Summary
암 세포의 이식은 암 기전과 치료 반응의 확인에 중요한 도구입니다. 현재의 기술은 면역 기능이없는 동물에 달려 있습니다. 여기, 우리는 종양 세포 행동과 생체 내 약물 반응의 장기 분석을위한 면역 능력이있는 배아에 zebrafish 종양 세포를 이식하는 방법을 설명합니다.
Abstract
종양 세포 이식은 암세포 성장, 이동 및 숙주 반응을 제어하는 메커니즘을 정의하고 치료에 대한 잠재적 인 환자 반응을 평가하는 중요한 기술입니다. 현재의 방법은 종양 이식편의 거부를 피하기 위해 동종 또는 면역 저하 동물을 사용하는 것에 크게 의존합니다. 이러한 방법은 종종 면역 - 종양 세포 상호 작용의 분석을 방해하거나 특정 유전 적 배경으로 제한되는 특정 유전 변종의 사용을 필요로합니다. zebrafish의 다른 방법은 종양 세포를 단기 검사 ( 즉, 3 ~ 10 일)에 사용하기 위해 이식 한 3 일 전에 배아 뇌에서 불완전하게 발달 된 면역 시스템을 이용합니다. 그러나, 이러한 방법은 종양 세포의 행동과 약물 반응에 대한 장기적인 연구를 방해하는 숙주의 치사율을 유발합니다. 이 프로토콜은 zebrafish 뇌종양 조직의 장기간 동위 원소 이식을위한 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다.2 일 된 면역 기능을 갖춘 제브라 피쉬의 제 4 뇌실로 옮긴다. 이 방법은 1) 침입 및 보급과 같은 종양 세포 행동의 장기 연구; 2) 마약에 대한 내성 종양 반응; 및 3) 종양 진화 및 / 또는 상이한 숙주 유전 적 배경의 영향 연구를위한 종양의 재 이식. 요약하면이 기술을 통해 암 연구원은 먼 곳에서의 생착, 침입 및 성장을 평가할 수있을뿐 아니라 여러 달 동안 화학 스크린 및 세포 경쟁 분석을 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 종양 유형의 연구로 확장 될 수 있으며 chemoresistance 및 전이의 메커니즘을 명료하게하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
종양 세포를 면역이 손상된 동물, 특히 마우스 이종 이식 물에 이식하는 것은 암세포 증식 1 , 2 , 생존, 침입 및 전이 3 , 4 를 제어하는 메커니즘을 연구하고 플랫폼을 제공하는 데 널리 사용되는 기술이다 약물 검사 5 , 6 , 7 . 최근 면역 원성 손상된 마우스에 일차 종양 샘플을 이식하는 것은 진단 및 전임상 약물 스크리닝 목적을위한 환자 유래 이종 이식 (PDX) 모델을 생성하는 데 사용되어 왔으며 개인 맞춤 의학 이니셔티브의 백본입니다 8 , 9 , 10 , 11 . 그러나, 중요한 증거는 면역 체계를 조절한다는 것을 보여줍니다줄기는 종양의 행동과 환자의 결과에 큰 영향을 미칠 수 있습니다 12 , 13 . 이것은 이종 이식 기술의 재 설계를 주도하여 인간 면역계와 종양 세포를 공동 이식함으로써 마우스의 면역계가 재구성되는 "인간화 된"쥐를 포함하도록 유도했다. 그러나이 방법은 기술 비용과 함께 다양한 재현성 및 독성으로 기술적으로 어려움이 있습니다 14 , 15 . 따라서 암 전이 및 약물 반응에 대한 면역 및 종양 특이 적 기전의 발견을 가속화시키기 위해서는 면역력이있는 동물에서의 새로운 이식 기술이 필요하다.
Zebrafish는 인간 암 연구를위한 대체 동물 모델입니다. 20 가지 이상의 암 모델이 현재 16 가지 로 확립되었습니다. 악성 뇌 17 , mela noma 18 , 19 , 20 및 췌장암 21 , 22 뿐만 아니라 많은 백혈병 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . zebrafish 시스템의 두 가지 특성은 암 연구에 특히 적합합니다. 1) 반투명 동물의 광학 투명도는 간단한 현미경 기술을 사용하여 암 세포 행동 ( 즉, 증식, 생존, 침입 및 보급)을 직접 시각화 할 수 있으며 2) 여성 제브라 피쉬는 하루에 최대 200 개의 배아를 생산할 수 있기 때문에 저렴한 비용으로 유전이나 약물 검사를위한 동물 수를 신속하게 조정할 수 있습니다. 또한, 제브라 피쉬 (zebrafish)와 인간의 암 게놈은 (암 유전자와 종양 억제 유전자를 포함한) 고도로 보존되어 있으며,f "> 28, 기계적 및 약물 발견이 포유류 시스템으로 신속하게 전환 될 수 있도록 해줌으로써 zebrafish는 이미징, 확장 성 및 시스템 비용의 이점을 취하는 이식 기술을위한 이상적인 동물 모델이됩니다.
면역 손상된 제브라 피시의 종양 이식 연구는자가 재생 능력, 종양 악성 종양 및 침입 / 보급을 확인하는 데 도움을주었습니다 11 , 29 . 종양 세포 행동에 대한 단기 연구는 면역 체계가 ~ 20 일 동안 효과적으로 억제 된 γ- 선 조사 된 성인에게 이식 한 후에 수행 될 수있다. 성인 제브라 피쉬의 dexamethasone 처리는 거부 반응이 일어나기 30 일 전부터 B 세포와 T 세포를 억제합니다 31 . 또 다른 덜 일반적인 전략은 클론 제브라 피스 균주를 사용합니다면역 능력이있는 숙주에서 장기간 조사가 가능합니다. 그러나 제한된 수의 클론 균주가 생성되었고 낮은 생산성으로 인해 유지하기가 어렵습니다. 또한, 확립 된 제브라 피쉬 종양 모델의 대부분은 다른 유전 적 배경에서 생성되므로 이러한 종양은 면역 계통을 억제하지 않고 클론 균주에 이식 할 수 없습니다. 장기 이식 연구를 개선하기위한보다 최근의 접근법으로는 여러 암 35,36 을 성공적으로 이식하기 위해 사용 된 손상된 B 세포 및 T 세포 기능을 가진 rag2 E450fs 돌연변이 계통의 개발이 포함됩니다. 클론 제브라 피쉬 라인이나 면역이 손상된 숙주에 대한 요구를 피하기 위해 많은 그룹이 초기 단계의 배아를 사용했습니다 ( 즉, > 72 hpost-fertilization (hpf))에 대한 적응증이 아직 없다.이 배아는 아직 적응 면역계를 완전히 개발하지 못했기 때문에 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 . 그러나이 방법은 인간 암세포 또는 이식 기술 자체가 숙주를 사멸시켜 장기간의 연구와 재 이식을 방지하기 때문에 종양 세포 행동 또는 약물 반응 (일반적으로 2 주 미만)에 대한 단기 분석으로 제한됩니다.
이 프로토콜은 수정 된 배아 이식 방법을 배아 이틀 후 수정 (dpf) 뇌의 네 번째 뇌실 루멘에 자세히 설명합니다. 그것은 숙주에 대한 독성을 최소화하고 종양 세포의 장기 생장을위한 zebrafish 뇌종양 모델과 결합 될 수 있습니다. 따라서,이 기술은숙주 / 면역 반응, 약물 반응 또는 전이 잠재성에 대한 향후 연구를 촉진하여 여러 세대에 걸쳐 종양 세포를 새로운 숙주로 재 이식 할 수있는 기회를 제공합니다. 이 방법은 또한 단순하고 효율적이며 확장 성이 뛰어나며 최대 90 %의 생착율로 하루에 단일 사용자가 최대 300 회의 이식을 수행 할 수 있습니다. 이것은 유전자 또는 약물 스크리닝 프로젝트를 위해 2 dpf의 수백 개의 배아로 단일 원발 종양을 빠르게 번식 시키거나 수개월에 걸쳐 다른 숙주 배경에서 뇌종양 세포 행동을 직접 시각화 할 수 있습니다.
Protocol
모든 동물 절차는 유타 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC # 16-03019)의 동물 관리 지침에 따라 승인 및 준수되었습니다.
1. 마이크로 인젝션 장비 준비
- 주입 판 준비.
- 달걀 물 (역삼 투 물 0.6g / L 수족관 염 + 0.01mg / L 메틸렌 블루)에 용해 된 1.2 % 아가로 오스의 50 ML 솔루션을 준비합니다. 아가로 오스가 녹을 때까지 용액을 끓인 다음 0.05 mg / L 메틸렌 블루를 첨가하여 보충하십시오. 최종 용액 25 mL를 10 cm 페트리 접시에 붓고 고화시킨다. 단계 1.1.2 준비 때까지 42 ° C 수 욕조에 아가로 오스 솔루션의 나머지 25 ML을 놓습니다.
- 응고 된 표면의 중심에 2 인치 직경의 비커를 설정하고 나머지 25 ML의 1.2 % 아가로 오스를 부어.
참고 : 이것은 플레이트의 주변에 주입 표면을 만들고 중앙에 코어를 생성합니다.바늘 크기와 종양 현탁액의 일관성을 테스트 할 수있는 영역을 제공합니다.- 주입 전에 최소 30 분 동안 28 ° C에서, 또는 장기 보관을 위해 4 ° C에서 사출 플레이트를 유지하십시오.
- 주사 바늘 준비.
- 외경 1.2 mm, 내경 0.9 mm (필라멘트 없음)의 10 cm 모세관을 바늘 풀러에있는 두 개의 바늘로 당겨 바늘을 만듭니다.
참고 : 각 바늘은 총 길이가 약 6cm인데, 약 1.5cm의 끝이 가늘어집니다. - 조심스럽게 플라스틱 파라핀 필름에 싸여있는 현미경 슬라이드에 바늘을 놓습니다. 면도날을 사용하여 45 ° 각도로 바늘 끝 부분을 자르고 팁이있는 바늘을 만듭니다.
참고 : 일반적으로 바늘 끝 0.1 mm ~ 0.3 mm가 제거됩니다. 경 사진 팁은 주사를 수행 할 필요가 없습니다.
- 외경 1.2 mm, 내경 0.9 mm (필라멘트 없음)의 10 cm 모세관을 바늘 풀러에있는 두 개의 바늘로 당겨 바늘을 만듭니다.
- 마이크로 인젝션 설정을 준비하십시오.
- <> 입체 현미경, 조작자 및 이식을위한 마이크로 인젝터를 포함하여 표준 마이크로 주입 설정을 구성하십시오.
2. 이식 준비 배아
- 45 ° C의 배양기에서 45 개의 mitfa w2 배아 44 (또는 사용자가 정의한 다른 모든 제브라 피쉬 유전자형의 배아)를 수집하고 45 로 유지한다.
- 달걀 물로 희석 10 MG / ML 프로 테아 제 칵테일 솔루션 100 μL를 추가하여 24 hpf에서 태아를 Dechorionate하고 약 20 분 부드럽게 흔들. 신선한 알맹이 물로 배아를 3 번 씻어 잔류 프로테아제를 제거하십시오.
- 표준 발병 시리즈 기준 45 에 의해 정의 된 바와 같이 적절한 발달 단계에 대해 48 hpf로 배아를 선별합니다.
참고 : 이식을 위해서는 올바르게 준비된 형태 학적으로 정상적인 배아를 사용해야합니다. - 마취하다페트리 접시에 0.002 %의 Tricaine-S를 함유 한 난 수에 약 48 hpf의 태아. 움직임의 중지를 관찰하여 적절한 마취를 확인하십시오.
3. 종양 세포 현탁액 만들기
참고 : Zebrafish 뇌종양 모델은 종양 유전자 및 종양 억제 유전자 17 , 46 , 47의 조합을 유전자 조작하여 생성 할 수 있습니다. 여기에서 최근에 기술 된 바와 같이, sox10 프로모터 구동 NRAS WT , p53 zdf1 / zdf1 CNS-PNET 제브라 피쉬 모델이 사용되었다.
- IACUC 승인 프로토콜에 따라 0.4 % Tricaine-S 과량 투여 후 얼음물에 담가 두어 종양이 전 체 크기의 약 20 % 인 뇌 종양이있는 물고기를 안락사하십시오.
- 형광 아래에 면도날과 족집게와 형광 염색 종양을 해부현미경으로 멸균 기술을 사용하고 1x 인산 버퍼 식염수 (PBS) 5 ML에 넣으십시오.
참고 : 정확한 해부 방법은 사용자 정의되며 종양 유형 및 조직 위치에 따라 다릅니다. 다른 제브라 피쉬 기관 및 뇌종양의 해부에 대한 자세한 절차는 나열된 참고 자료를 참조하십시오 17 , 48 . - 균일하고 흐린 용액이 생길 때까지 p1000 피펫을 사용하여 종양 질량을 수동으로 파괴하십시오. 피펫 팁 또는 40 μm 셀 스트레이너를 사용하여 큰 미립자를 제거합니다 (종양에 따라 다릅니다). 현탁액을 실온에서 290 xg로 5 분간 원심 분리하고 상등액을 제거한다.
참고 : 종양 세포를 분리하기 위해 형광 활성 세포 선별 (FACS)을 수행하지 않습니다. 이것은 간질, 면역 및 종양 세포의 이종 인구의 이식을 허용합니다. - 멸균 PBS 100 μL에 종양 세포 펠렛을 Resuspend 1.5 ML 마이크로로 전송원심 분리기 튜브. 세포 현탁액 5 μL를 취해 PBS 250 μL로 희석한다. hemocytometer를 사용하여 세포의 수를 계산합니다. 290 XG에서 3 분 동안 현탁액을 원심 분리하고, 뜨는을 제거하고 원하는 세포 농도를 얻기 위해 멸균 PBS에 펠렛을 resuspend.
참고 : 일반적으로 멸균 PBS 30-40 μL에 resuspended 세포는 점성과 불투명 (세포 농도 ≥ 100 세포 / NL)이며 가장 성공적인 이식을 생성하는 경향이 솔루션을 얻을 수 있습니다. 세포 생존력은 평가되지 않습니다. - 이식 절차 동안 28 ° C 열 블록에 종양 현탁액을 저장하십시오.
4. 종양 현탁액을 2-dpf 태아의 제 4 심실에 주입
- 전송 피펫을 사용하여 10-20 마취 된 태아 (단계 2.4에서)를 주사판의 주변으로 옮기십시오. 배아는 사출 판에 옆으로 떨어지고 심실은 명확하게 보이고 접근 가능해야한다.. 각진 프로브를 사용하여 필요에 따라 배아를 조정하고 사출 플레이트의 바깥 쪽 가장자리에서 멀리 배치하십시오.
- 겔로드 피펫 팁을 사용하여 주사 바늘에 종양 세포 현탁액의 1-2 μL를로드하고 manipulator에 바늘을 삽입합니다.
- 바늘을 45 ° 각도로 잡고 조종기를 수동으로 내립니다. 바늘이 배아 머리의 바로 위에 있고 약 5mm 때까지 x, y 및 z 방향으로 micromanipulator의 손잡이를 조정합니다. stereomicroscope의 eyepieces을 통해 봐 천천히 바늘이 배아의 넷째 뇌실을 관통 때까지 x 방향으로 micromanipulator를 조정합니다. 바늘이 심장이나 노른자를 뚫지 못하게하십시오.
- 종양 세포 현탁액을 주입하기 위해 마이크로 인젝터에 부착 된 발 페달을 밉니다.
참고 : 사출 압력과 시간은 니들 보어 크기에 따라 다르지만 좋은 출발점은 5 - 10 PSI와 50 - 100 ms입니다.주입 된 종양 세포의 부피는 원하는 경우 광유에 주입하여 표준 오일 드롭 기법으로 평가할 수 있습니다. 대개 0.1mm의 낙하 직경을 가진 500pL의 주사가 최상의 결과를 제공합니다.
- 종양 세포 현탁액을 주입하기 위해 마이크로 인젝터에 부착 된 발 페달을 밉니다.
- 부드럽게 주입 접시에서 주입 배아와 신선한 계란 물을 사용하여 배양 접시로 씻어. 나머지 절차를 위해 또는 그들이 탱크에서 자랄 때까지 (4.9.1 단계에 설명 된대로) 난수에 배아를 유지하십시오.
- 형광 stereomicroscope에서 주입 된 배아를 검사합니다. 주입 압력, 각도, 바늘 크기 및 세포 현탁액 점도가 종양 세포가 심실 공간의 25-50 %를 채우는 결과를 가져 오는 지 확인하십시오. 필요한 경우이 매개 변수를 조정하십시오.
- 남아있는 모든 배아에 대해 4.1-4.5 단계를 반복하십시오. 필요에 따라 추가 배아를 마취 (2.4 단계에서 설명).
참고 : 숙련 된 사용자는 3-4 시간에 최대 300 개의 배아를 주입 할 수 있습니다. - 배아를 다시 넣으십시오.밤새 28 ° C 배양기.
- 다음날, 정상적인 심장 및 뇌 발달과 같은 형태 학적 및 생리 학적 특징을 조사하여 배아 생존을 평가한다.
- 선별을 위해, 이식 후 1 일 (dpt)에 단계 2.4에서 설명한대로 배아를 마취시킨다.
- 페트 접시의 중간에 4 % 메틸 셀룰로오스를 추가하려면 전송 피펫을 사용하고 methylcellulose 드롭에 배아를 추가합니다. 형광 현미경을 사용하여 일관된 engraftment 크기에 대한 각도 프로브와 화면을 사용하여 배아 (광원쪽으로 직면 복부 쪽)을 동양. 심실에 국한되지 않은 종양 세포 또는 심실 공간의 25 % 미만을 차지하는 종양 세포를 포함하는 모든 배아를 제거하십시오.
참고 : 일관된 이식은 심실 공간의 25-50 %를 포함하는 단일 종양 질량을 갖는 배아로 정의됩니다. 스크리닝 목적으로 형광을 사용하십시오.1X 대물 렌즈, 0.15 개구 수, 0.7-1.6X 범위의 배율 및 50ms ~ 1 초의 노출 시간을 갖는 현미경. 모든 이미지의 경우 GFP 또는 RFP 채널 외에도 명 시야 채널을 사용하십시오. - 종양 유지를 위해 이식 한 배아를 탱크에 넣고 8 dpf (6 dpt)로 성장시킵니다.
- 페트 접시의 중간에 4 % 메틸 셀룰로오스를 추가하려면 전송 피펫을 사용하고 methylcellulose 드롭에 배아를 추가합니다. 형광 현미경을 사용하여 일관된 engraftment 크기에 대한 각도 프로브와 화면을 사용하여 배아 (광원쪽으로 직면 복부 쪽)을 동양. 심실에 국한되지 않은 종양 세포 또는 심실 공간의 25 % 미만을 차지하는 종양 세포를 포함하는 모든 배아를 제거하십시오.
5. 세포질 행동을위한 이식 된 배아
- 1.2 % 낮은 용융 아가로 오스에서 3-8 dpf (1 ~ 6 dpt) 및 마운트 (coverslip에 직면 등)에있는 태아를 마취. 필요에 따라 마이 그 레이션, 세포 분열 또는 세포 - 세포 상호 작용과 같은 세포 행동을 시각화하기 위해 원하는 시간 동안 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경을 사용하여 장착 된 배아의 저속 이미징을 수행하십시오 38 , 43 , 53 .
참고 : 가로 세로 비율 1,024 x 1,024, 스캔 속도 8 &181; s / 픽셀. 스캔 평균화를 사용하고 전체 종양 질량 (1,000-1,500 μm)을 포착 할 수 있도록 z 깊이 치수를 정의하십시오. 또한 40 배 목표를 사용하여 10-15 분마다 이미지를 수집하여 침입 행위를 모니터링하는 4 시간 저속 실험을 수행하십시오. 검출기 감도는 종양 질량의 강도에 따라 달라지며 레이저 출력은 현미경에 따라 다르지만 일반적으로 15 ~ 40 % 인 것이 좋습니다. - 이미징이 완료되면 각도 프로브를 사용하여 아가로 오스에서 장착 된 배아를 무료로 신선한 계란 물로 페트리 접시로 전송합니다.
6. 이식 된 태아에 대한 약물 투여 및 종양 부담 평가 17
- 3 dpf에서 태아를 마취하고 복부 쪽이 광원을 마주보고 4 % 메틸 셀룰로즈에서 그들을 배향. 형광 현미경을 사용하여 전처리 배아 이미지 17 .
- Pla12 웰 플레이트에 3 dpf의 이식 배아를 넣고 0.5 ml의 난수에 10 개의 배아를 넣는다. 원하는 최종 농도 ( 예 : 50 μm의 MEK 억제제)를 얻기 위해 약물의 적절한 금액을 추가하고 28 ° C 배양기로 배아를 반환합니다. 다음날, 얇은 구멍이있는 이송 피펫으로 약물 처리 된 난수를 제거하고 신선한 처리를하십시오. 배아가 8 dpf에 도달 할 때까지 매일 이것을 반복하십시오.
- 8 dpf에서 약물 치료에서 배아를 제거하고 신선한 계란 물에 그들을 놓으십시오. 배아를 마취하고 4 % 메틸 셀룰로오스 (광원쪽으로 향한 복부 쪽)을 동양. 형광 현미경을 사용하여 이미지 배아 사후 치료. 설명 된대로 적절한 소프트웨어를 사용하여 종양 영역을 정량화하십시오.
- 처리 당 적절한 배아를 분리하고 성장 탱크에 그들을 놓으십시오. 4-9 주 후, 물고기를 마취하고 표준 형광 stereomicroscope를 사용하여 전반적인 종양 부담을 평가합니다.17 살이된다.
Representative Results
종양 이식 및 생식
절차의 개략적 인 개요가 그림 1 에 나와 있습니다. Fluorescently 레이블이 종양 세포는 기본 장기 사이트에서 추출하고, 단일 세포 현탁액은 2-dpf mitfa w2 zebrafish 배아의 네 번째 뇌실로 이식을 위해 생성됩니다. 그림 2 는 중추 신경계 원시 신경 외배엽 종양 (CNS-PNET)의 zebrafish 모델을 사용하여이 방법의 대표 결과를 보여 주며, sox10 프로모터는 p53이 부족한 과발성 전구 세포에서 mCherry에 융합 된 야생형 NRAS 또는 활성화 된 NRAS의 발현을 유도합니다 17 . melanophores가없는 mitfa w2 zebrafish 44 돌연변이는보다 쉽게 시각화하기 위해 사용되었습니다이식 후 종양 세포 및 / 또는 성인기까지. 캐스퍼 ( Canper ) 50 과 같은 추가적인 이미징 선명도를 제공하기 위해 다른 안료 돌연변이 체도 사용할 수 있습니다. 24 시간 이식 후 조기에 종양 세포가 주변 뇌 조직으로 침투하는 것을 볼 수 있습니다 ( 그림 2A , 3 dpf, 화살표). 종양 이식편은 다음주에 심실 및 주변 뇌 조직에서 계속 성장합니다 ( 그림 2A , 8dpf). 이 시점에서 형광도 신장 부위에서 관찰 될 수 있습니다 ( 그림 2A , 별표). 이것은 신장 기능을 평가하기위한 분석법으로 형광 염료를 사용하는 이전 연구와 일치하는 이식에서 세포 파편을 필터링하는 신장 때문일 수 있습니다. 종양 세포는 지속적으로 증식하고 침투하므로 28 dpf만큼 제브라 피시 뇌 ( 그림 2A , 28 dpf)에서 종괴가 관찰됩니다.
그림 2B 의 상단 패널에 표시됩니다. 종양 생식은 일반적으로 배아의 80-90 %에서 이루어지며 종양 이식은 성인기까지 지속됩니다. 세 가지 대표적인 예가 그림 2B 의 하단 패널에 표시됩니다. 이것은 종양 이식이 수 세대 동안 수확되고 동결되거나 다시 이식되는 것을 허용합니다.
종양 침입 및 약물 반응
도 3A 는 GFP (종양 A) 또는 mCherry (종양 B)로 표지 된 2 개의 상이한 종양이 whole-tum에 의해 수확되는 공동 이식 계획을 나타낸다또는 해리 (여기서는 FACS는 사용되지 않지만 필요할 경우 FACS로 분류 된 종양 세포를 사용할 수 있음). 종양 A와 종양 B는 서로 다른 위치에 있거나 서로 다른 종양 유전자로 유도되거나 다른 유전 적 배경으로 유도 될 수 있습니다. 각 종양을 단일 세포 현탁액으로 가공 한 다음 종양 세포를 1 : 1 비율로 함께 혼합하여 2-dpf 배아에 이식합니다. 종양 A 대 종양 B의 생착, 성장, 침입 및 보급과 같은 종양 특성이 기술 및 유전 적 배경에 대한 내부 통제를 허용하는 동일한 숙주에서 관찰 될 수있다.
그림 3B 에서, 광학 tectum의 NRAS 구동 mCherry로 표지 된 zebrafish CNS-PNET과 소뇌의 GFP 표지 CNS-PNET을 수확하여 단일 세포 현탁액으로 처리했습니다. 세포 수를 세고 각 종양의 동일한 수의 세포를 함께 혼합하고 2-dpf 배아에 이식했다. 4 d이식 후, 공여 현미경으로 배아를 영상화 하였다. tectum 종양 세포 (적색)가 소뇌 종양보다 숙주 뇌 (화살표)로 더 광범위하게 이동한다는 것을 입증하는 대표적인 배아가 보여진다.
형광으로 표지 된 종양 세포로 이식 된 태아는 종양 성장을 억제하는 화합물을 동정하기 위해 약물 치료 요법에 사용될 수있다. 도 3C 는 종양 이식 치료 및 이미징을위한 전형적인 타임 라인이다. 24 시간의 이식 후 배아는 일관된 생착 크기로 접근하고 치료 그룹으로 나누어진다. 제공된 예에서, NRAS로 구동 된 mCherry로 표지 된 제브라 피시 CNS-PNETs를 이식 한 태아를 50 μM 디메틸 술폭 사이드 (DMSO) 또는 MEK 저해제 (AZD6244)로 치료합니다. 배아는 5 일 동안 처리되고 그림 3C 에 설명 된대로 8 dpf에서 이미징됩니다. 그림 3D (왼쪽 패널) 2 마리의 치료군에서 나온 동물. MEK 억제제 처리 배아는 설명 된 바와 같이 DMSO로 처리 한 배보다 훨씬 적은 양의 형광을 갖는다. 동물을 이미지화 한 후 약물없이 탱크로 옮기고 2 개월 동안 종양 성장을 모니터합니다. 제공된 예에서, MEK 억제제 처리는 성인 물고기에서 내구성있는 반응을 일으킨다 ( 도 3D , 우측 패널). 약물 치료, 이미징 및 부량에 대한 자세한 내용은 참조 문헌 17을 참조하십시오.
그림 1 : 2-dpf Zebrafish 태아의 제 4 심실 내 종양 세포 이식의 프로토콜 도식. 대체 종말점 분석 (섹션 4.9-6)을 포함한 프로토콜의 섹션 3에서 4까지의 일반적인 개략도./55712/55712fig1large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 종양 이식과 진행. (A) mCherry로 표지 된 Zebrafish의 1 차 CNS-PNET 17 종양 세포를 2-dpf 배아의 제 4 뇌실로 이식 하였다. 3 dpf에서 종양 세포가 주변 뇌 조직으로 침입하는 것으로 나타납니다 (화살표). 8 dpf에서 종양 세포는 심실에서 자라고 있습니다. 적색 종양 세포는 주변의 뇌 조직과 신장 (별표)에도 존재합니다. 28 dpf에서 종양 세포는 숙주 뇌 전체에 침투하여 성장합니다. (B) 상부 패널. 7 개의 3-dpf 배아에는 mCherry로 표지 된 제브라 피시 뇌종양 세포가 이식되었습니다. 종양 세포는 수백 개의 배아에 지속적으로 이식 할 수 있으며 높은 생착률 ( 즉, 일반적으로 85/100 배)이 있습니다. 중간 및하단 패널. 수정 후 4-8 주간 이식 된 종양을 가진 3 명의 대표적인 성인 생선 (wpf). 종양은 형광 현미경으로 시각화 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도표 3 : 종양 내습과 약 반응을 비교하십시오. ( A ) 시신경 또는 소뇌의 CNS-PNETs 17 은 각각 mCherry 또는 GFP로 표지하고, 단일 세포 현탁액으로 가공하고, 1 : 1 비율로 함께 혼합하고, 2-dpf 배아에 공동 이식한다. ( B ) 광학 tectum에서 GFP - 라벨 소뇌 종양 세포와 mCherry 분류 종양 세포의 혼합 현탁액을 공동 이식 6-dpf의 배아. t에서 각 종양의 침입 성질의 차이그는 형광 현미경을 사용하여 동일한 수령인을 관찰 할 수 있습니다. 이 예에서 mCherry로 표지 된 종양 세포는 GFP로 표지 된 종양 세포보다 더 광범위하게 이동합니다 (화살표). ( C ) 종양 세포로 이식 된 배아에 대한 약물 치료의 타임 라인. ( D ) DMSO 대조군 또는 50 μM MEK 억제제가있는 치료 요법 (8 dpf) 및 치료 후 8 주 (8 wpf)에서의 대표 동물 이미지. 종양 부담은 설명 된 바와 같이 형광을 정량화하여 측정 할 수 있습니다 17 . 이 실험에서 mCherry 표지 된 종양 세포의 성장은 MEK 억제제로 처리 한 배아에서 감소되어 성인에서 내구성있는 반응으로 전환됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 프로토콜은 완벽하게 유능한 면역계를 개발할 2-dpf 배아의 심실에 제브라 피쉬 종양 세포를 주입하는 과정을 포함하는 간단하고 효율적인 이식 법을 상세히 설명합니다. 지금까지 zebrafish CNS-PNET 17 과 흑색 종 (데이터는 표시되지 않음)이 종양 세포의 행동과 침습에 대한 장기 연구를 위해 성공적으로 이식되었습니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 적절한 바늘 구멍 크기 및 적절한 종양 세포 현탁액을 적절하게 마취 호스트 배아를 보장 포함합니다. 각 연구원에 대해이 기술의 추가 최적화에는 종양 세포 농도, 주입 압력 및 배아 방향 조정이 포함될 수 있습니다. 또한 다른 종양에서 유래 된 현탁액의 점도에는 이질성이있을 수 있으므로 다른 종양 유형은 재발 성 및 이식이 다소 어려울 수 있습니다. 그러나, 니들 보어 크기를 조정하고 diffe를 사용하여종양 현탁액을 희석 시키면 종양 점도와 관련된 어려움을 극복 할 수 있습니다.
우리의 경험에서, 심실의 드문 드문 한 세포 / 불규칙한 세포 덩어리에 대한 가장 일반적인 이유는 다음과 같습니다 : 1) 종양 세포 현탁액이 너무 희박합니다. 2) 니들 보어 크기가 너무 작습니다. 3) 분사 시간과 압력이 너무 낮습니다. 및 / 또는 4) 남아있는 조직은 종양으로부터 여과되지 않고 바늘에 박혀 있었다. 종양 세포 현탁액이 주사 후 심실 밖으로 흘러 나올 때 그것은 1) 뇌실 바닥에 바늘을 놓는 것; 2) 높은 사출 압력과 시간; 및 / 또는 3) 너무 큰 니들 보어 크기. 이식 된 배아의 낮은 생존율은 1) 오랜 기간 동안 태아를 마취하는 것; 2) 사출 판에 배아를 남기고 건조시킨다. 3) 심실 내로 기포의 주입; 및 / 또는 4) 뇌와 같은 중요한 장기를 관통하고바늘이 심실을 통과했기 때문에 심장.
성인 또는 배아 제브라 피시 뇌에서 종양 이식의 이전 방법은 성인의 면역 억제 (유 전적으로, 약리학 적으로 또는 방사선을 통한)에 의존하거나 배아 38 , 43 , 52 , 53 , 54 의 인간 또는 마우스 세포에 대한 단기 연구로 제한됩니다 . 예를 들어, 마우스 뇌종양은 단기 (~ 2 일) 전임상 약물 검사에서 사용하기 위해 dexamethasone 면역 억제 된 30-dpf, 청소년 제브라 피쉬에 비강 내 주사 할 수 있습니다. 그러나 이러한 실험에서 주사 부위는 두개골과 뇌 조직에 의해 가려져 정상적인 뇌 조직에 손상을 줄 수 있으며 이로 인해 숙주 생존력과 생장 효율이 저하됩니다. 최근에 설명 된 또 다른 방법은 인간 glioblastoma 세포주는 zebrafish 배아의 중뇌 영역으로 이동하여 성장, 침입 및 약물 반응의 단기 분석을 가능하게했다. 다시, 주사 부위의 정확한 위치는 가변적이며 정상 조직을 손상시킬 가능성이 있습니다. 따라서 배아 뇌 이식의 이전 방법은 종종 단기간의 분석 ( 즉, 2 일에서 14 일)으로 제한하여 이러한 연구를 불분명 한 주사 부위로 인한 개별 주사 간의 가변성을 증가시키고, 세포 행동 및 약물 반응 또는 여러 세대에 걸친 재 이식의 장기 분석.
여기에 설명 된 방법은 zebrafish 배아 및 면역 손상된 이식 기술의 현재 한계를 해결합니다. 연구원은 다음을 수행 할 수 있습니다. 1) 주변 조직에 대한 최소한의 손상으로 동일한 위치에 재현 가능하게 주사합니다. 2) 주입 부위를 직접 시각화하여 최대화생화 효율; 3) 하루 수백 마리의 배아 이식. 4) 면역 기능이있는 동물에서 종양이 자랄 수 있도록한다; 5) zebrafish의 수명 동안 종양 세포 행동 및 내약성 약물 반응을 모니터링 할 수 있습니다. 6) 종양의 진화 또는 약물 재발 기전에 대한 잠재적 인 연구를 위해 여러 세대에 걸친 종양의 재 이식이 가능하다. 또한,이 프로토콜은 연구자들이 다른 면역 집단을 포함한 숙주 반응 평가를 위해 모든 제브라 피쉬 유전자형을 이용할 수있게 해줍니다. 이러한 특성으로 인해이 방법은 이미 제브라 피쉬에서 표준 마이크로 인젝션을 수행하는 모든 실험실에서 쉽게 적용 할 수 있습니다. 마지막으로,이 방법은 zebrafish 뇌종양의 정위 주입에 이상적이지만, 간이나 췌장과 같은 다른 종양 유형을 이식 할 때 동위체 부위가 면역 능력보다 더 중요 할 수 있습니다 ( 예 : 연구자가 간질의 영향을 연구하는 경우 종양 성장에 대한 미세 환경). 이 시나리오에서새로 개발 된 면역 결핍 성 제브라 피쉬 모델은 정위 이식 종양 이식을 수행하는 데 더 적합 할 수 있습니다 11 .
이 프로토콜은 종양 세포 경쟁 assays을 수행하고 이중 라벨 종양을 주입하는 데 사용되었습니다. 물에 약물을 첨가하여 이식 후 배아의 치료를 포함하는 종양 발생에 대한 화합물의 유효성 평가를위한 잠재적 치료 전략도 논의되었다. 이전에 종양 세포를 ex vivo로 치료하는 방법도 이전에보고되었다. 또한, 이식 된 종양은 여러 번 이식하여 다시 종양의 진화 및 항암 화학 요법에 도움이 될 것입니다. 현재, 전임상 연구는 잠재적 인 화합물의 효능을 평가하기위한 마우스 이종 이식에 의존합니다. 그러나,이 연구는 시간이 많이 소요됩니다그리고 값 비싼. 제브라 피쉬와 인간 사이의 발암 신호 전달 경로의 높은 수준의 보존을 고려할 때,이 방법은 전임상 및 임상 시험에 들어가는 효과적인 화합물의보다 신속한 확인을 위해 기존의 마우스 및 인간 세포 연구를 보완 할 것으로 예상됩니다. 궁극적으로,이 방법은 1 차 환자 종양의 신속한 화학적 스크리닝에 유용 할 수 있으며, 이는 개인화 된 의학 이니셔티브를 추진할 수 있습니다. 그러나, 제브라 피쉬 (성인 또는 배아)에서 인간 세포의 장기간 성장을위한 조건은 여전히 확인 될 필요가있다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
원고에 대한 훌륭한 제안과 개선 사항에 대해 두 명의 평론가에게 감사드립니다. 우리는 또한 축산 및 유지 관리를 위해 유타 대학 헌츠 만 암 연구소 (Huntsman Cancer Institute) / 유타 대학에 감사드립니다. 이 연구는 미국 암 협회 (# 124250-RSG-13-025-01-CSM), NIH 교부금 (P30 CA042014 CRR 프로그램), Utah Seed Grant 대학 및 Huntsman Cancer Foundation의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
| 50 mL beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
| Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
| Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
| Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
| Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
| Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
| 1,000 µL filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
| 100 µL filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
| 50 mL conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
| 15 mL conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
| 1.7 mL microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
| Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
| Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
| Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
| Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
| Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
| Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
| Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
| Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
| Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
| Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
| Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
| Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
| Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
| Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
| PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
| 12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
| Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
| Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
| N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |
References
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