Summary
Transplantationen av cancerceller är ett viktigt verktyg för identifiering av cancermekanismer och terapeutiska svar. Nuvarande tekniker beror på immunkompetenta djur. Här beskriver vi en metod för att transplantera tumörceller från zebrafisk till immunkompetenta embryon för långsiktig analys av tumörcellsbeteende och in vivo läkemedelsreaktioner.
Abstract
Tumörcellstransplantation är en viktig teknik för att definiera mekanismerna som reglerar cancercelltillväxt, migration och värdrespons samt att bedöma potentiellt patientrespons på terapi. Nuvarande metoder beror till stor del på att använda syngene eller immunförsvagade djur för att undvika avstötning av tumörtransplantatet. Sådana metoder kräver användning av specifika genetiska stammar som ofta förhindrar analys av immuntumörcellsinteraktioner och / eller är begränsade till specifika genetiska bakgrunder. En alternativ metod i zebrafisk drar nytta av ett ofullständigt utvecklat immunförsvar i den embryonala hjärnan före 3 dagar, där tumörceller transplanteras för användning vid kortvariga analyser ( dvs 3 till 10 dagar). Dessa metoder medför dock värddatalitet, vilket förhindrar den långsiktiga studien av tumörcellsbeteende och läkemedelsrespons. Detta protokoll beskriver en enkel och effektiv metod för den långsiktiga ortototoptransplantationen av zebrafisk hjärntumörvävnad iTill den fjärde kammaren hos en 2-dagars immunkompetent sebrafisk. Denna metod möjliggör: 1) långsiktig studie av tumörcellsbeteenden, såsom invasion och spridning; 2) hållbart tumörsvar mot droger; Och 3) re-transplantation av tumörer för studier av tumörutveckling och / eller inverkan av olika värdgenetiska bakgrunder. Sammanfattningsvis tillåter denna teknik cancerforskare att bedöma engraftment, invasion och tillväxt på avlägsna platser, samt att utföra kemiska skärmar och celltävlingstest under många månader. Detta protokoll kan utvidgas till studier av andra tumortyper och kan användas för att belysa mekanismer för kemoresistens och metastasering.
Introduction
Transplantationen av tumörceller till immunkompromierade djur, särskilt musxenotransplantat, är en allmänt använd teknik som används för att studera mekanismer som styr cancercellerproliferation 1 , 2 , överlevnad, invasion och metastasering 3 , 4 samt att tillhandahålla en plattform För screening av droger 5 , 6 , 7 . Mer nyligen har transplantationen av primära tumörprover till immunkompromitterade möss använts för att generera patient-avledda xenograftmodeller (PDX) för diagnostisk och preklinisk läkemedelsscreening och är ryggraden i det personliga initiativet 8 , 9 , 10 , 11 . Emellertid visar betydande bevis att modulera immunsystemetStammen kan ha en dramatisk inverkan på tumörbeteendet och patientutfallet 12 , 13 . Detta har drivit omkonstruktionen av xenograftbaserade tekniker för att inkludera "humaniserade" möss, i vilka immunsystemet hos musen rekonstitueras genom samtransplantation av humana immunceller med tumörceller. Emellertid är detta tillvägagångssätt fortfarande tekniskt utmanande, med variabel reproducerbarhet och toxiciteter associerade med tekniken, förutom den betydande kostnaden 14 , 15 . Således behövs nya transplantationstekniker i immunkompetenta djur för att påskynda upptäckten av immun- och tumörspecifika mekanismer för cancerprogression och läkemedelsrespons.
Zebrafish är en alternativ djurmodell för studier av mänsklig cancer, med över 20 cancermodeller som nu etablerats 16 , inklusive mycket maligna hjärnor 17 , mela Noma 18 , 19 , 20 och bukspottkörtelcancer 21 , 22 , såväl som många leukemier 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Två funktioner hos zebrafisksystemet gör det särskilt mottagligt för cancerforskning: 1) Den transparenta djurs optiska klarhet möjliggör direkt visualisering av cancercellsbeteenden ( dvs. proliferation, överlevnad, invasion och spridning) med hjälp av enkla mikroskopitekniker och 2) Kvinnlig zebrafisk kan producera upp till 200 embryon per dag, vilket möjliggör snabb skaling av djurnummer för genetisk eller läkemedelssökning till låg kostnad. Dessutom är cancergenomerna hos zebrafisk och människor starkt konserverade (inklusive onkogener och tumör-suppressorgener)F "> 28, vilket möjliggör att mekaniska och läkemedelsupptäckter snabbt översättas till däggdjursystem. Dessa egenskaper gör också zebrafisken en idealisk djurmodell för transplantationstekniker som utnyttjar avbildning, skalbarhet och låg kostnad för systemet.
Tidigare tumörtransplantationsstudier i immunkompromitterad zebrafisk har underlättat identifieringen av självförnyelsekapacitet, tumörmalignitet och invasion / spridning 11 , 29 . Kortsiktiga studier av tumörcellsbeteende kan utföras efter transplantation till γ-bestrålade vuxna, vars immunsystem effektivt undertryckas för ~ 20 dagar 11 , 30 . Behandlingen av vuxna zebrafisk med dexametason undertrycker B- och T-celler i upp till 30 dagar innan avstötning sker 31 . En annan mindre vanlig strategi använder klonala zebrafiskstammarSom möjliggör långsiktiga undersökningar i en immunkompetent värd 32 . Emellertid har endast ett begränsat antal klonstammar genererats och är svåra att upprätthålla på grund av låg fecunditet. Dessutom genereras de flesta av de etablerade zebrafisktumormodellerna i andra genetiska bakgrunder, så dessa tumörer kan inte transplanteras i klonstammarna utan att undertrycka immunsystemet 11 , 33 , 34 . Nyare tillvägagångssätt för att förbättra långsiktiga transplantationsstudier inkluderar utvecklingen av rag2 E450fs mutantlinjen , med komprometterade B- och T-cellfunktioner, som har använts för att framgångsrikt transplantera flera cancerformer 35 , 36 . För att kringgå kravet på klonala zebrafisklinjer eller en immunförsvarad värd har ett antal grupper använt embryon i tidigt stadium ( dvs. > 72 hkOst-befruktning (hpf)) för human tumörcellstransplantation, eftersom dessa embryon ännu inte helt utvecklat ett adaptivt immunsystem 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 . Dessa metoder är emellertid begränsade till den kortsiktiga analysen av tumörcellsbeteende eller läkemedelsrespons (vanligtvis mindre än 2 veckor) eftersom de mänskliga cancercellerna eller själva transplantationstekniken dödar värden, förhindrar långtidsstudier och re-transplantation.
Detta protokoll beskriver en modifierad embryonal transplantationsmetod i lumen i den fjärde ventrikeln i en 2-dagars efterbefruktning (dpf) embryohjärna. Det minimerar toxiciteten hos värden och kan kombineras med zebrafisk hjärntumörmodeller för långsiktig engraftment av tumörceller. Således är denna teknik alLows för re-transplantation av tumörceller till nya värdar över flera generationer, underlättande framtida studier av tumör heterogenitet, värd / immunsvar, läkemedelssvar eller metastatisk potential. Denna metod är också enkel, effektiv och skalbar, eftersom upp till 300 transplantationer kan utföras av en enskild användare per dag, med upp till 90% engraftment. Detta möjliggör snabb fortplantning av enskilda primära tumörer i hundratals embryon vid 2 dpf för genetiska eller läkemedelssökningsprojekt eller för direkt visualisering av hjärntumörcellsbeteende i olika värdbakgrunder under många månader.
Protocol
Alla djurprocedurer godkändes och följdes av djurhälsovården från University of Utah Institutionella Animal Care and Use Committee (IACUC # 16-03019).
1. Förbereda utrustningen för mikroinjektion
- Förbered injektionsplattan.
- Förbered en 50 ml lösning av 1,2% agaros upplöst i äggvatten (0,6 g / L akvariumsalt i omvänd osmosvatten + 0,01 mg / L metylenblå). Koka lösningen tills agarosen löser upp och tillsätt sedan genom att tillsätta 0,05 mg / L metylenblå. Häll 25 ml av den slutliga lösningen i en 10 cm petriskål och låt den stelna. Placera de återstående 25 ml agaroslösningen i ett 42 ° C vattenbad tills det är klart för steg 1.1.2.
- Sätt en bägare med 2 tums diameter i mitten av den stelnade ytan och häll de resterande 25 ml 1,2% agarosen.
OBS: Detta skapar en injektionsyta på plattans periferi och en kärna i mitten, vilkenTillhandahåller ett område för att testa nålstorlek och tumörssuspensionskonsistens.- Håll injektionsplattan vid 28 ° C i minst 30 min före injektion eller vid 4 ° C för långvarig förvaring.
- Förbered injektionsnålar.
- Gör nålarna genom att dra 10 cm kapillärer med en yttre dimension av 1,2 mm och en inre dimension av 0,9 mm (utan filament) i två nålar på en nåldragare.
OBS! Varje nål ska mäta 6 cm i total längd, där cirka 1,5 cm av änden är avsmalnande. - Placera försiktigt nålen på ett mikroskopglas glidigt i plastparaffinfilm. Använd ett rakblad för att klippa änden av nålen i 45 ° vinkel för att skapa en nål med en öppning vid spetsen.
OBS: Vanligen avlägsnas 0,1 mm till 0,3 mm av nålens ände. En avfasad spets behövs inte för att utföra injektionerna.
- Gör nålarna genom att dra 10 cm kapillärer med en yttre dimension av 1,2 mm och en inre dimension av 0,9 mm (utan filament) i två nålar på en nåldragare.
- Förbered mikroinjektionsinstallationen.
- <Li> Ordna en vanlig mikroinjektionsinstallation, inklusive ett stereomikroskop, en manipulator och en mikroinjektor för transplantationen.
2. Förberedelse av embryon för transplantation
- Samla upp till 500 mitfa w2- embryon 44 (eller embryon från alla andra zebrafiskgenotyper som definieras av användaren) som beskrivits 45 och bibehålla i en inkubator med 28 ° C.
- Dechorionera embryonerna vid 24 hpf genom att tillsätta 100 | xl 10 mg / ml proteascocktaillösning utspädd i äggvatten och försiktigt rocka i ca 20 min. Skölj embryon 3 gånger med färskt äggvatten för att ta bort resterande proteas.
- Skärma embryonerna vid 48 hkf för det lämpliga utvecklingsstadiet, enligt definitionen i standardcertifieringsseriekriterierna 45 .
Obs! Endast korrekt iscensatta och morfologiskt normala embryon ska användas för transplantationen. - BedövaUngefär tjugo 48 hpf embryon i äggvatten innehållande 0,002% Tricaine-S i en petriskål. Bekräfta korrekt anestesi genom att observera att rörelsen upphör.
3. Gör en tumörcellssuspension
OBS: Zebrafish hjärntumörmodeller kan genereras genom genetiskt ingenjörskombinationer av onkogener och tumörsuppressorgener 17 , 46 , 47 . Här användes den sox10- promotor-drivna NRAS WT , p53 zdf1 / zdf1 CNS-PNET sebrafiskmodellen, som nyligen beskrivits 17 .
- Euthanisera en hjärntumörbärande fisk vars tumörbörda är ungefär 20% av den totala kroppsstorleken med en 0,4% Tricaine-S-överdosning följt av nedsänkning i isvatten enligt IACUC-godkända protokoll.
- Dissektera den fluorescensmärkta tumören med ett rakblad och pincett under fluorescensMikroskop med steril teknik och placera den i 5 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
OBS: Exakta dissektionsmetoder kommer att vara användardefinierade och beroende av tumortyp och vävnadsläge. Se de angivna referenserna för detaljerade förfaranden för dissektion av olika zebrafiskorgan och hjärntumörer 17 , 48 . - Manuellt störa tumörmassan med hjälp av en pipettp1000 tills en enhetlig, grumlig lösning utvecklas. Ta bort stora partiklar med en pipettspets eller använd en 40 μm cellsilter (detta är tumörberoende). Centrifugera suspensionen vid rumstemperatur i 5 minuter vid 290 xg och avlägsna supernatanten.
Obs! Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) utförs inte för att isolera tumörceller. Detta möjliggör transplantationen av en heterogen population av stromala, immun- och tumörceller. - Resuspendera tumörcellspelleten i 100 | il steril PBS och överför den till en 1,5 ml mikroCentrifugrör. Ta 5 | il av cellsuspensionen och späd den i 250 | il PBS. Räkna antalet celler med hjälp av en hemocytometer. Centrifugera suspensionen under 3 minuter vid 290 xg, avlägsna supernatanten och resuspendera pelleten i sterilt PBS för att erhålla den önskade cellkoncentrationen.
OBS: Celler som resuspenderas i 30-40 μL sterilt PBS ger vanligtvis en lösning som är viskös och ogenomskinlig (cellkoncentration ≥100 celler / nL) och tenderar att generera de mest framgångsrika transplantationerna. Cellleabilitet utvärderas ej. - Förvara tumörsuspensionen på ett 28 ° C värmeblock under transplantationsförfarandet.
4. Injicera tumörsuspensionen i den fjärde ventrikeln i en 2-dpf-embryo
- Överför 10-20 bedövade embryon (från steg 2.4) till injektionsplattans periferi med användning av en överföringspipett; Embryonerna ska falla i sidled på injektionsplattan, med ventriklarna tydligt synliga och tillgängliga. Använd en vinklad sond för att justera embryon efter behov och placera dem bort från insprutningsplattans ytterkant.
- Ladda 1-2 μL av tumörcellsuspensionen i injektionsnålen med hjälp av gelpipettips och sätt in nålen i manipulatorn.
- Manuellt sänka manipulatorn och håll nålen i 45 ° vinkel. Justera rattarna på mikromekanipulatorn i x-, y- och z-riktningen tills nålen ligger strax ovanför och ca 5 mm till höger om embryohuvudet. Titta igenom stereomikroskopets okular och justera mikromekanipulatorn i x-riktningen tills nålen piercerar det fjärde ventrikeln i embryot. Låt inte nålen genomborra hjärtat eller äggula.
- Skjut fotpedalen kopplad till mikroinjektorn för att injicera tumörcellsuspensionen.
OBS: Injektionstrycket och tiden varierar beroende på nålborrstorlek, men en bra utgångspunkt är 5 - 10 PSI och 50-100 ms.Volymen injicerade tumörceller kan bedömas med standard oljedroppstekniker genom injektion i mineralolja, om så önskas 49 . Injektioner av 500 pL med en droppdiameter av 0,1 mm ger vanligtvis de bästa resultaten.
- Skjut fotpedalen kopplad till mikroinjektorn för att injicera tumörcellsuspensionen.
- Skölj försiktigt de injicerade embryon från injektionsplattan och in i en petriskål med färskt äggvatten. Behåll embryon i äggvatten för de återstående procedurerna eller tills de odlas i tankar (som beskrivs i steg 4.9.1).
- Inspektera de injicerade embryonema under ett fluorescens-stereomikroskop. Bekräfta att insprutningstrycket, vinkeln, nålstorleken och cellupphängningsviskositeten resulterar i tumörceller som fyller 25-50% av ventrikelutrymmet. Justera dessa parametrar vid behov.
- Upprepa steg 4.1-4.5 för eventuella återstående embryon. Bedöva ytterligare embryon efter behov (beskrivet i steg 2.4).
OBS! En erfaren användare kan injicera upp till 300 embryon under 3-4 timmar. - Placera embryon tillbaka28 ° C inkubatorn över natten.
- Nästa dag, bedöma embryoöverlevnad genom att undersöka morfologiska och fysiologiska egenskaper, såsom normal hjärta och hjärnans utveckling, som beskrivs 45 .
- För screening bedövar embryon, som beskrivs i steg 2.4, vid 1 dag efter transplantation (dpt).
- Använd en överföringspipett för att tillsätta 4% metylcellulosa på mitten av en petriskål och tillsätt embryonerna till metylcellulosedroppen. Orientera embryon (ventral sida vänd mot ljuskällan) med hjälp av en vinklad sond och skärm för en konsekvent engraftmentstorlek med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Ta bort alla embryon med tumörceller som inte är begränsade till ventrikeln eller de som innehåller tumörceller som komprimerar mindre än 25% av ventrikelutrymmet.
Anmärkning: Konsekvent engraftment definieras som embryon med en enda tumörmassa som omfattar 25-50% av ventrikelutrymmet 17 . För screeningändamål, använd en fluorescens sTereomikroskop med ett 1X-objekt, en 0,15 numerisk bländare, en förstoring som sträcker sig från 0,7-1,6x och en exponeringstid på 50 ms till 1 s. För alla bilder, använd ljusfältkanalen utöver antingen GFP- eller RFP-kanalen. - För underhåll av tumörer, placera de transplanterade embryon i tankar att växa 45 vid 8 dpf (6 dpt).
- Använd en överföringspipett för att tillsätta 4% metylcellulosa på mitten av en petriskål och tillsätt embryonerna till metylcellulosedroppen. Orientera embryon (ventral sida vänd mot ljuskällan) med hjälp av en vinklad sond och skärm för en konsekvent engraftmentstorlek med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Ta bort alla embryon med tumörceller som inte är begränsade till ventrikeln eller de som innehåller tumörceller som komprimerar mindre än 25% av ventrikelutrymmet.
5. Imaging Transplanterade embryon för cellulär beteende
- Bedöda embryonerna vid 3-8 dpf (1-6 dpt) och montera (dorsal sida vänd mot täckglaset) i 1,2% lågmält agaros. Utför time-lapse avbildning av de monterade embryonerna med hjälp av ett laserskanningskonokolemikroskop för önskad tid för att visualisera cellulära beteenden, såsom migration, celldelning eller cellcellsinteraktioner, efter behov 38 , 43 , 53 .
OBS! Använd ett bildförhållande på 1,024 x 1,024, en skanningshastighet på 8 & #181; s / pixel. Använda genomsökningsgenomsnitt och definiera z-djupdimensionerna för att säkerställa fångst av hela tumörmassan (1000-1 500 μm). Utför dessutom 4-tims-förloppsförsök, och skaffa en bild var 10-15 minuter med ett 40x-objekt för att övervaka invasiva beteenden. Detektorens känslighet varierar beroende på tumörmassans intensitet och laserkraften är mikroskopberoende, men det rekommenderas vanligtvis att vara mellan 15 och 40%. - När bildbildningen är klar, frigör det monterade embryot från agarosen med en vinklad sond och överför den till en petriskål med färskt äggvatten.
6. Drogadministration till transplanterade embryon och bedömning av tumörbörda 17
- Bedöda embryon vid 3 dpf och rikta dem i 4% metylcellulosa, med den ventrala sidan mot ljuskällan. Bild förebehandlingsembryon med hjälp av ett fluorescensmikroskop 17 .
- PlaCe de transplanterade embryonerna vid 3 dpf i en 12-brunnsplatta med 10 embryon per brunn i 0,5 ml äggvatten. Tillsätt lämplig mängd läkemedel för att erhålla den önskade slutkoncentrationen ( t ex 50 | im MEK-inhibitor) och returnera embryon till en inkubator med 28 ° C. Nästa dag, ta bort det läkemedelsbehandlade äggvattnet med en pipett med tunn borrning och tillsätt frisk behandling. Upprepa detta dagligen tills embryonerna når 8 dpf.
- Vid 8 dpf, ta bort embryon från läkemedelsbehandling och placera dem i färskt äggvatten. Bedöva embryon och orientera (ventral sida vänd mot ljuskällan) i 4% metylcellulosa. Bildembryon efterbehandling med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Kvantifiera tumörområdet med lämplig programvara, som beskrivet 17 .
- Separera embryon som lämpligt per behandling och placera dem i tankar att växa. Efter 4-9 veckor bedövar fisken och bedömer dem för den totala tumörbördan med hjälp av ett standardfluorescens stereomikroskop, som dEscribed 17 .
Representative Results
Tumörtransplantation och engraftment
En schematiserad skiss av proceduren är representerad i figur 1 . Fluorescensmärkta tumörceller extraheras från det primära organsätet, och en enkelcellsuspension alstras för transplantation i den fjärde ventrikeln av 2-dpf mitfa w2 zebrafiskembryon 44 . Figur 2 visar de representativa resultaten för denna metod med användning av en zebrafiskmodell av primärnitalt ektodermaltumör (CNS-PNET) i centralnervsystemet , där sox10 -promotorn driver expression av vildtyp- NRAS eller aktiverad NRAS kondenserad till mCherry i p53- deficienta oligonala prekursorceller 17 . Mitfa w2 zebrafish 44 mutanten, som saknar melanophores, användes för att lättare visualiseraTumörcellerna efter transplantation och / eller i vuxenlivet. Andra pigmentmutanter skulle också kunna användas för att tillhandahålla ytterligare bildhantering, såsom Casper 50 . Så tidigt som 24 timmar efter transplantation kan tumörceller ses invaderande till omgivande hjärnvävnad ( Figur 2A , 3 dpf, pilar). Tumörtransplantat fortsätter att växa i ventrikeln och omgivande hjärnvävnad under nästa vecka ( Figur 2A , 8 dpf). Vid denna tidpunkt kan fluorescens också observeras i njurarna i regionen ( Figur 2A , asterisker). Detta kan bero på njurarna som filtrerar cellens skräp från transplantationen, vilket överensstämmer med tidigare studier som använder fluorescerande färgämnen som en analys för att utvärdera njurfunktionen 51 . Tumörceller fortsätter att proliferera och invadera, så med 28 dpf kan en tumörmassa ses i zebrafiskens hjärna ( Figur 2A , 28 dpf).
Figur 2B . Tumör engraftment uppnås typiskt i 80-90% embryon, och tumörtransplantationer kvarstår i vuxen ålder; Tre representativa exempel visas i bottenpanelerna i figur 2B . Detta medger att tumörtransplantationerna kan skördas och frysta eller omplanteras över flera generationer.
Tumörinvasion och läkemedelssvar
Figur 3A visar ett samtransplantationsschema i vilket två olika tumörer märkta med antingen GFP (tumör A) eller mCherry (tumör B) skördas med hel tumEller dissociation (notera att FACS inte används här, men FACS-sorterade tumörceller kan användas om det behövs). Tumör A och B kan vara från olika ställen inducerad med olika onkogener eller induceras i olika genetiska bakgrunder. Varje tumör bearbetas till en enkelcellsuspension, och tumörceller blandas därefter ihop i ett 1: 1 förhållande och transplanteras i 2-dpf-embryot. Tumöregenskaper, såsom engraftment, growth, invasion och dissemination of Tumor A versus Tumor B, kan sedan observeras i samma värd som möjliggör interna kontroller för tekniken och genetisk bakgrund.
I figur 3B skördades en NRAS- driven, mCherry-märkt zebrafisk CNS-PNET från det optiska tektumet och ett GFP-märkt CNS-PNET från cerebellumet och bearbetades till encellsuspensioner. Celler räknades, och ett lika antal celler från varje tumör blandades och transplanterades i 2-dpf-embryon. Fyra dEfter transplantationen, embryonerna avbildades med konfokal mikroskopi. Visat är ett representativt embryo som visar att tektum-tumörcellerna (röda) migrerar mer i stor utsträckning i värdhjärnan (pilarna) än cerebellär tumören.
Embryon transplanterade med fluorescensmärkta tumörceller kan användas i läkemedelsbehandlingsregimer för att identifiera föreningar som hämmar tumörtillväxt. Figur 3C är en typisk tidslinje för behandling och bildbehandling av tumörtransplantationer. 24 h efter transplantation, embryon är åtkomliga för konsekvent engraftment storlek och uppdelad i behandlingsgrupper. I det angivna exemplet behandlas embryon transplanterade med NRAS- drivna, mCherry-märkta zebrafisk CNS-PNETs med 50 | im dimetylsulfoxid (DMSO) eller MEK-inhibitor (AZD6244). Embryon behandlas i 5 dagar och avbildas vid 8 dpf, såsom beskrivs i figur 3C . Figur 3D (vänstra paneler) visar representativ E djur från de två behandlingsgrupperna. MEK-inhibitorbehandlade embryon har en signifikant lägre mängd fluorescens än de som behandlats med DMSO, såsom beskrivits 17 . Efter att djuren har avbildats överförs de till tankar utan droger och övervakas för tumörtillväxt i två månader. I det angivna exemplet resulterar MEK-inhibitorbehandlingen i ett varaktigt svar i vuxenfisken ( Figur 3D , högra paneler). För ytterligare detaljer om läkemedelsbehandling, bildbehandling och kvantifiering, se referens 17 .
Figur 1: Schematisk protokoll för tumörcellstransplantation i den fjärde ventrikeln av 2-dpf sebrafiskembryon. Allmän schema över avsnitt 3 till 4 i protokollet, inklusive alternativa ändpunktsanalyser (avsnitt 4.9-6)./55712/55712fig1large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Tumör Engraftment och Progression. (A) Zebrafish primära CNS-PNET 17 tumörceller märkta med mCherry transplanterades i den fjärde ventrikel av 2-dpf-embryon. Vid 3 dpf ses tumörceller som invaderar sig i omgivande hjärnvävnad (pilar). Vid 8 dpf växer tumörceller i ventrikeln; Röda tumörceller finns också i den omgivande hjärnvävnaden och njurarna (asterisker). Vid 28 dpf har tumörceller invaderat och växit genom värdvärdet. (B) Överpanel. Sju 3-dpf-embryon transplanterade med mCherry-märkta zebrafisk hjärntumörceller. Tumörceller kan transplanteras konsekvent i hundratals embryon, med höga engraftment-hastigheter ( dvs. vanligtvis 85/100 embryon). Mellan ochBottenpaneler. Tre representativa vuxna fiskar med transplanterade tumörer 4-8 veckor efter befruktning (wpf). Tumörer kan visualiseras genom fluorescensmikroskopi. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Jämförelse av tumörinvasion och drogrespons. ( A ) CNS-PNETs 17 från det optiska tektum eller cerebellum märks med respektive mCherry eller GFP, bearbetas till en enkelcellsuspension, blandas ihop i ett 1: 1-förhållande och samtransplanteras i 2-dpf-embryon. ( B ) Ett 6-dpf-embryo samtransplantat med en blandad suspension av GFP-märkta cerebellära tumörceller och mCherry-märkta tumörceller från det optiska tektumet. Skillnader i de invasiva egenskaperna hos varje tumör i tHan samma mottagare kan observeras med hjälp av fluorescensmikroskopi. I detta exempel migrerar mCherry-märkta tumörceller mer omfattande än de som är märkta med GFP (pilar). ( C ) Tidslinje för läkemedelsbehandling på embryon transplanterade med tumörceller. ( D ) Bilder av representativa djur i slutet av behandlingsregimen (8 dpf) och vid 8 veckor efter behandling (8 wpf), med antingen en DMSO-kontroll eller en 50 μM MEK-inhibitor. Tumörbördan kan mätas genom kvantifiering av fluorescens, såsom beskrivits 17 . I detta försök reduceras tillväxten av mCherry-märkta tumörceller i MEK-inhibitorbehandlade embryon och omvandlas till ett varaktigt svar hos vuxna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Detta protokoll beskriver en enkel och effektiv transplantationsanalys som innefattar injektion av zebrafisk-tumörceller i ventrikeln i ett 2-dpf-embryo som kommer att utveckla ett fullt kompetent immunsystem. Hittills har zebrafisk CNS-PNET 17 och melanom (data ej visat) framgångsrikt transplanterats för långsiktiga studier av tumörcellsbeteende och invasion. De kritiska stegen i detta protokoll innefattar att man säkerställer den lämpliga nålborrstorleken och den korrekta tumörcellsuspensionen och adekvat anestesiserande värdembryon. För varje enskild forskare kan ytterligare optimering av denna teknik innefatta justering av tumörcellskoncentration, injektionstryck och embryoorientering. Dessutom kan det föreligga heterogenitet i viskositeten hos suspensioner som härrör från olika tumörer, så olika tumortyper kan vara mer eller mindre svåra att åter suspendera och transplantera. Genom att justera nålborrstorleken och använda diffeHyrspädningar av tumörsuspensionen är det möjligt att övervinna svårigheter associerade med tumörviskositeter.
Enligt vår erfarenhet är de vanligaste orsakerna till glesa celler / inkonsekventa cellmassor i ventrikeln följande: 1) tumörcellsuspensionen är för utspädd; 2) nålborrstorleken är för liten; 3) Injektionstid och tryck är för låga. Och / eller 4) återstående vävnad filtrerades inte från tumören och placerades i nålen. När tumörcellsuspensionen strömmar ut ur ventrikeln efter injektion beror det troligen på: 1) placeringen av nålen mot ventrikelns golv; 2) ett högt injektionstryck och tid; Och / eller 3) en nålborrstorlek som är för stor. Låg överlevnad av transplanterade embryon kan orsakas av: 1) bedövning av embryon under en längre tid; 2) lämnar embryon på injektionsplattan för att torka; 3) injektion av luftbubblor in i ventrikeln; Och / eller 4) piercing vitala organ, som hjärnan ochHjärta, eftersom nålen gick genom ventrikeln.
Tidigare metoder för tumörtransplantation hos den vuxna eller embryonala zebrafiskhjärnan är beroende av immunosuppression hos vuxna (genetiskt, farmakologiskt eller via strålning) eller är begränsade till kortvariga studier av humana eller musceller i embryon 38 , 43 , 52 , 53 , 54 . Till exempel kan hjärntumörer i mus injiceras intranasalt i dexametason-immunsupprimerad 30-dpf juvenil zebrafisk för användning vid kortvariga (~ 2 dagar) prekliniska läkemedelsanalyser 54 . Injektionsstället i dessa experiment döljs emellertid av skallen och hjärnvävnaden och leder sannolikt till skador på normal hjärnvävnad vilket minskar värdens livskraft och engraftmenteffektivitet. En annan nyligen beskriven metod innefattar injektion av humant gliobLastoma celllinjer i midbrainområdet av zebrafiskembryon, vilket möjliggjorde den kortsiktiga analysen av tillväxt, invasion och läkemedelssvar 43 . Återigen är den exakta placeringen av injektionsstället variabel och skadar sannolikt normal vävnad. Således äventyrar tidigare metoder för embryonala hjärntransplantationer ofta värden hos värdarna, vilket begränsar dessa studier till kortsiktig analys ( dvs. 2 till 14 dagar), vilket medför ökad variation mellan individuella injektioner på grund av förmörkade injektionsställen och förhindrande av långvarig Termisk analys av cellbeteenden och läkemedelssvar eller omtransplantation över flera generationer.
Metoden som beskrivs här behandlar nuvarande begränsningar i embryonala och immunkompromitterade transplantationstekniker genom att tillåta forskare att: 1) reproducerbart injicera på samma plats med minimal skada på omgivande vävnad; 2) visualisera direkt injektionsstället för att maximeraEngraftment effektivitet; 3) transplantera hundratals embryon per dag; 4) tillåta tumörer att växa i immunkompetenta djur 5) möjliggöra övervakning av tumörcellsbeteende och hållbara läkemedelsreaktioner över zebrafiskens liv; Och 6) tillåter re-transplantation av tumörer över många generationer för potentiella studier på tumörutveckling eller läkemedelsreaktionsmekanismer. Dessutom möjliggör detta protokoll forskare att använda någon zebrafiskgenotyp för bedömning av värdrespons, inklusive olika immunpopulationer. Dessa attribut gör denna metod lätt anpassningsbar av alla laboratorier som redan utför standardmikroinjektioner i zebrafisk. Slutligen, medan denna metod är idealisk för ortopotopinjektioner av zebrafisk hjärntumörer, kan transplantationen av andra tumortyper, såsom lever eller bukspottskörtel, vara viktigare än immunkompetens ( t.ex. om en forskare studerar effekterna av stromal Mikromiljö på tumörtillväxt). I det här scenariotNyutvecklade, immundefektera zebrafiskmodeller kan vara mer lämpliga för utförande av ortotopiska tumortransplantationer 11 .
Detta protokoll har använts för att utföra tumörcellstävlingstest och att injicera dubbelmärkta tumörer. En potentiell behandlingsstrategi för bedömningen av effektiviteten hos kemiska föreningar på tumörgenesen, som innefattar behandlingen av embryon efter transplantationen via tillsatsen av läkemedlet till vatten, diskuterades också. Ett förfarande för behandling ex vivo av tumörceller före transplantation rapporterades också tidigare 17 . Dessutom har transplanterade tumörer sammanslagits för flera omgångar av re-transplantation, vilket kommer att vara fördelaktigt för studier av tumörutveckling och kemoresistans 17 . För närvarande är prekliniska studier beroende av mus xenotransplantat för att bedöma effekten av potentiella föreningar. Men dessa studier är tidskrävandeOch dyrt. Med tanke på den höga bevarandet av onkogena signalvägar mellan zebrafisk och människor 28 , kan det förväntas att denna metod kommer att komplementera konventionella mus- och humana cellstudier för att möjliggöra en snabbare identifiering av effektiva föreningar som går in i prekliniska och kliniska prövningar. I slutändan kan denna metod visa sig vara användbar för snabb kemisk screening av primära patienttumörer, vilket ytterligare kan driva initiativet för personlig medicin. Dock måste villkor för den långsiktiga tillväxten av humana celler i zebrafisk (vuxen eller embryo) fortfarande identifieras.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar de två granskarna för utmärkta förslag och förbättringar av manuskriptet. Vi tackar också Huntsman Cancer Institute / University of Utah för djurhållning och underhåll. Detta arbete finansierades av American Cancer Society (# 124250-RSG-13-025-01-CSM), ett NIH-bidrag (P30 CA042014 CRR-programmet), University of Utah Seed Grant och Huntsman Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
| 50 mL beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
| Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
| Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
| Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
| Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
| Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
| 1,000 µL filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
| 100 µL filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
| 50 mL conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
| 15 mL conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
| 1.7 mL microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
| Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
| Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
| Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
| Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
| Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
| Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
| Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
| Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
| Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
| Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
| Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
| Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
| Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
| Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
| PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
| 12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
| Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
| Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
| N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |
References
- Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer. Mol Ther. 10 (6), 1032-1042 (2004).
- Stephen, R. M., et al. Monitoring the development of xenograft triple-negative breast cancer models using diffusion-weighted magnetic resonance imaging. Exp Biol Med. 237 (11), 1273-1280 (2012).
- Deroose, C. M., et al. Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined small-animal PET, small-animal CT, and bioluminescence imaging. J Nucl Med. 48 (2), 295-303 (2007).
- Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).
- Johnson, J. I., et al. Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials. Br J Cancer. 84 (10), 1424-1431 (2001).
- Kerbel, R. S. Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans - Better than commonly perceived - But they can be improved. Cancer Biology & Therapy. 2 (4), S134-S139 (2003).
- Scholz, C. C., Berger, D. P., Winterhalter, B. R., Henss, H., Fiebig, H. H. Correlation of Drug Response in Patients and in the Clonogenic-Assay with Solid Human Tumor Xenografts. Eur J Cancer. 26 (8), 901-905 (1990).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Cho, S. Y., et al. An Integrative Approach to Precision Cancer Medicine Using Patient-Derived Xenografts. Mol Cells. 39 (2), 77-86 (2016).
- Hiroshima, Y., et al. Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy. Oncotarget. 7 (44), 71696-71702 (2016).
- Moore, J. C., Langenau, D. M. Allograft Cancer Cell Transplantation in Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916, 265-287 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Dranoff, G. Experimental mouse tumour models: what can be learnt about human cancer immunology. Nat Rev Immunol. 12 (1), 61-66 (2011).
- Richmond, A., Su, Y. Mouse xenograft models vs GEM models for human cancer therapeutics. Dis Model Mech. 1 (2-3), 78-82 (2008).
- Bernard, D., Peakman, M., Hayday, A. C. Establishing humanized mice using stem cells: maximizing the potential. Clin Exp Immunol. 152 (3), 406-414 (2008).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Modzelewska, K., et al. MEK Inhibitors Reverse Growth of Embryonal Brain Tumors Derived from Oligoneural Precursor Cells. Cell Rep. 17 (5), 1255-1264 (2016).
- Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Curr Biol. 15 (3), 249-254 (2005).
- Dovey, M., White, R. M., Zon, L. I. Oncogenic NRAS cooperates with p53 loss to generate melanoma in zebrafish. Zebrafish. 6 (4), 397-404 (2009).
- Santoriello, C., et al. Kita driven expression of oncogenic HRAS leads to early onset and highly penetrant melanoma in zebrafish. PLoS One. 5 (12), e15170 (2010).
- Park, S. W., et al. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
- Liu, S., Leach, S. D. Screening pancreatic oncogenes in zebrafish using the Gal4/UAS system. Methods Cell Biol. 105, 367-381 (2011).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
- Langenau, D. M., et al. Cre/lox-regulated transgenic zebrafish model with conditional myc-induced T cell acute lymphoblastic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 6068-6073 (2005).
- Sabaawy, H. E., et al. TEL-AML1 transgenic zebrafish model of precursor B cell acute lymphoblastic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15166-15171 (2006).
- Chen, J., et al. NOTCH1-induced T-cell leukemia in transgenic zebrafish. Leukemia. 21 (3), 462-471 (2007).
- Feng, H., et al. Heat-shock induction of T-cell lymphoma/leukaemia in conditional Cre/lox-regulated transgenic zebrafish. Br J Haematol. 138 (2), 169-175 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Li, P., White, R. M., Zon, L. I. Transplantation in zebrafish. Methods Cell Biol. 105, 403-417 (2011).
- Traver, D., et al. Effects of lethal irradiation in zebrafish and rescue by hematopoietic cell transplantation. Blood. 104 (5), 1298-1305 (2004).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5 (3), 383-394 (2010).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Tenente, I. M., Tang, Q., Moore, J. C., Langenau, D. M. Normal and malignant muscle cell transplantation into immune compromised adult zebrafish. J Vis Exp. (94), (2014).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Geiger, G. A., Fu, W., Kao, G. D. Temozolomide-mediated radiosensitization of human glioma cells in a zebrafish embryonic system. Cancer Res. 68 (9), 3396-3404 (2008).
- Kitambi, S. S., et al. Vulnerability of glioblastoma cells to catastrophic vacuolization and death induced by a small molecule. Cell. 157 (2), 313-328 (2014).
- Lally, B. E., et al. Identification and biological evaluation of a novel and potent small molecule radiation sensitizer via an unbiased screen of a chemical library. Cancer Res. 67 (18), 8791-8799 (2007).
- Vittori, M., Motaln, H., Turnsek, T. L. The study of glioma by xenotransplantation in zebrafish early life stages. J Histochem Cytochem. 63 (10), 749-761 (2015).
- Yang, X. J., et al. A novel zebrafish xenotransplantation model for study of glioma stem cell invasion. PLoS One. 8 (4), e61801 (2013).
- Zhao, H., Tang, C., Cui, K., Ang, B. T., Wong, S. T. A screening platform for glioma growth and invasion using bioluminescence imaging. Laboratory investigation. J Neurosurg. 111 (2), 238-246 (2009).
- Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Dis Model Mech. 9 (9), 1063-1065 (2016).
- Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126 (17), 3757-3767 (1999).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- Solin, S. L., Shive, H. R., Woolard, K. D., Essner, J. J., McGrail, M. Rapid tumor induction in zebrafish by TALEN-mediated somatic inactivation of the retinoblastoma1 tumor suppressor rb1. Sci Rep. 5, 13745 (2015).
- Ju, B., et al. Oncogenic KRAS promotes malignant brain tumors in zebrafish. Mol Cancer. 14, (2015).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. J Vis Exp. (96), e52540 (2015).
- Rampazzo, E., et al. Wnt activation promotes neuronal differentiation of glioblastoma. Cell Death Dis. 4, (2013).
- Lal, S., La Du,, Tanguay, J., L, R., Greenwood, J. A. Calpain 2 is required for the invasion of glioblastoma cells in the zebrafish brain microenvironment. J Neurosci Res. 90 (4), 769-781 (2012).
- Eden, C. J., et al. Orthotopic models of pediatric brain tumors in zebrafish. Oncogene. 34 (13), 1736-1742 (2015).
