Summary
Les tests de compétition peptidique sont largement utilisés dans une variété d'expériences moléculaires et immunologiques. Cet article décrit une méthode détaillée pour un test de kinase concurrent par oligopeptide in vitro et les procédures de validation associées, qui peuvent être utiles pour trouver des sites de phosphorylation spécifiques.
Abstract
La phosphorylation des protéines sur des sites spécifiques détermine sa conformation et son interaction avec d'autres molécules. Ainsi, la phosphorylation des protéines affecte les fonctions biologiques et les caractéristiques de la cellule. Actuellement, la méthode la plus commune pour découvrir les sites de phosphorylation est l'analyse par chromatographie en phase liquide / spectrométrie de masse (LC / MS), une méthode rapide et sensible. Cependant, des fragments de phosphate relativement labiles sont souvent libérés à partir de phosphopeptides pendant l'étape de fragmentation, ce qui donne souvent des signaux faussement négatifs. Dans de tels cas, un dosage traditionnel de kinase in vitro utilisant des mutants dirigés par site serait plus précis, mais cette méthode est laborieuse et prend beaucoup de temps. Par conséquent, une autre méthode utilisant une compétition peptidique peut être avantageuse. Le motif de reconnaissance consensus de 5 'de la protéine kinase activée par l'adénosine monophosphate (AMPK) a été établi 1 et a été validé à l'aide d'un culot de bibliothèque de peptides à balayage de positionAy 2 . Ainsi, les sites de phosphorylation AMPK pour un nouveau substrat pourraient être prédits et confirmés par les tests de compétition peptidique. Dans ce rapport, nous décrivons les étapes détaillées et les procédures pour le test de kinase concurrent par oligopeptide in vitro en illustrant la phosphorylation du facteur 2 associé au facteur 2 de l'erythroid 2 (Nrf2) à médiation par AMPK. Pour authentifier le site de phosphorylation, nous avons effectué un dosage séquentiel de kinase in vitro en utilisant un mutant spécifique au site. Dans l'ensemble, le test de compétition peptidique fournit une méthode pour cribler de multiples sites potentiels de phosphorylation et pour identifier les sites à valider par les mutants du site de phosphorylation.
Introduction
La phosphorylation des protéines à un résidu spécifique joue un rôle important dans un large éventail de processus cellulaires. Ainsi, une compréhension des réseaux de signalisation nécessite l'identification de sites spécifiques de phosphorylation. En outre, le site de phosphorylation détermine l'effet sur la fonction des protéines car les domaines individuels dans une protéine possèdent différentes structures et fonctions. L'activité du facteur 2 du facteur nucléaire 2 (Nrf2), un facteur de transcription antioxydant clé, est régulée bidirectionnellement par la phosphorylation sur différents sites. Nos études ont porté sur les kinases qui catalysent la phosphorylation de Nrf2. La réponse au stress de Nrf2 contre le défi oxydatif se produit rapidement, principalement par la phosphorylation à la serine 40 et médiée par la protéine kinase C (PKC) -δ, qui active Nrf2 3 , 4 . Inversement, Fyn catalyse la phosphorylation inhibitrice de Nrf2 à la tyrosine 568 pour un contrôle strict de l'activité 5 .
La méthode la plus commune utilisée pour découvrir les sites de phosphorylation est l'analyse par chromatographie liquide / spectrométrie de masse (LC / MS). Des données de cartographie de sites de phosphorylation rapides et très sensibles peuvent être générées de cette façon; Cependant, il présente plusieurs limitations techniques, générant souvent des signaux faussement négatifs. Une mauvaise couverture séquentielle se manifeste fréquemment dans l'analyse LC / MS. Pour identifier les sites de phosphorylation, il est nécessaire d'obtenir des informations sur la couverture maximale d'acides aminés d'une protéine 6 . La protéolyse de la protéine d'intérêt avec plusieurs protéases pendant la phase de digestion peut être utile pour améliorer la couverture des séquences. Un autre obstacle à l'identification des résidus de phosphorylation est la perte facile d'acide phosphorique fréquemment observée pour les peptides phosphorylés par la serine et la thréonine 6 , 7 . Les fragments de phosphate labile sont souventLibéré à partir de phosphopeptides pendant le processus de fragmentation 7 . La deuxième option lors de la recherche de sites de phosphorylation est l'utilisation d'une méthode de microarray peptidique. Il est possible d'examiner les sites cibles de la kinase en utilisant une puce de microarray contenant des fragments peptidiques dérivés d'une protéine d'intérêt. Cependant, en raison de l'exigence d'équipement pour la production et la détection d'une puce de microarray, la méthode de microarray peptidique est considérée comme longue et coûteuse.
Pour surmonter ces défis, on peut utiliser un test de kinase concurrent d'oligopeptide in vitro pour une protéine kinase avec des motifs de reconnaissance connus. Si le motif de reconnaissance de consensus d'une kinase est établi, on peut prédire les sites de phosphorylation putatifs d'un substrat candidat et l'authenticité des sites peut être validée. La méthode la plus convaincante pour cette procédure est de montrer l'abrogation de la phosphorylation dans une protéine mutante dans laquelle le prédicteurD résidu est substitué par un acide aminé non phosphorylable ( c'est-à-dire la sérine ou la thréonine à l'alanine, la tyrosine à la phénylalanine). Cependant, la production et l'isolement des protéines mutantes prend du temps. Comme alternative au stade initial de la recherche, le dosage compétitif de la peptide kinase est simple et pratique. Ici, nous décrivons un protocole pour un test de compétition peptidique in vitro et pour la validation du site de phosphorylation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sécurité
ATTENTION: Ce protocole utilise [γ- 32 P] -ATP pour évaluer l'activité de l'AMPK. Phosphorus-32 est un isotope radioactif, émettant en grande partie un rayonnement bêta. Comme la taille d'une particule bêta est extrêmement petite, elle peut facilement pénétrer les vêtements et la peau. L'exposition externe et interne au rayonnement bêta peut nuire à la santé humaine, y compris en causant des brûlures cutanées et des lésions tissulaires.
- Effectuez toutes les étapes nécessitant l'utilisation de [γ- 32 P] -ATP en utilisant une protection appropriée, comme le blindage acrylique.
- Assurez-vous que tout le personnel est équipé de dosimètres personnels électroniques (EPD) pour surveiller l'étendue de l'exposition aux rayonnements nuisibles pendant toutes les procédures.
- Gérer les rayonnements à source ouverte uniquement après une formation appropriée et une approbation réglementaire.
REMARQUE: Ici, toutes les expériences ont été menées après l'achèvement de la formation sur l'utilisation de rayons à source ouverte au Seoul National UnivEt l'approbation du gouvernement coréen (nssc.go.kr/nssc/fr). - Éliminer les déchets radioactifs selon les réglementations locales.
NOTE: Ici, les directives de l'Institut de protection de l'environnement et de sécurité de l'Université nationale de Séoul ont été suivies. Voici une liste des organismes de réglementation des États-Unis et des pays européens: les États-Unis d'Amérique, la Commission de réglementation nucléaire des États-Unis (http://www.nrc.gov/); Royaume-Uni, Health and Safety Executive (HSE) (http://www.hse.gov.uk); France, Autorité de sûreté nucléaire (https://www.asn.fr/); Et l'Allemagne, Ministère fédéral de l'environnement, de la conservation de la nature, du bâtiment et de la sûreté nucléaire (BMU) (http://www.bmu.de).
2. Essai in vitro de la kinase compétitive
- Construction de peptides compétitifs
- Déterminer le motif de consensus phosphorylé par AMPK.
REMARQUE: AMPK reconnaît le motif du consensus, &# 934; - [X, β] -XX-Ser / Thr-XXX-Φ. Dans la séquence consensus, Φ représente les acides aminés hydrophobes ( c'est-à-dire la valine [V], la leucine [L], la méthionine [M] et l'isoleucine [I]) et β représente les acides aminés basiques ( c'est-à-dire la lysine [K], l'arginine [ R], et histidine [H]) 1 . - Sélectionnez les résidus de serine ou de thréonine à partir de séquences cibles selon le motif de consensus ci-dessus. Utiliser trois sites putatifs de Nrf2 humain (# 1, 148-157 comprenant Ser153; # 2, 330-339 comprenant Ser335 et # 3, 553-562 comprenant Ser558) 8 .
- Synthèse commerciale de peptides à 10 résidus qui imitent les sites putatifs. Obtenir le produit synthétisé sous la forme d'une poudre lyophilisée avec une pureté supérieure à 98% pour chaque peptide.
- Dissoudre les peptides en utilisant un tampon kinase pour obtenir une concentration de 71,667 g / L. Si un peptide n'est pas soluble dans un tampon kinase, dissolvez-le dans 20% de DMSO. Si elle reste insoluble, un peptide imitant la mise en placeLe site actif peut être étendu pour augmenter la solubilité.
- Déterminer le motif de consensus phosphorylé par AMPK.
- Essai compétitif AMPK Kinase In Vitro
- Préparer 5 x kinase tampon comme suit: HEPES 100 mM, pH 7,4; 25 mM de MgCl 2 ; EGTA 5 mM; DTT 5 mM; 125 mM β-glycérophosphate (serine / thréonine phosphatase inhibiteur); Na 3 VO 4 5 mM (inhibiteur de tyrosine phosphatase); 0,5% (v / v) de l'ensemble de cocktails inhibiteur de protéase III, 1 mM d'ATP froid; Et 500 μM AMP.
REMARQUE: AMP est un composant essentiel du tampon kinase pour tester l'activité AMPK. Le tampon peut être utilisé pour mesurer l'activité de la serine / thréonine kinases et des tyrosine kinases. - Décongeler les protéines recombinantes et les peptides synthétiques suivants sur la glace: AMPK; Nrf2; Et les oligopeptides n ° 1, n ° 2 et n ° 3.
- Préparer un tampon de réaction sur glace: 0,15 μg d'AMPK, 0,4 μg de Nrf2 (~ 4 pmol), 0,43 mg d'oligopeptide (~ 300 nmol) et 6 μL de tampon kinase 5 x. UNEAjustez le volume final à 30 μL avec de l'eau distillée stérile (DW).
NOTE: L'ajout de [γ- 32 P] -ATP après la préparation du tampon de réaction peut réduire le signal radioactif dû à l'autophosphorylation de la kinase.
- Préparer 5 x kinase tampon comme suit: HEPES 100 mM, pH 7,4; 25 mM de MgCl 2 ; EGTA 5 mM; DTT 5 mM; 125 mM β-glycérophosphate (serine / thréonine phosphatase inhibiteur); Na 3 VO 4 5 mM (inhibiteur de tyrosine phosphatase); 0,5% (v / v) de l'ensemble de cocktails inhibiteur de protéase III, 1 mM d'ATP froid; Et 500 μM AMP.
- Exécution des réactifs
REMARQUE: Tous les procédés ci-dessous doivent être effectués sous protection avec un écran acrylique, un rack ou un bloc, ainsi qu'un équipement de protection individuelle approprié.- Réglez les blocs de chauffage à 30 ° C avant de commencer l'expérience.
- Ajouter 1 μl de [γ- 32 P] -ATP (1 μCi) aux tubes de réaction sur de la glace. Mélangez le tampon de réaction en pipetant de haut en bas plusieurs fois.
NOTE: La radioactivité de 32 P a une demi-vie courte d'environ 14 jours 9 . Réglez le volume en considérant la demi-vie ( par exemple, après un mois à partir de la production de [γ- 32 P] -ATP, ajoutez 4 μL de [γ- 32 P]-ATP pour faire 1 μCi). - Incuber l'échantillon dans le bloc de chauffage à 30 ° C pendant 15 à 30 minutes. Au cours de cette étape, préparer des gels à 7,5% de gomme de dodécyl sulfate-polyacrylamide en gel de sodium (SDS-PAGE). Ajuster le pourcentage du gel en fonction de la taille de la protéine cible.
- Arrêter la réaction de la kinase en ajoutant 3 μL de tampon d'échantillon de 10 x SDS (10% (v / v) de glycerol, 20% (p / v) de SDS, 15,42% (p / v) de dithiothréitol, 90% (v / v) 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8) et 0,02% (p / v) de bleu de bromophénol). Mélangez le tampon de réaction en pipetant de haut en bas plusieurs fois.
- Exécuter les échantillons dans un gel SDS-PAGE à 7,5% à 70 V pendant 20 min et en continu à 140 V pendant 1 h.
NOTE: La ligne bleue de bromophénol à la fin du gel contient des signaux radioactifs extrêmement élevés. Il est recommandé d'enlever le gel sous la ligne bleue avant de passer à l'étape suivante pour réduire les signaux d'arrière-plan. - Après SDS-PAGE, retirez doucement le gel du routeur. Placez le gel dans un verre tPour la prochaine étape.
- Fixer le gel avec un tampon de fixation pendant 20 min (50% de methanol et 10% d'acide acétique glacial).
- Déplacez doucement le gel sur du papier filtre et recouvrez-le avec une enveloppe transparente. Notez que le gel peut être facilement déchiré à cette étape. Sécher le gel avec un séchoir à gel sous vide à 80 ° C pendant 1 h.
- Visualisation
- Exposez le gel à un écran phosphore ou à un film de rayons X pendant la nuit (habituellement environ 16 h).
REMARQUE: Un écran phosphore peut être réutilisé après exposition à la lumière extra-lumineuse. Lorsqu'un film à rayons X est utilisé, exposez le gel sur deux jours. Les films à rayons X ont des sensibilité plus faible que les écrans phosphores. - Scannez l'écran phosphore avec un imageur de phosphore. Exportez l'image en tant que fichier TIFF ou bitmap haute résolution.
- Après la visualisation, déplacez le gel dans un récipient en verre ou en plastique pour la coloration Blue Coomassie (CBB).
- Laver le gel avec DW. Jeter le DW et tacher leE gel avec le réactif de coloration pendant 1 h.
- Jeter le réactif et dégager le gel avec du DW pendant 1 h ou pendant la nuit. Placez le gel entre des films plastiques transparents (ou l'équivalent) pour numériser avec un scanner de bureau.
- Exposez le gel à un écran phosphore ou à un film de rayons X pendant la nuit (habituellement environ 16 h).
3. Essai in Vitro Kinase en utilisant un mutant spécifique au site
- Mutagenèse dirigée par site de pGEX-Nrf2
- Mutagenic Primer Design
NOTE: La conception d'amorces mutagènes appropriées est essentielle pour l'issue réussie de la mutagenèse. Voici quelques considérations pour la conception d'amorces mutagènes. Créez une amorce composée de 25 à 45 bases, avec la mutation souhaitée au milieu de l'amorce. L'amorce doit avoir un contenu de 40 à 60% de GC et se terminer avec une ou plusieurs bases G ou C. Assurez-vous que le T m de l'amorce est égal à 78 ° C ou plus selon la formule [T m = 81,5 + 0,41 (% GC) - (675 / longueur des bases) -% désagrégé].
REMARQUE: Purifiez leCar sa pureté est importante pour l'efficacité de la mutation. Il existe plusieurs sites Web pour la conception d'amorces mutagènes.- Ouvrez le programme de conception d'amorces pour "concevoir des amorces pour la mutagenèse dirigée" (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp).
- Collez la séquence d'ADN Nrf2 humaine (Numéro d'accès NM_006164.4) et sélectionnez le bouton "Télécharger la traduction".
- Sélectionnez le résidu de serine 558 à partir de la séquence d'acides aminés traduite à changer en alanine. En utilisant l'amorce mutagène, remplacer le codon pour la serine d'agc en gcc, pour l'alanine.
- Considérons la longueur d'amorce, T m et le contenu GC.
NOTE: L'amorce mutagène est finalement conçue sous la forme de 5'-ctactgaaaaaacaactc gcc accttatatctcgaag-3 '.
- Réaction pour la synthèse du brin mutant utilisant la réaction en chaîne par polymérase (PCR)
- Préparer le mélange réactionnel de PCR sur de la glace: 10 x tampon de réaction, 50 ng dePGEX-GST-Nrf2, 125 ng d'amorce directe, 125 ng d'amorce inverse, 1 μL de mélange de dNTP (10 mM chacun), 2,5 U d'ADN polymerase de Pfu et DW stérile à 50 μL.
- Exécuter la PCR pour la synthèse du brin mutant pGEX-GST-Nrf2 avec le programme de cyclage suivant: 1 cycle à 95 ° C pendant 30 s; 18 cycles à 95 ° C pendant 30 s, à 55 ° C pendant 1 min et à 68 ° C pendant 90 s; Et 1 cycle à 68 ° C pendant 5 min.
REMARQUE: Selon la longueur du plasmide, les paramètres de cyclage peuvent être modifiés. - Placez-le sur de la glace pendant 2 minutes pour refroidir les réactifs pour l'étape suivante. Sinon, rangez-les à 4 ° C pendant la nuit.
- Dpn I Digestion et la sélection d'un plasmide mutant
- Ajouter 1 μL d' enzyme de restriction Dpn I (10 U / μL) à chacun des réactifs après refroidissement. Mélanger minutieusement et doucement en pipettant et centrifuger pendant 1 min.
- Incuber à 37 ° C pendant 2 h pour digérer parental pGEX-GST-Nrf2 double-ADN échoué.
- Décongeler doucement les cellules supercompétentes DH5 α sur la glace.
- Ajouter 50 μL du réactif à 150 μL de cellules supercompétentes DH5 α pré-refroidies et incuber sur de la glace pendant au moins 30 minutes.
- Transférer les tubes dans un bloc chauffant préchauffé à 42 ° C et les laisser pendant 90 s. Placez-les sur de la glace pendant 2 min.
- Ajouter un bouillon de lysogénie pré-réchauffé (LB) aux cellules DH5 α transformées et incuber à 37 ° C pendant 1 h avec agitation à 180 tr / min.
- Étaler les cellules transformées sur des plaques de gélose LB-ampicilline et incuber pendant une nuit à 37 ° C.
NOTE: L'ampicilline est utilisée pour la sélection puisque le plasmide GEX-GST-Nrf2 possède le marqueur de résistance à l'ampicilline. Utiliser des antibiotiques appropriés, en fonction du marqueur de résistance du plasmide mutagénisé. - Choisissez une seule colonie de la plaque, transférez-la à 5 mL de LB-ampicilline et incupez toute la nuit à 37 ° C sous agitation à 180 tr / min.Pour la vérification de la séquence mutagène, évaluer au moins trois colonies.
- Extraire l'ADN en utilisant un kit miniprep d'ADN pour l'analyse de séquence d'ADN; Suivre le protocole du fabricant.
- Vérifier les séquences d'ADN mutagène en utilisant un analyseur automatique de séquence d'ADN selon le protocole du fabricant. Utiliser au moins 200 ng de la construction d'ADN pour la vérification des séquences mutantes.
- Mutagenic Primer Design
- Purification de la protéine GST-Nrf2 recombinante
- Expression de la protéine de fusion GST-Nrf2 mutagène chez Escherichia coli
- Transformer le plasmide pGEX-GST-Nrf2 mutagène en cellules BL21 . Inoculer une colonie unique dans 25 ml de bouillon LB contenant de l'ampicilline (100 μg / mL) et incuber à 37 ° C sur un rotateur pendant une nuit.
- Inoculer les cellules cultivées dans 100 ml de bouillon LB contenant de l'ampicilline (100 μg / mL) à un rapport de dilution 1: 100.
- Incuber à 37 ° C sur une rotationOu jusqu'à ce que l'absorbance à 600 nm atteigne environ 0,4-0,8 (environ 4 h).
- Ajouter 100 μL d'IPTG 1 M à 100 ml de cellules cultivées pour préparer une concentration finale d'IPTG 1 mM.
- Incuber les cellules à 30 ° C sur un rotateur pendant 6 h ou pendant la nuit pour l'expression de la protéine.
- Centrifuger les cellules à 5 000 xg pendant 20 min et remettre en suspension les pastilles cellulaires avec 1 ml de tampon de lyse bactérien (25 mM d'HEPES, 5 mM d'EDTA, 2 mM de DTT, 0,1% de CHAPS, 1 ug / mL de pepstatine, 0,5 μg / mL de leupeptine, Et PMSF 1 mM) sur de la glace.
- Lyse les pastilles cellulaires en utilisant un homogénéisateur à ultrasons avec des intervalles de 2 s pendant 2 min à 50% de la puissance maximale.
- Centrifuger les cellules à 12 000 × g pendant 15 min à 4 ° C et collecter le surnageant.
- Purification de la protéine GST-Nrf2 recombinante
- Préparer 200 μl de billes de glutathion-agarose à 50% (v / v) et laver avec 1 ml de PBS (pH 7,3, NaCl 140 mM, KCl 2,7 mM, NaCl 10 mM 4 et 1,8 mM KH 2 PO 4 ). Recueillir les perles par centrifugation à 500 × g pendant 1 min. Répétez trois fois l'étape de lavage.
- Ajouter le lysat cellulaire sur les 200 μL préparés de perles de glutathione-agarose à 50% (v / v) et incuber à 4 ° C sur un rotator de bout en bout pendant 2 h.
- Recueillir les perles de glutathion-agarose combinées avec la protéine GST-Nrf2 par centrifugation à 500 xg pendant 1 min. Retirer le surnageant en utilisant une seringue de 1 mL avec une aiguille 31 G.
- Laver les perles avec 1 ml de PBS (pH 7,3), comme à l'étape 1.
- Ajouter 500 μL de tampon d'élution (Tris-HCl 50 mM et glutathion réduit 10 mM, pH 8,0) sur les billes de glutathion-agarose combinées avec du GST-Nrf2. Incuber à 4 ° C sur un rotator de bout en bout pendant 30 min.
- Centrifuger à 500 xg pendant 1 min et collecter le surnageant.
- Encore ajouter 300 μL de tampon d'élution aux perles et répéter deux fois les étapes 3.2.2.5-3.2.2.6.
- Confirmation de la protéine GST-Nrf2 purifiée
- Préparez 5 μL de l'échantillon pour la visualisation de la quantité de protéines avec 0,5 μg de protéine BSA standard.
- Exécuter les échantillons dans un gel SDS-PAGE à 7,5% à 70 V pendant 20 min, puis à 140 V pendant 60 minutes.
- Tachez le gel avec 0,1% de solution de coloration au CBB (0,1 g de CBB R250, 40 ml de 99% de methanol, 10 ml d'acide acétique glacial et 50 ml d'H2O distillé) pendant 2 h et déstain (30 ml de methanol, 10 ml d'acide acétique glacial et 60 ml d'H 2 O distillé jusqu'à ce que les bandes soient clairement représentées.
- Placez le gel décoloré sur du papier filtre et recouvrez-le avec une enveloppe transparente. Sécher le gel avec un séchoir à gel sous vide à 80 ° C pendant 1 h.
- Déterminer la quantité de protéine mutante GST-Nrf2 avec densitométrie pour le dosage de la kinase AMPK in vitro .
- Expression de la protéine de fusion GST-Nrf2 mutagène chez Escherichia coli
- Essai d'activité AMPK in vitro avec un mutant spécifique au site
NE PASE: Le test de la kinase AMPK in vitro est réalisé selon les étapes 2.2-2.4, en utilisant 0,4 μg de GST-Nrf2 de type sauvage purifié ou le mutant GST-Nrf2-S558A sans inhibiteur de peptides. Suivez toutes les directives de sécurité radiologique décrites à l'étape 1.- Préparer un tampon de réaction sur de la glace avec 0,15 μg d'AMPK, 0,4 μg de GST-Nrf2 mutant ou sauvage et 6 μL de tampon 5 kinase. Remplissez jusqu'à 30 μL avec du DW stérile.
- Ajouter 1 μL de [γ- 32 P] -ATP (1 μCi / μL) aux tubes de réaction sur de la glace. Mélanger le tampon de réaction en pipetant de haut en bas plusieurs fois et centrifuger.
- Incuber les échantillons dans un bloc chauffant à 30 ° C pendant 30 min.
- Arrêtez la réaction de la kinase en ajoutant 3 μL de tampon échantillon 10 x SDS.
- Exécuter dans un gel SDS-PAGE à 7,5% à 70 V pendant 20 min, puis à 140 V pendant 1 h.
- Fixez le gel avec le tampon de fixation pendant 20 minutes, déplacez-le sur le papier filtre et recouvrez le gel avec un transparentEnt wrapper.
- Séchez le gel avec le séchoir à gel sous vide à 80 ° C pendant 1 h, puis exposez-le pendant une nuit à un écran phosphore ou à un film à rayons X.
- Numérisez l'écran phosphore avec un imageur de phosphore et déplacez le gel dans un tube de verre pour la coloration CBB après la visualisation selon l'étape 2.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figure 1 et la figure 2 démontrent les résultats des expériences répétées dans le document précédemment rapporté 8 . Trois oligopeptides de 10 résidus différents imitant les sites cibles de l'AMPK putatifs (# 1, 148-157 comprenant Ser153; # 2, 330-339 comprenant Ser335 et # 3, 553-562 comprenant Ser558) ont été synthétisés et utilisés comme concurrents dans le Test de kinase vitro . La phosphorylation de Nrf2 par AMPK a été fortement diminuée en présence d'oligopeptide n ° 3 ( figure 1 ). Ensuite, un test de mutagenèse dirigé par site a été réalisé pour valider le résultat de l'expérience peptidomimétique. Compte tenu de l'effet inhibiteur de l'oligopeptide n ° 3 sur la phosphorylation médiée par AMPK de Nrf2 ( figure 1 ), nous avons généré un mutant S558A-Nrf2. Les niveaux de phosphorylation ont été comparés entre le type sauvage Nrf2 et le S558A utilisant le test in vitro de AMPK kinase. La substitution unique d'acides aminés de Nrf2 (Ser → Ala à 558) a empêché l'AMPK de phosphoryler Nrf2, ce qui indique que l'AMPK phosphoryle directement Nrf2 à Ser558 ( Figure 2 ).
Figure 1: dosage de la kinase AMPK compétitive in vitro . Des tests de kinase in vitro ont été réalisés en présence des oligopeptides indiqués (# 1, 148-157 comprenant Ser153; # 2, 330-339 comprenant Ser335 et # 3, 553-562 comprenant Ser558).
Figure 2: dosage de la kinase AMPK in vitro en utilisant une protéine mutante spécifique au site. Les tests de kinase in vitro ont été effectués en présence de WildtYpe GST-Nrf2 ou son mutant S558A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Comme un moyen simple et pratique d'évaluer l'authenticité des sites de phosphorylation prédits médiés par AMPK, on décrit ici un test de kinase in vitro qui peut être utilisé pour découvrir un site de phosphorylation spécifique en utilisant des peptides compétitifs et pour le vérifier en utilisant un mutant spécifique au site . Les données représentatives obtenues à partir du test d'activité AMPK compétitif in vitro correspondent aux résultats d'un essai en utilisant une protéine mutante dirigée par le site, ce qui indique que le test de compétition peptidique est un outil utile pour déterminer un site de phosphorylation. Cette méthode a également été utilisée dans l'étude identifiant le site spécifique phosphorylé par PKCδ, qui phosphoryle Nrf2 à la serine 40 3 . Puisque les peptides se lient de manière compétitive à une protéine, le principe peut également être appliqué à un test déroulant GST in vitro pour identifier un motif de liaison 10 , 11 . De plus, ce peptidomimeLa méthode tic peut également s'appliquer à l'identification d'autres modifications post-traductionnelles telles que l'acétylation dans les résidus de lysine.
En utilisant ce protocole, il peut être difficile de dissoudre certains peptides hydrophobes. Si un peptide est insoluble dans un tampon kinase, il peut être utile de le dissoudre dans 20% de DMSO. Pour dissoudre des peptides extrêmement hydrophobes, essayez d'abord de le dissoudre dans 100% de DMSO, puis diluez la solution avec un tampon kinase. La sonication peut également aider à dissoudre les peptides. Si elle reste insoluble, un peptide imitant le site putatif devrait être étendu pour augmenter la solubilité.
Le protocole introduit dans cet article décrit un "système in vitro " dans lequel une kinase et un substrat purifiés sont mis à réagir. Dans le système in vitro , de petites différences dans la concentration des peptides compétitifs n'affectent pas les résultats, à moins que la concentration soit inférieure à la protéine du substrat. Le rEsult obtenu à partir d'une expérience in vitro comprend la possibilité inhérente d'être un événement artefactif produit par la proximité artificielle et la forte concentration de réactifs. Pour éliminer cette perspective, l'interprétation des données devrait être accompagnée des résultats issus d'expériences basées sur des cellules. Une autre possibilité d'obtenir des résultats faussement positifs à l'aide de peptides peut être due à des modifications de la conformation du substrat et / ou à la reconnaissance de la kinase. Pour exclure cette possibilité, il est nécessaire de faire des expériences de confirmation avec des protéines mutantes.
D'autre part, des données faussement négatives peuvent également être produites à partir de ce système. De nombreuses kinases agissent comme des complexes de protéines dans le contexte cellulaire et nécessitent des cofacteurs pour une fonctionnalité complète. L'AMPK est un complexe représentatif de la protéine kinase composé de sous-unités AMPKα, AMPKβ et AMPKγ, et la liaison de l'AMP à la sous-unité AMPKγ est nécessaire pour l'activation de la kinase. En effet, AMPKN'a pas phosphorylé Nrf2 dans un tampon kinase sans AMP (données non présentées). Ainsi, il convient de noter que l'AMP doit être dissous dans le tampon de réaction kinase pour un essai in vitro réussi.
L'utilisation de la spectrométrie de masse pour l'identification des sites de phosphorylation, la méthode la plus populaire, présente plusieurs limitations techniques, générant souvent des signaux faussement négatifs par la perte facile d'acide phosphorique pendant le processus de fragmentation 7 . Une méthode de microarray peptidique peut être la deuxième option pour rechercher des sites de phosphorylation. Cependant, cette méthode est considérée comme longue et coûteuse. En tant que méthode alternative pour le dépistage des sites de phosphorylation putatifs, la méthode du peptide compétitif peut être un moyen pratique et peu coûteux pour mieux comprendre la nature d'un site de phosphorylation putatif.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention de la Fondation nationale de la recherche de Corée financée par le gouvernement coréen (MSIP) (n ° 2015R1A2A1A10052663 et n ° 2014M1A3A3A02034698).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem, Nottingham, UK | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, Taipei City, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32P]-ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| EZblue staining reagent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polymerase | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | Avoid multiple thaw and freezing cycle |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB broth | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands | L1704 | |
| Ampicillin | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarose LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Bovine Serum Albumin | Bovogen Biologicals, Victoria, Australia | BSA100 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare, Marlborough, MA | 17-0756-01 | |
| Acetic Acid glacial | Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea | ||
| Methyl alcohol |
Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea | 5558-4410 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| SDS-PAGE kit | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 1658001FC | |
| Vacuum pump | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| Gel dryer | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| Dancing shaker | FINEPCR, Seoul, Korea | CR300 | The machine is needed for washing step |
| PCR machine | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | |
| Incubator/shakers | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea | NB-205L | |
| Microcentrifuges | LABOGENE, Seoul, Korea | 1730R | |
| Chromatography columns | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 732-1010 |
References
- Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs. Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).
- Gwinn, D. M., et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint. Mol Cell. 30, 214-226 (2008).
- Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription. J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).
- Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance. J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).
- Jain, A. K., Jaiswal, A. K. GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2. J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).
- Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements. Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).
- Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).
- Joo, M. S., et al. AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550. Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).
- Sinclair, W. K., Holloway, A. F. Half-lives of some radioactive isotopes. Nature. 167 (4244), 365 (1951).
- Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1. J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).
- Smith, L., et al. RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).
