Summary
Peptid rekabet testleri, çeşitli moleküler ve immünolojik deneylerde yaygın olarak kullanılır. Bu makale , in vitro oligopeptitle rekabet eden kinaz testi için ayrıntılı bir yöntem ve ilgili fosforilasyon sitelerini bulmak için yararlı olabilen ilişkili validasyon prosedürlerini açıklamaktadır.
Abstract
Belirli bölgelerdeki protein fosforilasyonu, konformasyonunu ve diğer moleküllerle olan etkileşimini belirler. Böylece protein fosforilasyonu, hücrenin biyolojik işlevlerini ve özelliklerini etkiler. Günümüzde, fosforilasyon alanlarını keşfetmek için en yaygın yöntem, hızlı ve hassas bir yöntem olan sıvı kromatografi / kütle spektrometresi (LC / MS) analizidir. Bununla birlikte, nispeten kararsız fosfat kısımları sıklıkla sahte-negatif sinyaller üreten parçalanma aşaması esnasında fosfopeptidlerden salınmaktadır. Bu gibi durumlarda , bölgeye yönelik mutantları kullanan geleneksel bir in vitro kinaz tahlili daha doğru olur, ancak bu yöntem zahmetli ve zaman alıcıdır. Bu nedenle, peptid rekabetini kullanan alternatif bir yöntem avantajlı olabilir. 5 'adenosin monofosfat aktive protein kinaz (AMPK)' nın konsensüs tanıma motifi 1 olarak belirlenmiş ve pozisyonel tarama peptit kütüphanesi eşeği kullanılarak onaylanmıştır2. ay. Böylece, yeni bir substrat için AMPK fosforilasyon bölgeleri peptid rekabet deneyleri ile öngörülebilir ve teyit edilebilir. Bu raporda, AMPK aracılı nükleer faktör eritroid 2 ile ilişkili faktör 2 (Nrf2) fosforilasyonunu örnekleyerek, in vitro oligopeptidle rekabet eden kinaz tahlili için ayrıntılı adımları ve prosedürleri açıklıyoruz. Fosforilasyon sahasının kimliğini doğrulamak için, bir bölgeye özgü mutant kullanarak ardışık in vitro kinaz deneyi gerçekleştirdik. Genel olarak, peptit rekabet tahlili, çoklu potansiyel fosforilasyon bölgelerini taramak ve fosforilasyon bölgesi mutantları tarafından geçerlilik için siteleri belirlemek için bir yöntem sağlar.
Introduction
Belirli bir tortuda protein fosforilasyonu çok çeşitli hücresel süreçlerde önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, sinyalleme ağlarının anlaşılması, spesifik fosforilasyon sahalarının tanımlanmasını gerektirir. Buna ek olarak, fosforilasyon bölgesi protein işlevindeki etkiyi belirler, çünkü bir proteindeki tekli alanlar farklı yapılara ve işlevlere sahiptir. Anahtar bir antioksidan transkripsiyon faktörü olan nükleer faktör eritroid 2-ilişkili faktör 2 (Nrf2) aktivitesi, farklı bölgelerdeki fosforilasyon yoluyla iki yönlü olarak düzenlenir. Çalışmalarımız, Nrf2'nin fosforilasyonunu katalizleyen kinazlara odaklanmıştır. Nrf2'nin oksidatif meydan okumaya karşı stres tepkisi, esas olarak serin 40'da fosforilasyon yoluyla ve Nrf2 3 , 4'ü aktive eden protein kinaz C (PKC) -8 aracılığında hızlı bir şekilde oluşur. Tersine, Fyn, Tirozin 5'de Nrf2'nin inhibe edici fosforilasyonunu katalize ederAktivitenin sıkı kontrolü için 68.
Fosforilasyon bölgelerini keşfetmek için kullanılan en yaygın yöntem sıvı kromatografisi / kütle spektrometresi (LC / MS) analizidir. Hızlı ve son derece hassas fosforilasyon sitesi haritalama verileri bu şekilde oluşturulabilir; Bununla birlikte, sıklıkla yanlış negatif sinyaller üreten birkaç teknik sınırlama vardır. Zayıf dizi kapsamı sıklıkla LC / MS analizinde meydana gelir. Fosforilasyon bölgelerini belirlemek için, bir proteinin maksimum amino asit kapsamı hakkında bilgi gereklidir 6 . Sindirim basamağı boyunca ilgi çekici proteinin birkaç proteazla proteolizi, sekans kapsamının iyileştirilmesinde yardımcı olabilir. Fosforilasyon kalıntılarının belirlenmesinin bir başka engeli, serin ve treonin fosforile peptitler 6 , 7 için sıklıkla gözlemlenen kolay fosforik asit kaybıdır. Labil fosfat kısımları genellikleParçalanma işlemi sırasında fosfopeptidlerden salınır 7 . Fosforilasyon bölgeleri ararken ikinci seçenek, bir peptid mikrodizisi metodu kullanmaktadır. İlgi konusu bir proteinden türetilen peptid fragmanlarını içeren bir mikro-dizi çipi kullanarak kinaz hedef bölgeleri için tarama yapmak mümkündür. Bununla birlikte, mikroarray çipinin üretilmesi ve algılanması için ekipman gereksinimi nedeniyle, peptid mikrodizisi metodu zaman alıcı ve pahalıdır.
Bu zorlukların üstesinden gelmek için, bilinen tanıma motifleri olan bir protein kinazı için bir in vitro oligopeptit-rekabet kinaz testi kullanılabilir. Bir kinazın konsensüs tanıma motifi oluşturulursa, aday bir substratın varsayılan fosforilasyon bölgeleri tahmin edilebilir ve sitelerin orijinalliği doğrulanabilir. Bu işlem için en ikna edici yöntem, bir mutant proteinde fosforilasyonun kaldırılmasını göstermektir; burada predicteD kalıntısı, fosforile edilemeyen bir amino asitle ( yani, alanin için serin ya da treonin, tirosinden fenilalanine) ikame edilir. Bununla birlikte, mutant proteinlerin üretimi ve izolasyonu zaman alıcıdır. Araştırmanın ilk aşamasında alternatif olarak, rekabetçi peptit kinaz tahlili basit ve kullanışlıdır. Burada, bir in vitro peptit rekabet testi için ve fosforilasyon bölgesinin doğrulamasına ilişkin bir protokolü açıklıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Güvenlik
DİKKAT: Bu protokol AMPK aktivitesini değerlendirmek için [γ- 32 P] -ATP kullanır. Fosfor-32, büyük oranda beta radyasyon yayan bir radyoaktif izotoptur. Bir beta parçacık boyutu son derece küçük olduğu için, giyim ve deriye kolayca nüfuz edebilir. Hem beta hem de dışa maruz kalma, insan sağlığına zararlı olabilir; cilt yanıkları ve doku hasarına neden olabilir.
- Akrilik koruyucu gibi uygun koruma kullanılarak [γ- 32 P] -ATP'nin kullanılmasını gerektiren tüm adımları uygulayın.
- Tüm işlemler sırasında zararlı radyasyona maruz kalma durumunu izlemek için tüm personelin elektronik kişisel dozimetrelerle (EPD) donatılmış olduğundan emin olun.
- Açık kaynaklı radyasyonu yalnızca uygun eğitim ve düzenleyici onayı aldıktan sonra kullanın.
NOT: Buradaki tüm deneyler, Seul Ulusal Üniversitesi'nde açık kaynak radyasyon kullanımı eğitimi tamamlandıktan sonra gerçekleştirildiErsity ve Kore hükümetinin onayı (nssc.go.kr/nssc/en). - Yerel yönetmeliklere göre radyoaktif atıkları imha edin.
NOT: Burada, Seul Ulusal Üniversitesi Çevre Koruma ve Güvenlik Enstitüsünden direktifler takip edildi. Aşağıda ABD ve Avrupa ülkelerindeki düzenleyicilerin bir listesi bulunmaktadır: Birleşik Devletler, Birleşik Devletler Nükleer Düzenleme Komisyonu (http://www.nrc.gov/); Birleşik Krallık, Sağlık ve Güvenlik İcracı (SEÇ) (http://www.hse.gov.uk); Fransa, Autorité de sûreté nucléaire (https://www.asn.fr/); Ve Almanya, Çevre, Doğa Koruma, İnşaat ve Nükleer Güvenlik (BMU) Federal Bakanlığı (http://www.bmu.de).
2. In Vitro Rekabetçi Kinaz Testi
- Rekabetçi Peptitlerin İnşası
- AMPK ile fosforillenmiş konsensüs motifini belirleyin.
NOT: AMPK, konsensüs motifini tanır,# 934 - [X, β] -XX-Ser / Thr-XXX-Φ. Konsensüs dizisinde, Φ, hidrofobik amino asitleri ( yani, valin [V], lösin [L], metiyonin [M] ve izolösin [I] temsil eder ve β, bazik amino asidi temsil eder ( örn., Lisin [K], arginin [ R] ve histidin [H]) 1 . - Yukarıdaki konsensüs motifine uygun olarak hedef sekanslardan serin veya treonin kalıntılarını seçin. İnsan Nrf2'sinin (Ser153 içeren # 1, 148-157; Ser335 içeren # 2, 330-339 ve Ser558 ihtiva eden # 3, 553-562) üç varsayılan alanı kullanın.
- Tahmini siteleri taklit eden 10 kalıntı peptidi ticari olarak sentezleyin. Sentezlenen ürünü, her bir peptid için saflık derecesi% 98'den fazla olan bir liyofilize toz olarak elde edin.
- 71.667 g / L bir konsantrasyon elde etmek için bir kinaz tampon kullanarak peptidleri çözün. Bir peptid bir kinaz tamponunda çözünmezse,% 20 DMSO içinde çözünür. Çözünmez kalırsa, putı taklit eden bir peptidÇözünürlüğü artırmak için genişletilebilir.
- AMPK ile fosforillenmiş konsensüs motifini belirleyin.
- In Vitro Rekabetçi AMPK Kinaz Testi
- 5X kinaz tamponunu aşağıdaki gibi hazırlayın: 100 mM HEPES, pH 7.4; 25 mM MgCI2; 5 mM EGTA; 5 mM DTT; 125 mM β-gliserofosfat (serin / treonin fosfataz inhibitörü); 5 mM Na3VO4 (tirozin fosfataz inhibitörü); % 0.5 (h / h) Proteaz İnhibitörü Kokteyl Seti III, 1 mM soğuk ATP; Ve 500 uM AMP.
NOT: AMP, AMPK aktivitesini test etmek için kinaz tamponunun vazgeçilmez bir bileşenidir. Tampon, hem serin / treonin kinazları hem de tirozin kinazların aktivitesini ölçmek için kullanılabilir. - Aşağıdaki rekombinant protein ve sentetik peptidleri buz üzerinde çözdürün: AMPK; Nrf2; Ve oligopeptid # 1, # 2 ve # 3'ü içerir.
- Buz üzerinde bir reaksiyon tamponu hazırlayın: 0.15 μg AMPK, 0.4 μg Nrf2 (~ 4 pmol), 0.43 mg oligopeptid (~ 300 nmol) ve 6 μL 5 x kinaz tamponu. birSteril damıtılmış su (DW) ile nihai hacmi 30 μL'ye ayarlayın.
NOT: Tepkime tamponunu hazırladıktan sonra [γ- 32 P] -ATP ilavesi, kinazın otofosforilasyonundan kaynaklanan radyoaktif sinyali azaltabilir.
- 5X kinaz tamponunu aşağıdaki gibi hazırlayın: 100 mM HEPES, pH 7.4; 25 mM MgCI2; 5 mM EGTA; 5 mM DTT; 125 mM β-gliserofosfat (serin / treonin fosfataz inhibitörü); 5 mM Na3VO4 (tirozin fosfataz inhibitörü); % 0.5 (h / h) Proteaz İnhibitörü Kokteyl Seti III, 1 mM soğuk ATP; Ve 500 uM AMP.
- Reaktanları Çalıştırmak
NOT: Aşağıdaki tüm işlemler, koruyucu bir akrilik kalkan, raf veya blok ile uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla yapılmalıdır.- Denetime başlamadan önce ısıtma bloklarını 30 ° C'ye ayarlayın.
- Buz üzerinde reaksiyon tüplerine 1 uL [γ- 32 P] -ATP (1 uCi) ekleyin. Reaksiyon tamponunu birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
NOT: 32 P'nin radyoaktivitesi, yaklaşık 14 gün 9 kısa bir yarılanma ömrüne sahiptir. Yarı ömrü göz önüne alarak hacmi ayarlayın ( örneğin, [γ- 32 P] -ATP'nin üretiminden bir ay sonra, [γ- 32 P]1 μCi yapmak için -ATP). - Numuneyi 15-30 dakika boyunca 30 ° C'de ısıtma bloğunda inkübe edin. Bu adım esnasında,% 7.5 sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) jelleri hazırlayın. Jel yüzdesini hedef proteinin boyutuna göre ayarlayın.
- % 10 (v / v) gliserol,% 20 (ağ / hac) SDS,% 15.42 (ağ / hac) ditiyotreitol,% 90 (h / h) 0,5 M Tris-HC1 (pH 6.8) ve% 0.02 (w / v) bromofenol mavisi). Reaksiyon tamponunu birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
- Örnekleri% 7.5 SDS-PAGE jelinde 70 V'de 20 dakika boyunca ve sürekli 140 V'de 1 saat süreyle çalıştırın.
NOT: Jelin sonundaki bromofenol mavi çizgisi, son derece yüksek radyoaktif sinyaller içerir. Arka plandaki sinyalleri azaltmak için bir sonraki adıma geçmeden önce meleğin altındaki jelin çıkarılması önerilir. - SDS-PAGE'den sonra jöleyi casterdan hafifçe çıkarın. Jeli bir bardak içine yerleştirin.Bir sonraki adıma.
- Jel fiksasyon tamponu ile 20 dakika sabitleyin (% 50 metanol ve% 10 buzlu asetik asit).
- Jeli hafifçe filtre kağıdının üzerine alın ve şeffaf bir sargı ile örtün. Bu aşamada jelin kolayca yırtılabileceğini unutmayın. Jel bir vakumlu jel kurutucu ile 1 saat boyunca 80 ° C'de kurutulur.
- görüntüleme
- Jel, gece boyunca (genellikle yaklaşık 16 saat boyunca) bir fosforlu elek veya bir X ışını filmi ile açıklayın.
NOT: Ekstra parlak ışığa maruz kaldıktan sonra fosforlu bir elek kullanılabilir. Bir röntgen filmi kullanıldığında, iki gün içinde jel ortaya koyun. X-ışını filmleri, fosforlu ekranlardan daha düşük hassasiyete sahiptir. - Fosfor ekranını bir fosforlu görüntüleyiciyle tarayın. Görüntüyü yüksek çözünürlüklü bir TIFF veya bitmap dosyası olarak dışa aktarın.
- Görüntülemeden sonra, jel Coomassie parlak mavi (CBB) boyama için bir cam veya plastik kap taşımak.
- Jeli DW ile yıkayın. DW'yi atın ve lekeBoyama reaktifi ile 1 saat j el ile jel edin.
- Reaktifi atın ve 1 saat boyunca veya gece boyunca DW ile jelleştirin. Bir ofis tarayıcısı ile taramak için jel şeffaf plastik filmlerin (veya eşdeğeri) arasına yerleştirilir.
- Jel, gece boyunca (genellikle yaklaşık 16 saat boyunca) bir fosforlu elek veya bir X ışını filmi ile açıklayın.
3. Bir Siteye Özgü Mutant Kullanan İn Vitro Kinaz Testi
- PGEX-Nrf2'nin Alan Yönelimli Mutagenezi
- Mutajenik Astar Tasarımı
NOT: Uygun mutajenik primerler tasarlamak, mutajenezin başarılı bir sonucu için kritik önem taşır. Mutajenik primerler tasarlamak için bazı hususlar aşağıda belirtilmiştir. Astarın ortasında arzu edilen mutasyonla 25 ila 45 baz içeren bir astar oluşturun. Primer% 40-60 GC içeriğine sahip olmalı ve bir veya daha fazla G veya C bazıyla sonlandırılmalıdır. [T m = 81.5 + 0.41 (% GC) - (675 / bazların uzunluğu) -% uyumsuzluk] formülüne göre primerin Tm değerinin 78 ° C veya daha yüksek olmasına dikkat edin.
NOT:Çünkü saflık mutasyon verimliliği için önemlidir. Mutajenik primerler tasarlamak için birkaç web sitesi bulunmaktadır.- "Alana yönelik mutajenez için primerler tasarlamak" için primer tasarım programını açın (http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp).
- İnsan Nrf2 DNA dizisini yapıştırın (Erişim No. NM_006164.4) ve "çevrilmiş karşıya yükle" düğmesini seçin.
- Alanin olarak değiştirilmek üzere çevrilmiş amino asit dizisinden serin 558 kalıntısını seçin. Mutagenik primeri kullanarak alanin için agc'dan gcc'ye serin için kodonu değiştirin.
- Primer uzunluğu, T m ve GC içeriğini düşünün.
NOT: Mutajenik primer sonunda 5'-ctactgaaaaaacactacgcc accttatatctcgaag-3 'olarak tasarlanır.
- Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) kullanılarak Mutant İplikçik Sentezi için Reaksiyon
- PCR reaksiyon karışımının buz üzerinde hazırlanması: 10 x reaksiyon tamponu, 50 ngPGEX-GST-Nrf2, 125 ng ileri primer, 125 ng ters primer, 1 uL dNTP karışımı (her biri 10 mM), 2.5 U Pfu DNA polimeraz ve 50 uL'ye kadar steril DW.
- Aşağıdaki bisiklet programı ile pGEX-GST-Nrf2-mutant iplikçik sentezi için PCR'ı çalıştırın: 95 ° C'de 30 saniye süreyle 1 devir; 95 ° C'de 30 saniye, 55 ° C'de 1 dakika ve 68 ° C'de 90 saniye boyunca 18 döngü; Ve 1 çevrim 68 ° C'de 5 dakika süreyle.
NOT: Plazmid uzunluğuna bağlı olarak, döngü parametreleri değiştirilebilir. - Bir sonraki adım için reaktifleri soğutmak için 2 dakika boyunca buz üzerinde bırakın. Alternatif olarak, gece boyunca 4 ° C'de saklayın.
- Dpn I Sindirimi ve Bir Mutant Plasmid Seçimi
- Soğutmadan sonra her bir reaktana 1 uL Dpn I sınır enzimi (10 U / μL) ekleyin. 1 dakika pipetle ve santrifüjle iyice karıştırın.
- Ebeveyn pGEX-GST-Nrf2 çift sindirimi için 37 ° C'de 2 saat inkübe edin,Telli DNA.
- Buz üzerinde DH5 α supercompetent hücreleri yavaşça çözülür.
- Önceden soğutulmuş DH5α supercompetent hücrelerin 150 ul 50 μL reaktan ekleyin ve buz üzerinde en az 30 dakika inkübe edin.
- Tüpleri 42 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış bir ısıtma bloğuna aktarın ve 90 saniye boyunca bırakın. 2 dakika boyunca buz üzerinde bırakın.
- Dönüştürülmüş DH5 α hücrelerine önceden ısıtılmış lizojen besiyeri (LB) ekleyin ve 180 rpm'de çalkalama ile 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Dönüştürülen hücreleri LB-ampisilin agar plakalarına yayın ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
NOT: Amfisilin, GEX-GST-Nrf2 plasmidinin ampisilin direnci işaretçisine sahip olması nedeniyle seçim için kullanılır. Mutajenize tâbi tutulan plazmitin direnç markörüne bağlı olarak uygun antibiyotikleri kullanın. - Plakadan tek bir koloni seçin, 5 mL LB-ampisiline aktarın ve gece boyunca 180 rpm'de çalkalayarak 37 ° C'de inkübe edin.Mutajenik dizinin doğrulanması için en az üç koloniyi değerlendirin.
- DNA dizi analizi için bir DNA miniprep kiti kullanarak DNA ekstrakte edin; Üreticinin protokolünü izleyin.
- Üreticinin protokolüne göre otomatik DNA sekans analizörü kullanarak mutajenik DNA sekanslarını doğrulayın. Mutant dizilerin doğrulanması için DNA yapısının en az 200 ng'ı kullanın.
- Mutajenik Astar Tasarımı
- Rekombinan GST-Nrf2 Proteininin Saflaştırılması
- Escherichia coli'sinde mutajenik GST-Nrf2 Füzyon Proteininin Ekspresyonu
- Mutajenik pGEX-GST-Nrf2 plasmidini BL21 hücrelerine dönüştürün. Tek bir koloni, ampisilin (100 μg / mL) içeren 25 mL LB suyunda inoküle edin ve 37 ° C'de rotatorda gece boyunca inkübe edin.
- Kültürlenen hücreleri 1: 100 seyreltme oranında ampisilin (100 ug / mL) içeren 100 mL LB suyu içerisinde inoküle edin.
- 37 ° C'de bir rotatta inkübe edinVeya 600 nm'de absorbans yaklaşık 0.4-0.8 (yaklaşık 4 saat) ulaşana kadar.
- 1 mM IPTG'nin nihai konsantrasyonunu hazırlamak için 100 mL kültürlenmiş hücrelere 100 uL 1 M IPTG ekleyin.
- Hücreleri, protein ekspresyonu için 6 saat veya gece boyunca rotatorda 30 ° C'de inkübe edin.
- 20 dakika süreyle 5,000 xg'de hücreleri santrifüjleyin ve 1 mL bakteri liziz tamponu (25 mM HEPES, 5 mM EDTA, 2 mM DTT,% 0.1 CHAPS, 1 μg / mL pepstatin, 0.5 μg / mL leupeptin) ile hücre peletini tekrar süspanse edin, Ve 1 mM PMSF) eklendi.
- Hücre pelletlerini, maksimum güç çıkışının% 50'sinde 2 dakika aralıklarla bir ultrasonik homojenleştirici kullanarak lize edin.
- 4 ° C'de 15 dakika boyunca 12.000 xg'de hücreleri santrifüjleyin ve süpernatantı toplayın.
- Rekombinant GST-Nrf2 Proteininin Saflaştırılması
- 200 ul% 50 (v / v) glutatyon agaroz boncuk hazırlayın ve 1 mL PBS (pH 7.3; 140 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 10 mM Na2 4 ve 1.8 mM KH2PO4). Boncukları, 500 × g'de 1 dakika süreyle santrifüje ederek toplayın. Yıkama adımını ç kez tekrarlayın.
- % 50 (v / v) glutatyon-agaroz boncuklar hazırlanmış 200 mcL hücre lizatı ekleyin ve 2 saat boyunca bir uç uca rotator 4 ° C'de inkübe edin.
- 1 dakika boyunca 500 xg'de santrifüj ederek GST-Nrf2 proteini ile kombine edilen glutatyon-agaroz boncuklarını toplayın. Süpernatantı 1 ml'lik bir şırınga kullanarak 31 G'lik bir iğne ile çıkarın.
- Adım 1'de olduğu gibi, boncukları 1 mL PBS (pH 7.3) ile yıkayın.
- GST-Nrf2 ile kombine glutatyon-agaroz boncuklara 500 uL elüsyon tamponu (50 mM Tris-HC1 ve 10 mM indirgenmiş glutatyon, pH 8.0) ilave edin. 30 dakika boyunca uç uca bir rotatörde 4 ° C'de inkübe edin.
- 1 dakika süreyle 500 xg'de santrifüjleyin ve süpernatanı toplayın.
- Yine boncuklara 300 uL elüsyon tamponu ilave edin ve 3.2.2.5-3.2.2.6 adımlarını iki kez tekrarlayın.
- Saflaştırılmış GST-Nrf2 Proteinin Doğrulanması
- 0.5 μg standart protein BSA ile protein miktarının görselleştirilmesi için numunenin 5 μL'sini hazırlayın.
- Örnekleri% 7.5 SDS-PAGE jelinde 70 V'de 20 dakika çalıştırın ve sonra 140 V'da 60 dakika süreyle çalıştırın.
- Jel, 2 saat süreyle% 0.1 CBB boyama çözeltisi (0.1 g CBB R250, 40 mL% 99 metanol, 10 mL buzlu asetik asit ve 50 mL damıtılmış H20) ile leke ve destain (30 mL metanol, 10 mL buzlu asetik asit ve 60 mL damıtılmış H20), bantlar açıkça gösterilene kadar.
- Kusurlu jeli filtre kağıdına yerleştirin ve şeffaf bir sargı ile örtün. Jel bir vakumlu jel kurutucu ile 1 saat boyunca 80 ° C'de kurutulur.
- In vitro AMPK kinaz tahlili için dansitometre ile mutant GST-Nrf2 proteininin miktarını belirleyin.
- Escherichia coli'sinde mutajenik GST-Nrf2 Füzyon Proteininin Ekspresyonu
- Siteye Özgü Mutant İle In Vitro AMPK Aktivite Testi
DEĞİLE: İn vitro AMPK kinaz tahlili, peptid inhibitörleri olmadan 0.4 mikrogram saflaştırılmış vahşi tip GST-Nrf2 veya GST-Nrf2-S558A mutant kullanılarak adım 2.2-2.4'e göre gerçekleştirilir. 1. adımda açıklanan tüm radyasyon güvenlik yönergelerini uygulayın.- 0.15 μg AMPK, 0.4 mikrogram mutant veya vahşi GST-Nrf2 ve 6 uL 5 kinaz tamponu ile buz üzerinde bir reaksiyon tamponu hazırlayın. Steril DW ile 30 mcL'ye kadar doldurun.
- Buz üzerindeki reaksiyon tüplerine 1 uL [γ- 32 P] -ATP (1 μCi / μL) ekleyin. Reaksiyon tamponunu birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve santrifüjleyin.
- Numuneleri 30 ° C'de 30 dakika ısıtma bloğunda inkübe edin.
- 3 μL 10 x SDS numune tamponu ilave ederek kinaz reaksiyonunu durdurun.
- % 7.5 SDS-PAGE jelinde 70 V'de 20 dakika ve daha sonra 140 V'de 1 saat çalıştırın.
- Jel sabitleme tamponuyla 20 dakika sabitleyin, filtre kağıdına taşıyın ve jel şeffaf ile örtünSarıcı.
- Jel vakum jel kurutucusu ile 80 ° C'de 1 saat kurutulur ve daha sonra gece boyunca fosforlu bir elek veya bir röntgen filmine maruz bırakılır.
- Bir fosforlu görüntüleyiciyle fosfor taramasını tarayın ve adım 2.4'e göre görselleştirmeden sonra CBB boyaması için jeli bir cam tüpe taşıyın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 ve Şekil 2 , daha önce bildirilen bildiride 8 tekrarlanan deneylerden elde edilen sonuçları göstermektedir. Tahmini AMPK hedef bölgelerini taklit eden üç farklı 10 kalıntı oligopeptid (Ser153 içeren # 1, 148-157, Ser335 içeren # 2, 330-339 ve Ser558 içeren # 3, 553-562) sentezlendi ve in Vitro kinaz tahlili. Nrf2'nin AMPK tarafından fosforilasyonu, oligopeptit # 3 varlığında büyük ölçüde azaldı ( Şekil 1 ). Daha sonra, peptidomimetrik deneyin sonucunun doğrulanması için bir bölgeye yönelik mutagenez tahlili gerçekleştirildi. Oligoopeptid # 3'ün AMPK aracılı Nrf2 fosforilasyonu ( Şekil 1 ) üzerindeki inhibisyon etkisi göz önüne alındığında, bir S558A-Nrf2 mutantı ürettik. Fosforilasyon seviyeleri, vahşi tip Nrf2 ve S558A mutantı in vitro AMPK kinaz tahlilini kullanmaktadır. Nrf2'nin tek amino asit ikamesi (558'de Ser → Ala), AMPK'nın Nrf2'yi fosforilasyonundan alıkoymuştur ki AMPK'nin doğrudan Nrf2'yi Ser558'de fosforilatlandığını belirtir ( Şekil 2 ).
Şekil 1: İn vitro rekabetçi AMPK kinaz tahlili. İn vitro kinaz tahlilleri, belirtilen oligopeptidlerin (Ser153 içeren # 1, 148-157; Ser335 içeren # 2, 330-339 ve Ser558 ihtiva eden # 3, 553-562) varlığında gerçekleştirildi.
Şekil 2: Bir bölgeye özgü mutant protein kullanarak in vitro AMPK kinaz tahlili. İn vitro kinaz tahlilleri vahşi ortamın varlığında yapıldıYpe GST-Nrf2 veya onun S558A mutantı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AMPK'nın aracılık ettiği tahmini fosforilasyon mevkilerinin özgünlüğünü değerlendirmenin basit ve kullanışlı bir yolu olarak, burada, rekabetçi peptidleri kullanarak belirli bir fosforilasyon bölgesini keşfetmek ve bir bölgeye özgü mutant kullanarak doğrulamak için kullanılabilecek bir in vitro kinaz tahlilini açıklamaktayız . In vitro rekabetçi AMPK aktivite tahlilinden elde edilen temsili veriler, bir bölgeye yönlendirilmiş mutant protein kullanılarak bir deneyin sonuçlarına uymaktadır; bu, peptit rekabet tahlili, bir fosforilasyon sahasının belirlenmesi için yararlı bir araçtır. Bu yöntem aynı zamanda, serin 403'te Nrf2'yi fosforile eden PKCδ ile fosforile edilen spesifik bölgeyi tanımlayan çalışmada da kullanılmıştır. Peptidler rekabete dayalı olarak bir proteine bağlandığından, ilke, bir bağlanma motifi 10 , 11'i tanımlamak için bir in vitro GST aşağı indirme tahliline de uygulanabilir. Dahası, bu peptidomimTik yöntemi, lizin kalıntılarında asetilasyon gibi diğer translasyon sonrası modifikasyonları tanımlamak için de uygulanabilir.
Bu protokolü kullanarak, bazı hidrofobik peptidlerin çözülmesi zor olabilir. Bir peptid bir kinaz tamponu içinde çözünmezse, bunu% 20 DMSO'da çözmek faydalı olabilir. Son derece hidrofobik peptidleri çözmek için önce% 100 DMSO içinde eritmeye ve daha sonra çözeltiyi bir kinaz tamponu ile inceltmeye çalışın. Sonication, peptidlerin çözülmesinde de yardımcı olabilir. Çözünmez kalırsa, çözünürlüğü artırmak için varsayılan siteyi taklit eden bir peptid uzatılmalıdır.
Bu yazıda tanıtılan protokolde, saflaştırılmış bir kinazın ve substratın reaksiyona girdiği " in vitro sistem" tanımlanmaktadır. İn vitro sistemde, rekabetçi peptidlerin konsantrasyonundaki küçük farklılıklar, konsantrasyon substrat proteinden daha düşük olmadığı sürece sonuçları etkilemez. RBir in vitro deneyden elde edilen esult, suni yakınlık ve yüksek reaktan konsantrasyonu ile üretilen artefakt bir olay olma ihtimalini içerir. Bu ihtimalin ortadan kaldırılması için, verilerin yorumlanmasına hücre esaslı deneylerden elde edilen sonuçlar eşlik etmelidir. Peptitleri kullanarak yanlış-pozitif sonuçlar elde etmek için bir başka olasılık, substrat konformasyonunda ve / veya kinaz tanımada değişikliklere bağlı olabilir. Bu olasılığı dışlamak için, mutant proteinler ile onaylama deneyleri yapmak gereklidir.
Öte yandan, sahte-negatif veri de bu sistemden üretilebilir. Birçok kinaz, hücresel bağlam içinde protein kompleksleri gibi davranır ve tam fonksiyonellik için birlikte faktörler gerektirir. AMPK, AMPKα, AMPKβ ve AMPKγ altbirimlerinden oluşan temsili bir protein kinaz kompleksidir ve AMP'nin AMPKγ altbirimine bağlanması, kinazın aktivasyonu için gereklidir. Nitekim AMPKAMP-içermeyen kinaz tamponunda Nrf2'yi fosforile etmedi (veriler gösterilmemiştir). Bu nedenle, başarılı bir in vitro deney için AMP'nin kinaz reaksiyon tamponunda çözülmesi gerektiğini belirtmek gerekir.
En popüler yöntem olan fosforilasyon yerlerinin belirlenmesi için kütle spektrometrisinin kullanılması, parçalanma işlemi sırasında fosforik asidin kolay kaybedilmesiyle sıklıkla yanlış negatif sinyaller üreten birkaç teknik sınırlamaya sahiptir 7 . Bir peptid mikrodizi yöntemi, fosforilasyon bölgeleri aramak için ikinci seçenek olabilir. Bununla birlikte, bu yöntem zaman alıcı ve pahalıdır. Tahmini fosforilasyon sahalarının taranması için alternatif bir yöntem olan rekabetçi peptid yöntemi, varsayılan bir fosforilasyon bölgesinin doğasına ilişkin bilgiler edinmek için uygun ve ucuz bir yol olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Kore Ulusal Hükümet Başkanlığı (MSIP) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (2015R1A2A1A10052663 ve 2014M1A3A3A02034698 no'lu) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glycerophosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem, Nottingham, UK | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, Taipei City, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32P]-ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| EZblue staining reagent | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polymerase | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | Avoid multiple thaw and freezing cycle |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB broth | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands | L1704 | |
| Ampicillin | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarose LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Bovine Serum Albumin | Bovogen Biologicals, Victoria, Australia | BSA100 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare, Marlborough, MA | 17-0756-01 | |
| Acetic Acid glacial | Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea | ||
| Methyl alcohol |
Daejung Chemicals & Metals, Siheung, South Korea | 5558-4410 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| SDS-PAGE kit | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 1658001FC | |
| Vacuum pump | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| Gel dryer | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| Dancing shaker | FINEPCR, Seoul, Korea | CR300 | The machine is needed for washing step |
| PCR machine | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | |
| Incubator/shakers | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea | NB-205L | |
| Microcentrifuges | LABOGENE, Seoul, Korea | 1730R | |
| Chromatography columns | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 732-1010 |
References
- Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs. Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).
- Gwinn, D. M., et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint. Mol Cell. 30, 214-226 (2008).
- Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription. J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).
- Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance. J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).
- Jain, A. K., Jaiswal, A. K. GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2. J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).
- Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements. Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).
- Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).
- Joo, M. S., et al. AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550. Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).
- Sinclair, W. K., Holloway, A. F. Half-lives of some radioactive isotopes. Nature. 167 (4244), 365 (1951).
- Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1. J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).
- Smith, L., et al. RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).
