Summary
Transplantationen af kræftceller er et vigtigt redskab til identifikation af kræftmekanismer og terapeutiske reaktioner. Nuværende teknikker afhænger af immunkompetente dyr. Her beskriver vi en metode til transplantation af zebrafisk-tumorceller til immunkompetente embryoner til den langsigtede analyse af tumorcelleadfærd og in vivo- lægemiddelresponser.
Abstract
Tumorcelletransplantation er en vigtig teknik til at definere mekanismerne til regulering af kræftcellevækst, migration og værtsrespons samt at vurdere potentielt patientrespons på terapi. Nuværende metoder afhænger i høj grad af at anvende syngene eller immunforstyrrede dyr for at undgå afvisning af tumorgraft. Sådanne fremgangsmåder kræver anvendelse af specifikke genetiske stammer, der ofte forhindrer analysen af immuntumorcelleinteraktioner og / eller er begrænset til specifikke genetiske baggrunde. En alternativ metode i zebrafisk drager fordel af et ufuldstændigt udviklet immunsystem i den embryonale hjerne inden 3 dage, hvor tumorceller transplanteres til brug i kortvarige analyser ( dvs. 3 til 10 dage). Disse metoder medfører imidlertid værtsdatalitet, som forhindrer den langsigtede undersøgelse af tumorcelleadfærd og lægemiddelrespons. Denne protokol beskriver en simpel og effektiv metode til langsigtet ortototopisk transplantation af zebrafisk hjernetumorvæv iTil den fjerde ventrikel af en 2-dages gammel immunkompetent zebrafisk. Denne metode giver mulighed for: 1) langvarig undersøgelse af tumorcelleadfærd, såsom invasion og formidling; 2) varigt tumorrespons på lægemidler Og 3) re-transplantation af tumorer til undersøgelse af tumorevolution og / eller virkningen af forskellige værtsgenetiske baggrunde. Sammenfattende giver denne teknik mulighed for kræftforskere til at vurdere engraftment, invasion og vækst på fjerne steder samt at udføre kemiske skærme og cellekonkurrenceanalyser i mange måneder. Denne protokol kan udvides til undersøgelser af andre tumortyper og kan bruges til at belyse mekanismer for kemoresistance og metastase.
Introduction
Transplantationen af tumorceller til immunkompromitterede dyr, især musen xenotransplantater, er en almindeligt anvendt teknik anvendt til at studere mekanismer, der styrer cancercelleproliferation 1 , 2 , overlevelse, invasion og metastase 3 , 4 såvel som at tilvejebringe en platform Til screening af lægemidler 5 , 6 , 7 . For nylig er transplantationen af primære tumorprøver til immunkompromitterede mus blevet brugt til at generere patient-afledte xenograftmodeller (PDX) til diagnostisk og præklinisk lægemiddel screening og er rygraden i det personlige medicin initiativ 8 , 9 , 10 , 11 . Imidlertid viser betydelige beviser at modulere immunsystemetStamme kan have en dramatisk indvirkning på tumoradfærd og patientudfald 12 , 13 . Dette har drevet redesignet af xenograft-baserede teknikker til at inkludere "humaniserede" mus, hvori immunsystemet af musen rekonstitueres ved co-transplantation af humane immunceller med tumorceller. Denne fremgangsmåde er dog stadig teknisk udfordrende, med variabel reproducerbarhed og toksiciteter forbundet med teknikken, ud over den betydelige omkostning 14 , 15 . Således er nye transplantationsteknikker i immunkompetente dyr nødvendige for at fremskynde opdagelsen af immun- og tumor-specifikke mekanismer for kræftprogression og lægemiddelrespons.
Zebrafish er en alternativ dyremodel til undersøgelse af humant kræft, med over 20 kræftmodeller etableret nu 16 , herunder meget ondartet hjerne 17 , mela Noma 18 , 19 , 20 og bukspyttkjertelkræft 21 , 22 såvel som mange leukæmier 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . To zebrafisksystemers to egenskaber gør det særligt egnet til kræftforskning: 1) Den transparente dyrs optiske klarhed muliggør direkte visualisering af kræftcelleadfærd ( dvs. spredning, overlevelse, invasion og formidling) ved brug af enkle mikroskopiteknikker og 2) Kvindelige zebrafisk kan producere op til 200 embryoner om dagen, hvilket gør det muligt hurtigt at scalere dyrenumre til genetisk eller medikament screening til en lav pris. Derudover er kræftgenomene af zebrafisk og mennesker stærkt konserverede (herunder onkogener og tumor-suppressor-gener)F "> 28, som gør det muligt hurtigt at omdanne mekanismer og stofopdagelser til pattedyrsystemer. Disse egenskaber gør også zebrafisken til en ideel dyremodel til transplantationsteknikker, der udnytter billeddannelsen, skalerbarheden og den lave pris ved systemet.
Tidligere tumortransplantationsundersøgelser i immunforstyrret zebrafisk har lettet identifikationen af selvfornyelsesevner, tumor malignitet og invasion / formidling 11 , 29 . Kortvarige undersøgelser af tumorcelleadfærd kan udføres efter transplantation til y-bestrålede voksne, hvis immunsystem effektivt undertrykkes i ~ 20 dage 11 , 30 . Behandlingen af voksne zebrafisk med dexamethason undertrykker B- og T-celler i op til 30 dage før afstødning sker 31 . En anden mindre fælles strategi anvender klonale zebrafiskstammerDer muliggør langsigtede undersøgelser hos en immunkompetent vært 32 . Imidlertid er kun et begrænset antal klonestammer genereret og er vanskelige at opretholde på grund af lav fecunditet. Derudover genereres de fleste af de etablerede zebrafisktumormodeller i andre genetiske baggrunde, så disse tumorer kan ikke transplanteres i klonestammerne uden at undertrykke immunsystemet 11 , 33 , 34 . Nyere tilgange til forbedring af langsigtede transplantationsundersøgelser omfatter udvikling af rag2 E450fs mutantlinien med kompromitterede B- og T-cellefunktioner, som er blevet brugt til succesfuldt transplantation af flere kræftformer 35 , 36 . For at omgå kravet om klonale zebrafisk linjer eller en immunkompromitteret vært har en række grupper brugt embryoner i tidligt stadium ( dvs. > 72 hkOste-befrugtning (hpf)) til human tumorcelletransplantation, da disse embryoner endnu ikke fuldt ud har udviklet et adaptivt immunsystem 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 . Disse metoder er imidlertid begrænset til den kortsigtede analyse af tumorcelleadfærd eller lægemiddelrespons (normalt mindre end 2 uger), fordi de humane cancerceller eller selve transplantationsteknikken dræber værten, forhindrer langtidsstudier og gentransplantation.
Denne protokol beskriver en modificeret embryonal transplantationsmetode i lumen i den fjerde ventrikel i en 2-dages post-befrugtning (dpf) embryo-hjerne. Det minimerer toksiciteten for værten og kan kombineres med zebrafisk hjerne tumor modeller til langsigtet engraftment af tumorceller. Således er denne teknik alLows for omplantning af tumorceller til nye værter i mange generationer, hvilket letter fremtidige undersøgelser af tumor heterogenitet, værts / immunrespons, lægemiddelrespons eller metastatisk potentiale. Denne metode er også enkel, effektiv og skalerbar, da op til 300 transplantationer kan udføres af en enkelt bruger om dagen med op til 90% engraftment. Dette giver mulighed for hurtig udbredelse af enkelt primære tumorer i hundreder af embryoner ved 2 dpf til genetiske eller lægemiddel screening projekter eller direkte visualisere hjerne tumor celle adfærd i forskellige vært baggrunde i mange måneder.
Protocol
Alle dyreprocedurer blev godkendt og fulgt retningslinjerne for dyresundhed ved University of Utah Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC # 16-03019).
1. Forberedelse af udstyret til mikroinjektion
- Forberedelse af injektionspladen.
- Forbered en 50 ml opløsning af 1,2% agarose opløst i ægvand (0,6 g / L akvariumsalt i omvendt osmosevand + 0,01 mg / l methylenblåt). Kog opløsningen, indtil agarosen opløses og tilsættes derefter ved tilsætning af 0,05 mg / l methylenblåt. Hæld 25 ml af den endelige opløsning i en 10 cm petriskål og lad den størkne. Anbring de resterende 25 ml agaroseopløsning i et 42 ° C vandbad indtil klar til trin 1.1.2.
- Sæt et beger på 2 tommer i midten af den størkne overflade og hæld de resterende 25 ml 1,2% agarose.
BEMÆRK: Dette skaber en indsprøjtningsflade på pladens periferi og en kerne i midten, somGiver et område til at teste nålestørrelse og svulstsuspensionskonsistens.- Hold injektionspladen ved 28 ° C i mindst 30 minutter før injektion eller ved 4 ° C til langtidsopbevaring.
- Forberedelse af injektionsnåle.
- Lav nålerne ved at trække 10 cm kapillærer med en ydre dimension på 1,2 mm og en indre dimension på 0,9 mm (uden glødetråd) i to nåle på en nåletrækker.
BEMÆRK: Hver nål skal måle 6 cm i længden, hvor ca. 1,5 cm af enden er tilspidset. - Anbring forsigtigt nålen på et mikroskopglas, indpakket i plastisk paraffinfilm. Brug et knivblad til at skære enden af nålen i en 45 ° vinkel for at skabe en nål med en åbning på spidsen.
BEMÆRK: Typisk fjernes 0,1 mm til 0,3 mm af nålens ende. En skråt tip er ikke påkrævet for at udføre injektionerne.
- Lav nålerne ved at trække 10 cm kapillærer med en ydre dimension på 1,2 mm og en indre dimension på 0,9 mm (uden glødetråd) i to nåle på en nåletrækker.
- Forbered mikroinjektionsopsætningen.
- <Li> Arranger en standard mikroinjektionsopsætning, herunder et stereomikroskop, en manipulator og en mikroinjektor til transplantationen.
2. Forberedelse af embryoer til transplantation
- Indsaml op til 500 mitfa w2 embryoner 44 (eller embryoner af andre genfyser af zebrafisk som defineret af brugeren) som beskrevet 45 og opretholde i en 28 ° C inkubator.
- Dekkerionere embryonerne ved 24 hpf ved at tilsætte 100 μl 10 mg / ml protease cocktailopløsning fortyndet i ægvand og forsigtigt rocke i ca. 20 minutter. Skyl embryonerne 3 gange med frisk ægvand for at fjerne resterende protease.
- Skær embryonerne på 48 hpf for det passende udviklingsstadium, som defineret i standardconditioneringsseriekriterierne 45 .
Bemærk: Kun korrekt indrettede og morfologisk normale embryoner bør anvendes til transplantationen. - bedøverCa. 20 48 hpf embryoner i ægvand indeholdende 0,002% Tricaine-S i en petriskål. Bekræft korrekt bedøvelse ved at observere ophør af bevægelse.
3. Gør en suspension af tumorceller
BEMÆRK: Zebrafish hjerne tumor modeller kan genereres af genetisk ingeniørkombinationer af onkogener og tumor suppressor gener 17 , 46 , 47 . Her blev den sox10 promotor-drevne NRAS WT , p53 zdf1 / zdf1 CNS-PNET zebrafiskmodel anvendt som for nylig beskrevet 17 .
- Euthanize en hjerne-tumorbærende fisk, hvis tumorbyrde er ca. 20% af den samlede kropsstørrelse ved anvendelse af en overdosis på 0,4% Tricaine-S efterfulgt af nedsænkning i isvand i overensstemmelse med IACUC-godkendte protokoller.
- Dissect den fluorescensmærkede tumor med et barberblad og pincet under en fluorescensMikroskop ved anvendelse af steril teknik og anbring den i 5 ml 1x phosphatpufret saltvand (PBS).
BEMÆRK: Eksakte dissektionsmetoder vil være brugerdefineret og afhængig af tumortype og vævsplacering. Se de angivne referencer for detaljerede procedurer for dissektion af forskellige zebrafiskorganer og hjernetumorer 17 , 48 . - Manuelt forstyrre tumormassen ved hjælp af en pipette p1000, indtil en ensartet, overskyet opløsning udvikler sig. Fjern store partikler med en pipetip eller ved hjælp af en 40 μm cellefil (dette er tumorafhængig). Centrifug suspensionen ved stuetemperatur i 5 minutter ved 290 xg og fjern supernatanten.
Bemærk: Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) udføres ikke for at isolere tumorceller. Dette tillader transplantation af en heterogen population af stromale, immun- og tumorceller. - Resuspender tumorcellepellet i 100 μL sterilt PBS og overfør det til en 1,5 ml mikroCentrifugerør. Tag 5 μl af cellesuspensionen og fortyn den i 250 μl PBS. Tæl antallet af celler ved hjælp af et hæmocytometer. Centrifug suspensionen i 3 minutter ved 290 xg, fjern supernatanten og resuspender pelleten i sterilt PBS for at opnå den ønskede cellekoncentration.
BEMÆRK: Celler, der resuspenderes i 30-40 μL sterilt PBS, giver typisk en opløsning, der er viskøs og uigennemsigtig (cellekoncentration ≥100 celler / nL) og har tendens til at generere de mest vellykkede transplantater. Celleevnen er ikke vurderet. - Opbevar tumor suspensionen på en 28 ° C varmeblok under transplantationsproceduren.
4. Injektion af tumorsuspensionen i den fjerde ventrikel af en 2-dpf-embryo
- Overfør 10-20 bedøvede embryoner (fra trin 2.4) til injektionspladeets periferi ved hjælp af en overførselspipette; Embryoerne skal falde lateralt på injektionspladen, med ventriklerne klart synlige og tilgængelige. Brug en vinklet sonde til at justere embryonerne efter behov og placere dem væk fra indsprøjtningspladeens yderkant.
- Indlæs 1-2 μL af tumorcellesuspensionen i injektionsnålen ved hjælp af gelpipetips og indsæt nålen i manipulatoren.
- Manuelt sænke manipulatoren og holde nålen i en 45 ° vinkel. Juster knapperne på micromanipulatoren i x-, y- og z-retningen, indtil nålen er lige over og ca. 5 mm til højre for embryohovedet. Kig igennem stereomikroskopets okularer og juster mikromomanipulatoren langsomt i x-retningen, indtil nålen gennemborer fjerde ventrikel i embryoet. Lad ikke nålen gennembore hjertet eller æggeblommen.
- Skub fodpedalen fastgjort til mikroinjektoren for at injicere tumorcellesuspensionen.
BEMÆRK: Indsprøjtningstrykket og tiden varierer afhængigt af nålens borestørrelse, men et godt udgangspunkt er 5 - 10 PSI og 50 - 100 ms.Volumenet af injicerede tumorceller kan vurderes ved standard oliedråbsteknikker ved injektion i mineralolie, om ønsket 49 . Injektioner på 500 pL med en dråbe diameter på 0,1 mm giver typisk de bedste resultater.
- Skub fodpedalen fastgjort til mikroinjektoren for at injicere tumorcellesuspensionen.
- Skyl forsigtigt de injicerede embryoner ud af injektionspladen og ind i en petriskål med frisk ægvand. Vedligehold embryoner i ægvand for de resterende procedurer, eller indtil de dyrkes i tanke (som beskrevet i trin 4.9.1).
- Undersøg de injicerede embryoner under et fluorescens stereomikroskop. Bekræft, at indsprøjtningstrykket, vinklen, nålestørrelsen og cellesuspensionsviskositeten resulterer i tumorceller, der fylder 25-50% af ventrikelrummet. Juster disse parametre efter behov.
- Gentag trin 4.1-4.5 for eventuelle resterende embryoner. Bedøve de ekstra embryoner efter behov (beskrevet i trin 2.4).
BEMÆRK: En erfaren bruger kan injicere op til 300 embryoner i løbet af 3-4 timer. - Placer embryoerne tilbage28 ° C inkubatoren natten over.
- Næste dag vurder embryooverlevelse ved at undersøge morfologiske og fysiologiske træk, såsom normal hjerte og hjerneudvikling, som beskrevet 45 .
- Til screening bedøves embryonerne som beskrevet i trin 2.4 ved 1 dag efter transplantation (dpt).
- Brug en overførselspipette til at tilsætte 4% methylcellulose på midten af en petriskål og tilsæt embryoerne til methylcellulosedråben. Orient embryoerne (ventral side vendt mod lyskilden) ved hjælp af en vinklet probe og skærm for en konsistent engraftment størrelse ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Fjern eventuelle embryoner med tumorceller, der ikke er begrænset til ventriklen eller dem, som indeholder tumorceller, der kompromitterer mindre end 25% af ventrikelrummet.
Bemærk: Konsistent engraftment defineres som embryoner med en enkelt tumor masse, der omfatter 25-50% af ventrikelrummet 17 . Til screening skal du bruge en fluorescens sTereomicroscope med et 1X objektiv, en 0,15 numerisk blænde, en forstørrelse på mellem 0,7-1,6x og en eksponeringstid på 50 ms til 1 s. For alle billeder skal du bruge lysfeltkanalen ud over enten GFP- eller RFP-kanalen. - Ved opretholdelse af tumorer skal de transplanterede embryoner i tanke vokse 45 ved 8 dpf (6 dpt).
- Brug en overførselspipette til at tilsætte 4% methylcellulose på midten af en petriskål og tilsæt embryoerne til methylcellulosedråben. Orient embryoerne (ventral side vendt mod lyskilden) ved hjælp af en vinklet probe og skærm for en konsistent engraftment størrelse ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Fjern eventuelle embryoner med tumorceller, der ikke er begrænset til ventriklen eller dem, som indeholder tumorceller, der kompromitterer mindre end 25% af ventrikelrummet.
5. Imaging Transplanted Embryos for Cellular Behaviors
- Bedøves embryonerne ved 3-8 dpf (1-6 dpt) og monteres (dorsal side mod dækslet) i 1,2% lavmeltig agarose. Udfør time-lapse-billeddannelse af de monterede embryoner ved hjælp af et laserskanningskonokulært mikroskop i den ønskede tidsperiode for at visualisere cellulære adfærd, såsom migration, celledeling eller cellecelleinteraktioner efter behov 38 , 43 , 53 .
BEMÆRK: Brug et billedforhold på 1.024 x 1.024, en scanhastighed på 8 & #181; s / pixel. Ansøg scanningsmidler og definer z-dybdimensionerne for at sikre indfangning af hele tumormassen (1000-1.500 μm). Derudover udfører 4-h time-lapse eksperimenter, der køber et billede hver 10-15 min ved hjælp af et 40x objektiv, der overvåger invasive adfærd. Sensorfølsomheden vil variere afhængigt af tumormassens intensitet, og laserkraften vil være mikroskopafhængig, men det anbefales generelt at være mellem 15 og 40%. - Når billeddannelsen er færdig, frigør det monterede embryo fra agarosen ved hjælp af en vinklet sonde og overfør den til en petriskål med frisk ægvand.
6. Drug Administration til Transplanterede Embryoer og Vurdering af Tumor Burden 17
- Bedøve embryoner med 3 dpf og orienter dem i 4% methylcellulose, med den ventrale side vendt mod lyskilden. Billede af forbehandlingens embryoner ved anvendelse af et fluorescensmikroskop 17 .
- PlaCe de transplanterede embryoner ved 3 dpf i en 12-brønds plade med 10 embryoner pr. Brønd i 0,5 ml ægvand. Tilsæt den passende mængde lægemiddel for at opnå den ønskede endelige koncentration ( fx 50 μM MEK inhibitor) og returnere embryonerne til en 28 ° C inkubator. Den næste dag skal du fjerne det medikamentbehandlede æggevand med en tyndt overføringspipette og tilføje frisk behandling. Gentag dette dagligt indtil embryoerne når op til 8 dpf.
- Ved 8 dpf fjern embryoerne fra lægemiddelbehandling og læg dem i frisk ægvand. Bedøves embryoer og orientering (ventral side vendt mod lyskilde) i 4% methylcellulose. Billedembryoner efter behandling ved anvendelse af et fluorescensmikroskop. Kvantificer tumorområdet ved hjælp af passende software, som beskrevet 17 .
- Adskil embryonerne efter behov, og læg dem i tanke for at vokse. Efter 4-9 uger bedøve fisken og vurdere dem for den samlede tumorbyrde ved brug af et standardfluorescens stereomikroskop, som dEscribed 17 .
Representative Results
Tumortransplantation og engraftment
En skematisk omrids af fremgangsmåden er vist i figur 1 . Fluorescensmærkede tumorceller ekstraheres fra det primære orgelsted, og en enkeltcellesuspension genereres til transplantation i den fjerde ventrikel af 2-dpf mitfa w2 zebrafiskembryoner 44 . Figur 2 viser de repræsentative resultater for denne metode ved anvendelse af en zebrafiskmodel af primær neural ektodermal tumor (CNS-PNET) i centralnervesystemet, hvor sox10-promotoren driver ekspression af vildtype- NRAS eller aktiveret NRAS fusioneret til mCherry i p53- deficiente oligonale prækursorceller 17 . Mitfa w2 zebrafish 44 mutanten, som mangler melanophores, blev brugt til mere let at visualisereTumorcellerne efter transplantation og / eller i voksenalderen. Andre pigmentmutanter kunne også anvendes til at tilvejebringe yderligere billedklarhed, såsom Casper 50 . Så tidligt som 24 timer efter transplantation kan tumorceller ses invaderende i omgivende hjernevæv ( Figur 2A , 3 dpf, pile). Tumortransplantater fortsætter med at vokse i ventrikel og omgivende hjernevæv i løbet af den næste uge ( Figur 2A , 8 dpf). På dette tidspunkt kan fluorescens også observeres i nyrernes område ( figur 2A , asterisker). Dette kan skyldes nyrerne, der filtrerer de cellulære affald fra transplantationen, hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der anvender fluorescerende farvestoffer som et assay til evaluering af nyrefunktion 51 . Tumorceller fortsætter med at proliferere og invadere, så med 28 dpf kan en tumormasse ses gennem zebrafiskens hjerne ( Figur 2A , 28 dpf).
figur 2B . Tumor engraftment opnås typisk i 80-90% af embryoner, og tumortransplantationer vedvarer til voksenalderen; Tre repræsentative eksempler er vist i bundpanelerne i figur 2B . Dette gør det muligt for tumortransplantaterne at blive høstet og frosset eller gentransplanteret i flere generationer.
Tumor invasion og lægemiddel respons
Figur 3A viser et co-transplantationsskema, hvori to forskellige tumorer mærket med enten GFP (Tumor A) eller mCherry (Tumor B) høstes af hel-tumEller dissociation (bemærk at FACS ikke anvendes her, men FACS-sorterede tumorceller kan bruges, hvis det er nødvendigt). Tumor A og B kan være fra forskellige steder induceret med forskellige onkogener eller induceret i forskellige genetiske baggrunde. Hver tumor behandles til en enkeltcellesuspension, og tumorceller blandes derefter sammen i et 1: 1 forhold og transplanteres i 2-dpf-embryoet. Tumoregenskaber, såsom engraftment, vækst, invasion og formidling af Tumor A versus Tumor B kan så observeres i den samme vært, der tillader interne kontroller for teknikken og genetisk baggrund.
I figur 3B blev en NRAS-drevet , mCherry-mærket zebrafisk CNS-PNET fra det optiske tektum og et GFP-mærket CNS-PNET fra cerebellumet høstet og bearbejdet til enkeltcellesuspensioner. Celler tælles, og et lige antal celler fra hver tumor blev blandet sammen og transplanteret i 2-dpf-embryoner. Fire dEfter transplantationen blev embryoer afbildet med konfokal mikroskopi. Vist er et repræsentativt embryo, der demonstrerer, at tectum-tumorcellerne (røde) migreres mere omfattende i værtshjerne (pile) end cerebellarumor.
Embryoer transplanteret med fluorescensmærkede tumorceller kan anvendes i lægemiddelbehandlingsregimer til at identificere forbindelser, der hæmmer tumorvækst. Figur 3C er en typisk tidslinje til behandling og billeddannelse af tumortransplantationer. 24 timer efter transplantation, fås embryoner til konsekvent engraftment størrelse og opdeles i behandlingsgrupper. I det viste eksempel behandles embryoner transplanteret med NRAS-drevne , mCherry-mærkede zebrafisk-CNS-PNET'er med 50 μM dimethylsulfoxid (DMSO) eller MEK-inhibitor (AZD6244). Embryoer behandles i 5 dage og afbildes ved 8 dpf, som skitseret i figur 3C . Figur 3D (venstre panel) viser repræsentativ E dyr fra de to behandlingsgrupper. MEK-inhibitorbehandlede embryoner har en signifikant lavere mængde fluorescens end dem, der behandles med DMSO, som beskrevet 17 . Efter dyrene er afbildet, overføres de til tanke uden medicin og overvåges for tumorvækst i to måneder. I det givne eksempel resulterer MEK-inhibitorbehandlingen i et varigt svar i den voksne fisk ( Figur 3D , højre paneler). For yderligere oplysninger om lægemiddelbehandling, billedbehandling og kvantificering henvises til reference 17 .
Figur 1: Protokol skematisk af tumorcellertransplantation i den fjerde ventrikel af 2-dpf sebrafiskembryoer. Generel skematisk af afsnit 3 til 4 i protokollen, herunder alternative endepunktanalyser (afsnit 4.9-6)./55712/55712fig1large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Tumor Engraftment og Progression. (A) Zebrafish primære CNS-PNET 17 tumorceller mærket med mCherry blev transplanteret i fjerde ventrikel af 2-dpf-embryoner. Ved 3 dpf ses tumorceller invaderende til omgivende hjernevæv (pile). Ved 8 dpf vokser tumorceller i ventriklen; Røde tumorceller er også til stede i det omgivende hjernevæv og nyrer (asterisker). Ved 28 dpf har tumorsceller invaderet og vokset gennem værtshjernen. (B) Toppanel. Syv 3-dpf-embryoner transplanteret med mCherry-mærkede zebrafisk hjernetumorceller. Tumorceller kan transplanteres konsekvent i hundreder af embryoner, med høje engraftment satser ( dvs. typisk 85/100 embryoner). Mellem ogBundpaneler. Tre repræsentative voksne fisk med transplanterede tumorer 4-8 uger efter befrugtning (wpf). Tumorer kan visualiseres ved fluorescensmikroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Sammenligning af tumorinvasion og lægemiddelrespons. ( A ) CNS-PNETs 17 fra det optiske tektum eller cerebellum er mærket med henholdsvis mCherry eller GFP, behandlet til en enkeltcellesuspension, blandet sammen i et 1: 1-forhold og co-transplanteret i 2-dpf-embryoner. ( B ) Et 6-dpf-embryo co-transplanteret med en blandet suspension af GFP-mærkede cerebellære tumorceller og mCherry-mærkede tumorceller fra det optiske tektum. Forskelle i de invasive egenskaber hos hver tumor i tHan samme modtager kan observeres ved hjælp af fluorescensmikroskopi. I dette eksempel migrerer mCherry-mærkede tumorceller mere omfattende end dem, der er mærket med GFP (pile). ( C ) Tidslinje for lægemiddelbehandling på embryoner transplanteret med tumorceller. ( D ) Billeder af repræsentative dyr ved afslutningen af behandlingsregimen (8 dpf) og 8 uger efter behandling (8 wpf), med enten en DMSO-kontrol eller en 50 μM MEK-inhibitor. Tumorbyrden kan måles ved at kvantificere fluorescens som beskrevet 17 . I dette forsøg reduceres væksten af mCherry-mærkede tumorceller i MEK-inhibitorbehandlede embryoner og omdannes til et holdbart respons hos den voksne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Denne protokol beskriver et simpelt og effektivt transplantationsassay, der involverer injektion af zebrafisk-tumorceller i ventriklen i et 2-dpf-embryo, som vil udvikle et fuldt kompetent immunsystem. Hidtil er zebrafisk CNS-PNET 17 og melanom (data ikke vist) med succes transplanteret til langsigtede undersøgelser af tumorcelleadfærd og invasion. De kritiske trin i denne protokol omfatter sikring af den passende nålboringsstørrelse og den korrekte tumorcellesuspension og tilstrækkeligt bedøvende værtsembryoner. For hver enkelt forsker kan yderligere optimering af denne teknik indbefatte justeringen af tumorcellekoncentration, indsprøjtningstryk og embryoorientering. Derudover kan der være heterogenitet i viskositeten af suspensioner, der stammer fra forskellige tumorer, så forskellige tumortyper kan være mere eller mindre vanskelige at genop suspendere og transplantere. Ved at justere nålens borestørrelse og ved at anvende diffeLejefortyndinger af tumorsuspensionen er det muligt at overvinde vanskeligheder forbundet med tumorviskositeter.
I vores erfaring er de mest almindelige årsager til sparsomme celler / inkonsekvente cellemasser i ventriklen som følger: 1) tumorcellesuspensionen er for fortyndet; 2) nålens borestørrelse er for lille; 3) Injektionstid og tryk er for lave; Og / eller 4) resterende væv blev ikke filtreret fra tumoren og indlagt i nålen. Når tumorcellesuspensionen strømmer ud af ventriklen efter injektion, skyldes det sandsynligvis: 1) placeringen af nålen mod kammerets gulv; 2) et højt indsprøjtningstryk og tid Og / eller 3) en nålboringsstørrelse, der er for stor. Lav overlevelse af transplanterede embryoner kan skyldes: 1) bedøvelse af embryoner i længere tid; 2) forlader embryoner på injektionspladen for at tørre 3) injektion af luftbobler ind i ventriklen Og / eller 4) piercing vitale organer, såsom hjernen ogHjerte, fordi nålen gik gennem ventriklen.
Tidligere metoder til tumortransplantation i den voksne eller embryonale zebrafisk-hjerne er afhængige af immunosuppression hos voksne (genetisk, farmakologisk eller via stråling) eller er begrænset til kortvarige undersøgelser af humane eller museceller i embryoner 38 , 43 , 52 , 53 , 54 . For eksempel kan musens hjernetumorer injiceres intranasalt i dexamethason-immunsupprimeret 30-dpf juvenil zebrafisk til brug i kortvarige (~ 2 dage) prækliniske lægemiddelanalyser 54 . Injektionsstedet i disse forsøg dækkes imidlertid af kraniet og hjernevævet og resulterer sandsynligvis i skade på normalt hjernevæv, hvilket reducerer værtsvævbarhed og engraftmenteffektivitet. En anden nyligt beskrevet metode involverer injektion af humant gliobLastoma cellelinier ind i midterste område af zebrafiskembryoer, hvilket muliggjorde kortfristet analyse af vækst, invasion og lægemiddelrespons 43 . Igen er den præcise placering af injektionsstedet variabel og sandsynligvis ødelægger normalt væv. Således kompromitterer tidligere metoder til embryonale hjerne-transplantationer ofte levedygtigheden af værterne, hvilket begrænser disse undersøgelser til kortvarig analyse ( dvs. 2 til 14 dage), hvilket medfører øget variabilitet mellem individuelle injektioner på grund af uklarede injektionssteder og forebyggelse af langvarig injektion Langsigtet analyse af celleadfærd og lægemiddelrespons eller re-transplantation på tværs af flere generationer.
Den her beskrevne metode omhandler nuværende begrænsninger i embryonale og immunforstyrrede transplantationsteknikker ved zebrafisk ved at tillade forskere at: 1) reproduceres injiceres på samme sted med minimal skade på omgivende væv; 2) visualisere direkte indsprøjtningsstedet for at maksimereEngraftment effektivitet; 3) transplantere hundredvis af embryoner om dagen 4) tillade tumorer at vokse hos immunkompetente dyr 5) tillade overvågning af tumorcelleadfærd og holdbare lægemiddelresponser over zebrafiskens liv; Og 6) muliggøre re-transplantation af tumorer over mange generationer til potentielle undersøgelser af tumorevolution eller lægemiddelrelateret mekanismer. Desuden giver denne protokol forskere mulighed for at udnytte enhver zebrafish genotype til vurdering af værtsrespons, herunder forskellige immunpopulationer. Disse egenskaber gør denne metode nem at tilpasse af ethvert laboratorium, der allerede udfører standardmikroinjektioner i zebrafisk. Endelig, mens denne metode er ideel til ortopotopiske injektioner af zebrafisk hjernetumorer, kan transplantation af andre tumortyper, såsom lever eller pankreas, være vigtigere end immunkompetence ( f.eks. Hvis en forsker studerer virkningerne af stromal Mikro-miljø på tumorvækst). I dette scenario, denNyudviklede immundefekt zebrafiskmodeller kan være mere hensigtsmæssige til udførelse af orthotopiske tumortransplantationer 11 .
Denne protokol er blevet anvendt til at udføre tumorcellekonkurrenceanalyser og til at injicere dobbeltmærkede tumorer. En potentiel behandlingsstrategi til vurdering af effektiviteten af kemiske forbindelser på tumorigenese, som involverer behandling af embryon efter transplantation via tilsætning af lægemidlet til vand, blev også drøftet. En metode til ex vivo behandling af tumorceller forud for transplantation blev også tidligere rapporteret 17 . Derudover er transplanterede tumorer blevet samlet for flere runder af re-transplantation, hvilket vil være gavnligt for undersøgelser af tumorevolution og kemoresistens 17 . I øjeblikket er prækliniske undersøgelser afhængige af muse xenotransplantater for at vurdere effekten af potentielle forbindelser. Disse undersøgelser er imidlertid tidskrævendeOg dyrt. I betragtning af den høje grad af bevarelse af onkogene signalveje mellem zebrafisk og mennesker 28 , kan det forventes, at denne metode vil komplementere konventionelle mus- og humane celleundersøgelser for at muliggøre hurtigere identifikation af effektive forbindelser ind i prækliniske og kliniske forsøg. I sidste ende kunne denne metode vise sig at være nyttig til hurtig kemisk screening af primære patienttumorer, som yderligere kunne fremme det personlige medicininitiativ. Imidlertid skal betingelserne for den langsigtede vækst af humane celler i zebrafisk (voksen eller embryo) stadig identificeres.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker de to korrekturlæsere for fremragende forslag og forbedringer af manuskriptet. Vi takker også Huntsman Cancer Institute / University of Utah til husdyrhold og vedligeholdelse. Dette arbejde blev finansieret af American Cancer Society (# 124250-RSG-13-025-01-CSM), et NIH-tilskud (P30 CA042014 CRR-program), University of Utah Seed Grant og Huntsman Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
| 50 mL beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
| Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
| Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
| Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
| Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
| Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
| 1,000 µL filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
| 100 µL filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
| 50 mL conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
| 15 mL conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
| 1.7 mL microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
| Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
| Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
| Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
| Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
| Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
| Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
| Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
| Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
| Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
| Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
| Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
| Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
| Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
| Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
| PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
| 12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
| Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
| Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
| N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |
References
- Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer. Mol Ther. 10 (6), 1032-1042 (2004).
- Stephen, R. M., et al. Monitoring the development of xenograft triple-negative breast cancer models using diffusion-weighted magnetic resonance imaging. Exp Biol Med. 237 (11), 1273-1280 (2012).
- Deroose, C. M., et al. Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined small-animal PET, small-animal CT, and bioluminescence imaging. J Nucl Med. 48 (2), 295-303 (2007).
- Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).
- Johnson, J. I., et al. Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials. Br J Cancer. 84 (10), 1424-1431 (2001).
- Kerbel, R. S. Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans - Better than commonly perceived - But they can be improved. Cancer Biology & Therapy. 2 (4), S134-S139 (2003).
- Scholz, C. C., Berger, D. P., Winterhalter, B. R., Henss, H., Fiebig, H. H. Correlation of Drug Response in Patients and in the Clonogenic-Assay with Solid Human Tumor Xenografts. Eur J Cancer. 26 (8), 901-905 (1990).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Cho, S. Y., et al. An Integrative Approach to Precision Cancer Medicine Using Patient-Derived Xenografts. Mol Cells. 39 (2), 77-86 (2016).
- Hiroshima, Y., et al. Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy. Oncotarget. 7 (44), 71696-71702 (2016).
- Moore, J. C., Langenau, D. M. Allograft Cancer Cell Transplantation in Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916, 265-287 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Dranoff, G. Experimental mouse tumour models: what can be learnt about human cancer immunology. Nat Rev Immunol. 12 (1), 61-66 (2011).
- Richmond, A., Su, Y. Mouse xenograft models vs GEM models for human cancer therapeutics. Dis Model Mech. 1 (2-3), 78-82 (2008).
- Bernard, D., Peakman, M., Hayday, A. C. Establishing humanized mice using stem cells: maximizing the potential. Clin Exp Immunol. 152 (3), 406-414 (2008).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Modzelewska, K., et al. MEK Inhibitors Reverse Growth of Embryonal Brain Tumors Derived from Oligoneural Precursor Cells. Cell Rep. 17 (5), 1255-1264 (2016).
- Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Curr Biol. 15 (3), 249-254 (2005).
- Dovey, M., White, R. M., Zon, L. I. Oncogenic NRAS cooperates with p53 loss to generate melanoma in zebrafish. Zebrafish. 6 (4), 397-404 (2009).
- Santoriello, C., et al. Kita driven expression of oncogenic HRAS leads to early onset and highly penetrant melanoma in zebrafish. PLoS One. 5 (12), e15170 (2010).
- Park, S. W., et al. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
- Liu, S., Leach, S. D. Screening pancreatic oncogenes in zebrafish using the Gal4/UAS system. Methods Cell Biol. 105, 367-381 (2011).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
- Langenau, D. M., et al. Cre/lox-regulated transgenic zebrafish model with conditional myc-induced T cell acute lymphoblastic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 6068-6073 (2005).
- Sabaawy, H. E., et al. TEL-AML1 transgenic zebrafish model of precursor B cell acute lymphoblastic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15166-15171 (2006).
- Chen, J., et al. NOTCH1-induced T-cell leukemia in transgenic zebrafish. Leukemia. 21 (3), 462-471 (2007).
- Feng, H., et al. Heat-shock induction of T-cell lymphoma/leukaemia in conditional Cre/lox-regulated transgenic zebrafish. Br J Haematol. 138 (2), 169-175 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Li, P., White, R. M., Zon, L. I. Transplantation in zebrafish. Methods Cell Biol. 105, 403-417 (2011).
- Traver, D., et al. Effects of lethal irradiation in zebrafish and rescue by hematopoietic cell transplantation. Blood. 104 (5), 1298-1305 (2004).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5 (3), 383-394 (2010).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Tenente, I. M., Tang, Q., Moore, J. C., Langenau, D. M. Normal and malignant muscle cell transplantation into immune compromised adult zebrafish. J Vis Exp. (94), (2014).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Geiger, G. A., Fu, W., Kao, G. D. Temozolomide-mediated radiosensitization of human glioma cells in a zebrafish embryonic system. Cancer Res. 68 (9), 3396-3404 (2008).
- Kitambi, S. S., et al. Vulnerability of glioblastoma cells to catastrophic vacuolization and death induced by a small molecule. Cell. 157 (2), 313-328 (2014).
- Lally, B. E., et al. Identification and biological evaluation of a novel and potent small molecule radiation sensitizer via an unbiased screen of a chemical library. Cancer Res. 67 (18), 8791-8799 (2007).
- Vittori, M., Motaln, H., Turnsek, T. L. The study of glioma by xenotransplantation in zebrafish early life stages. J Histochem Cytochem. 63 (10), 749-761 (2015).
- Yang, X. J., et al. A novel zebrafish xenotransplantation model for study of glioma stem cell invasion. PLoS One. 8 (4), e61801 (2013).
- Zhao, H., Tang, C., Cui, K., Ang, B. T., Wong, S. T. A screening platform for glioma growth and invasion using bioluminescence imaging. Laboratory investigation. J Neurosurg. 111 (2), 238-246 (2009).
- Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Dis Model Mech. 9 (9), 1063-1065 (2016).
- Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126 (17), 3757-3767 (1999).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- Solin, S. L., Shive, H. R., Woolard, K. D., Essner, J. J., McGrail, M. Rapid tumor induction in zebrafish by TALEN-mediated somatic inactivation of the retinoblastoma1 tumor suppressor rb1. Sci Rep. 5, 13745 (2015).
- Ju, B., et al. Oncogenic KRAS promotes malignant brain tumors in zebrafish. Mol Cancer. 14, (2015).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. J Vis Exp. (96), e52540 (2015).
- Rampazzo, E., et al. Wnt activation promotes neuronal differentiation of glioblastoma. Cell Death Dis. 4, (2013).
- Lal, S., La Du,, Tanguay, J., L, R., Greenwood, J. A. Calpain 2 is required for the invasion of glioblastoma cells in the zebrafish brain microenvironment. J Neurosci Res. 90 (4), 769-781 (2012).
- Eden, C. J., et al. Orthotopic models of pediatric brain tumors in zebrafish. Oncogene. 34 (13), 1736-1742 (2015).
