Summary
Nous décrivons ici une technique pour isoler les cellules de la population de côté d'un modèle de poisson zèbre leucémie aiguë lymphoblastique T myc induite (T-ALL). Ce test de population côté est très sensible et est décrit pour T-ALL zebrafish, mais il peut être applicable à d'autres types de cellules malignes et non zebrafish malignes.
Abstract
Les populations de cellules hétérogènes, à partir de tissus sains ou malins, peuvent contenir une population de cellules caractérisées par une capacité différentielle à effacer le colorant de liaison à l'ADN Hoechst 33342. Cette «population latérale» des cellules peut être identifiée à l'aide de méthodes cytométriques en flux après le Hoechst 33342 Le colorant est excité par un laser ultraviolet (UV). La population secondaire de nombreux types de cellules contient des cellules souches ou de type progéniteur. Cependant, tous les types de cellules n'ont pas une population latérale identifiable. Danio rerio , le poisson zèbre, possèdent un modèle robuste in vivo de leucémie lymphoblastique aiguë des lymphocytes T (T-ALL), mais on ignore si ces T-ALL de poisson zèbre ont une population latérale. La méthode décrite ici décrit comment isoler les cellules latérales de la population dans le T-ALL du poisson zèbre. Pour commencer, le T-ALL dans le poisson zèbre est généré par micro-injection de plasmides tol2 dans des embryons à une seule cellule. Une fois que les tumeurs sont passées à une étape où elles se développent dans plus de la moitié de l'aniMal, les cellules T-ALL peuvent être récoltées. Les cellules sont ensuite colorées avec Hoechst 33342 et examinées par cytométrie en flux pour les cellules de population latérales. Cette méthode a de larges applications dans la recherche T-ALL de poisson zèbre. Bien qu'il n'y ait pas de marqueurs de surface cellulaire connus dans le poisson zèbre qui confirment si ces cellules de population latérale sont des cellules cancéreuses, des tests de transplantation fonctionnelle in vivo sont possibles. De plus, une transcriptomie à une seule cellule pourrait être utilisée pour identifier les caractéristiques génétiques de ces cellules latérales.
Introduction
Le dosage de la population latérale met en majuscule la capacité améliorée de certaines cellules dans un tissu à efflux du colorant de liaison à l'ADN Hoechst 33342 en raison des niveaux élevés de protéines transportrices de la cassette de liaison ATP (ABC) sur la membrane cellulaire. Les cellules qui effluxent le colorant Hoechst 33342 peuvent être identifiées à l'aide d'une analyse cytométrique à double flux de longueur d'onde après que le colorant soit excité par un laser UV. Ce test a d'abord été utilisé pour identifier les cellules souches hématopoïétiques murines (HSC) 1 , mais il a depuis été utilisé pour identifier les populations de cellules souches / progénitrices dans de nombreux tissus et cancers (révisé dans la référence 2). Cependant, toutes les populations de cellules n'ont pas une population latérale, et toutes les populations latérales ne sont pas enrichies pour les cellules souches / progénitrices.
Le poisson zèbre est un puissant système de modèle génétique de vertébrés pour étudier le cancer humain 3 , 4 , avec un certain nombre d'avantages par rapport au mo murin traditionneldels de cancer. Embryons de poisson zèbre sont fertilisés à l' extérieur et sont optiquement clair, ce qui facilite la transgénèse et l'observation in vivo de processus pathologiques, y compris l' initiation et la progression du cancer. À ce jour, le dosage de la population de côté pour détecter souches potentielles ou les cellules progénitrices n'a été appliquée à la moelle du rein chez le poisson zèbre pour identifier CSHs, et non à tous les modèles de cancer 5, 6 poisson zèbre.
Le modèle zebrafish de leucémie lymphoblastique aiguë à cellules T (T-ALL) est morphologiquement et génétiquement similaires à T-ALL 7, 8 humaine, 11. T-ALL est une tumeur maligne agressive qui, chez l' homme, représente 10-15% de pédiatrie et 25% des adultes TOUS les cas 9. Bien que le traitement des T-ALL est améliorée, la rechute est encore courante et est associée à un mauvais pronostic. T-ALL tumeurs sont HeterogeneEt qui contiennent de nombreuses sous-populations de cellules tumorales, y compris les cellules initiatrices de leucémies (LIC). Les LIC sont définis par leur capacité à repousser la totalité de la tumeur à partir d'une cellule unique, et la fréquence des LIC dans une population de cellules tumorales peut être calculée en transplanant des doses cellulaires variables en récipients via un dosage de transposition de dilution limite (LDA). Alors que les expériences de LDA ont été effectuées dans le poisson zèbre pour calculer la fréquence des LIC 8 , 10 , 11 , cette détermination est faite en rétrospective et ne permet pas l'isolement prospectif des LIC. Par conséquent, une méthode pour isoler prospectivement une population enrichie pour l'activité des cellules souches cancéreuses est insuffisante. L'identification et l'isolement des cellules de population latérales des T-ALL de poissons zèbres est la première étape vers la résolution de cette carence.
Le protocole présenté ici décrit comment générer efficacement des tumeurs T-ALL dans zebrafish utilisant la transgénèse médiée par TOL2, récolter les cellules T-ALL tumeurs, et de les colorer avec Hoechst 33342 pour identifier la population de côté de cellules. Avenir dans des expériences in vivo avec T-ALL zebrafish pourrait comprendre si les cellules de la population de côté sont enrichis pour les PFR ou ont d' autres propriétés ou comme tige - progénitrices.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures ont été danio approuvés par le Comité de protection des animaux institutionnel et utilisation (IACUC) à l'Université de Chicago. L'Université de Chicago est accrédité par l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des laboratoires de protection des animaux (AAALAC).
1. Génération et Isolating T-marqués par fluorescence toutes les cellules de poisson zèbre
- Microinjection dans des embryons de poisson zèbre syngéniques
- En utilisant des kits disponibles dans le commerce, isoler rag2 circulaire: c-myc et rag2: protéine fluorescente verte (rag2: GFP) ADN de plasmide contenant les répétitions terminales inversées reconnu par TOL2 transposase (voir le tableau des matériaux pour la source d'ADN de plasmide) 12 et éluer l'ADN dans de l'eau stérile.
NOTE: GFP est utilisé dans cette étude, mais toute protéine fluorescente fonctionnera. - Préparer pCS2-transposase (TOL2) ARN
- Isoler ADN plasmide TOL 2 en utilisant des kits disponibles dans le commerce (voir til table des matières pour la source d'ADN de plasmide) 12 et on élue l'ADN dans de l' eau stérile.
- Incuber 1 pg d'ADN de TOL2 à 37 ° C pendant 1 h avec 5 unités d'enzyme de restriction Notl dans le tampon approprié pour linéariser le plasmide. Heat-inactiver l'Notl à 65 ° C pendant 20 min.
- Transcrire l'ARN TOL2 avec l'ARN polymerase SP6 à partir de l'ADN linéarisé en utilisant un kit de transcription d'ARN disponible dans le commerce 13. Stocker l'ARN dans des aliquotes à usage unique à -80 ° C.
- Préparer le mélange d'injection sur de la glace en ajoutant 250 ng de rag2: c-myc ADN de plasmide, 250 ng de rag2: l' ADN de plasmide GFP, 150 ng d'ARN de TOL2, et 0,5 ul de rouge de phénol. Réglez le volume à 10 pi avec de l'eau sans nucléase.
- Injecter ~ 1 nL du mélange d'injection dans la cellule d'un embryon au stade d'une cellule syngénique zebrafish en utilisant un micro-injecteur et une aiguille tiré d'un tube capillaire en verre, suivant précédemment étaméthodes lished 8, 14.
REMARQUE: syngénique zebrafish généré par parthénogenèse 15 sont utilisés ici pour éliminer l' hétérogénéité génétique et le rejet immunitaire après la transplantation. Cependant, le poisson zèbre de type sauvage ou d'une souche souhaitée peuvent également être utilisés. - Retirer les embryons morts, sous - développés ou malformés à 24 h et 48 h après l'injection 16.
- Placer le poisson injecté sur le système de poisson à 6 jours après l'injection et les élever selon le protocole standard 6.
- En utilisant des kits disponibles dans le commerce, isoler rag2 circulaire: c-myc et rag2: protéine fluorescente verte (rag2: GFP) ADN de plasmide contenant les répétitions terminales inversées reconnu par TOL2 transposase (voir le tableau des matériaux pour la source d'ADN de plasmide) 12 et éluer l'ADN dans de l'eau stérile.
- Le dépistage zebrafish injecté et surveiller la croissance de la tumeur
- A 21 jours après l'injection, placer une seule larve injectée dans une goutte de milieu d'embryons sur une boîte de Pétri et d'un écran pour la fluorescence de la GFP en utilisant un microscope à épifluorescence (passe - bande d'excitation: 470/40, passe - bande d'émission: 525/50) 8.
NOTE: les larves de poisson zèbre que have intégré à la fois rag2: c-myc et rag2: GFP aura un thymus fluorescente verte (poisson positive) et peut déjà présenter l'expansion des cellules fluorescentes vertes malignes au - delà du thymus. Tous les poissons avec un GFP + thymus continuera à développer une GFP + T-ALL. Les larves qui ne démontrent pas l'intégration des plasmides n'aura pas de cellules fluorescentes vertes (poissons négatif). - Séparer le poisson négatif (basé sur un manque de fluorescence) dans un réservoir différent et surveiller le poisson à nouveau à 28 et 35 jours après l'injection. A 28 et 35 jours après l'injection, anesthésier les poissons avec 0,02% de tricaïne tamponnée (MS-222) dans l'eau du système de poisson avant le criblage.
- Placer chaque larve de poisson zèbre qui est positif pour un thymus marqué par fluorescence ou une tumeur marquée par fluorescence dans un réservoir particulier pour la surveillance de la croissance de la tumeur trois fois par semaine.
- A 21 jours après l'injection, placer une seule larve injectée dans une goutte de milieu d'embryons sur une boîte de Pétri et d'un écran pour la fluorescence de la GFP en utilisant un microscope à épifluorescence (passe - bande d'excitation: 470/40, passe - bande d'émission: 525/50) 8.
- Collection of marqué par fluorescence des cellules T-ALL du poisson de la tumeur primaire
- Préparer au moins 20 ml de 10% de sérum de fœtus bovin inactivé par la chaleur dans une solution saline tamponnée au phosphate de 0,9x (FBS / PBS).
- Ajouter 1 ml de FBS / PBS à un flacon de sel de sodium de l'héparine (300 unités).
- Sélectionnez tumeurs poissonneux dans plus de 50% du corps, ou les poissons ayant des difficultés à manger ou la natation. Sacrifiez les poissons en les surdosages de tricaïne ou par immersion dans l'eau glacée. Confirmer la mort par manque un mouvement maillant et le rythme cardiaque.
- Utiliser une lame de rasoir pour retirer la tête du poisson.
- Laver la cavité du poisson avec la solution d'héparine pour éliminer les cellules en excès de globules rouges.
- En utilisant une pipette, injecter 100 ml de solution d'héparine (préparé à l'étape 1.3.2) dans la cavité du corps du poisson. Retirez tout le liquide qui se déverse (il contient des cellules sanguines) et la pipette dans un tube de 1,5 ml.
- Utilisez une pointe de pipette fraîche pour laver le corps à nouveau. Effectuer au moins trois lavages, ou jusqu'à ce que le liquide qui se déverse apparaît sans blOod.
- Jeter tous les liquides des lavages aux étapes 1.3.5.1 et 1.3.5.2, car ils ne seront pas utilisés dans d'autres analyses.
- Recueillir les cellules de leucémie.
- Injecter 100 μL de FBS / PBS dans la cavité corporelle du poisson.
- Appliquer une pression douce à l'extérieur du corps du poisson avec la pointe de la pipette pour presser / pousser les cellules tumorales.
NOTE: Si cette étape est effectuée à l'aide d'un microscope à dissection, les cellules tumorales qui se répandent hors de la cavité corporelle seront évidentes. - Recueillir le liquide et les cellules de chaque lavage dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL.
- Répétez les étapes 1.3.6.1-1.3.6.3 jusqu'à ce que la plupart des cellules tumorales soient collectées (habituellement 5-10 fois). Recueillir toutes les cellules tumorales dans le même tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml. Garder les cellules à température ambiante.
- Mélangez les cellules tumorales collectées à partir de l'étape 1.3.6 en les pipetant doucement pour dissocier les agglomérés de cellules. Filtrer la suspension cellulaire à travers un 4Filtre à mailles 0 um. Laver le filtre 1-2 fois avec 100 pl de FBS / PBS. Gardez les cellules à la température ambiante.
- Mélanger 2 ul de suspension cellulaire avec 18 pi de bleu trypan (0,4%, dilué à 1:10 et on filtre) dans un nouveau tube. Charge: 10 ul sur un hémocytomètre et compter le nombre de non-vivants (bleu) des cellules fluorescentes pour calculer le nombre de cellules tumorales isolées.
REMARQUE: les cellules GFP-négatif non-bleu sont probablement normales, les cellules T non malignes et ne doivent pas être comptés. Au moins 2 x 10 6 cellules sont nécessaires pour colorer les cellules avec Hoechst 33342.
2. la coloration des T-marqués par fluorescence toutes les cellules avec Hoechst 33342 pour identifier la population de côté
- Diluer avec Hoechst 33342 01:10 H sans nucléase 2 O pour rendre le 1 mg / ml concentration de travail. Stocker le colorant à 4 ° C et dans l'obscurité.
- Préparer une solution de 100 mM de vérapamil en dissolvant 49,1 mg dans 1 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO).
NOTE: Le vérapamil est un inhibiteur des transporteurs ABC et un contrôle important pour les expériences de la population de côté. Ajout vérapamil à des échantillons inhibera la capacité des transporteurs ABC à efflux le colorant Hoechst 33342. Par conséquent, une population de côté vrai disparaîtra lorsque le vérapamil est ajouté à l'échantillon. - Définissez un bain d'eau à 28 ° C.
- Préparer les échantillons et les témoins à l'obscurité en ajoutant des cellules et des solutions dans des tubes de trieur de cellules activé par fluorescence (FACS).
- Préparer les échantillons en ajoutant 10 6 cellules, 15 pi de 1 mg / ml de Hoechst 33342, et 2,5 ul de DMSO dans un tube FACS. Ajuster le volume à 1 ml avec du FBS / PBS.
- Préparer les commandes par addition de 10 6 cellules, 15 pi de 1 mg / ml de Hoechst 33342, et 2,5 ul de 100 mM de verapamil dans un tube FACS. Ajuster le volume à 1 ml avec du FBS / PBS.
NOTE: Un minimum de 10 6 cellules / échantillon est recommandé, mais la coloration plus cellules est préférable, surtout si le côté populatles cellules d'ions sont triés pour une analyse ultérieure. Ne pas dépasser 10 6 cellules / ml, et maintenir la concentration Hoechst 33342 à 15 pg / ml. Si 10 x 10 6 cellules sont colorées, le volume total de réaction est de 10 ml.
- Incuber dans un bain d'eau 28 ° C dans l'obscurité pendant 120 min.
- Après l'incubation, placer les cellules immédiatement sur la glace et les garder dans l'obscurité.
- Pellet les cellules à 4 ° C pendant 6 minutes à 300 x g. Retirer le surnageant. Laver avec 1 ml de FBS / PBS.
- Pellet les cellules à 4 ° C pendant 6 minutes à 300 x g. Retirer le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de FBS / PBS.
- Conserver à 4 ° C jusqu'à ce que le tri de cellules.
- 15 min avant le triage de cellules, ajouter 2 ul du stock de l'iodure de propidium (PI) (1 mg / ml) à 1 ml de FBS / PBS (concentration finale: 2 ug / ml). Bien mélanger.
3. Utilisez FACS pour trouver la population de côté dans le T-marqué par fluorescence toute la population cellulaire
- Déterminez une porte pour les cellules Live, GFP + T-ALL.
- Utilisez la zone de diffusion directe (FSC) et la dispersion latérale (SSC) pour décharger les débris.
REMARQUE: FSC est utilisé pour distinguer la taille de la cellule et le SSC est utilisé pour distinguer la granularité de la cellule. - Utilisez la largeur FSC et SSC pour discriminer les doublets.
REMARQUE: Il existe trois composants identifiés par les détecteurs de cytomètre de flux: zone, hauteur et largeur. La zone est généralement utilisée pour mesurer la fluorescence de la cellule. La largeur mesure le temps de vol et est deux fois plus large si deux cellules sont regroupées. - Pour les cellules tumorales vivantes, dessinez une porte autour des cellules positives pour GFP et négative pour PI en utilisant les détecteurs appropriés ( par exemple , FITC pour GFP et PerCP Cy5-5 pour PI).
- Utilisez la zone de diffusion directe (FSC) et la dispersion latérale (SSC) pour décharger les débris.
- Si le tri des cellules de la population latérale pour d'autres expériences, utilisez le gros bout de buse (100 μm) et rassemblez les cellules dans un tube FACS contenant 3 ml de FBS à 100%. Utilisez une pointe de buse plus grande (100 μm) au lieu de la pointe plus petite (70 μm) pour améliorer la viabilité cellulaire après le tri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pour générer efficacement fluorescentes T-ALL tumeurs myc induite chez le poisson zèbre, des constructions d'ADN circulaire flanqué de sites de Tol2 transposase peuvent être co-injectés avec de l'ARN de TOL2. Des études antérieures de l'injection d'ADN linéarisé dans des embryons de poisson zèbre font état d' un taux de transgénèse 5% 8. Avec le protocole modifié pour inclure les taux transgenèse, la transgenèse médiation TOL2-allant de 10 à 44% peuvent être observés (Tableau 1).
Dans l'exemple représentatif, un poisson avec une GFP + T-ALL a été colorée avec Hoechst 33342 pour déterminer le pourcentage de cellules dans la population latérale. La figure 1 montre le schéma utilisé pour déterminer gating le pourcentage de cellules de la population de côté. Tout d' abord, en utilisant FSC et SSC, les cellules T-ALL sont isolés en excluant les débris (figure 1A), puis la sélection contre doublets (figure 1B). Ensuite, toutes les cellules vivantes sont isolés par gating cellules qui sont GFP + et négatif pour le discriminateur de cellules mortes PI (Figure 1C). Une fois la seule, les cellules vivantes T-ALL sont sélectionnées, la population secondaire se trouve dans le profil Hoechst 33342. Dans la population cellulaire principale, Hoechst 33342 reste dans les cellules, et ces cellules peuvent être séparés en groupes par la teneur en ADN. Cependant, la population de cellules de côté se distinguent de la population cellulaire principale, telle que les cellules de la population des efflux côté du colorant due à un plus grand nombre de transporteurs ABC sur la membrane cellulaire. Pour visualiser la population côté, le profil Hoechst est utilisé pour comparer deux canaux, Hoechst bleu et rouge Hoechst. La population de côté est la queue faible de cellules étendant à partir du côté gauche de la population de cellules principale en direction de l'axe bleu Hoechst (Figure 1D).
Une véritable population côté sera perdue lorsque les cellules sont traitées avec un inhibiteur of transporteurs ABC tels que le vérapamil. La figure 2 montre les populations secondaires dans plusieurs représentatifs T-tumeurs, ainsi que lorsque ces tumeurs sont traitées par vérapamil pendant la coloration avec Hoechst 33342. Pour faire en sorte que la population trouvée dans l'échantillon est une population de côté vrai, ces cellules doivent disparaître en présence de l'inhibiteur, comme cela est représenté sur la figure 2.
| Numéro d'inventaire | Nombre de poissons Projeté | nombre positif | Taux de transgénèse |
| 930 | 21 | 3 | 14,3% |
| 934 | 12 | 4 | 33,3% |
| 950 | 12 | 5 | 41,7% |
| 951 | 19 | 3 | 15,8% |
| 960 | 3 </ Td> | 1 | 33,3% |
| 983 | 9 | 4 | 44,4% |
| 1004 | 30 | 3 | 10,0% |
| 1013 | 4 | 1 | 25,0% |
| 1025 | 35 | 5 | 14,3% |
| 1029 | dix | 2 | 20,0% |
| 1065 | 5 | 1 | 20,0% |
| 1070 | 6 | 1 | 16,7% |
| 1073 | 19 | 8 | 42,1% |
| 1079 | 8 | 1 | 12,5% |
| 1105 | 38 | 7 | 18,4% |
| 1193 | 30 | 8 | 26,7% |
| 1215 | 9 | 1 | 11,1% |
| 1229 | dix | 2 | 20,0% |
| 1314 | 6 | 1 | 16,7% |
Tableau 1: Taux transgénèse lors de l' utilisation transposase pour le plasmide TOL 2 microinjection dans embryons de poissons zèbres. Les taux calculés de transgénèse sont présentés pendant dix-neuf jours d'injection séparés. Le nombre de poissons Projeté représente le nombre de poissons qui sont restés en vie après l'injection de 21 jours, et le nombre positif représente le nombre de poissons qui étaient positifs pour les tumeurs fluorescentes.
Figure 1: Side Population Gating Scheme. Un exemple du système de gating utilisé pour identifier la population latérale dans une GFP + T-ALL zebrafish. (A) d' abord, le débris est exclue en utilisant la dispersion avant (FSC) etzone dispersion latérale (SSC). (B) Ensuite, les cellules individuelles sont isolées en discriminant les doublets en utilisant des paramètres de largeur FSC et SSC. (C) Étant donné que cette tumeur était par exemple GFP +, toutes les cellules vivantes doivent être GFP + et négatif pour le marqueur de cellules mortes propidium Iodide. (D) La population latérale peut être vu avec la Croix - Rouge Hoechst contre Hoechst profil bleu. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Population côté Disparaît quand ils sont traités avec le transporteur ABC Inhibiteur, vérapamil. Portails de la population côté sont représentés. Les panneaux supérieurs montrent quatre échantillons de tumeurs différentes. Il est important de noter que toutes les tumeurs ont pas le même pourcentage de la population côté, et la population côté can look différent pour chaque tumeur testée. Les panneaux inférieurs montrent des échantillons de tumeurs qui ont été traités avec le vérapamil lors de la coloration avec Hoechst 33342 pour bloquer efflux de colorant. Alors que les populations secondaires peuvent être différents pour chaque tumeur, l'effet du vérapamil est le même: la population côté disparaît. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le dosage de population latérale est très sensible; Par conséquent, de petites modifications apportées au protocole peuvent entraîner une difficulté à détecter les cellules de population latérales. Tout d'abord, la température pendant l'étape de coloration est spécifique à chaque système animal / cellulaire. Pour les systèmes de mammifères, le dosage de la population latérale est généralement effectué à 37 ° C 2 . Lorsque les cellules T-ALL de poisson zèbre ont été incubées à 37 ° C, de nombreuses cellules sont mortes, ce qui a rendu cette température d'incubation inacceptable (données non représentées). Lorsque Kobayashi et ses collègues (2008) ont disséqué la moelle des reins zèbres pour le dosage de la population latérale, les incubations ont été effectuées à 25 ° C 5 . Cette température d'incubation n'était pas suffisante pour les cellules T-ALL de poisson zèbre, car il a abouti à un faible profil Hoechst 33342 (données non présentées). Dans le protocole décrit ici, une température d'incubation de 28 ° C était optimale pour maintenir la viabilité cellulaire et pour obtenir un profil Hoechst 33342 fort.
Une deuxième condition pour le dosage de la population de côté qui nécessite un examen et d'essais avant est la concentration de Hoechst 33342. Si la concentration de Hoechst 33342 est trop faible, la population latérale peut ne pas être visible, ou le phénotype de la population latérale (colorant capacité efflux) peut être faussement augmenté, l' identification des cellules de population plus secondaires que sont réellement présents 2. D'autre part, trop élevé d'une concentration de Hoechst 33342 peuvent être toxiques pour les cellules. Pour les cellules T-ALL, 15 pg / ml de Hoechst 33342 zebrafish incubées pendant 120 min est la combinaison optimale. Des concentrations plus faibles de Hoechst 33342 ont été jugés pour T-poisson zèbre toutes les cellules, mais la population côté était pas toujours évident (données non présentées). Un temps total d'incubation de 90 min est suffisante pour détecter une population de côté, mais le nombre maximal de cellules de la population de côté a été observée après 120 min de temps d'incubation.
Comme indiqué précédemment pour s mammifères ystems, pas tous tumeur aura une population secondaire détectable 17, 18, 19. En utilisant cette méthode, nous avons observé une population latérale 14 de 17 T-ALLs testé (données non présentées). Ayant des cellules de la population des côtés isolés à partir de T-alls, ce procédé devrait être applicable à d'autres modèles de tumeur de poisson zèbre.
Au sein de l'hétérogène T-poisson zèbre ALL tumeur, cellules initiatrices de leucémie (PFR) sont capables de réinitialisant la croissance tumorale et sont donc responsables présumés de récidive du cancer et des métastases. Actuellement, il n'y a pas de méthode dans le poisson zèbre qui permet l'isolement éventuel de PFR in vivo. Le calcul de la fréquence LIC nécessite une transplantation de cellules tumorales à une dilution de limitation 8, 10. Des études publiées antérieurement danio clonale ont identifié que les PFR représentent 0,1-1,4% de T-ALL cellules primaires"xref"> 10. Ici, variabilité comparable à la fréquence des cellules de population latérales (0,2 à 1,0%) par rapport à zebrafish clonal T-alls est rapporté (figure 2). D'autres expériences sont nécessaires pour déterminer si la population latérale est enrichie en PFR; cependant, la similitude entre les gammes de fréquence LIC et le pourcentage de cellules de la population des côtés dans ces T-alls soutient cette hypothèse.
Alors que le dosage de la population côté est sensible et pas toujours facile à réaliser, le test permet aux chercheurs, pour la première fois, d'isoler une population rare de cellules T-zebrafish tout ce qui a des propriétés souches ou de cellules progénitrices. Il n'y a pas de marqueurs de surface cellulaire disponibles chez le poisson zèbre pour identifier des cellules ou comme tige-progénitrices; par conséquent, la capacité d'isoler la population secondaire est très prometteur. Les futures applications de cette méthode comprennent des expériences de transplantation de dilution limite de population de côté T-ALL Sorted cellules pour évaluer l'enrichissement de LCircuits intégrés. De plus, cette méthode permettra des caractéristiques qui définissent les PFR à élucider, y compris les mécanismes moléculaires qui régissent PFR dans T-ALL zebrafish. Ces expériences pourraient fournir des points de départ pour la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques pour T-ALL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l'Université de Chicago Board de femmes, Wendy financerons cas, et l'Université de Chicago Comprehensive Cancer Center de soutien de subvention (CA014599 P30). Nous tenons à remercier le flux Cytométrie de base à l'Université de Chicago pour leur aide dans la mise en place de cette expérience, et ainsi que d'autres membres du laboratoire de Jong, en particulier Leslie Pedraza et Sean McConnell.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific - AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific - NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific - SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) - 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 - 300 unit vials |
| 40 µm mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL - Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
References
- Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).
- Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties. Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299, 887-890 (2003).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. , e2790 (2011).
- Martelli, A. M., et al. Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells. Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).
- Smith, A. C. H., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation. Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregan Press. (1993).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Komuro, H., et al. Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines. J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).
- Moshaver, B., et al. Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia. Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).
