Summary
כאן, אנו מתארים טכניקה לבודד את האוכלוסייה תאים בצד מ מודל דג הזברה של myc- המושרה T- תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה (T-ALL). זה assay האוכלוסייה בצד רגיש מאוד מתואר דג הזברה T-ALL, אבל זה עשוי להיות ישים סוגים אחרים של תאים ממאירים ולא ממאיר דג הזברה.
Abstract
אוכלוסיות תאים הטרוגניות, ברקמות בריאים או ממאירים, עשויות להכיל אוכלוסיה של תאים המאופיינים ביכולת דיפרנציאלית להפרדת צבע ה- DNA מחייב 33342. זה "אוכלוסיית הצד" של תאים ניתן לזהות באמצעות שיטות זרימה cytometric לאחר Hoechst 33342 צבע נרגש על ידי לייזר אולטרה סגול (UV). אוכלוסיית הצד של סוגי תאים רבים מכילה תאים דמויי גזע או אב. עם זאת, לא כל סוגי התאים יש אוכלוסייה בצד לזיהוי. Danio rerio , דג הזברה, יש חזקים במודל vivo של תא T-ALL לוקמיה חריפה (T-ALL), אבל אם אלה דג הזברה T-ALLs יש אוכלוסייה צד לא ידוע. השיטה המתוארת כאן מתאר כיצד לבודד את התאים האוכלוסייה בצד דג הזברה T-ALL. כדי להתחיל, T-ALL דג הזברה נוצרת באמצעות microinjection של פלסמידים tol2 לתוך עוברים שלב אחד תא. לאחר הגידול גדלו לשלב שבו הם מתפשטים לתוך יותר ממחצית האניהגוף של mal, תאי T-ALL ניתן לקצור. התאים אז מגואלות Hoechst 33,342 ובחנו ידי cytometry זרימה עבור תאי אוכלוסייה בצד. לשיטה זו יישומים רחב של דג הזברה T-ALL המחקר. אמנם אין סמנים פני תא ידוע של דג זברה כי לאשר תאי אוכלוסייה בצד אלה הם תאים דמויים גזע סרטני, in vivo מבחני השתלה פונקציונליים אפשריים. יתר על כן, transcriptomics מתא בודד יכול להיות מיושם כדי לזהות את המאפיינים הגנטיים של תאי האוכלוסייה בצד אלה.
Introduction
את assay האוכלוסייה בצד מנצל את היכולת המשופרת של תאים מסוימים בתוך רקמה כדי בזרימת צבע מחייב DNA Hoechst 33,342 בשל רמות גבוהות של קלטת מחייב ATP (ABC) חלבונים טרנספורטר על קרום התא. התאים בזרימת הצבע Hoechst 33,342 ניתן לזהות באמצעות ניתוח תזרים cytometric גל כפול אחרי צבען הוא נרגש על ידי לייזר UV. Assay זה שימש הראשון לזהות תאי גזע hematopoietic בעכברים (HSCs) 1, אבל זה ומאז משמש לזיהוי אוכלוסיות תאי גזע / ובתאים רבים רקמות סרטן (הנסקרת תוך התייחסות 2). עם זאת, לא כל האוכלוסיות של תאים יש אוכלוסייה בצד, ולא כל אוכלוסיות הצד מועשרות עבור תאי גזע / אב.
דג הזברה היא מערכת מודל גנטי חוליות עצמה לחקר סרטן 3 אנושי, 4, עם מספר היתרונות על פני mo בעכברים המסורתיdels של סרטן. עוברי דג זברה הם מופרים חיצוניים, ברורים אופטיים, הקלת transgenesis ואת תצפית in vivo של תהליכים פתולוגיים, לרבות ייזום התקדמות סרטן. נכון להיום, assay האוכלוסייה בצד לזהות תאי גזע או ובתאים פוטנציאל יושם רק עד לשד הכליה דג הזברה לזהות HSCs, ולא לכל דגמי סרטן דג הזברה 5, 6.
המודל דג הזברה של לוקמיה לימפובלסטית חריפה תאי T (T-ALL) היא מורפולוגית גנטית דומה האנושי T-ALL 7, 8, 11. T-ALL הוא ממאירות אגרסיבית כי, בבני אדם, מהווה 10-15% של ילדים ו 25% מכלל הבוגרים במקרים 9. בעוד הטיפול של T-ALL השתפר, הישנות עדיין נפוצה קשורה פרוגנוזה גרועה. T-ALL גידולים הם heterogeneיחידות ארגוניות ומכילות תת-אוכלוסיות תאים סרטניים רבות שונות, כוללים תאי ייזום לוקמיה (LICs). LICs מוגדר על ידי יכולתי להצמיח מחדש את הגידול כולו מתא בודד, ואת התדירות של LICs בתוך אוכלוסיית תאים סרטניים יכול להיות מחושב על ידי השתלת תאים במינונים משתנים לתוך נמענים באמצעות assay השתלת דילול מגביל (LDA). בעוד ניסויי LDA בוצעו דג זברה כדי לחשב את התדירות של 8 LICs, 10, 11, קביעה זו נעשית בדיעבד ואינה מאפשרת את הבידוד הפוטנציאלי של LICs. לכן, שיטה לבודדת פרוספקטיבית אוכלוסייה המועשרת עבור פעילות תאי גזע סרטני חסרה. זיהוי ובידוד תאי האוכלוסייה בצד מן דג הזברה טי יכלתי היא הצעד הראשון לקראת פונה חסר זה.
הפרוטוקול המובא כאן מתאר כיצד ליצור ביעילות T-ALL גידולים zebrafish ניצול transgenesis בתיווך-tol2, לקצור את T-ALL תאים גידולים, ואת להכתים אותם עם Hoechst 33,342 כדי לזהות את האוכלוסייה בצד של תאים. עתיד בניסויי vivo עם דג הזברה T-ALL יכול לכלול בין תאי האוכלוסייה בצד מועשרים עבור LICs או בעלי תכונות stem- או ובתאים אחרות דמויים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים עם דג הזברה אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטת שיקגו. אוניברסיטת שיקגו הוא מוכר על ידי האגודה להערכת ההסמכה של מעבדה טיפול בבעלי חיים (AAALAC).
1. יצירת בידוד בידוד fluorescently T- כל תאים דג הזברה
- Microinjection לתוך עוברי דג הזברה הסיניגנית
- באמצעות ערכות זמין מסחרית, לבודד rag2 עגול: c-myc ו rag2 : חלבון פלואורסצנטי ירוק (Rg2: GFP) פלסמיד DNA המכיל חוזר מסוף הפוך המוכרת על ידי טרנספוזיס tol2 (ראה טבלה של חומרים עבור המקור של פלסמיד DNA) 12 ו elute DNA במים סטריליים.
הערה: GFP משמש במחקר זה, אבל כל חלבון פלואורסצנטי יעבוד. - הכן pCS2-transposase (tol2) RNA
- בידוד tol2 פלסמיד DNA באמצעות ערכות זמין מסחרית (ראה tטבלה של חומרים הוא עבור מקור פלסמיד דנ"א) 12 ו elute DNA במים סטריליים.
- דגירה 1 מיקרוגרם של ה- DNA tol2 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות עם 5 יחידות של אנזים הגבלה NotI במאגר המתאים ליניארי הפלסמיד. חום-להשבית NotI ב 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- לתמלל את RNA tol2 עם RNA פולימראז SP6 מן ה- DNA לינארית באמצעות ערכת שעתוק RNA זמין מסחרית 13. חנות RNA ב aliquots לשימוש חד פעמי ב -80 ° C.
- מכינים את תערובת הזרקה על הקרח על ידי הוספת 250 ננוגרם של rag2: פלסמיד דנ"א c-myc, 250 ננוגרם של rag2: DNA פלסמיד ה- GFP, 150 ננוגרם של רנ"א tol2, ו 0.5 μL של פנול אדום. כוון את עוצמת הקול 10 μL עם מים nuclease חינם.
- להזריק ~ 1 NL של תמהיל הזרקה לתוך תא של העובר דג הזברה syngeneic בשלב אחד התא באמצעות microinjector ו מחט משך מן צינור נימי זכוכית, בעקבות בעבר estabשיטות lished 8, 14.
הערה: דג הזברה syngeneic שנוצר בשכפול גנטי 15 משמשים כאן כדי לחסל הטרוגניות גנטית ודחייה החיסון לאחר השתלת. עם זאת, דג הזברה wildtype או כל זן הרצוי יכול לשמש גם. - סור מת, לא מפותח, או עובר פגום ב 24 שעות ולאחר 48 שעות לאחר הזרקה 16.
- מניחים את הדג מוזרק על מערכת דגים 6 ימים לאחר ההזרקה ולהעלות אותם על פי פרוטוקול סטנדרטי 6.
- באמצעות ערכות זמין מסחרית, לבודד rag2 עגול: c-myc ו rag2 : חלבון פלואורסצנטי ירוק (Rg2: GFP) פלסמיד DNA המכיל חוזר מסוף הפוך המוכרת על ידי טרנספוזיס tol2 (ראה טבלה של חומרים עבור המקור של פלסמיד DNA) 12 ו elute DNA במים סטריליים.
- הקרנת דג זברה מוזרקת וניטור צמיחת גידולים
- בשעת 21 ימים לאחר הזרקה, במקום זחל אחד מוזרק אגל של מדיום העובר על צלחת פטרי מסך עבור GFP קרינה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent (bandpass עירור: 470/40, bandpass פליטה: 525/50) 8.
הערה: זחלי דג זברה כי hAve משולבת הן rag2 : c-myc ו rag2 : GFP יהיה תימוס ניאון ירוק (דגים חיוביים) ועשויים כבר להפגין את הרחבת תאים ממאירים ירוק ניאון מעבר התימוס. כל הדג עם התימוס GFP + ימשיך לפתח GFP + T-ALL. הזחלים שאינם מראים שילוב של פלסמידים לא יהיה כל תאים פלואורסצנטיים ירוקים (דגים שליליים). - להפריד את הדגים השליליים (על בסיס חוסר הקרינה) לתוך טנק אחר לפקח על הדג שוב ב 28 ו -35 ימים שלאחר ההזרקה. ב 28 ו -35 ימים לאחר ההזרקה, להרדים את הדג עם 0.02% שנאגרו tricaine (MS-222) במי המערכת של מערכת דגים לפני ההקרנה.
- מניחים כל זחל דג הזברה כי חיובי עבור תימוס שכותרתו fluorescently או גידול שכותרתו fluorescently בטנק בודד לניטור הגידול הגידול שלוש פעמים בשבוע.
- בשעת 21 ימים לאחר הזרקה, במקום זחל אחד מוזרק אגל של מדיום העובר על צלחת פטרי מסך עבור GFP קרינה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent (bandpass עירור: 470/40, bandpass פליטה: 525/50) 8.
- אוסף של תאים שכותרתו fluorescently T-ALL מדג הגידול הראשוני
- הכן לפחות 20 מ"ל של 10% חום- inactivated בסרום שור עוברית ב 0.9x פוספט שנאגרו מלוחים (FBS / PBS).
- הוסף 1 מ"ל של FBS / PBS לבקבוקון אחד של מלח נתרן הפרין (300 יחידות).
- בחר דגים הנושאים גידולים ביותר מ 50% של הגוף, או דגים אלה מתקשים לאכול או לשחות. להקריב את הדגים על ידי מינון יתר עם טריקין או על ידי טבילה במים הקרח. לאשר את המוות על ידי חוסר של זיל תנועה דופק.
- השתמש סכין גילוח כדי להסיר את ראש הדג.
- לשטוף את חלל הדגים עם פתרון הפרין כדי להסיר עודף כדוריות דם אדומות.
- באמצעות פיפטה, להזריק 100 μL של פתרון הפרין (מוכן בשלב 1.3.2) לתוך חלל הגוף של הדג. הסר את כל הנוזל שנשפך החוצה (זה יכיל תאי דם) ופיפטה אותו לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
- השתמש קצה פיפטה טרי לשטוף את הגוף שוב. בצעו לפחות שלושה שוטפים, או עד שהנוזלים שנשפכו מופיעים ללא צבעאוד.
- מחק את כל הנוזל מן השטיפות ב 1.3.5.1 צעדי 1.3.5.2, כפי שהוא לא ישמש בניתוחים נוספים.
- אוספים את התאים לוקמיה.
- להזריק 100 μL של FBS / PBS לתוך חלל הגוף של הדג.
- להפעיל לחץ עדין החלק החיצוני של הגוף של הדג עם קצה פיפטה לסחוט / לדחוף את תאי הגידול.
הערה: אם שלב זה מבוצע באמצעות מיקרוסקופ לנתח, תאי גידול השפיכה מתוך חלל הגוף יהיו ברורים. - אסוף את הנוזל ותאי מכל לשטוף לתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
- חזרו על שלבים 1.3.6.1-1.3.6.3 עד שרוב תאי הגידול נאספים (בדרך כלל 5-10 פעמים). לאסוף את כל התאים הסרטניים לתוך 1.5 מ"ל microcentrifuge צינור זהה. שמור את התאים בטמפרטורת החדר.
- מערבבים את התאים הסרטניים שנאספו צעד 1.3.6 ידי pipetting אותם בעדינות כדי לנתק את גושים של תאים. סנן את ההשעיה התא דרך 4מסנן רשת 0 מיקרומטר. שטפו את המסנן 1-2 פעמים עם 100 μL של FBS / PBS. שמור את התאים בטמפרטורת החדר.
- מערבבים 2 μL של ההשעיה תא עם 18 μL של trypan כחול (0.4%, בדילול 01:10 ומסוננים) בצינור חדש. טען 10 μL על hemocytometer ולספור את מספר חי (לא כחול) תאי ניאון כדי לחשב את מספר תאים סרטניים בודדים.
הערה: Non-כחול תאי GFP-שלילי צפויים נורמלים, לא ממאיר T-תאים ולא צריך לספור. לפחות 2 x 10 6 תאים נדרשים להכתים את התאים עם Hoechst 33,342.
2. מגירה על תאים-ALL T שכותרתו fluorescently עם Hoechst 33,342 כדי לזהות את האוכלוסייה Side
- לדלל Hoechst 33,342 01:10 עם H nuclease- חופשית 2 O כדי להפוך את הריכוז בעבודה 1 מ"ג / מ"ל. אחסן את הצבע על 4 מעלות צלזיוס בחושך.
- הכן פתרון 100 מ"מ של verapamil ידי המסת 49.1 מ"ג ב 1 מ"ל של sulfoxide דימתיל (DMSO).
הערה: Verapamil הוא מעכב של מובילי ABC והוא פקד חשוב עבור ניסויי אוכלוסייה בצד. הוספת verapamil כדי דגימות תמנע את היכולת של מובילי ABC כדי בזרימת צבע Hoechst 33,342. לכן, אוכלוסיית צד אמיתית תיעלם כאשר verapamil מתווסף המדגם. - הגדר באמבט מים 28 מעלות צלזיוס.
- הכינו דגימות ובקרות בחושך על ידי הוספת תאים ופתרונות צינורות סדרן התא המופעל פלואורסצנטי (FACS).
- הכן את הדגימות על ידי הוספת 10 6 תאים, 15 μL של 1 מ"ג / מ"ל Hoechst 33,342, ו 2.5 μL של DMSO לצינור FACS. כוון את עוצמת הקול 1 מ"ל עם FBS / PBS.
- הכן את הבקרות על ידי הוספת 10 6 תאים, 15 μL של 1 מ"ג / מ"ל Hoechst 33,342, ו 2.5 μL של 100 מ"מ verapamil לצינור FACS. כוון את עוצמת הקול 1 מ"ל עם FBS / PBS.
הערה: מינימום של 10 6 תאים / מדגם מומלץ, אבל מכתים יותר בתאים עדיף, במיוחד אם הצד populatתאי יון ימוינו לניתוח נוסף. אין לעבור 10 6 תאים / מ"ל, ולשמור על ריכוז Hoechst 33,342 ב 15 מיקרוגרם / מ"ל. אם 10 x 10 6 תאים מגואלות, נפח התגובה הכולל הוא 10 מ"ל.
- דגירה באמבט מים C 28 ° בחושך במשך 120 דקות.
- לאחר הדגירה, למקם את התאים מיד על הקרח ולשמור אותם בחושך.
- גלולת התאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 6 דקות ב g 300 x. הסר את supernatant. לשטוף עם 1 מ"ל של FBS / PBS.
- גלולת התאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 6 דקות ב g 300 x. הסר את supernatant. Resuspend התאים 1 מ"ל של FBS / PBS.
- שמור על 4 מעלות צלזיוס עד מיון התא.
- 15 דק 'לפני מיון תאים, להוסיף 2 μL של יודיד propidium המניות (PI) (1 מ"ג / מ"ל) לכל 1 מ"ל של FBS / PBS (ריכוז סופי: 2 מיקרוגרם / מ"ל). לערבב היטב.
3. השתמשו FACS כדי למצוא את אוכלוסיית הסייד בתוך אוכלוסיית תאי T-ALL שכותרתו fluorescently
- קביעת שער לחיות, GFP + T-ALL תאים.
- השתמש קדימה פיזור (FSC) ופיזור בצד (SSC) אזור לשפכים החוצה החוצה.
הערה: FSC משמש כדי להבדיל בין גודל התא ו SSC משמש כדי להבדיל את הפירוט של התא. - השתמש FSC רוחב SSC כדי להפלות כפילויות.
הערה: ישנם שלושה מרכיבים שזוהו על ידי גלאי cytometer זרימה: שטח, גובה ורוחב. שטח משמש בדרך כלל למדוד את הקרינה של התא. רוחב מודד את זמן הטיסה, והוא רחב פי שניים, אם שני תאים מחוברים זה לזה. - עבור תאים סרטניים חיים, לצייר שער סביב התאים החיוביים עבור ה- GFP ושלילי עבור PI באמצעות גלאים המתאימים ( למשל , FITC עבור ה- GFP ו PerCP Cy5-5 עבור PI).
- השתמש קדימה פיזור (FSC) ופיזור בצד (SSC) אזור לשפכים החוצה החוצה.
- אם מיון תאים האוכלוסייה בצד לניסויים נוספים, להשתמש קצה זרבובית גדולה (100 מיקרומטר) ולאסוף את התאים לתוך צינור FACS המכיל 3 מ"ל של 100% FBS. השתמש קצה זרבובית גדולה יותר (100 מיקרומטר) במקום קצה קטן (70 מיקרומטר) כדי לשפר את הכדאיות התא לאחר מיון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי ליצור ניאון ביעילות המושרה myc T-ALL גידולים דג הזברה, בונה DNA מעגלי מוקף אתרים transposase tol2 יכול להיות שותף מוזרק עם RNA tol2. מחקרים קודמים מן ההזרקה של ה- DNA לינארית לתוך עוברי דג זברה לדווח על שיעור 5% transgenesis 8. עם הפרוטוקול מותאם כולל transgenesis בתיווך-tol2, שיעורי transgenesis החל 10-44% ניתן לראות (לוח 1).
בדוגמא הנציג, דג עם GFP + T-ALL היה מוכתם Hoechst 33,342 כדי לקבוע את אחוז תאי האוכלוסייה בצד. איור 1 מציג את ערכת gating המשמשת לקביעת אחוזי תאי אוכלוסייה בצד. ראשית, באמצעות FSC ו SSC, תאי T-ALL מבודדים על ידי למעט פסולת (איור 1 א) ובהמשך הבחירה נגד כפילויות (איור 1B). בשלב בא, כל תאי החיים מבודדים על ידי gating תאים הנמצאים GFP + ושלילי עבור מאבחן PI תאים המת (האיור 1C). לאחר יחיד, לחיות תאי T-ALL נבחרים, האוכלוסייה בצד ניתן למצוא את פרופיל 33,342 Hoechst. בשנת אוכלוסיית התא הראשית, Hoechst 33,342 נשאר בתאים, ותאים אלה ניתן להפריד לקבוצות לפי תוכן DNA. עם זאת, אוכלוסיית התאים בצד להבדיל ביניהם לבין אוכלוסיית התא הראשית, כמו תאי אוכלוסייה בצד בזרימת הצבע בשל מספרים גבוהים של מובילי ABC על קרום התא. כדי להמחיש את האוכלוסייה בצד, פרופיל Hoechst משמש להשוות בין שני ערוצים, Hoechst כחול Hoechst אדום. אוכלוסיית הצד היא הזנב העמום של תאי הארכה מצד השמאל של אוכלוסיית התא הראשית לכיוון הציר הכחול Hoechst (איור 1D).
אוכלוסיית צד אמיתית תיאבד כאשר תאי מטופלים עם o מעכבהובלות ABC, כגון verapamil. איור 2 מציג את אוכלוסיות הצד בכמה גידולי T-ALL מייצגים, כמו גם כאשר אותם גידולים מטופלים עם verapamil במהלך מכתים עם Hoechst 33342. כדי להבטיח כי האוכלוסייה נמצא המדגם הוא אוכלוסייה בצד נכון, תאים אלה חייבים להיעלם בנוכחות המעכב, כפי שמוצג באיור 2 .
| מספר מלאי | מספר דגים מוקרנים | מספר חיובי | שיעור טרנסגנסיס |
| 930 | 21 | 3 | 14.3% |
| 934 | 12 | 4 | 33.3% |
| 950 | 12 | 5 | 41.7% |
| 951 | 19 | 3 | 15.8% |
| 960 | 3 </ Td> | 1 | 33.3% |
| 983 | 9 | 4 | 44.4% |
| 1004 | 30 | 3 | 10.0% |
| 1013 | 4 | 1 | 25.0% |
| 1025 | 35 | 5 | 14.3% |
| 1029 | 10 | 2 | 20.0% |
| 1065 | 5 | 1 | 20.0% |
| 1070 | 6 | 1 | 16.7% |
| 1073 | 19 | 8 | 42.1% |
| 1079 | 8 | 1 | 12.5% |
| 1105 | 38 | 7 | 18.4% |
| 1193 | 30 | 8 | 26.7% |
| 1215 | 9 | 1 | 11.1% |
| 1229 | 10 | 2 | 20.0% |
| 1314 | 6 | 1 | 16.7% |
טבלה 1: שערי transgenesis בעת שימוש טרנספוזז Tol2 עבור Microinjection פלסמיד לתוך עוברי דג הזברה. שיעורי מחושב של transgenesis מוצגים עבור תשעה עשר ימי הזרקה נפרדים. מספר הדגים מוקרן מייצג את מספר הדגים שנותרו בחיים 21 ימים לאחר ההזרקה, ואת מספר חיובי מייצג את מספר הדגים שהיו חיוביים עבור גידולים ניאון.
איור 1: צדדי האוכלוסייה Gating Scheme. דוגמה של ערכת gating השתמשו כדי לזהות את האוכלוסייה בצד GFP + T-ALL דג הזברה. ( א ) ראשית, פסולת אינו נכלל באמצעות פיזור קדימה (FSC) ופיזור צד באזור (SSC). (ב) הבא, תאים בודדים מבודדים באמצעות קיפוחם כפילויות באמצעות FSC ופרמטרים רוחב SSC. (ג) מאז גידול בדוגמא זו היה GFP +, כל תאי החיים חייבים להיות GFP + ושלילי לסמן תאים המתים יודיד Propidium. (ד) האוכלוסייה בצד ניתן לראות את האדום Hoechst לעומת פרופיל כחול Hoechst. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: צד אוכלוסין נעלמים כאשר שטופלו מונעי Transporter ABC, Verapamil. גייטס עבור האוכלוסייה בצד מוצג. הפנלים העליונים להראות ארבע דגימות גידולים שונות. חשוב לציין כי לא כל הגידולים באותו אחוז האוכלוסייה בצד, ואת ca האוכלוסייה בצדn הוא שונה עבור כל גידול הנבדק. הפנלים התחתונים להראות דגימות גידולים אשר טופלו verapamil במהלך המכתים עם Hoechst 33,342 לחסום בזרימת צבע. בעוד אוכלוסיות הצד עשויות להיראות שונות עבור כל גידול, את ההשפעה של verapamil זהה: אוכלוסיית הצד נעלמת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Assay האוכלוסייה בצד הוא רגיש מאוד; לכן, שינויים קטנים בפרוטוקול יכול לגרום לקושי באיתור תאים באוכלוסייה בצד. ראשית, הטמפרטורה במהלך שלב מכתים הוא ספציפי לכל חיה / מערכת התא. עבור מערכות יונקים, assay האוכלוסייה בצד מבוצע בדרך כלל על 37 מעלות צלזיוס. כאשר דג הזברה T-ALL תאים הודגרו על 37 מעלות צלזיוס, רבים של תאים מת, מה שגרם טמפרטורת הדגירה מקובל (הנתונים לא מוצג). כאשר Kobayashi ועמיתיו (2008) גזור דג הזברה מוח העצם עבור assay האוכלוסייה בצד, האינקובציות בוצעו ב 25 ° C 5 . הטמפרטורה הדגירה לא היה מספיק עבור דג הזברה תאים T-ALL, כפי שהוא הביא פרופיל חלש 33342 Hoechst (נתונים לא מוצג). בפרוטוקול המתואר כאן, הטמפרטורה דגירה של 28 מעלות צלזיוס היה אופטימלי כדי לשמור על הכדאיות התא כדי להשיג פרופיל Hoechst 33342 חזק.
תנאים שניים עבור assay אוכלוסיית הצד הדורש התייחסות ובדיקה מוקדמת הוא הריכוז של Hoechst 33342. אם הריכוז של Hoechst 33,342 נמוך מדי, אוכלוסיית הצד לא יכולה להיות גלויה, או הפנוטיפ האוכלוסייה בצד (לצבוע יכולת בזרימה) רשאיים יוגדל באופן שקרי, זיהוי תאי אוכלוסייה צדים יותר הם בעצם הווה 2. מצד השני, גבוה מדי של ריכוז של Hoechst 33,342 יכול להיות רעיל לתאים. עבור תאים דג הזברה T-ALL, 15 מיקרוגרם / מ"ל Hoechst 33,342 וטופחו במשך 120 דק 'הוא השילוב האופטימלי. ריכוזים נמוכים של Hoechst 33,342 נשפטו עבור תאי דג זברת T-ALL, אבל אוכלוסיית הלוואי שלא תמיד הייתה ברורה (מידע לא מוצג). זמן דגירה כולל של 90 דקות היה מספיק כדי לזהות אוכלוסיית לוואי, אך המספר המרבי של תאי אוכלוסייה בצד נתפס לאחר 120 דקות של זמן דגירה.
כפי שדווח בעבר עבור ים יונק Ystems, לא כל גידול יהיה האוכלוסייה בצד לזיהוי 17 , 18 , 19 . באמצעות שיטה זו, ראינו אוכלוסיית צד ב 14 מתוך 17 T-ALLs נבדק (נתונים לא מוצג). לאחר בודדים בצד האוכלוסייה תאים מ T-ALLs, שיטה זו צפויה להיות ישימה מודלים דג הזברה אחרים.
בתוך גידול דג הזברה הטרוגנית T-ALL, תאי לוקמיה ליוקמיה (lics) מסוגלים לצמיחה מחדש של הגידול, וככאלה הם האמינו באחריות לסרטן ולגרורות. נכון לעכשיו, אין שיטה דג הזברה המאפשר בידוד פוטנציאלי של LICs in vivo . חישוב תדר LIC דורש השתלת תאים סרטניים בדילול מגביל 8 , 10 . מחקרים שפורסמו בעבר עם דג הזברה משובטים זיהו כי LICs לפצות 0.1-1.4% של תאים ראשוניים T-ALL"Xref"> 10. הנה, השתנות דומה לתדירות של תאים האוכלוסייה בצד (0.2-1.0%) מן משובט דג הזברה T יכלתי מדווח (איור 2). ניסויים נוספים נדרשים כדי לקבוע אם האוכלוסייה בצד מועשרת LICs; עם זאת, הדמיון בין הטווחים של תדר LIC ואחוז תאי האוכלוסייה בצד ב T-יכלתי אלה תומך בהשערה זו.
בעוד assay האוכלוסייה בצד רגיש ולא תמיד קל לבצע, assay מאפשר לחוקרים, בפעם הראשונה, כדי לבודד אוכלוסיה נדירה של תאים דג הזברה T-ALL שעשויים להיות בעלי תכונות גזע או תאי אב. כרגע אין סמנים פני התא זמין דג הזברה לזהות תאים stem- או אב-כמו; ומכאן, היכולת לבודד את האוכלוסייה בצד מאוד מבטיחה. יישומים עתידיים של שיטה זו כוללים ניסויי השתלת דילול גבול של תאי T-ALL אוכלוסייה בצד ממוין להעריך את העשרת LICS. בנוסף, שיטה זו תאפשר מאפיינים שמגדירים LICs הובהרו, כולל המנגנונים המולקולריים השולטים LICs דג הזברה T-ALL. ניסויים אלו יכולים לספק נקודת המוצא שלפיה לגילוי מטרות טיפוליות חדשות T-ALL.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת דירקטוריון שיקגו נשים, קרן Case וונדי וויל, ואוניברסיטת גרנט מרכז התמיכה הסרטן שיקגו מקיף (CA014599 P30). ברצוננו להודות Core cytometry זרימה באוניברסיטת שיקגו עזרתם בהקמת הניסוי הזה, גם שאר חברי המעבדה דה יונג, במיוחד לסלי Pedraza ושון מקונל.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syngeneic zebrafish (CG2) | See Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plasmid | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab | rag2 promoter from Langenau Laboratory | ||
| pCS2-transposase plasmid | Chien Laboratory | ||
| NotI -HF restriction enzyme | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 units in 25 µL |
| mMessage Machine SP6 Transcription Kit | Ambion | Thermo Fisher Scientific - AM1340 | 25 reactions |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| SteREO Discovery V8 Microscope | Carl Zeiss Microscopy | 495015-0008-000 | |
| Digital microinjector | Tritech Research | MINJ-D | |
| Brass straight-arm needle holder | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Magnetic base and stand | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN153 | |
| Glass capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm without filament |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf North America Inc. | 930001007 | |
| Phenol Red solution | Sigma Life Science | P0290 | 0.5% concentration 100 mL |
| Plastic Transfer pipettes | Fisherbrand | 137119D | graduated 7.5 mL bulb |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific - NC0342409 | 100 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific - SH3007103 | 500 mL |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) - 500 mL |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 - 300 unit vials |
| 40 µm mesh filter | Falcon Corning Brand | 352340 | Case of 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL - Solution (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
References
- Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).
- Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).
- Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties. Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299, 887-890 (2003).
- Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. , e2790 (2011).
- Martelli, A. M., et al. Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells. Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).
- Smith, A. C. H., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
- Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation. Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).
- Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregan Press. (1993).
- Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).
- Komuro, H., et al. Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines. J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).
- Moshaver, B., et al. Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia. Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).
