Summary
زرع الخلايا السرطانية هو أداة هامة لتحديد آليات السرطان والاستجابات العلاجية. تعتمد التقنيات الحالية على الحيوانات المناعية غير المؤهلة. هنا، ونحن تصف طريقة لزرع الخلايا السرطانية الزرد في الأجنة المختصة المناعة للتحليل على المدى الطويل من سلوك الخلايا السرطانية وفي ردود الفعل الجسم الحي المخدرات.
Abstract
زرع الخلايا السرطانية هو تقنية هامة لتحديد آليات السيطرة على نمو الخلايا السرطانية، والهجرة، واستجابة المضيف، فضلا عن تقييم استجابة المريض المحتملة للعلاج. الطرق الحالية تعتمد إلى حد كبير على استخدام الحيوانات سينجينيك أو المناعة للخطر لتجنب رفض الكسب غير المشروع الورم. تتطلب هذه الأساليب استخدام سلالات وراثية محددة غالبا ما تمنع تحليل تفاعلات الخلايا المناعية للورم و / أو تقتصر على خلفيات وراثية محددة. طريقة بديلة في الزرد يستفيد من نظام المناعة غير مكتملة تماما في الدماغ الجنينية قبل 3 أيام، حيث يتم زرع الخلايا السرطانية لاستخدامها في المقايسات على المدى القصير ( أي 3-10 أيام). ومع ذلك، فإن هذه الأساليب تسبب الفتك المضيف، والذي يمنع دراسة طويلة الأجل لسلوك الخلايا السرطانية واستجابة المخدرات. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة لزرع مثلي الأجل على المدى الطويل من الأنسجة الورم الدماغ الزرد فيإلى البطين الرابع من الزرد المختصة المناعة المناعية 2 يوم. هذه الطريقة تسمح: 1) دراسة على المدى الطويل من السلوكيات الخلية السرطانية، مثل الغزو والنشر؛ 2) استجابة ورم دائم للمخدرات. و 3) إعادة زرع الأورام لدراسة تطور الورم و / أو تأثير مختلف الخلفيات الوراثية المضيفة. وباختصار، فإن هذه التقنية تسمح للباحثين السرطان لتقييم إنغرافتمنت، والغزو، والنمو في المواقع البعيدة، وكذلك لأداء شاشات الكيميائية والفحوصات المنافسة الخلية على مدى عدة أشهر. ويمكن تمديد هذا البروتوكول لدراسات أنواع الورم الأخرى، ويمكن استخدامها لتوضيح آليات المقاومة الكيميائية والانبثاث.
Introduction
زرع الخلايا السرطانية في الحيوانات المناعية للخطر، وخاصة زينوغرافتس الماوس، هو تقنية تستخدم على نطاق واسع المستخدمة لدراسة آليات السيطرة على انتشار الخلايا السرطانية 1 ، 2 ، والبقاء على قيد الحياة، والغزو، ورم خبيث 3 ، 4 ، فضلا عن توفير منصة لفحص المخدرات 5 ، 6 ، 7 . في الآونة الأخيرة، تم استخدام زرع عينات الورم الأولية في الفئران المناعية للخطر لتوليد طعم أجنبي المستمدة من المريض (بدكس) نماذج لأغراض التشخيص والمخدرات قبل السريرية وفحص العمود الفقري لمبادرة الطب شخصية 8 و 9 و 10 و 11 . ومع ذلك، أدلة هامة تبين أن تحوير سي المناعةالجذعية يمكن أن يكون لها تأثير دراماتيكي على سلوك الورم ونتائج المريض 12 ، 13 . وقد أدى هذا إلى إعادة تصميم التقنيات القائمة على طعم أجنبي لتشمل الفئران "أنسنة"، حيث يتم إعادة تشكيل الجهاز المناعي للفأرة من خلال زرع خلايا المناعة البشرية مع الخلايا السرطانية. ومع ذلك، فإن هذا النهج لا يزال من الناحية الفنية تحديا، مع متغير الاستنساخ والسمية المرتبطة بهذه التقنية، بالإضافة إلى تكلفة كبيرة 14 ، 15 . وبالتالي، هناك حاجة إلى تقنيات زرع جديدة في الحيوانات المناعية المختصة لتسريع اكتشاف آليات المناعة والورم محددة من تطور السرطان والاستجابة للمخدرات.
الزرد هي نموذج حيواني بديل لدراسة السرطان البشري، مع أكثر من 20 نماذج السرطان الآن إنشاء 16 ، بما في ذلك الدماغ الخبيث للغاية 17 ، ميلا نوما 18 ، 19 ، 20 ، وسرطان البنكرياس 21 ، 22 ، فضلا عن العديد من اللوكيميا 23 ، 24 ، 25 ، 26 ، 27 . اثنين من سمات نظام الزرد جعلها قابلة للتحديد خاصة لأبحاث السرطان: 1) الوضوح البصري للحيوانات شفافة يسمح للتصور المباشر للسلوك الخلايا السرطانية ( أي الانتشار والبقاء والغزو والنشر) باستخدام تقنيات المجهر بسيطة و 2) يمكن أن تنتج الزرد الإناث ما يصل إلى 200 الأجنة في اليوم الواحد، مما يسمح للالتسارع السريع لأرقام الحيوانات للفحص الجيني أو المخدرات بتكلفة منخفضة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم حفظ جينومات السرطان من الزرد والبشر للغاية (بما في ذلك الجينات الورمية والجينات الكابتة للورم)f "> 28، مما يتيح للاكتشافات الآلية والمخدرات أن تترجم بسرعة إلى نظم الثدييات، كما أن هذه الصفات تجعل الزرد نموذجا حيويا مثاليا لتقنيات الزرع، التي تستفيد من التصوير والتدرجية والتكلفة المنخفضة للنظام.
وقد سهلت الدراسات السابقة لزرع الورم في الزرد المناعي للخطر التعرف على قدرات التجديد الذاتي، ورم خبيث الورم، والغزو / نشر 11 ، 29 . ويمكن إجراء دراسات قصيرة الأجل لسلوك الخلايا السرطانية بعد زرع في البالغين المشع،، الذين يتم قمعها بشكل فعال أجهزة المناعة لمدة 20 يوما ~ 11 ، 30 . علاج الزرد الكبار مع ديكساميثازون يقمع B- والخلايا T لمدة تصل إلى 30 يوما قبل الرفض يحدث 31 . وهناك استراتيجية أخرى أقل شيوعا تستخدم سلالات الزرد نسيليالتي تمكن من تحقيقات طويلة الأجل في مضيف مختص مناعة 32 . ومع ذلك، لم يتم توليد سوى عدد محدود من سلالات نسلية وصعبة للحفاظ على بسبب انخفاض الخصوبة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم إنشاء معظم النماذج الورم الزرد أنشئت في الخلفيات الوراثية الأخرى، لذلك لا يمكن زرع هذه الأورام في سلالات نسلي دون قمع الجهاز المناعي 11 ، 33 ، 34 . وتشمل الأساليب الحديثة لتحسين دراسات زرع طويلة الأجل تطوير خط متحولة Rag2 E450fs ، مع اختراق وظائف B- و T- الخلية، والتي تم استخدامها لنجاح زرع سرطان متعددة 35 ، 36 . للتحايل على متطلبات خطوط الزرد نسلي أو المضيف المناعي للخطر، استخدم عدد من المجموعات الأجنة في مرحلة مبكرة ( أي > 72 حصان(هف)) لزرع الخلايا السرطانية البشرية، حيث أن هذه الأجنة لم تتطور بشكل كامل على جهاز المناعة التكيف 37 ، 38 ، 39 ، 40 ، 41 ، 42 ، 43 . ومع ذلك، تقتصر هذه الطرق على تحليل قصير الأجل لسلوك الخلايا السرطانية أو الاستجابة للأدوية (عادة أقل من 2 أسابيع) لأن الخلايا السرطانية البشرية أو تقنية زرع نفسها تقتل المضيف، ومنع الدراسات طويلة الأجل وإعادة زرع.
هذا البروتوكول تفاصيل طريقة زرع الجنينية المعدلة في تجويف البطين الرابع من 2 يوم بعد الإخصاب (دبف) الدماغ الجنين. فإنه يقلل سمية إلى المضيف ويمكن الجمع بين نماذج الورم الدماغ الزرد ل إنغرافتمنت على المدى الطويل من الخلايا السرطانية. وهكذا، فإن هذه التقنية آلوانخفاض لإعادة زرع الخلايا السرطانية إلى مضيفات جديدة على مدى أجيال عديدة، وتسهيل الدراسات المستقبلية على عدم التجانس الورم، واستضافة المضيف / المناعة، واستجابات المخدرات، أو إمكانات النقيلي. هذا الأسلوب هو أيضا بسيطة وفعالة، وقابلة للتطوير، ما يصل إلى 300 زرع يمكن أن يؤديها مستخدم واحد في اليوم الواحد، مع ما يصل إلى 90٪ إنغرافتمنت. وهذا يسمح للانتشار السريع للأورام الأولية واحدة في مئات الأجنة في 2 دبف لمشاريع الفحص الجيني أو المخدرات أو لتصور مباشرة سلوك خلايا ورم الدماغ في الخلفيات المضيف المختلفة على مدى عدة أشهر.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية واتبعت المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من جامعة ولاية يوتا المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (إاكوك # 16-03019).
1. إعداد المعدات ل ميكروينجكتيون
- إعداد لوحة حقن.
- إعداد محلول 50 مل من الاغاروز 1.2٪ المذاب في ماء البيض (0.6 غرام / لتر ملح الحوض في المياه التناضح العكسي + 0.01 ملغم / لتر الميثيلين الأزرق). يغلي الحل حتى يذوب أغاروس ثم تكمل بإضافة 0.05 ملغم / لتر الميثيلين الأزرق. صب 25 مل من الحل النهائي إلى طبق بتري 10 سم والسماح لها لتدعيم. وضع 25 مل المتبقية من الحل الاغاروز في حمام مائي 42 درجة مئوية حتى جاهزة للخطوة 1.1.2.
- تعيين 2 بوصة قطرها كوب في وسط سطح عزز وتصب 25 مل المتبقية من الاغاروز 1.2٪.
ملاحظة: هذا يخلق سطح الحقن على هامش لوحة ونواة في المركز، والتييوفر مساحة لاختبار حجم الإبرة والاتساق تعليق الورم.- الحفاظ على لوحة حقن في 28 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الحقن أو في 4 درجات مئوية للتخزين على المدى الطويل.
- إعداد الإبر الحقن.
- جعل الإبر عن طريق سحب الشعيرات الدموية 10 سم مع البعد الخارجي من 1.2 ملم والبعد الداخلي من 0.9 ملم (دون خيوط) إلى اثنين من الإبر على مجتذب الإبرة.
ملاحظة: كل إبرة يجب قياس 6 سم في الطول الإجمالي، حيث حوالي 1.5 سم من نهاية مدبب. - وضع بعناية الإبرة على شريحة المجهر ملفوفة في فيلم البارافين البلاستيك. استخدام شفرة حلاقة لقطع نهاية الإبرة في زاوية 45 درجة لخلق إبرة مع افتتاح في طرف.
ملاحظة: عادة، يتم إزالة 0.1 ملم إلى 0.3 ملم من نهاية الإبرة. ليس مطلوبا طرف مشطوفة لأداء الحقن.
- جعل الإبر عن طريق سحب الشعيرات الدموية 10 سم مع البعد الخارجي من 1.2 ملم والبعد الداخلي من 0.9 ملم (دون خيوط) إلى اثنين من الإبر على مجتذب الإبرة.
- إعداد الإعداد ميكروينجكتيون.
- <لي> ترتيب إعداد ميكروينجكتيون القياسية، بما في ذلك ستيريوميكروسكوب، مناور، و ميكروينجيكتور لزرع.
2. إعداد الأجنة لزرع
- جمع ما يصل إلى 500 ميتفا W2 الأجنة 44 (أو الأجنة من أي الأنماط الجينية الزرد الأخرى كما هو محدد من قبل المستخدم) كما هو موضح 45 والحفاظ على حاضنة 28 درجة مئوية.
- ديكوريونات الأجنة في 24 هف عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من 10 ملغ / مل حل كوكتيل البروتياز المخفف في مياه البيض والصخور بلطف لمدة 20 دقيقة تقريبا. شطف الأجنة 3 مرات مع البيض البيض الطازج لإزالة البروتياز المتبقية.
- شاشة الأجنة في 48 هف للمرحلة التنموية المناسبة، كما هو محدد من قبل معايير سلسلة التدريج القياسية 45 .
ملاحظة: يجب أن تستخدم فقط بشكل صحيح نظمت وأجنة طبيعية شكليا للزرع. - خدرما يقرب من عشرين 48 هف الأجنة في ماء البيض تحتوي على 0.002٪ تريكين-S في طبق بتري. تأكيد التخدير السليم من خلال مراقبة وقف الحركة.
3. جعل تعليق خلية الورم
ملاحظة: يمكن أن تتولد نماذج الورم الدماغ الزرد من قبل مجموعات الهندسة الوراثية من الجينات الورمية والجينات الكابتة للورم 17 ، 46 ، 47 . هنا، و sox10 يحركها المروج نراس وت ، تم استخدام p53 zdf1 / zdf1 نس -بينت نموذج الزرد، كما وصفت مؤخرا 17 .
- الموت ببطء الأسماك التي تحمل الورم الدماغ الذي هو عبء الورم حوالي 20٪ من حجم الجسم الإجمالي باستخدام 0.4٪ تريكين-S جرعة زائدة تليها الغمر في الماء الجليدي وفقا لبروتوكولات إاكوك المعتمدة.
- تشريح الورم فلورزنتلي المسمى مع شفرة حلاقة وملاقط تحت مضانالمجهر باستخدام تقنية معقمة ووضعه في 5 مل من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (بس).
ملاحظة: أساليب تشريح الدقيق سيتم تعريف المستخدم وتعتمد على نوع الورم وموقع الأنسجة. انظر المراجع المذكورة لإجراءات مفصلة لتشريح أجهزة الزرد مختلفة وأورام المخ 17 ، 48 . - تعطيل يدويا كتلة الورم باستخدام ماصة p1000 حتى موحدة، حل غائم يتطور. إزالة الجسيمات الكبيرة مع طرف ماصة أو باستخدام مصفاة الخلية 40 ميكرون (وهذا يعتمد على الورم). الطرد المركزي تعليق في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في 290 x ج وإزالة طاف.
ملاحظة: لا يتم تنفيذ فرز الخلايا مضان (فاكس) لعزل الخلايا السرطانية. وهذا يسمح لزرع السكان غير المتجانسة من انسجة، المناعة، والخلايا السرطانية. - ريسوسبيند بيليه الخلية السرطانية في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة ونقله إلى 1.5 مل الدقيقةأنبوب الطرد المركزي. خذ 5 ميكرولتر من تعليق الخلية وتمييع ذلك في 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. عد عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. الطرد المركزي تعليق لمدة 3 دقائق في 290 x ج، وإزالة طاف، و ريسوسبيند بيليه في برنامج تلفزيوني العقيمة للحصول على تركيز الخلية المطلوب.
ملاحظة: عادة، الخلايا معلق في 30-40 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة تسفر عن الحل الذي هو لزج ومبهمة (خلايا تركيز ≥100 خلايا / نل) وتميل إلى توليد عمليات الزرع الأكثر نجاحا. لا يتم تقييم قابلية الخلية. - تخزين تعليق الورم على كتلة حرارة 28 درجة مئوية أثناء إجراء زرع.
4. حقن تعليق الورم في البطين الرابع من 2-دبف الجنين
- نقل 10-20 الأجنة تخدير (من الخطوة 2.4) إلى محيط لوحة حقن باستخدام ماصة نقل. يجب أن تقع الأجنة أفقيا على لوحة الحقن، مع البطينين واضحة للعيان ويمكن الوصول إليها. استخدام مسبار الزاوية لضبط الأجنة حسب الحاجة ووضعها بعيدا عن الحافة الخارجية للوحة الحقن.
- تحميل 1-2 ميكرولتر من تعليق خلية الورم في إبرة الحقن باستخدام هلام نصائح ماصة التحميل وإدراج الإبرة في مناور.
- خفض يدويا مناور، وعقد الإبرة في زاوية 45 درجة. ضبط المقابض على ميكرومانيبولاتور في x، y، z الاتجاهات حتى الإبرة هو فقط أعلاه وحوالي 5 ملم على يمين رأس الجنين. ننظر من خلال العدسات من ستيريوميكروسكوب وضبط ببطء ميكرومانيبولاتور في الاتجاه س حتى إبرة ثقب البطين الرابع من الجنين. لا تسمح للإبرة أن تخترق القلب أو صفار البيض.
- دفع دواسة القدم تعلق على ميكروينجيكتور لحقن تعليق خلية الورم.
ملاحظة: ضغط الحقن والوقت سوف تختلف على أساس إبرة حجم تتحمل، ولكن نقطة انطلاق جيدة هي 5 - 10 يسي و 50 - 100 مللي ثانية.ويمكن تقييم حجم الخلايا السرطانية حقن مع تقنيات قطرة النفط القياسية من خلال الحقن في الزيوت المعدنية، إذا رغبت في ذلك 49 . حقن 500 بل مع قطرة قطرها 0.1 ملم عادة تعطي أفضل النتائج.
- دفع دواسة القدم تعلق على ميكروينجيكتور لحقن تعليق خلية الورم.
- شطف بلطف الأجنة حقن قبالة لوحة حقن وإلى طبق بتري باستخدام المياه البيض الطازج. الحفاظ على الأجنة في مياه البيض عن الإجراءات المتبقية أو حتى تزرع في خزانات (كما هو موضح في الخطوة 4.9.1).
- فحص الأجنة حقن تحت مضان ستيريوميكروسكوب. تأكد من أن ضغط الحقن، وزاوية، وحجم الإبرة، والخلية تعليق اللزوجة يؤدي إلى الخلايا السرطانية ملء 25-50٪ من الفضاء البطين. اضبط هذه المعلمات حسب الضرورة.
- كرر الخطوات 4،1-4،5 لأي الأجنة المتبقية. تخدير الأجنة إضافية حسب الحاجة (وصفها في الخطوة 2.4).
ملاحظة: يمكن للمستخدم من ذوي الخبرة حقن ما يصل إلى 300 الأجنة خلال 3-4 ح. - وضع الأجنة مرة أخرى فيحاضنة 28 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي، تقييم البقاء على قيد الحياة الجنين من خلال فحص السمات المورفولوجية والفسيولوجية، مثل القلب الطبيعي وتطوير الدماغ، كما هو موضح 45 .
- للفحص، تخدير الأجنة، كما هو موضح في الخطوة 2.4، في 1 يوم بعد زرع (قسم).
- استخدام ماصة نقل لإضافة 4٪ ميثيلسيلولوس على منتصف طبق بتري وإضافة الأجنة إلى قطرة ميثيلسيلولوس. توجيه الأجنة (الجانب البطني التي تواجه مصدر الضوء) باستخدام مسبار الزاوية وشاشة لحجم إنغرافتمنت متسقة باستخدام المجهر مضان. إزالة أي أجنة مع الخلايا السرطانية لا تقتصر على البطين أو تلك التي تحتوي على الخلايا السرطانية إمباساسينغ أقل من 25٪ من الفضاء البطين.
ملاحظة: يتم تعريف إنغرافتمنت متسقة كما الأجنة مع كتلة الورم واحد الذي يشمل 25-50٪ من الفضاء البطين 17 . لأغراض الفرز، استخدم مضان sتيريوميكروسكوب مع هدف 1X، 0.15 الفتحة العددية، والتكبير تتراوح بين 0،7-1،6X، ووقت التعرض من 50 مللي ثانية إلى 1 ثانية. لجميع الصور، الاستفادة من قناة حقل مشرق بالإضافة إلى إما غفب أو قناة رفب. - لصيانة الأورام، ووضع الأجنة المزروعة في الدبابات لتنمو 45 في 8 دبف (6 نقطة).
- استخدام ماصة نقل لإضافة 4٪ ميثيلسيلولوس على منتصف طبق بتري وإضافة الأجنة إلى قطرة ميثيلسيلولوس. توجيه الأجنة (الجانب البطني التي تواجه مصدر الضوء) باستخدام مسبار الزاوية وشاشة لحجم إنغرافتمنت متسقة باستخدام المجهر مضان. إزالة أي أجنة مع الخلايا السرطانية لا تقتصر على البطين أو تلك التي تحتوي على الخلايا السرطانية إمباساسينغ أقل من 25٪ من الفضاء البطين.
5. التصوير زرع الأجنة للسلوك الخلوي
- تخدير الأجنة في 3-8 دبف (1-6 دبت) وجبل (الجانب الظهري التي تواجه ساترة) في الاغاروز ذوبان منخفضة 1.2٪. إجراء التصوير الوقت الفاصل بين الأجنة التي شنت باستخدام المجهر متحد البؤر الليزر المسح الضوئي لطول المطلوب من الوقت لتصور السلوكيات الخلوية، مثل الهجرة، انقسام الخلايا، أو التفاعلات خلية الخلية، حسب الحاجة 38 ، 43 ، 53 .
ملاحظة: استخدام نسبة العرض إلى الارتفاع 1024 × 1،024، سرعة المسح الضوئي من 8 & #181؛ ق / بكسل. توظيف متوسط المسح وتحديد أبعاد z- عمق لضمان التقاط كامل كتلة الورم (1،000-1،500 ميكرون). بالإضافة إلى ذلك، إجراء 4-ساعة التجارب الفاصل الزمني، والحصول على صورة كل 10-15 دقيقة باستخدام الهدف 40X، لمراقبة السلوكيات الغازية. حساسية الكاشف سوف تختلف تبعا لشدة كتلة الورم، وسوف تكون قوة الليزر تعتمد على المجهر، ولكن ينصح عموما أن يكون بين 15 و 40٪. - مرة واحدة في التصوير كاملة، مجانا الجنين شنت من الاغاروز باستخدام مسبار الزاوية ونقله إلى طبق بتري مع ماء البيض الطازج.
6. إدارة الدواء إلى الأجنة المزروعة وتقييم عبء الورم 17
- تخدير الأجنة في 3 دبف وتوجيهها في 4٪ ميثيلسيلولوس، مع الجانب البطني التي تواجه مصدر الضوء. صورة الأجنة المعالجة المسبقة باستخدام المجهر مضان 17 .
- جيش التحرير الشعبى الصينىسي الأجنة المزروعة في 3 دبف في لوحة 12 جيدا، مع 10 أجنة لكل بئر في 0.5 مل من مياه البيض. إضافة كمية مناسبة من الدواء للحصول على التركيز النهائي المطلوب (على سبيل المثال، 50 ميكرومتر ميك المانع) والعودة الأجنة إلى حاضنة 28 درجة مئوية. في اليوم التالي، وإزالة مياه البيض المعالجة بالمخدرات مع ماصة نقل رقيقة تتحمل وإضافة علاج جديد. كرر هذا يوميا حتى تصل الأجنة 8 دبف.
- في 8 دبف، وإزالة الأجنة من العلاج من تعاطي المخدرات ووضعها في ماء البيض الطازج. تخدير الأجنة والتوجيه (الجانب البطني التي تواجه مصدر الضوء) في 4٪ ميثيلسيلولوس. صورة الأجنة بعد العلاج باستخدام المجهر مضان. تحديد منطقة الورم باستخدام البرامج المناسبة، كما هو موضح 17 .
- فصل الأجنة حسب الاقتضاء في العلاج ووضعها في خزانات لتنمو. بعد 4-9 أسابيع، تخدير الأسماك وتقييمها للعبء الكلي للورم باستخدام مضان ستيريوميكروسكوب مضان، كما د17
Representative Results
زرع الورم و إنغرافتمنت
ويرد مخطط تخطيطي للإجراء في الشكل 1 . يتم استخراج الخلايا السرطانية فلورزنتلي المسمى من موقع الجهاز الأساسي، ويتم إنشاء تعليق خلية واحدة للزرع في البطين الرابع من 2- دبف ميتفا W2 الزرد الأجنة 44 . ويبين الشكل 2 النتائج ممثل لهذه الطريقة باستخدام نموذج الزرد من الجهاز العصبي المركزي البدائي الورم الأديم العصبي العصبي (نس-بينيت)، الذي يدفع المروج sox10 التعبير عن ويلديب نراس أو تنشيط نراس تنصهر ل مشيري في p53 خلايا سلفي أوليغونيورالخلية 17 - تم استخدام الزرافة W2 ميتفا 44 متحولة، والتي تفتقر إلى ميلانوفوريس، لتصور أكثر سهولة والخلايا السرطانية بعد الزرع و / أو في مرحلة البلوغ. ويمكن أيضا استخدام المسوخ الصباغ الأخرى لتوفير مزيد من الوضوح التصوير، مثل كاسبر 50 . في وقت مبكر من 24 ساعة بعد الزرع، ويمكن رؤية خلايا الورم غزو في أنسجة المخ المحيطة ( الشكل 2A ، 3 دبف، والسهام). الطعوم الورم تستمر في النمو في البطين وأنسجة المخ المحيطة خلال الأسبوع المقبل ( الشكل 2A ، 8 دبف). في هذا الوقت، ويمكن أيضا أن يلاحظ مضان في منطقة الكلى ( الشكل 2A ، النجمة). هذا قد يكون راجعا إلى الكلى تصفية الحطام الخلوي من زرع، وهو ما يتسق مع الدراسات السابقة التي تستخدم الأصباغ الفلورية كمقايسة لتقييم وظائف الكلى 51 . تستمر الخلايا السرطانية في التكاثر وغزو، وذلك من قبل 28 دبف، ويمكن رؤية كتلة الورم في جميع أنحاء الدماغ الزرد ( الشكل 2A ، 28 دبف).
.within-بادج = "1"> هذه التقنية تسمح للزرع السريع للخلايا السرطانية في مئات الأجنة مع اتساق استنساخه، حيث يمكن استهداف موقع الحقن بدقة مع الحد الأدنى من الأضرار التي لحقت المضيف. ويظهر مجموعة تمثيلية من الأجنة زرع مع مشيري المسمى خلايا ورم الدماغ في اللوحة العليا من الشكل 2B . وعادة ما يتحقق إنغرافتمنت الورم في 80-90٪ من الأجنة، وتستمر عمليات زرع الورم في مرحلة البلوغ. وترد ثلاثة أمثلة ممثلة في لوحات أسفل من الشكل 2B . وهذا يسمح لزراعة الورم وتجميدها أو إعادة زراعتها على مدى عدة أجيال.
غزو الورم والاستجابات المخدرات
ويبين الشكل 3A مخطط زرع مشترك فيها اثنين من الأورام المختلفة المسمى إما غفب (الورم A) أو مشيري (الورم B) يتم حصادها من قبل كاملأو التفكك (لاحظ أن فاكس لا تستخدم هنا، ولكن فاكس يمكن أن تستخدم الخلايا السرطانية فرزها إذا لزم الأمر). الورم A و B يمكن أن يكون من مواقع مختلفة، الناجم عن الجينات الورمية مختلفة، أو المستحثة في خلفيات وراثية مختلفة. تتم معالجة كل ورم في تعليق خلية واحدة، ثم يتم خلط الخلايا السرطانية معا في نسبة 1: 1 وزرعها في الجنين 2-دبف. ويمكن ملاحظة خصائص الورم، مثل إنغرافتمنت، والنمو، والغزو، ونشر الورم A مقابل الورم B في نفس المضيف الذي يسمح الضوابط الداخلية لهذه التقنية والخلفية الوراثية.
في الشكل 3B ، و نراس مدفوعة ، مشيري المسمى الزرد نس-بينيت من الكتلة البصرية و غفب المسمى نس-بينيت من المخيخ تم حصادها ومعالجتها في تعليق خلية واحدة. تم عد الخلايا، وتم خلط عدد متساو من الخلايا من كل ورم معا وزرعها في الأجنة 2-دبف. أربعة دأيس بعد زرع، تم تصوير الأجنة مع المجهر متحد البؤر. يظهر هو الجنين ممثل يدل على أن خلايا ورم الخلايا (الحمراء) تهاجر على نطاق أوسع في الدماغ المضيف (السهام) من ورم المخيخ.
الأجنة زرعها مع الخلايا الورم فلورزنتلي المسمى يمكن استخدامها في نظم العلاج من تعاطي المخدرات لتحديد المركبات التي تمنع نمو الورم. الشكل 3C هو الجدول الزمني نموذجي لعلاج وتصوير زرع الورم. 24 ساعة بعد زرع، يتم الوصول الأجنة لحجم إنغرافتمنت متسقة والانقسام إلى مجموعات العلاج. في المثال المقدم، يتم زرع الأجنة المزروعة مع نراس مدفوعة ، مشيري المسمى الزرد نس-بينتس مع 50 ميكرومتر ثنائي ميثيل سلفوكسيد (دمسو) أو المانع ميك (AZD6244). يتم علاج الأجنة لمدة 5 أيام وتصويرها في 8 دبف، على النحو المبين في الشكل 3C . الشكل 3D (لوحات اليسار) يظهر تمثيلية ه الحيوانات من المجموعتين العلاج. ميك الأجنة المعالجة المانع لديها كمية أقل بكثير من مضان من تلك التي تعامل مع دمسو، كما هو موضح 17 . بعد تصوير الحيوانات، يتم نقلها إلى الدبابات دون أدوية ورصدها لنمو الورم لمدة شهرين. في المثال المقدم، يؤدي العلاج المثبط منظمة مجاهدي خلق في استجابة دائمة في الأسماك الكبار ( الشكل 3D ، لوحات اليمنى). لمزيد من التفاصيل حول العلاج من تعاطي المخدرات، والتصوير، والتقدير الكمي، انظر المرجع 17 .
الشكل 1: تخطيطي بروتوكول زرع الخلايا السرطانية في البطين الرابع من 2-دب الأجنة الزرد. التخطيطي العام للأبواب من 3 إلى 4 من البروتوكول بما في ذلك تحليلات نقطة النهاية البديلة (الأقسام 4.9-6)./55712/55712fig1large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الورم إنغرافتمنت والتقدم. (A) الزرع الأولية نس-بينت 17 الخلايا السرطانية المسمى مع مشيري تم زرعها في البطين الرابع من الأجنة 2-دبف. في 3 دبف، ينظر إلى الخلايا السرطانية غزو في أنسجة المخ المحيطة (السهام). في 8 دبف، والخلايا السرطانية تنمو في البطين. خلايا الورم الحمراء موجودة أيضا في أنسجة المخ المحيطة والكلى (النجمة). في 28 دبف، غزت الخلايا السرطانية وتنمو في جميع أنحاء الدماغ المضيف. (ب) اللوحة العلوية. سبعة أجنة 3-دب زرعها مع مشيري المسمى الزرد خلايا الورم الدماغ. يمكن زرع الخلايا السرطانية باستمرار في مئات الأجنة، مع ارتفاع معدلات إنغرافتمنت ( أي عادة 85/100 الأجنة). الأوسط ولوحات أسفل. ثلاثة أسماك البالغين ممثل مع الأورام المزروعة 4-8 أسابيع بعد الإخصاب (وف). الأورام يمكن تصور بواسطة المجهر مضان. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنة غزو الورم والاستجابة للمخدرات. ( A ) نس-بينتس 17 من السقف البصري أو المخيخ وصفت مع مشيري أو غفب، على التوالي، معالجتها في تعليق خلية واحدة، مختلطة معا في نسبة 1: 1، وشارك في زرعها في الأجنة 2-دبف. ( B ) A 6-دب جنين شارك في زرع مع تعليق مختلطة من غفب المسمى الخلايا السرطانية المخيخ والخلايا الورم مشيري المسمى من العظم البصري. الاختلافات في الخصائص الغازية لكل ورم في tهو نفسه المتلقي يمكن ملاحظتها باستخدام المجهر مضان. في هذا المثال، تهاجر خلايا الورم المسمى "مشيري" على نطاق أوسع من تلك التي تحمل علامة غفب (الأسهم). ( C ) الجدول الزمني للعلاج من تعاطي المخدرات على الأجنة زرعها مع الخلايا السرطانية. ( D ) صور الحيوانات التمثيلية في نهاية نظام العلاج (8 دبف) وفي 8 أسابيع بعد المعالجة (8 وف)، إما مع مراقبة دمسو أو 50 ميكرومتر ميك المانع. ويمكن قياس عبء الورم عن طريق قياس مضان، كما هو موضح 17 . في هذه التجربة، يتم تقليل نمو الخلايا السرطانية المسمى مشيري في أجنة الميكروبات المعالجة المثبطة ويترجم إلى استجابة دائمة في البالغين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
هذا البروتوكول تفاصيل مقايسة زرع بسيطة وفعالة التي تنطوي على حقن خلايا الورم الزرد في البطين من الجنين 2-دبف التي من شأنها تطوير جهاز المناعة المختصة بكامل طاقتها. وحتى الآن، الزرد نس-بينت 17 وسرطان الجلد (البيانات لا يظهر) تم زرعها بنجاح لدراسات طويلة الأجل لسلوك الخلايا السرطانية والغزو. الخطوات الحاسمة من هذا البروتوكول تشمل ضمان إبرة مناسبة حجم تتحمل والسليم تعليق الخلايا السرطانية والأجنة تخدير المضيف بما فيه الكفاية. لكل باحث على حدة، مزيد من التحسين من هذه التقنية قد تشمل تعديل تركيز الخلايا السرطانية، ضغط الحقن، والتوجه الجنين. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون هناك عدم التجانس في اللزوجة من تعليق الناشئة من الأورام المختلفة، لذلك أنواع ورم مختلفة قد يكون أكثر أو أقل صعوبة لإعادة تعليق وزرع. ومع ذلك، عن طريق ضبط حجم إبرة تتحمل واستخدام ديفالتخفيفات الإيجار من تعليق الورم، فمن الممكن للتغلب على الصعوبات المرتبطة لزوجة الورم.
في تجربتنا، والأسباب الأكثر شيوعا للخلايا متفرق / كتل الخلايا غير متناسقة في البطين هي كما يلي: 1) تعليق خلية الورم هو تمييع جدا. 2) إبرة تتحمل حجم صغير جدا. 3) وقت الحقن والضغط منخفضة جدا؛ و / أو 4) الأنسجة المتبقية لم تتم تصفيتها من الورم ويتم إيداعها في الإبرة. عندما يتدفق تعليق خلية الورم من البطين بعد الحقن، فمن المرجح بسبب: 1) وضع الإبرة ضد أرضية البطين. 2) ارتفاع ضغط الحقن والوقت؛ و / أو 3) إبرة تتحمل حجم كبير جدا. قد تكون ناجمة عن البقاء على قيد الحياة من الأجنة المزروعة: 1) الأجنة تخدير لفترة طويلة من الزمن. 2) ترك الأجنة على لوحة حقن لتجف. 3) حقن فقاعات الهواء في البطين. و / أو 4) ثقب الأعضاء الحيوية، مثل الدماغ والقلب، لأن إبرة ذهبت من خلال البطين.
الأساليب السابقة لزرع الورم في الدماغ الزرد أو الجنينية تعتمد على كبت المناعة في البالغين (وراثيا، صيدلانيا، أو عن طريق الإشعاع) أو تقتصر على الدراسات قصيرة الأجل من خلايا الإنسان أو الماوس في الأجنة 38 ، 43 ، 52 ، 53 ، 54 . على سبيل المثال، يمكن حقن أورام الدماغ الماوس داخل الأنف إلى ديكساميثازون مناعة، 30-دبف، الزرد الأحداث للاستخدام على المدى القصير (~ 2 أيام) فحوصات المخدرات قبل السريرية 54 . ومع ذلك، يتم حجب موقع الحقن في هذه التجارب من قبل أنسجة الجمجمة والدماغ، ومن المرجح أن يؤدي إلى تلف الأنسجة المخ الطبيعية، مما يقلل من جدوى المضيف والكفاءة إنغرافتمنت. طريقة أخرى وصفت مؤخرا ينطوي على حقن غليوب الإنسانخطوط الخلايا الماضومة في منطقة الدماغ المتوسط من الأجنة الزرد، مما مكن من تحليل على المدى القصير من النمو، والغزو، والاستجابة المخدرات 43 . مرة أخرى، الموقع الدقيق لموقع الحقن هو متغير ومن المرجح أن يضر الأنسجة العادية. وهكذا، فإن الأساليب السابقة لزرع الدماغ الجنينية غالبا ما تضر بقدرة المضيفين على البقاء، مما يحد من هذه الدراسات على التحليل القصير الأجل ( أي من يومين إلى 14 يوما)، مما يسبب زيادة في التباين بين الحقن الفردية بسبب مواقع الحقن المحجوبة، تحليل طويل الأجل للسلوكيات الخلوية واستجابات الأدوية أو إعادة زرع عبر أجيال متعددة.
الطريقة الموصوفة هنا يتناول القيود الحالية في الزرد الجنينية وتقنيات زرع المناعة للخطر عن طريق السماح للباحثين: 1) حقن بشكل متكاثر في نفس الموقع، مع الحد الأدنى من الأضرار التي لحقت الأنسجة المحيطة بها؛ 2) تصور مباشرة موقع الحقن لتعظيمكفاءة إنغرافتمنت؛ 3) زرع مئات من الأجنة يوميا. 4) تسمح الأورام أن تنمو في الحيوانات المناعية المختصة. 5) تسمح لرصد سلوك الخلايا السرطانية والاستجابات الدوائية دائمة على مدى حياة الزرد. و 6) تسمح لإعادة زرع الأورام على مدى أجيال عديدة للدراسات المحتملة على تطور الورم أو آليات الانتكاس المخدرات. وعلاوة على ذلك، فإن هذا البروتوكول يتيح للباحثين للاستفادة من أي النمط الجيني الزرد لتقييم استجابة المضيف، بما في ذلك السكان المناعي مختلفة. هذه السمات تجعل هذه الطريقة قابلة للتكيف بسهولة من قبل أي مختبر الذي يؤدي بالفعل ميكروينجكتيونس القياسية في الزرد. وأخيرا، في حين أن هذه الطريقة مثالية للحقن مثلي من أورام الدماغ الزرد، عند زرع أنواع الورم الأخرى، مثل الكبد أو البنكرياس، قد يكون موقع مثلي أكثر أهمية من الكفاءة المناعية (على سبيل المثال، إذا كان الباحث يدرس آثار انسجة المكروية على نمو الورم). في هذا السيناريو، ووضعت حديثا، ونماذج الزرد نقص المناعة قد يكون أكثر ملاءمة لأداء زرع الورم مثلي 11 .
وقد تم استخدام هذا البروتوكول لإجراء فحوصات المنافسة الخلايا السرطانية وحقن الأورام ذات العلامات المزدوجة. ونوقشت أيضا استراتيجية العلاج المحتملة لتقييم فعالية المركبات الكيميائية على الأورام، والذي ينطوي على علاج الأجنة بعد زرع عن طريق إضافة الدواء إلى الماء. كما تم الإبلاغ عن طريقة للعلاج خارج الجسم الحي من الخلايا السرطانية قبل زرع في وقت سابق 17 . بالإضافة إلى ذلك، تم تجميع الأورام المزروعة لعدة جولات من إعادة زرع، والتي سوف تكون مفيدة لدراسات تطور الورم والكيميائية 17 . حاليا، الدراسات ما قبل السريرية تعتمد على زينوغرافتس الماوس لتقييم فعالية المركبات المحتملة. ومع ذلك، فإن هذه الدراسات تستغرق وقتا طويلاومكلفة. وبالنظر إلى درجة عالية من الحفاظ على مسارات الجين المسرطنة بين الزرد والبشر 28 ، فمن المتوقع أن هذا الأسلوب سوف تكمل الفأر التقليدية ودراسات الخلايا البشرية للسماح لتحديد أكثر سرعة من المركبات الفعالة دخول التجارب السريرية والسريرية. في نهاية المطاف، يمكن لهذه الطريقة أن تكون مفيدة للفحص الكيميائي السريع للأورام المريض الأولية، والتي يمكن أن تدفع إلى دفع مبادرة الطب شخصية. ومع ذلك، فإن الظروف للنمو على المدى الطويل من الخلايا البشرية في الزرد (الكبار أو الجنين) لا تزال بحاجة إلى تحديدها.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر اثنين من المراجعين لاقتراحات وتحسينات ممتازة للمخطوطة. كما نشكر معهد هانتسمان للسرطان / جامعة يوتا لتربية الحيوانات والصيانة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الجمعية الأمريكية للسرطان (# 124250- رسغ-13-025-01-كسم)، ومنحة المعاهد الوطنية للصحة (P30 CA042014 كر)، وجامعة يوتا البذور منحة، ومؤسسة السرطان هنتسمان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
| 50 mL beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
| Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
| Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
| Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
| Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
| Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
| 1,000 µL filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
| 100 µL filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
| 50 mL conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
| 15 mL conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
| 1.7 mL microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
| Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
| Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
| Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
| Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
| Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
| Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
| Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
| Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
| Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
| Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
| Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
| Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
| Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
| Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
| PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
| 12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
| Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
| Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
| N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |
References
- Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer. Mol Ther. 10 (6), 1032-1042 (2004).
- Stephen, R. M., et al. Monitoring the development of xenograft triple-negative breast cancer models using diffusion-weighted magnetic resonance imaging. Exp Biol Med. 237 (11), 1273-1280 (2012).
- Deroose, C. M., et al. Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined small-animal PET, small-animal CT, and bioluminescence imaging. J Nucl Med. 48 (2), 295-303 (2007).
- Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).
- Johnson, J. I., et al. Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials. Br J Cancer. 84 (10), 1424-1431 (2001).
- Kerbel, R. S. Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans - Better than commonly perceived - But they can be improved. Cancer Biology & Therapy. 2 (4), S134-S139 (2003).
- Scholz, C. C., Berger, D. P., Winterhalter, B. R., Henss, H., Fiebig, H. H. Correlation of Drug Response in Patients and in the Clonogenic-Assay with Solid Human Tumor Xenografts. Eur J Cancer. 26 (8), 901-905 (1990).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Cho, S. Y., et al. An Integrative Approach to Precision Cancer Medicine Using Patient-Derived Xenografts. Mol Cells. 39 (2), 77-86 (2016).
- Hiroshima, Y., et al. Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy. Oncotarget. 7 (44), 71696-71702 (2016).
- Moore, J. C., Langenau, D. M. Allograft Cancer Cell Transplantation in Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916, 265-287 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Dranoff, G. Experimental mouse tumour models: what can be learnt about human cancer immunology. Nat Rev Immunol. 12 (1), 61-66 (2011).
- Richmond, A., Su, Y. Mouse xenograft models vs GEM models for human cancer therapeutics. Dis Model Mech. 1 (2-3), 78-82 (2008).
- Bernard, D., Peakman, M., Hayday, A. C. Establishing humanized mice using stem cells: maximizing the potential. Clin Exp Immunol. 152 (3), 406-414 (2008).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Modzelewska, K., et al. MEK Inhibitors Reverse Growth of Embryonal Brain Tumors Derived from Oligoneural Precursor Cells. Cell Rep. 17 (5), 1255-1264 (2016).
- Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Curr Biol. 15 (3), 249-254 (2005).
- Dovey, M., White, R. M., Zon, L. I. Oncogenic NRAS cooperates with p53 loss to generate melanoma in zebrafish. Zebrafish. 6 (4), 397-404 (2009).
- Santoriello, C., et al. Kita driven expression of oncogenic HRAS leads to early onset and highly penetrant melanoma in zebrafish. PLoS One. 5 (12), e15170 (2010).
- Park, S. W., et al. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
- Liu, S., Leach, S. D. Screening pancreatic oncogenes in zebrafish using the Gal4/UAS system. Methods Cell Biol. 105, 367-381 (2011).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
- Langenau, D. M., et al. Cre/lox-regulated transgenic zebrafish model with conditional myc-induced T cell acute lymphoblastic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 6068-6073 (2005).
- Sabaawy, H. E., et al. TEL-AML1 transgenic zebrafish model of precursor B cell acute lymphoblastic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15166-15171 (2006).
- Chen, J., et al. NOTCH1-induced T-cell leukemia in transgenic zebrafish. Leukemia. 21 (3), 462-471 (2007).
- Feng, H., et al. Heat-shock induction of T-cell lymphoma/leukaemia in conditional Cre/lox-regulated transgenic zebrafish. Br J Haematol. 138 (2), 169-175 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Li, P., White, R. M., Zon, L. I. Transplantation in zebrafish. Methods Cell Biol. 105, 403-417 (2011).
- Traver, D., et al. Effects of lethal irradiation in zebrafish and rescue by hematopoietic cell transplantation. Blood. 104 (5), 1298-1305 (2004).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5 (3), 383-394 (2010).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Tenente, I. M., Tang, Q., Moore, J. C., Langenau, D. M. Normal and malignant muscle cell transplantation into immune compromised adult zebrafish. J Vis Exp. (94), (2014).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Geiger, G. A., Fu, W., Kao, G. D. Temozolomide-mediated radiosensitization of human glioma cells in a zebrafish embryonic system. Cancer Res. 68 (9), 3396-3404 (2008).
- Kitambi, S. S., et al. Vulnerability of glioblastoma cells to catastrophic vacuolization and death induced by a small molecule. Cell. 157 (2), 313-328 (2014).
- Lally, B. E., et al. Identification and biological evaluation of a novel and potent small molecule radiation sensitizer via an unbiased screen of a chemical library. Cancer Res. 67 (18), 8791-8799 (2007).
- Vittori, M., Motaln, H., Turnsek, T. L. The study of glioma by xenotransplantation in zebrafish early life stages. J Histochem Cytochem. 63 (10), 749-761 (2015).
- Yang, X. J., et al. A novel zebrafish xenotransplantation model for study of glioma stem cell invasion. PLoS One. 8 (4), e61801 (2013).
- Zhao, H., Tang, C., Cui, K., Ang, B. T., Wong, S. T. A screening platform for glioma growth and invasion using bioluminescence imaging. Laboratory investigation. J Neurosurg. 111 (2), 238-246 (2009).
- Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Dis Model Mech. 9 (9), 1063-1065 (2016).
- Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126 (17), 3757-3767 (1999).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- Solin, S. L., Shive, H. R., Woolard, K. D., Essner, J. J., McGrail, M. Rapid tumor induction in zebrafish by TALEN-mediated somatic inactivation of the retinoblastoma1 tumor suppressor rb1. Sci Rep. 5, 13745 (2015).
- Ju, B., et al. Oncogenic KRAS promotes malignant brain tumors in zebrafish. Mol Cancer. 14, (2015).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. J Vis Exp. (96), e52540 (2015).
- Rampazzo, E., et al. Wnt activation promotes neuronal differentiation of glioblastoma. Cell Death Dis. 4, (2013).
- Lal, S., La Du,, Tanguay, J., L, R., Greenwood, J. A. Calpain 2 is required for the invasion of glioblastoma cells in the zebrafish brain microenvironment. J Neurosci Res. 90 (4), 769-781 (2012).
- Eden, C. J., et al. Orthotopic models of pediatric brain tumors in zebrafish. Oncogene. 34 (13), 1736-1742 (2015).
