gemedieerd door proteïne kinase C (PKC) -δ, die Nrf2 3 , 4 activeert. Omgekeerd katalyseert Fyn de remmende fosforylering van Nrf2 bij tyrosine 568 voor een strakke controle van de activiteit 5 .
De meest voorkomende methode die wordt gebruikt om fosforyleringsplaatsen te ontdekken is vloeistofchromatografie / massaspectrometrie (LC / MS) analyse. Snelle en zeer gevoelige fosforylatie site mapping data kan op deze manier worden gegenereerd; Het heeft echter verschillende technische beperkingen, die vaak valse negatieve signalen genereren. Slechte volgorde dekking voorkomt vaak in LC / MS analyse. Om fosforyleringsplaatsen te identificeren is informatie nodig over de maximale aminozuurdekking van een eiwit 6 . Proteolyse van het eiwit van belang met verschillende proteasen tijdens de spijsverteringstap kan helpen bij het verbeteren van sequentiedekking. Een ander obstakel voor de identificatie van fosforyleringsresten is het geluidsverlies van fosforzuur dat frequent waargenomen wordt voor serine- en threonine-gefosforyleerde peptiden 6 , 7 . Labile fosfaatdelen zijn vaakVrijgegeven van fosfopeptiden tijdens het fragmentatieproces 7 . De tweede optie bij het zoeken naar fosforyleringsplaatsen maakt gebruik van een peptide microarray methode. Het is mogelijk om te screenen voor de kinase target sites met behulp van een microarray chip bevattende peptide fragmenten afgeleid van een eiwit van belang. Door de apparatuurbehoefte voor de productie en detectie van een microarraychip, wordt de peptide microarray methode echter beschouwd als tijdrovend en duur.
Om deze uitdagingen te overwinnen kan een in vitro oligopeptide-concurrerende kinase-analyse gebruikt worden voor een proteïnekinase met bekende herkenningsmotieven. Als het consensus herkenningsmotief van een kinase wordt vastgesteld, kunnen verwachte fosforyleringsplaatsen van een kandidaat substraat voorspeld worden en kan de authenticiteit van de sites worden gevalideerd. De meest overtuigende methode voor deze procedure is het onthouden van fosforylering in een mutant eiwit waarin de predicteD residu is gesubstitueerd met een niet-fosforyleerbaar aminozuur ( dwz serine of threonine tot alanine, tyrosine tot fenylalanine). De productie en isolatie van mutante eiwitten is echter tijdrovend. Als alternatief bij de eerste fase van onderzoek is de competitieve peptide kinase-analyse eenvoudig en handig. Hier beschrijven we een protocol voor een in vitro peptide competitie assay en voor de validatie van de fosforyleringsplaats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Veiligheid
VOORZICHTIG: Dit protocol gebruikt [γ- 32 P] -ATP om de activiteit van AMPK te beoordelen. Fosfor-32 is een radioactieve isotoop, die grotendeels betaaldstraling uitstoot. Aangezien de grootte van een bèta deeltje extreem klein is, kan het gemakkelijk kleding en huid binnendringen. Zowel externe als interne blootstelling aan bètastraling kan schadelijk zijn voor de menselijke gezondheid, met inbegrip van het veroorzaken van huidverbrandingen en weefselschade.
- Voer alle stappen uit die nodig zijn voor het gebruik van [γ- 32 P] -ATP met behulp van een goede bescherming, zoals acrylafscherming.
- Zorg ervoor dat alle medewerkers uitgerust zijn met elektronische persoonlijke dosimeters (EPD) om de mate van blootstelling aan schadelijke straling tijdens alle procedures te controleren.
- Hanteer alleen open-stralingstraling na de nodige training en goedkeuring.
OPMERKING: hier werden alle experimenten uitgevoerd na de voltooiing van de training op open-source stralingsgebruik bij de Seoul National UnivVervangbaarheid en goedkeuring van de Koreaanse regering (nssc.go.kr/nssc/en). - Verwijder radioactief afval volgens lokale voorschriften.
OPMERKING: hier zijn richtlijnen van het Instituut voor Milieubescherming en Veiligheid van de Seoel National University gevolgd. De followings zijn een lijst van regelgevers in de Verenigde Staten en Europese landen: de Verenigde Staten van Amerika, de Verenigde Nucleaire Regulerende Commissie (http://www.nrc.gov/); Verenigd Koninkrijk, Gezondheids- en veiligheidsbeheerder (HSE) (http://www.hse.gov.uk); Frankrijk, Autorité de Sûreté Nucléaire (https://www.asn.fr/); En Duitsland, Federaal Ministerie van Milieu, Natuurbehoud, Bouw en Nucleaire Veiligheid (BMU) (http://www.bmu.de).
2. In Vitro Competitive Kinase Assay
- Bouw van concurrerende peptiden
- Bepaal het consensusmotief gefosforyleerd door AMPK.
OPMERKING: AMPK herkent het consensusmotief, &# 934; - [X, β] XX-Ser / Thr-XXX-Φ. In de consensussequentie vertegenwoordigt Φ hydrofobische aminozuren ( dwz valine [V], leucine [L], methionine [M] en isoleucine [I]) en β staat voor basische aminozuren ( dwz lysine [K], arginine [ R] en histidine [H]) 1 . - Selecteer serine- of threonine residuen uit doelgroepen volgens het bovenstaande consensusmotief. Gebruik drie vermeende plaatsen van humaan Nrf2 (# 1, 148-157 omvattende Ser153; # 2, 330-339 omvattende Ser335; en # 3, 553-562 omvattende Ser558) 8 .
- Commercieel synthetiseren 10-residue peptiden die de vermeende sites nabootsen. Verkrijg het gesynthetiseerde product als een gevriesdroogd poeder met een zuiverheid groter dan 98% voor elk peptide.
- Los de peptiden op met behulp van een kinase buffer om een concentratie van 71.667 g / L te bereiken. Als een peptide niet oplosbaar is in een kinase buffer, lost het in 20% DMSO op. Als het onoplosbaar blijft, zal een peptide de put nabootsenAtive site kan worden uitgebreid om de oplosbaarheid te verhogen.
- Bepaal het consensusmotief gefosforyleerd door AMPK.
- In Vitro Concurrerende AMPK Kinase Assay
- Bereid 5 × kinase buffer als volgt: 100 mM HEPES, pH 7,4; 25 mM MgCl2; 5 mM EGTA; 5 mM DTT; 125 mM p-glycerofosfaat (serine / threonine fosfatase inhibitor); 5 mM Na3VO4 (tyrosine fosfatase remmers); 0,5% (v / v) Protease Inhibitor Cocktail Set III, 1 mM koude ATP; En 500 μM AMP.
OPMERKING: AMP is een essentieel onderdeel van de kinase buffer om AMPK activiteit te testen. De buffer kan worden gebruikt om de activiteit van zowel serine / threonine kinasen als tyrosine kinasen te meten. - Doei het volgende recombinante eiwit en synthetische peptiden op ijs: AMPK; Nrf2; En oligopeptiden # 1, # 2 en # 3.
- Bereid een reactiebuffer op ijs: 0,15 μg AMPK, 0,4 μg Nrf2 (~ 4 pmol), 0,43 mg oligopeptide (~ 300 nmol) en 6 μl 5 × kinase buffer. EENDicht het uiteindelijke volume tot 30 μL met steriel gedistilleerd water (DW).
OPMERKING: De toevoeging van [y-32P] -ATP na het bereiden van de reactiebuffer kan het radioactieve signaal verminderen als gevolg van kinase-autofosforylering.
- Bereid 5 × kinase buffer als volgt: 100 mM HEPES, pH 7,4; 25 mM MgCl2; 5 mM EGTA; 5 mM DTT; 125 mM p-glycerofosfaat (serine / threonine fosfatase inhibitor); 5 mM Na3VO4 (tyrosine fosfatase remmers); 0,5% (v / v) Protease Inhibitor Cocktail Set III, 1 mM koude ATP; En 500 μM AMP.
- Reactants lopen
OPMERKING: Alle onderstaande processen moeten onder bescherming worden uitgevoerd met een acryl schild, rek of blok, evenals passende persoonlijke beschermende uitrusting.- Stel de verwarmingsblokken op tot 30 ° C voordat u het experiment start.
- Voeg 1 μL [γ-32P] -ATP (1 μCi) aan de reactiebuizen op ijs toe. Meng de reactiebuffer door meerdere keren op en neer te pipetteren.
OPMERKING: De radioactiviteit van 32 P heeft een korte halveringstijd van ongeveer 14 dagen 9 . Pas het volume aan door de halveringstijd in acht te nemen ( bijv. Na een maand vanaf de productie van [γ- 32 P] -ATP, voeg 4 μL [γ- 32 P] toe-ATP om 1 μCi te maken). - Incubeer het monster gedurende 15-30 minuten in het verwarmingsblok bij 30 ° C. Bereid tijdens deze stap 7,5% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) gels op. Pas het percentage van de gel aan volgens de grootte van het doel eiwit.
- Stop de kinase reactie door 3 μL 10 × SDS monsterbuffer (10% (v / v) glycerol, 20% (w / v) SDS, 15,42% (w / v) dithiothreitol, 90% (v / v) 0,5 toe te voegen M Tris-HCl (pH 6,8) en 0,02% (w / v) broomfenolblauw). Meng de reactiebuffer door meerdere keren op en neer te pipetteren.
- Run de monsters in een 7,5% SDS-PAGE gel bij 70 V gedurende 20 min en continu bij 140 V gedurende 1 uur.
OPMERKING: De bromofenol blauwe lijn aan het eind van de gel bevat extreem hoge radioactieve signalen. Het is aan te raden om de gel onder de blauwe lijn te verwijderen voordat u verder gaat naar de volgende stap om achtergrondsignalen te verminderen. - Na SDS-PAGE, verwijder de gel voorzichtig uit de kast. Plaats de gel in een glas tVoor de volgende stap.
- Bevestig de gel met fixatiebuffer gedurende 20 minuten (50% methanol en 10% ijsazijn).
- Zet de gel voorzichtig op filterpapier en bedek het met een transparante wikkel. Merk op dat de gel gemakkelijk in deze stap kan worden gescheurd. Droog de gel met 1 vacuumdroger bij 1 ° C bij 80 ° C.
- visualisatie
- Laat de gel op een avond ofwel een fosforscherm of een röntgenfilm overnachten (meestal gedurende ongeveer 16 uur).
OPMERKING: een fosfor scherm kan worden hergebruikt na blootstelling aan het extra heldere licht. Wanneer een röntgenfilm wordt gebruikt, laat de gel over twee dagen bloot. Röntgenfilms hebben lagere gevoeligheden dan fosforschermen. - Scan het fosforscherm met een fosforbeelder. Exporteer de afbeelding als een TIFF- of bitmapbestand met hoge resolutie.
- Na visualisatie, verplaats de gel naar een glazen of plastic container voor Coomassie brilliant blue (CBB) kleuring.
- Was de gel met DW. Gooi de DW weg en vlek hetGel met het kleurende reagens gedurende 1 uur.
- Verwijder het reagens en verdeel de gel met DW gedurende 1 uur of 's nachts. Plaats de gel tussen transparante plastic films (of het equivalent) om te scannen met een kantoorscanner.
- Laat de gel op een avond ofwel een fosforscherm of een röntgenfilm overnachten (meestal gedurende ongeveer 16 uur).
3. In Vitro Kinase Assay Met behulp van een Site-specifieke Mutant
- Site-gerichte mutagenese van pGEX-Nrf2
- Mutageen Primer Design
OPMERKING: Het ontwerpen van goede mutagene primers is cruciaal voor het succesvolle resultaat van mutagenese. Hieronder vindt u enkele overwegingen voor het ontwerpen van mutagene primers. Maak een primer bestaande uit 25 tot 45 basen, met de gewenste mutatie in het midden van de primer. De primer moet 40-60% GC-gehalte hebben en eindigen met een of meer G- of C-basen. Zorg ervoor dat de T m van de primer gelijk is aan 78 ° C of hoger volgens de formule [T m = 81,5 + 0,41 (% GC) - (675 / lengte van de basen) -% mismatch].
OPMERKING: Reinig dePrimer omdat zijn zuiverheid belangrijk is voor mutatie-efficiëntie. Er zijn verschillende websites voor het ontwerpen van mutagene primers.- Open het programma voor primerontwerp voor "ontwerpen van primers voor sitegerichte mutagenese" (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp).
- Plak de humane Nrf2 DNA-sequentie (Access No. NM_006164.4) en selecteer de knop "Upload translated".
- Selecteer het serine 558 residu van de vertaalde aminozuursequentie om te veranderen in alanine. Gebruik de mutagene primer, vervang het codon voor serine van agc tot gcc, voor alanine.
- Overweeg de lengte van de primer, T m en de GC-inhoud.
OPMERKING: De mutagene primer is uiteindelijk ontworpen als 5'-ctactgaaaaaacaactc gcc accttatatctcgaag-3 '.
- Reactie voor Mutant Strand Synthese met Polymerase Chain Reaction (PCR)
- Bereid het PCR-reactiemengsel op ijs: 10 × reactiebuffer, 50 ng vanPGEX-GST-Nrf2, 125 ng voorwaartse primer, 125 ng omgekeerde primer, 1 μl dNTP-mix (10 mM elk), 2,5 U Pfu DNA-polymerase en steriele DW tot 50 μl.
- Voer de PCR uit voor pGEX-GST-Nrf2-mutantstrengsynthese met het volgende fietsprogramma: 1 cyclus bij 95 ° C gedurende 30 s; 18 cycli bij 95 ° C gedurende 30 s, bij 55 ° C gedurende 1 minuut en bij 90 ° C bij 68 ° C; En 1 cyclus bij 68 ° C gedurende 5 minuten.
OPMERKING: Afhankelijk van de plasmidengte, kunnen de cyclische parameters veranderd worden. - Leg het gedurende 2 minuten op ijs om de reactanten af te koelen voor de volgende stap. Als alternatief, sla ze op bij 4 ° C overnacht.
- Dpn I Spijsvertering en de Selectie van een Mutant Plasmide
- Voeg 1 μL Dpn I- restrictie-enzym (10 U / μl) toe aan elk van de reactanten na afkoeling. Meng grondig en zachtjes door pipetten en centrifugeer gedurende 1 minuut.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur om ouderspGEX-GST-Nrf2 dubbel-Gestrand DNA.
- Doe DH5 α supercompetente cellen op ijs voorzichtig op ijs.
- Voeg 50 μl van de reactant toe aan 150 μl vooraf gekoelde DH5 α supercompetente cellen en incubeer op ijs gedurende tenminste 30 minuten.
- Breng de buizen over naar een verwarmingsblok voorverwarmd tot 42 ° C en laat ze 90 s. Zet ze 2 minuten op ijs.
- Voeg voorverwarmde lysogeenbouillon (LB) toe aan de getransformeerde DH5 a- cellen en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur bij schudden bij 180 rpm.
- Spread de getransformeerde cellen op LB-ampicilline-agarplaten en incubeer de nacht bij 37 ° C.
OPMERKING: Ampicilline wordt gebruikt voor selectie aangezien het plasmide GEX-GST-Nrf2 de ampicilline resistentie marker heeft. Gebruik geschikte antibiotica, afhankelijk van de weerstandsmerker van het gemuteageerde plasmide. - Breng een enkele kolonie uit de plaat, laat deze overbrengen naar 5 ml LB-ampicilline en incubeer het gedurende een nacht bij 37 ° C bij schudden bij 180 rpm.Voor het verifiëren van de mutagene sequentie, evalueer ten minste drie kolonies.
- Extract DNA met behulp van een DNA miniprep kit voor DNA sequentie analyse; Volg het protocol van de fabrikant.
- Controleer de mutagene DNA sequenties met behulp van een automatische DNA sequentie analysator volgens het protocol van de fabrikant. Gebruik ten minste 200 ng van het DNA-construct voor de verificatie van mutante sequenties.
- Mutageen Primer Design
- Zuivering van recombinant GST-Nrf2-eiwit
- Expressie van mutageen GST-Nrf2- fusieproteïne in Escherichia coli
- Transformeer het mutageen pGEX-GST-Nrf2 plasmide in BL21 cellen. Inoculeer een enkele kolonie in 25 ml LB bouillon die ampicilline bevat (100 μg / ml) en incubeer gedurende een nacht bij 37 ° C op een rotator.
- Inoculeer de gekweekte cellen in 100 ml LB bouillon die ampicilline bevat (100 μg / ml) bij een verdunning verhouding van 1: 100.
- Incubeer bij 37 ° C op een rotatieOf tot de absorbantie bij 600 nm ongeveer 0,4-0,8 bereikt (ongeveer 4 uur).
- Voeg 100 μl 1 M IPTG toe aan 100 ml gekweekte cellen om een uiteindelijke concentratie van 1 mM IPTG te bereiden.
- Incubeer de cellen bij 30 ° C op een rotator gedurende 6 uur of 's nachts voor eiwituitdrukking.
- Centrifugeer de cellen bij 5000 xg gedurende 20 minuten en resuspendeer de celpellets met 1 ml bacteriële lysisbuffer (25 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 0,1% CHAPS, 1 μg / ml pepstatine, 0,5 μg / ml leupeptine, En 1 mM PMSF) op ijs.
- Licht de celpellets met een ultrasone homogenisator met 2-s intervallen gedurende 2 minuten bij 50% van de maximale vermogen.
- Centrifugeer de cellen bij 12.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C en verzamel het supernatant.
- Zuivering van recombinant GST-Nrf2-eiwit
- Bereid 200 μl van 50% (v / v) glutathion-agarose kralen en was met 1 ml PBS (pH 7,3; 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2
- Voeg de cellysaat toe aan de bereidingen van 200 μL 50% (v / v) glutathion-agarose kralen en incubeer gedurende 2 uur bij 4 ° C op een rotatie-end-end-rotator.
- Verzamel de glutathion-agarose kralen gecombineerd met GST-Nrf2 eiwit door centrifugeren bij 500 xg gedurende 1 minuut. Verwijder de supernatant met een 1 ml spuit met een 31 G-naald.
- Was de kralen met 1 ml PBS (pH 7,3), zoals in stap 1.
- Voeg 500 μl elutiebuffer (50 mM Tris-HCl en 10 mM gereduceerd glutathion, pH 8,0) toe aan de glutathion-agarose kralen gecombineerd met GST-Nrf2. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C op een rotatie-end-end.
- Centrifugeer bij 500 xg gedurende 1 minuut en haal de supernatant op.
- Voeg nog eens 300 μl elutiebuffer toe aan de kralen en herhaal stap 3.2.2.5-3.2.2.6 tweemaal.
- Bevestiging van het gezuiverde GST-Nrf2-eiwit
- Bereid 5 μL van het monster voor visualisatie van eiwithoeveelheid met 0,5 μg standaard eiwit BSA.
- Run de monsters in een 7,5% SDS-PAGE gel bij 70 V gedurende 20 min en dan bij 140 V gedurende 60 min.
- Vlek de gel met 0,1% CBB-kleuroplossing (0,1 g CBB R250, 40 ml 99% methanol, 10 ml ijsazijn en 50 ml gedestilleerde H20) gedurende 2 uur en verwijder (30 ml methanol, 10 ml ijsazijn en 60 ml gedestilleerde H20) totdat de banden duidelijk zijn aangegeven.
- Plaats de afgeleide gel op het filterpapier en bedek het met een transparante wikkel. Droog de gel met 1 vacuumdroger bij 1 ° C bij 80 ° C.
- Bepaal de hoeveelheid mutant GST-Nrf2 eiwit met densitometrie voor de in vitro AMPK kinase assay.
- Expressie van mutageen GST-Nrf2- fusieproteïne in Escherichia coli
- In Vitro AMPK Activiteits Assay Met Een Site-Specifieke Mutant
NIETE: De in vitro AMPK kinase-analyse wordt uitgevoerd volgens stappen 2.2-2.4, onder gebruikmaking van 0,4 μg gezuiverde wildtype GST-Nrf2 of de GST-Nrf2-S558A mutant zonder peptide remmers. Volg alle richtlijnen inzake stralingsveiligheid, beschreven in stap 1.- Bereid een reactiebuffer op ijs met 0,15 μg AMPK, 0,4 μg mutant of wildtype GST-Nrf2 en 6 μl 5 kinase buffer. Vul tot 30 μL met steriele DW.
- Voeg 1 μL [γ-32P] -ATP (1 μCi / μL) toe aan de reactiebuizen op ijs. Meng de reactiebuffer door meerdere keren op en neer te pipetteren en centrifugeer.
- Incubeer de monsters in een verwarmingsblok bij 30 ° C gedurende 30 minuten.
- Stop de kinase reactie door 3 μL van 10 × SDS monster buffer toe te voegen.
- Run in een 7,5% SDS-PAGE gel bij 70 V gedurende 20 min en dan bij 140 V gedurende 1 uur.
- Bevestig de gel met de fixatiebuffer gedurende 20 minuten, beweeg het op het filterpapier en bedek de gel met een transparantEnt wrapper.
- Droog de gel met de vacuümdroger gedurende 1 uur bij 80 ° C en laat deze vervolgens overnacht op een fosforscherm of een röntgenfilm blootstellen.
- Scan het fosforscherm met een fosforafbeelding en beweeg de gel naar een glasbuis voor CBB-kleuring na visualisatie volgens stap 2.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 en Figuur 2 tonen de resultaten van herhaalde experimenten in het eerder gerapporteerde papier 8 . Drie verschillende oligoseptiden van 10 residuen die de vermeende AMPK-targetplaatsen nabootsen (# 1, 148-157 omvattende Ser153; # 2, 330-339 omvattende Ser335; en # 3, 553-562 omvattende Ser558) werden gesynthetiseerd en gebruikt als concurrenten in de Vitro kinase assay. De fosforylering van Nrf2 door AMPK werd sterk verminderd in aanwezigheid van oligopeptide # 3 ( Figuur 1 ). Vervolgens werd een site-gerichte mutagenese-analyse uitgevoerd om het resultaat van het peptidomimetische experiment te valideren. Gezien het remmende effect van oligopeptide # 3 op de AMPK-gemedieerde fosforylering van Nrf2 ( Figuur 1 ), genereren we een S558A-Nrf2 mutant. De fosforyleringsniveaus werden vergeleken tussen de wildtype Nrf2 en de S558A mutant met behulp van de in vitro AMPK kinase assay. De enkele aminozuur substitutie van Nrf2 (Ser → Ala bij 558) verhinderde AMPK van fosforylering Nrf2, wat aangeeft dat AMPK direct Nrf2 fosfyleert bij Ser558 ( Figuur 2 ).
Figuur 1: In vitro competitieve AMPK kinase assay. In vitro kinase assays werden gedaan in aanwezigheid van de aangegeven oligopeptiden (# 1, 148-157 omvattende Ser153; # 2, 330-339 omvattende Ser335; en # 3, 553-562 omvattende Ser558).
Figuur 2: In vitro AMPK kinase assay met behulp van een plaatsspecifiek mutant eiwit. In vitro kinase assays werden gedaan in aanwezigheid van wildtYp GST-Nrf2 of zijn S558A mutant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Als een eenvoudige en handige manier om de authenticiteit van de voorspelde fosforylatieplaatsen gemedieerd door AMPK te beoordelen, beschrijven we hier een in vitro kinase-analyse die kan worden gebruikt om een specifieke fosforyleringsplaats te ontdekken met behulp van competitieve peptiden en te verifiëren met behulp van een site-specifieke mutant . De representatieve data verkregen uit de in vitro competitieve AMPK activiteit assay matchde de resultaten van een assay met behulp van een plaatsgerichte mutant eiwit, wat aangeeft dat de peptide competitietest een nuttig hulpmiddel is om een fosforyleringsplaats te bepalen. Deze methode werd ook gebruikt in de studie die de specifieke plaats identificeerde die gefosoryleerd werd door PKCδ, dat Nof2 fosforyleert bij serine 403. Aangezien peptiden competitief binden op een eiwit, kan het principe ook toegepast worden op een in vitro GST-aftrekassay om een bindingsmotief 10 , 11 te identificeren. Bovendien is dit peptidomimeTische methode kan ook van toepassing zijn op de identificatie van andere post-translationele modificaties, zoals acetylering bij lysine residuen.
Met behulp van dit protocol kan het moeilijk zijn om wat hydrofobe peptiden op te lossen. Als een peptide onoplosbaar is in een kinase buffer, kan het oplossen in 20% DMSO nuttig zijn. Om extreem hydrofobe peptiden op te lossen, probeer eerst het te oplossen in 100% DMSO en verdun de oplossing vervolgens met een kinase buffer. Sonicatie kan ook helpen bij het oplossen van de peptiden. Als het onoplosbaar blijft, moet een peptide die de vermeende plaats naboots, uitgebreid worden om de oplosbaarheid te verhogen.
Het protocol dat in dit document wordt geïntroduceerd beschrijft een " in vitro systeem" waarin een gezuiverd kinase en substraat worden gereageerd. In het in vitro systeem zullen kleine verschillen in concentratie van competitieve peptiden de resultaten niet beïnvloeden, tenzij de concentratie lager is dan het substraat eiwit. De rEsult verkregen uit een in vitro experiment omvat de inherente mogelijkheid om een artefactuele gebeurtenis te zijn die geproduceerd wordt door kunstmatige nabijheid en de hoge concentratie reactanten. Om dit perspectief te elimineren, moet de interpretatie van de gegevens vergezeld gaan van de resultaten van cel-gebaseerde experimenten. Een andere mogelijkheid om vals-positieve resultaten te verkrijgen met behulp van peptiden kan het gevolg zijn van veranderingen in substraatconformatie en / of kinaseherkenning. Om deze mogelijkheid uit te sluiten, is het nodig om bevestigingsexperimenten met mutante eiwitten te doen.
Aan de andere kant kunnen ook valse negatieve gegevens van dit systeem worden geproduceerd. Veel kinases fungeren als eiwitcomplexen in de cellulaire context en vereisen co-factoren voor volledige functionaliteit. AMPK is een representatief proteïne kinase complex samengesteld uit AMPKa, AMPKβ en AMPKγ subeenheden, en de binding van AMP aan de AMPKγ subeenheid is nodig voor de activatie van de kinase. Inderdaad, AMPKFosforyleerde Nrf2 niet in een AMP-vrije kinase buffer (data niet getoond). Derhalve moet opgemerkt worden dat AMP in de kinase-reactiebuffer moet worden opgelost voor een succesvolle in vitro- analyse.
Het gebruik van massaspectrometrie voor de identificatie van fosforyleringsplaatsen, de meest populaire methode, heeft verschillende technische beperkingen, die vaak vals-negatieve signalen genereren door het flair verlies van fosforzuur tijdens het fragmentatieproces 7 . Een peptide microarray methode kan de tweede optie zijn om te zoeken naar fosforyleringsplaatsen. Deze methode wordt echter beschouwd als tijdrovend en duur. Als een alternatieve methode voor het screenen van vermoedelijke fosforyleringsplaatsen kan de competitieve peptidemethode een geschikte en goedkope manier zijn om inzicht te krijgen in de aard van een vermoedelijke fosforyleringsplaats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Nationale Onderzoeksstichting van Korea subsidie gefinancierd door de Koreaanse regering (MSIP) (nr. 2015R1A2A1A10052663 en nr. 2014M1A3A3A02034698).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem, Nottingham, UK | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, Taipei City, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32P]-ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| EZblue staining reagent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polymerase | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | Avoid multiple thaw and freezing cycle |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB broth | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands | L1704 | |
| Ampicillin | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarose LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Bovine Serum Albumin | Bovogen Biologicals, Victoria, Australia | BSA100 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare, Marlborough, MA | 17-0756-01 | |
| Acetic Acid glacial | Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea | ||
| Methyl alcohol |
Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea | 5558-4410 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| SDS-PAGE kit | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 1658001FC | |
| Vacuum pump | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| Gel dryer | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| Dancing shaker | FINEPCR, Seoul, Korea | CR300 | The machine is needed for washing step |
| PCR machine | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | |
| Incubator/shakers | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea | NB-205L | |
| Microcentrifuges | LABOGENE, Seoul, Korea | 1730R | |
| Chromatography columns | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 732-1010 |
References
- Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs. Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).
- Gwinn, D. M., et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint. Mol Cell. 30, 214-226 (2008).
- Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription. J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).
- Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance. J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).
- Jain, A. K., Jaiswal, A. K. GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2. J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).
- Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements. Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).
- Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).
- Joo, M. S., et al. AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550. Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).
- Sinclair, W. K., Holloway, A. F. Half-lives of some radioactive isotopes. Nature. 167 (4244), 365 (1951).
- Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1. J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).
- Smith, L., et al. RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).
