Summary
Peptidkonkurranseanalyser er mye brukt i en rekke molekylære og immunologiske eksperimenter. Dette papiret beskriver en detaljert metode for en in vitro oligopeptid-konkurrerende kinaseanalyse og de tilhørende valideringsprosedyrer, som kan være nyttige for å finne spesifikke fosforyleringssteder.
Abstract
Proteinfosforylering på bestemte steder bestemmer dens konformasjon og interaksjon med andre molekyler. Dermed påvirker proteinfosforylering biologiske funksjoner og egenskaper hos cellen. For tiden er den vanligste metoden for å oppdage fosforyleringssteder ved væskekromatografi / massespektrometri (LC / MS) analyse, en rask og sensitiv metode. Imidlertid frigjøres relativt labile fosfatgrupper ofte fra fosfopeptider under fragmenteringstrinnet, som ofte gir falske negative signaler. I slike tilfeller ville en tradisjonell in vitro kinaseanalyse ved bruk av stedrettede mutanter være mer nøyaktig, men denne metoden er arbeidskrevende og tidkrevende. Derfor kan en alternativ metode ved bruk av peptidkonkurranse være fordelaktig. Konsensusgjenkjenningsmotivet for 5'-adenosinmonofosfat-aktivert proteinkinase (AMPK) er blitt etablert 1 og ble validert ved å bruke et posisjonsskanningspeptidbibliotek assAy 2 . Dermed kan AMPK-fosforyleringssteder for et nytt substrat forutsies og bekreftes ved peptidkonkurranseanalysene. I denne rapporten beskriver vi de detaljerte trinnene og prosedyrene for den in vitro oligopeptidkonkurrerende kinaseanalysen ved å illustrere AMPK-mediert atomfaktor erytroide 2-relatert faktor 2 (Nrf2) fosforylering. For å autentisere fosforyleringsstedet gjennomførte vi en sekvensiell in vitro kinaseanalyse ved bruk av en stedsspesifik mutant. Samlet gir peptidkonkurranseanalysen en metode for å skjerme multiple potensielle fosforyleringssteder og å identifisere steder for validering av fosforyleringsstedsmutanter.
Introduction
Proteinfosforylering ved en bestemt rest spiller en betydelig rolle i et bredt spekter av cellulære prosesser. En forståelse av signalnettverk krever således identifisering av spesifikke fosforyleringssteder. I tillegg bestemmer fosforyleringsstedet effekten på proteinfunksjonen fordi individuelle domener i et protein har forskjellige strukturer og funksjoner. Aktiviteten av nukleær faktor erythroid 2-relatert faktor 2 (Nrf2), en nøkkel antioxidant transkripsjonsfaktor, er toveis regulert gjennom fosforylering på forskjellige steder. Våre studier har fokusert på kinaser som katalyserer fosforyleringen av Nrf2. Spenningsresponsen av Nrf2 mot oksidativ utfordring skjer raskt, hovedsakelig gjennom fosforylering ved serin 40 og mediert av proteinkinase C (PKC) -δ, som aktiverer Nrf2 3 , 4 . Omvendt katalyserer Fyn den inhibitoriske fosforyleringen av Nrf2 ved tyrosin 568 for tett kontroll av aktiviteten 5 .
Den vanligste metoden som brukes til å oppdage fosforyleringssteder er væskekromatografi / massespektrometrianalyse (LC / MS). Hurtig og svært sensitiv fosforyleringssted kartlegging data kan genereres på denne måten; Det har imidlertid flere tekniske begrensninger, som ofte genererer falsk-negative signaler. Dårlig sekvensdekning forekommer ofte i LC / MS analyse. For å identifisere fosforyleringssteder, er det nødvendig med opplysninger om maksimal aminosyredekning av et protein 6 . Proteolyse av proteinet av interesse med flere proteaser under fordøyelsestrinnet kan være til hjelp for å forbedre sekvensdekning. Et annet hinder for identifisering av fosforyleringsrester er det fatal tap av fosforsyre som ofte observeres for serin- og treonin-fosforylerte peptider 6 , 7 . Labile fosfatgrupper er ofteFrigjort fra fosfopeptider under fragmenteringsprosessen 7 . Det andre alternativet når man søker etter fosforyleringssteder, bruker en peptidmikroarray-metode. Det er mulig å skjerme for kinase-målstedene ved å bruke en mikroarray-chip som inneholder peptidfragmenter avledet fra et protein av interesse. På grunn av utstyrskravet for produksjon og deteksjon av en mikroarray-chip, anses peptidmikroarray-metoden imidlertid tidskrevende og kostbar.
For å overvinne disse utfordringene kan en in vitro oligopeptidkompeterende kinaseanalyse brukes til en proteinkinase med kjente genkende motiver. Hvis konsensusgjenkjenningsmotivet for en kinase er etablert, kan man forestille formative fosforyleringssteder av et kandidatsubstrat, og autentisiteten til nettstedene kan valideres. Den mest overbevisende metoden for denne prosedyren er å vise opphevelsen av fosforylering i et mutantprotein der prediktenD-rest er substituert med en ikke-fosforylerbar aminosyre ( dvs. serin eller treonin til alanin, tyrosin til fenylalanin). Produksjonen og isoleringen av mutantproteiner er imidlertid tidkrevende. Som et alternativ i den første fasen av forskningen er konkurransedyktig peptidkinaseanalyse enkel og praktisk. Her beskriver vi en protokoll for en in vitro- peptidkonkurranseanalyse og for validering av fosforyleringsstedet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sikkerhet
FORSIKTIG: Denne protokollen bruker [γ- 32 P] -ATP for å vurdere aktiviteten til AMPK. Fosfor-32 er en radioaktiv isotop, som i stor grad sender ut beta-stråling. Siden størrelsen på en beta-partikkel er ekstremt liten, kan den lett trenge inn i klær og hud. Både ekstern og intern eksponering for beta-stråling kan være skadelig for menneskers helse, blant annet ved å forårsake hudforbrenninger og vevskader.
- Utfør alle trinnene som krever bruk av [γ- 32 P] -ATP ved hjelp av riktig beskyttelse, for eksempel akrylskjerming.
- Sørg for at alt personell er utstyrt med elektroniske personlige dosimetre (EPD) for å overvåke omfanget av eksponering for skadelig stråling under alle prosedyrer.
- Håndter kun åpenkildestråling etter passende opplæring og godkjenning av myndighetene.
MERK: Her ble alle eksperimenter utført etter ferdigstillelse av opplæring ved bruk av open source-stråling ved Seoul National UnivErstatning og godkjenning av den koreanske regjeringen (nssc.go.kr/nssc/en). - Kast av radioaktivt avfall i henhold til lokale bestemmelser.
MERK: Her ble direktiver fra Institute of Environmental Protection & Safety av Seoul National University fulgt. Følgende er en liste over regulatorer i USA og europeiske land: USA, USA Nuclear Regulatory Commission (http://www.nrc.gov/); Storbritannia, Helse- og sikkerhetskonsulent (HMS) (http://www.hse.gov.uk); Frankrike, Autorité de Sûreté Nucléaire (https://www.asn.fr/); Og Tyskland, Forbundsdepartementet for miljø, naturvern, bygg og nukleær sikkerhet (BMU) (http://www.bmu.de).
2. In Vitro Competitive Kinase Assay
- Konstruksjon av konkurrerende peptider
- Bestem konsensusmotivet fosforylert av AMPK.
MERK: AMPK gjenkjenner konsensusmotivet, &# 934; - [X, β] -XX-Ser / Thr-XXX-Φ. I konsensussekvensen representerer Φ hydrofobaminosyrer ( dvs. valin [V], leucin [L], metionin [M] og isoleucin [I]) og p representerer basiske aminosyrer ( dvs. lysin [K], arginin [ R] og histidin [H]) 1 . - Velg serin- eller treoninrester fra målsekvenser i henhold til det ovenfor angitte konsensusmotivet. Bruk tre formodede steder av humant Nrf2 (# 1, 148-157 omfattende Ser153; # 2, 330-339 omfattende Ser335; og # 3, 553-562 omfattende Ser558) 8 .
- Kommersielt syntetiser 10 peptidrester som etterligner de formodede stedene. Hent det syntetiserte produktet som et lyofilisert pulver med en renhet på over 98% for hvert peptid.
- Oppløs peptidene ved hjelp av en kinasebuffer for å oppnå en konsentrasjon på 71,667 g / L. Hvis et peptid ikke er løselig i en kinasebuffer, oppløses det i 20% DMSO. Hvis det er uoppløselig, etterlikner et peptid putenAtivstedet kan utvides for å øke oppløseligheten.
- Bestem konsensusmotivet fosforylert av AMPK.
- I Vitro Competitive AMPK Kinase Assay
- Forbered 5 × kinasebuffer som følger: 100 mM HEPES, pH 7,4; 25 mM MgCl2; 5 mM EGTA; 5 mM DTT; 125 mM p-glycerofosfat (serin / treonin fosfatase inhibitor); 5 mM Na3VO4 (tyrosinfosfataseinhibitor); 0,5% (vol / vol) Protease Inhibitor Cocktail Set III, 1 mM kald ATP; Og 500 uM AMP.
MERK: AMP er en viktig komponent i kinasebufferen for å teste AMPK-aktivitet. Bufferen kan brukes til å måle aktiviteten til både serin / treoninkinaser og tyrosinkinaser. - Tine følgende rekombinante protein og syntetiske peptider på is: AMPK; Nrf2; Og oligopeptider nr. 1, nr. 2 og nr. 3.
- Lag en reaksjonsbuffer på is: 0,15 μg AMPK, 0,4 μg Nrf2 (~ 4 pmol), 0,43 mg oligopeptid (~ 300 nmol) og 6 μl 5 × kinase buffer. ENJust det endelige volumet til 30 μL med sterilt destillert vann (DW).
MERK: Tilsetningen av [y-32P] -ATP etter fremstilling av reaksjonsbufferen kan redusere det radioaktive signalet på grunn av kinaseautofosforylering.
- Forbered 5 × kinasebuffer som følger: 100 mM HEPES, pH 7,4; 25 mM MgCl2; 5 mM EGTA; 5 mM DTT; 125 mM p-glycerofosfat (serin / treonin fosfatase inhibitor); 5 mM Na3VO4 (tyrosinfosfataseinhibitor); 0,5% (vol / vol) Protease Inhibitor Cocktail Set III, 1 mM kald ATP; Og 500 uM AMP.
- Kjører reaktantene
MERK: Alle prosessene under må utføres under beskyttelse med akrylskjerm, rack eller blokk, samt passende personlig verneutstyr.- Still opp varmeblokker til 30 ° C før du starter forsøket.
- Tilsett 1 μL [γ-32P] -ATP (1 μCi) til reaksjonsrørene på is. Bland reaksjonsbufferen ved pipettering opp og ned flere ganger.
MERK: Radioaktiviteten på 32 P har kort halveringstid på ca. 14 dager 9 . Juster volumet ved å ta hensyn til halveringstiden ( f.eks. Etter en måned fra produksjonen av [γ- 32 P] -ATP, legg til 4 μL [γ- 32 P]-ATP for å gjøre 1 μCi). - Inkuber prøven i oppvarmingsblokken ved 30 ° C i 15-30 minutter. Under dette trinnet skal du lage 7,5% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) geler. Juster prosentandelen av gelen i henhold til målproteinets størrelse.
- Stopp kinasereaksjonen ved å tilsette 3 μl 10 x SDS prøvebuffer (10% (vol / vol) glycerol, 20% (vekt / volum) SDS, 15,42% (w / v) ditiotreitol, 90% (volum / volum) 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8) og 0,02% (vekt / volum) bromfenolblå). Bland reaksjonsbufferen ved pipettering opp og ned flere ganger.
- Kjør prøvene i en 7,5% SDS-PAGE gel ved 70 V i 20 minutter og kontinuerlig ved 140 V i 1 time.
MERK: Den bromofenolblå linjen ved enden av gelen inneholder ekstremt høye radioaktive signaler. Det anbefales å fjerne gelen under den blå linjen før du fortsetter til neste trinn for å redusere bakgrunnssignaler. - Etter SDS-PAGE, fjern forsiktig gelen fra kasteren. Plasser gelen i et glass tUbe for neste trinn.
- Fiks gelen med fikseringsbuffer i 20 minutter (50% metanol og 10% iseddik).
- Flytt gelen forsiktig på filterpapir og dekk den med et gjennomsiktig omslag. Legg merke til at gelen lett kan bli revet på dette trinnet. Tørk gelen med en vakuum-tørketrommel ved 80 ° C i 1 time.
- visualisering
- Utsett gelen til enten en fosforskjerm eller en røntgenfilm natten over (vanligvis i ca. 16 timer).
MERK: En fosforskjerm kan gjenbrukes etter eksponering for det ekstra sterke lyset. Når en røntgenfilm brukes, utsetter du gelen over to dager. Røntgenfilmer har lavere følsomhet enn fosforskjerm. - Skann fosforskjermen med en fosforbilderer. Eksporter bildet som en TIFF- eller bitmapfil med høy oppløsning.
- Etter visualisering, flytt gelen til en glass- eller plastbeholder for Coomassie brilliant blue (CBB) -farging.
- Vask gelen med DW. Kast DW og flekk thE gel med flekkingsreagenset i 1 time.
- Kast reagensen og fjern gelen med DW i 1 time eller over natten. Plasser gelen mellom gjennomsiktige plastfilmer (eller tilsvarende) for å skanne med en kontorskanner.
- Utsett gelen til enten en fosforskjerm eller en røntgenfilm natten over (vanligvis i ca. 16 timer).
3. I Vitro Kinase-analyse ved hjelp av et stedsspesifikt mutant
- Site-Directed Mutagenesis av pGEX-Nrf2
- Mutagen Primer Design
MERK: Å designe egnede mutagene primere er kritisk for det vellykkede resultatet av mutagenese. Følgende er noen hensyn til utforming av mutagene primere. Lag en primer bestående av 25 til 45 baser, med ønsket mutasjon i midten av primeren. Primeren skal ha 40-60% GC innhold og avslutte med ett eller flere G- eller C-baser. Kontroller at primerens T m er lik 78 ° C eller høyere i henhold til formelen [T m = 81,5 + 0,41 (% GC) - (675 / lengde av basene) -% mismatch].
MERK: Ryd påPrimer fordi renheten er viktig for mutasjonseffektivitet. Det er flere nettsteder for å designe mutagene primere.- Åpne primerdesignprogrammet for "utforming av primere for sidestyrt mutagenese" (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp).
- Lim inn menneskelig Nrf2-DNA-sekvens (Adgang nr. NM_006164.4) og velg "Last opp oversatt" -knappen.
- Velg serin 558 rest fra den translaterte aminosyresekvensen som skal endres til alanin. Bruk mutagen primer, erstatt kodonet for serin fra agc til gcc, for alanin.
- Vurder primerlengden, T m , og GC-innholdet.
MERK: Den mutagene primeren er endelig utformet som 5'-ctactgaaaaaacaactc gcc accttatatctcgaag-3 '.
- Reaksjon for mutantstrandsyntese ved anvendelse av polymerase-kjedereaksjon (PCR)
- Forbered PCR-reaksjonsblandingen på is: 10 x reaksjonsbuffer, 50 ng avPGEX-GST-Nrf2, 125 ng fremre primer, 125 ng omvendt primer, 1 ul dNTP-blanding (10 mM hver), 2,5 U Pfu DNA-polymerase og steril DW til 50 ul.
- Kjør PCR for pGEX-GST-Nrf2-mutantstrengsyntese med følgende syklusprogram: 1 syklus ved 95 ° C i 30 s; 18 sykluser ved 95 ° C i 30 s, ved 55 ° C i 1 min og ved 68 ° C i 90 s; Og 1 syklus ved 68 ° C i 5 minutter.
MERK: Avhengig av plasmidlengden, kan syklingsparametrene endres. - Plasser den på is i 2 minutter for å avkjøle reaktantene for neste trinn. Alternativt, lagre dem ved 4 ° C over natten.
- Dpn I Digestion og utvelgelsen av en Mutant Plasmid
- Tilsett 1 μl Dpn I restriksjonsenzym (10 U / μl) til hver av reaktantene etter avkjøling. Bland godt og forsiktig ved pipettering og sentrifuger i 1 min.
- Inkuber ved 37 ° C i 2 timer for å fordøye foreldre pGEX-GST-Nrf2 dobbelt-Strandet DNA.
- Tørk DH5 α superkompetente celler forsiktig på is.
- Tilsett 50 μL av reaktanten til 150 μl av forkjølte DH5 α superkompetente celler og inkuber på is i minst 30 min.
- Overfør rørene til en varmekilde som er forvarmet til 42 ° C og la dem stå i 90 s. Plasser dem på is i 2 minutter.
- Tilsett forvarmet lysogeneboks (LB) til de transformerte DH5a- cellene og inkuber ved 37 ° C i 1 time med risting ved 180 rpm.
- Spred de transformerte cellene på LB-ampicillin agarplater og inkuber natten over ved 37 ° C.
MERK: Ampicillin brukes til seleksjon siden plasmidet GEX-GST-Nrf2 har ampicillinresistensmarkøren. Bruk passende antibiotika, avhengig av resistensmarkøren til det mutageniserte plasmidet. - Velg en enkelt koloni fra platen, overfør den til 5 ml LB-ampicillin, og inkuber natten over ved 37 ° C ved risting ved 180 rpm.For å verifisere den mutagene sekvensen, vurder minst tre kolonier.
- Ekstraher DNA ved bruk av et DNA miniprep kit for DNA sekvensanalyse; Følg produsentens protokoll.
- Verifiser de mutagene DNA-sekvensene ved hjelp av en automatisk DNA-sekvensanalysator i henhold til produsentens protokoll. Bruk minst 200 ng av DNA-konstruksjonen for verifikasjon av mutante sekvenser.
- Mutagen Primer Design
- Rensing av rekombinant GST-Nrf2 Protein
- Ekspresjon av mutagen GST-Nrf2- fusjonsprotein i Escherichia coli
- Transform det mutagene pGEX-GST-Nrf2-plasmidet til BL21- celler. Inokulere en enkelt koloni i 25 ml LB-buljong inneholdende ampicillin (100 μg / ml) og inkuber ved 37 ° C på en rotator over natten.
- Inokuler de dyrkede cellene i 100 ml LB-buljong inneholdende ampicillin (100 ug / mL) ved et 1: 100 fortynningsforhold.
- Inkuber ved 37 ° C på en roterEller til absorbansen ved 600 nm når rundt 0,4-0,8 (ca. 4 timer).
- Tilsett 100 μL 1 M IPTG til 100 ml dyrkede celler for å fremstille en endelig konsentrasjon på 1 mM IPTG.
- Inkubér cellene ved 30 ° C på en rotator i 6 timer eller over natten for proteinekspresjon.
- Sentrifuger cellene ved 5000 xg i 20 minutter og resuspender cellepelletsene med 1 ml bakteriel lysbuffer (25 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 0,1% CHAPS, 1 ug / ml pepstatin, 0,5 ug / ml leupeptin, Og 1 mM PMSF) på is.
- Lyse cellepellets ved hjelp av en ultralydshomogenisator med 2-s intervaller i 2 min ved 50% av maksimal effekt.
- Sentrifuger cellene ved 12 000 x g i 15 minutter ved 4 ° C og oppsamler supernatanten.
- Rensing av rekombinant GST-Nrf2 Protein
- Forbered 200 μl 50% (v / v) glutation-agarosekuler og vask med 1 ml PBS (pH 7,3; 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2 4 og 1,8 mM KH 2 PO 4 ). Samle perlene ved sentrifugering ved 500 x g i 1 min. Gjenta vaskestrinnet tre ganger.
- Tilsett cellelysatet til de preparerte 200 μl 50% (v / v) glutation-agarosekuler og inkuber ved 4 ° C på en roterende ende-over-ende i 2 timer.
- Samle glutation-agarosekulene kombinert med GST-Nrf2-protein ved sentrifugering ved 500 xg i 1 min. Fjern supernatanten ved hjelp av en 1 ml sprøyte med en 31 G nål.
- Vask perlene med 1 ml PBS (pH 7,3), som i trinn 1.
- Tilsett 500 μl elueringsbuffer (50 mM Tris-HCl og 10 mM redusert glutation, pH 8,0) til glutation-agarosekulene kombinert med GST-Nrf2. Inkuber ved 4 ° C på en roterende rotor i 30 minutter.
- Sentrifuge ved 500 xg i 1 min og samle supernatanten.
- Legg igjen 300 μl elueringsbuffer til perlene og gjenta trinn 3.2.2.5-3.2.2.6 to ganger.
- Bekreftelse av det rensede GST-Nrf2 Protein
- Forbered 5 μL av prøven for visualisering av proteinmengde med 0,5 μg standard protein BSA.
- Kjør prøvene i en 7,5% SDS-PAGE-gel ved 70 V i 20 minutter og deretter ved 140 V i 60 min.
- Farg gelen med 0,1% CBB-fargeløsning (0,1 g CBB R250, 40 ml 99% metanol, 10 ml iseddik og 50 ml destillert H20) i 2 timer og destillere (30 ml metanol, 10 ml iseddik og 60 ml destillert H20) til båndene er tydelig vist.
- Legg den destillerte gelen på filterpapir og dekk med et gjennomsiktig omslag. Tørk gelen med en vakuum-tørketrommel ved 80 ° C i 1 time.
- Bestem mengden mutant GST-Nrf2-protein med densitometri for in vitro AMPK-kinaseanalysen.
- Ekspresjon av mutagen GST-Nrf2- fusjonsprotein i Escherichia coli
- I Vitro AMPK Aktivitetsanalyse med en Site-Specific Mutant
IKKEE: In vitro AMPK-kinaseanalysen utføres i henhold til trinnene 2.2-2.4 ved anvendelse av 0,4 μg renset villtype GST-Nrf2 eller GST-Nrf2-S558A-mutanten uten peptidinhibitorer. Følg alle retningslinjer for strålingssikkerhet som er beskrevet i trinn 1.- Forbered en reaksjonsbuffer på is med 0,15 μg AMPK, 0,4 μg mutant eller wildtype GST-Nrf2 og 6 μl 5 kinasebuffer. Fyll opptil 30 μL med sterilt DW.
- Tilsett 1 μL [γ-32P] -ATP (1 μCi / μL) til reaksjonsrørene på is. Bland reaksjonsbufferen ved pipettering opp og ned flere ganger og sentrifuger.
- Inkuber prøvene i en oppvarmingsblokk ved 30 ° C i 30 minutter.
- Stopp kinasereaksjonen ved å tilsette 3 μl 10 x SDS prøvebuffer.
- Kjør i en 7,5% SDS-PAGE gel ved 70 V i 20 minutter og deretter ved 140 V i 1 time.
- Fest gelen med fikseringsbufferen i 20 minutter, flytt den på filterpapiret, og dekk gelen med en transparentEnt wrapper.
- Tørk gelen med vakuumgeltørkeren ved 80 ° C i 1 time og utsett den deretter over natten til enten en fosforskjerm eller en røntgenfilm.
- Skann fosforskjermen med en fosforbilder og flytt gelen til et glassrør for CBB-farging etter visualisering i henhold til trinn 2.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 og Figur 2 viser resultatene fra gjentatte eksperimenter i det tidligere rapporterte papiret 8 . Tre forskjellige oligoseptider med 10 residu som etterligner de formodede AMPK-målsteder (# 1, 148-157 omfattende Ser153; # 2, 330-339 omfattende Ser335; og # 3, 553-562 omfattende Ser558) ble syntetisert og anvendt som konkurrenter i den Vitro kinaseanalyse. Fosforyleringen av Nrf2 ved AMPK ble kraftig redusert i nærvær av oligopeptid # 3 ( figur 1 ). Deretter ble en site-directed mutagenesis assay utført for å validere resultatet av det peptidomimetiske eksperimentet. Gitt den inhibitoriske effekten av oligopeptid # 3 på AMPK-mediert fosforylering av Nrf2 ( Figur 1 ), genererte vi en S558A-Nrf2-mutant. Fosforyleringsnivåene ble sammenlignet mellom villtype Nrf2 og S558A mutant ved bruk av in vitro AMPK kinase-analysen. Den eneste aminosyresubstitusjon av Nrf2 (Ser → Ala ved 558) forhindret AMPK fra fosforylering Nrf2, hvilket indikerer at AMPK direkte fosforylerer Nrf2 ved Ser558 ( Figur 2 ).
Figur 1: In vitro- konkurrerende AMPK-kinaseanalyse. In vitro kinaseanalyser ble utført i nærvær av de indikerte oligopeptider (# 1, 148-157 omfattende Ser153; # 2, 330-339 omfattende Ser335; og # 3, 553-562 omfattende Ser558).
Figur 2: In vitro AMPK-kinaseanalyse ved bruk av et stedsspesifikt mutantprotein. In vitro kinaseanalyser ble utført i nærvær av wildtYpe GST-Nrf2 eller dets S558A mutant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som en enkel og praktisk måte å vurdere ektheten av de forutsagte fosforyleringsstedene mediert av AMPK, beskriver vi en in vitro kinaseanalyse som kan brukes til å oppdage et spesifikt fosforyleringssted ved bruk av konkurrerende peptider og for å verifisere det ved bruk av en spesifikk mutant . Representative data oppnådd fra den in vitro- konkurrerende AMPK-aktivitetsanalysen matchet resultatene fra en analyse ved bruk av et stedrettet mutantprotein, hvilket indikerer at peptidkonkurranseanalysen er et nyttig verktøy for å bestemme et fosforyleringssted. Denne metoden ble også brukt i studien som identifiserer det spesifikke området fosforylert av PKCδ, som fosforylerer Nrf2 ved serin 403. Siden peptider binder konkurrentivt til et protein, kan prinsippet også påføres en in vitro GST-tilbaketrekningsanalyse for å identifisere et bindingsmotiv 10 , 11 . Dessuten er dette peptidomimetTic-metoden kan også gjelde for identifisering av andre posttranslasjonelle modifikasjoner, slik som acetylering ved lysinrester.
Ved hjelp av denne protokollen kan det være vanskelig å oppløse noen hydrofobe peptider. Hvis et peptid er uoppløselig i en kinasebuffer, kan det være nyttig å oppløse det i 20% DMSO. For å oppløse ekstremt hydrofobe peptider, første forsøk på å oppløse det i 100% DMSO og deretter fortynne løsningen med en kinasebuffer. Sonikering kan også være til hjelp ved oppløsning av peptidene. Hvis det fortsatt er uoppløselig, bør et peptid som etterligner det formodede området, bli utvidet for å øke oppløseligheten.
Protokollen introdusert i dette papir beskriver et " in vitro system" hvori en renset kinase og substrat reageres. I in vitro- systemet vil små forskjeller i konsentrasjonen av konkurrerende peptider ikke påvirke resultatene med mindre konsentrasjonen er lavere enn substratproteinet. REsult oppnådd fra et in vitro- eksperiment inkluderer den inneboende muligheten for å være en artefaktuell hendelse fremstilt ved kunstig nærhet og den høye konsentrasjon av reaktanter. For å eliminere dette prospektet, bør tolkningen av dataene ledsages av resultatene fra cellebaserte eksperimenter. En annen mulighet for å oppnå falske positive resultater ved bruk av peptider kan skyldes endringer i substratkonformasjon og / eller kinasegenkjenning. For å utelukke denne muligheten er det nødvendig å gjøre bekreftelseseksperimenter med mutantproteiner.
På den annen side kan også falske negative data produseres fra dette systemet. Mange kinaser virker som proteinkomplekser i den cellulære konteksten og krever samfaktorer for full funksjonalitet. AMPK er et representativt proteinkininkompleks bestående av AMPKa, AMPKβ og AMPKγ-underenheter, og bindingen av AMP til AMPKy-underenheten er nødvendig for aktiveringen av kinasen. Faktisk, AMPKFosforylerer ikke Nrf2 i en AMP-fri kinasebuffer (data ikke vist). Det skal derfor bemerkes at AMP må oppløses i kinasereaksjonsbufferen for en vellykket in vitro- analyse.
Bruken av massespektrometri for identifisering av fosforyleringsseter, den mest populære metoden, har flere tekniske begrensninger, og genererer ofte falsk-negative signaler ved hjelp av fosforsyrefeil i fragmenteringsprosessen 7 . En peptidmikroarray-metode kan være det andre alternativet for å søke etter fosforyleringssteder. Denne metoden anses imidlertid for tidskrevende og kostbar. Som en alternativ metode for screening av formodede fosforyleringssteder kan den konkurrerende peptidmetoden være en praktisk og billig måte å få innblikk i naturen til et formodet fosforyleringssted.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Research Foundation of Korea-stipend finansiert av den koreanske regjeringen (MSIP) (nr. 2015R1A2A1A10052663 og nr. 2014M1A3A3A02034698).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem, Nottingham, UK | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, Taipei City, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32P]-ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| EZblue staining reagent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polymerase | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | Avoid multiple thaw and freezing cycle |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB broth | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands | L1704 | |
| Ampicillin | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarose LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Bovine Serum Albumin | Bovogen Biologicals, Victoria, Australia | BSA100 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare, Marlborough, MA | 17-0756-01 | |
| Acetic Acid glacial | Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea | ||
| Methyl alcohol |
Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea | 5558-4410 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| SDS-PAGE kit | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 1658001FC | |
| Vacuum pump | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| Gel dryer | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| Dancing shaker | FINEPCR, Seoul, Korea | CR300 | The machine is needed for washing step |
| PCR machine | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | |
| Incubator/shakers | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea | NB-205L | |
| Microcentrifuges | LABOGENE, Seoul, Korea | 1730R | |
| Chromatography columns | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 732-1010 |
References
- Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs. Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).
- Gwinn, D. M., et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint. Mol Cell. 30, 214-226 (2008).
- Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription. J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).
- Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance. J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).
- Jain, A. K., Jaiswal, A. K. GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2. J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).
- Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements. Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).
- Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).
- Joo, M. S., et al. AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550. Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).
- Sinclair, W. K., Holloway, A. F. Half-lives of some radioactive isotopes. Nature. 167 (4244), 365 (1951).
- Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1. J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).
- Smith, L., et al. RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).
