Summary
השתלת תאי סרטן היא כלי חשוב לזיהוי מנגנוני סרטן ותגובות טיפוליות. הטכניקות הנוכחיות תלויים בבעלי חיים חסרי יכולת. כאן, אנו מתארים שיטה להשתלת תאים דג הזברה תאים לתוך עוברי המוסמכת-המוסמכת לניתוח לטווח ארוך של התנהגות התא הגידול בתגובות סמים vivo .
Abstract
השתלת תאים סרטניים היא טכניקה חשובה להגדרת המנגנונים השולטים בצמיחת תאים סרטניים, בהגירה ובתגובה המארחית, וכן בהערכת התגובה הפוטנציאלית של המטופל לטיפול. השיטות הנוכחיות תלויים בעיקר בשימוש בחיות סינגניות או חיסוניות, כדי למנוע דחייה של השתל הגידול. שיטות כאלה מחייבות שימוש זנים גנטיים ספציפיים, כי לעתים קרובות למנוע ניתוח של אינטראקציות תאים סרטניים החיסונית ו / או מוגבלים רקע גנטי מסוים. שיטה חלופית דג הזברה מנצל את מערכת החיסון שפותח בשלמותו של המוח העוברי לפני 3 ימים, שבו תאים סרטניים מושתלים לשימוש מבחני לטווח קצר ( כלומר, 3 עד 10 ימים). עם זאת, שיטות אלה לגרום קטלני המארח, אשר מונע את המחקר לטווח ארוך של התנהגות תאים סרטניים בתגובה לתרופה. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה להשתלה אורטופטית לטווח ארוך של רקמת גידול דג הזברה של המוח באל החדר הרביעי של דג הזברה בן 2 ימים החיסון המוסמכת. שיטה זו מאפשרת: 1) מחקר ארוך טווח של התאים התא הגידול, כגון פלישה והפצה; 2) תגובה מתמשכת של הגידול לסמים; ו 3) השתלה מחדש של גידולים לחקר האבולוציה הגידול ו / או את ההשפעה של רקע גנטי שונים המארח. לסיכום, טכניקה זו מאפשרת לחוקרי סרטן להעריך engraftment, פלישה, צמיחה באתרים מרוחקים, כמו גם לבצע מסכים כימיים מבחני תחרות התא במשך חודשים רבים. פרוטוקול זה ניתן להרחיב מחקרים של סוגי גידול אחרים וניתן להשתמש בהם כדי להבהיר מנגנונים של chemoresistance ו גרורה.
Introduction
ההשתלה של תאים סרטניים לתוך בעלי חיים נפגעת החיסון, במיוחד xenografts העכבר, היא טכניקה בשימוש נרחב המשמש ללמוד מנגנונים השליטה התפשטות תאים סרטניים 1 , 2 , הישרדות, פלישה, גרורות 3 , 4 , כמו גם כדי לספק פלטפורמה עבור סיקור סמים 5 , 6 , 7 . לאחרונה, השתלת דגימות גידולים ראשוניות לעכברים שנפגעו במערכת החיסונית שימשה ליצירת מודלים של קסנוגרפט (PDX) הנגזרות על ידי המטופל לצורך בדיקות אבחון ופרה-קליניות, והיא עמוד השדרה של היוזמה הרפואית 8 , 9 , 10 , 11 . עם זאת, ראיות משמעותיות מראה כי modulating את החיסון syגזע יכולה להיות השפעה דרמטית על התנהגות הגידול ותוצאות החולה 12 , 13 . זה הביא את העיצוב מחדש של טכניקות המבוססות על xenograft כדי לכלול עכברים "אנושיים", שבהם המערכת החיסונית של העכבר היא מחדש על ידי שיתוף השתלת תאים החיסון האנושי עם תאים סרטניים. עם זאת, גישה זו עדיין מאתגר מבחינה טכנית, עם reproducibility ו רעילות משתנה הקשורים הטכניקה, בנוסף העלות המשמעותית 14 , 15 . לכן, יש צורך בטכניקות השתלה חדשות בבעלי חיים בעלי יכולת חיסונית כדי להאיץ את גילוים של מנגנונים ספציפיים החיסוניים ושל הגידול של התקדמות הסרטן ותגובת הסמים.
דג הזברה הם מודל חיות אלטרנטיבי לחקר הסרטן האנושי, עם למעלה מ -20 דגמי סרטן עכשיו הוקמה 16 , כולל מוח מאוד ממאיר 17 , מלח נומה 18 , 19 , 20 , סרטן הלבלב 21 , 22 , כמו גם לוקמיה רבים 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . שתי תכונות של מערכת דג הזברה הופכות אותו לנכון במיוחד לחקר הסרטן: 1) הבהירות האופטית של בעלי חיים שקופים מאפשרת הדמיה ישירה של התנהגויות תאים סרטניים ( כלומר, התפשטות, הישרדות, פלישה והפצה) תוך שימוש בטכניקות מיקרוסקופיות פשוטות 2) נקבה דג הזברה יכול לייצר עד 200 עוברי ליום, המאפשר קנה המידה מהירה של מספרי בעלי חיים עבור בדיקות גנטיות או סמים בעלות נמוכה. בנוסף, הגנום הסרטני של דג הזברה ובני אדם שמורים מאוד (כולל אונקוגנים וגנים מדכאי גידולים)F "> 28, המאפשרת לתגליות מכניסטיות ותרופות לתרגם במהירות למערכות יונקים.מאפיינים אלה גם להפוך את דג הזברה מודל חיות אידיאלי עבור טכניקות השתלה, אשר מנצלים את הדמיה, מדרגיות, ועלות נמוכה של המערכת.
מחקרים קודמים השתלת הגידול של דג הזברה נפגעת החיסון יש להקל על זיהוי של יכולות חידוש עצמי, ממאירות הגידול, פלישה / הפצה 11 , 29 . מחקרים קצרי טווח על התנהגות תאים סרטניים יכולים להתבצע לאחר ההשתלה למבוגרים המוקרנים γ, שמערכת החיסון שלהם מדוכאת ביעילות במשך 20 ימים 11 , 30 . הטיפול דג הזברה מבוגר עם dexamethasone מדכא B- ו- T תאים עד 30 יום לפני הדחייה מתרחשת 31 . אסטרטגיה אחרת פחות נפוצה מעסיקה זנים דג הזברה משובטיםהמאפשרים חקירה ארוכת טווח במארח החיסון המוסמכת. עם זאת, רק מספר מוגבל של זנים משובטים נוצרו וקשה לשמור בשל פוריות נמוכה. בנוסף, רוב דגמי דג הזברה הוקמה נוצרו ברקעים גנטיים אחרים, ולכן אלה לא ניתן להשתיל לתוך זנים משובטים מבלי לדכא את המערכת החיסונית 11 , 33 , 34 . גישות חדשות יותר כדי לשפר את השתלות לטווח ארוך מחקרים כוללים את הפיתוח של מוטציה rag2 E450fs מוטציה, עם B- התאים B ו- T תאים, אשר שימש בהצלחה להשתלות מספר רב של סרטן 35 , 36 . כדי לעקוף את הדרישה של קווי דג הזברה משובטים או מארח החיסונית החיסונית, מספר קבוצות השתמשו בשלב מוקדם עוברי ( כלומר, > 72 כ"סOst-fertilization (hpf)) עבור השתלת תאי גידול אנושיים, מאחר שעוברים אלה עדיין לא פיתחו מערכת חיסונית אדפטיבית 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 . עם זאת, שיטות אלה מוגבלות לניתוח קצר טווח של התנהגות תאים סרטניים או בתגובה לתרופה (בדרך כלל פחות משבועיים), משום שתאי הסרטן האנושיים או טכניקת ההשתלה עצמם הורגים את המארח, ומניעת מחקרים ארוכי טווח והשתלה מחדש.
פרוטוקול זה משתנה שיטת השתלות עובריים השתנה לתוך לומן של החדר הרביעי של 2 יום שלאחר הפריה (dpf) המוח העובר. זה ממזער את הרעילות למארח והוא יכול להיות משולב עם דג הזברה דגמי המוח עבור engraftment לטווח ארוך של תאים סרטניים. לכן, טכניקה זו אלל-השתלה מחדש של תאים סרטניים למארחים חדשים על פני דורות רבים, ומאפשר מחקרים עתידיים על הטרוגניות הגידול, מארח / תגובות החיסון, תגובות סמים, או פוטנציאל גרורתי. שיטה זו היא גם פשוטה, יעילה, וניתן להרחבה, עד 300 השתלות יכול להתבצע על ידי משתמש יחיד ליום, עם עד 90% engraftment. זה מאפשר התפשטות מהירה של גידולים ראשוניים בודדים לתוך מאות עוברים ב 2 dpf עבור פרויקטים גנטיים או סמים הקרנה או ישירות לדמיין את ההתנהגות במוח הגידול התא ברקעים שונים המארח במשך חודשים רבים.
Protocol
כל הנהלים בבעלי חיים אושרו ועקבו אחר הנחיות הטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת יוטה מוסדיים טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה (IACUC # 16-03019).
1. הכנת הציוד עבור Microinjection
- הכנת לוחית ההזרקה.
- הכן פתרון 50 מ"ל של אגרוז 1.2% מומס במי ביצים (0.6 גרם / L אקווריום מלח במים אוסמוזה הפוכה + 0.01 מ"ג / L מתילן כחול). מרתיחים את הפתרון עד agarose מתמוסס ולאחר מכן להשלים על ידי הוספת 0.05 מ"ג / L מתילן כחול. יוצקים 25 מ"ל של הפתרון הסופי לתוך צלחת 10 פטרי ס"מ ולאפשר לו לחזק. מניחים את 25 מ"ל הנותרים של פתרון agarose באמבט מים 42 מעלות צלזיוס עד מוכן לשלב 1.1.2.
- הגדר 2 קוטר אינץ 'במרכז במרכז משטח מוצק ויוצקים את 25 מ"ל הנותרים של agarose 1.2%.
הערה: זה יוצר משטח הזרקת על פריפריה של הצלחת הליבה במרכז, אשרמספק שטח לבחון את גודל המחט ואת עקביות ההשעיה הגידול.- שמור על צלחת ההזרקה על 28 מעלות צלזיוס למשך לפחות 30 דקות לפני ההזרקה או 4 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
- הכנת מחטים הזרקת.
- הפוך את המחטים על ידי משיכת נימים 10 ס"מ עם מימד חיצוני של 1.2 מ"מ מימד פנימי של 0.9 מ"מ (ללא חוט) לתוך שתי מחטים על חולץ מחט.
הערה: כל מחט צריך למדוד 6 ס"מ באורך כולל, שם כ 1.5 ס"מ בסוף הוא מחודדות. - בזהירות במקום את המחט על שקופית מיקרוסקופ עטוף סרט פלסטיק פרפין. השתמש סכין גילוח לחתוך את קצה המחט בזווית של 45 ° כדי ליצור מחט עם פתח בקצה.
הערה: בדרך כלל, 0.1 מ"מ עד 0.3 מ"מ של קצה המחט מוסר. טיפ משופע אינו נדרש לבצע את הזריקות.
- הפוך את המחטים על ידי משיכת נימים 10 ס"מ עם מימד חיצוני של 1.2 מ"מ מימד פנימי של 0.9 מ"מ (ללא חוט) לתוך שתי מחטים על חולץ מחט.
- הכן את הגדרת microinjection.
- <Li> מסדר סטנדרטי microinjection ההתקנה, כולל stereomicroscope, מניפולטור, ו microinjector להשתלה.
2. הכנת עוברי להשתלה
- איסוף עד 500 עוברי w2 mitfa 44 (או עוברים של גנוטיפים דג הזברה אחרים כפי שהוגדר על ידי המשתמש) כמתואר 45 ולשמור על חממה 28 ° C.
- Dechorionate העוברים ב 24 hpf על ידי הוספת 100 μL של פתרון 10 מ"ג / מ"ל פרוטאז קוקטייל מדולל במי ביצים רוק בעדינות כ 20 דקות. שוטפים את העוברים 3 פעמים עם מי ביצים טריות כדי להסיר את פרוטאז שיורית.
- מסך העוברים ב 48 hpf עבור השלב ההתפתחותי המתאים, כפי שהוגדר על ידי קריטריונים סטנדרטיים סדרת הזמני 45 .
הערה: יש להשתמש רק בעוברים נורמליים ומורפולוגיים בצורה נכונה לצורך ההשתלה. - לְהַרְדִיםכעשרים 48-hpf עוברים במי ביצים המכיל 0.002% Tricaine-S בצלחת פטרי. אישור הרדמה נאותה על ידי התבוננות על הפסקת התנועה.
3. ביצוע השעיה תא הגידול
הערה: דג הזברה דגמי המוח יכול להיווצר על ידי שילובים הנדסיים גנטית של אונקוגנים גנים מדכאי הגידול 17 , 46 , 47 . הנה, sox10 מקדם מונע NRAS WT , p53 zdf1 / zdf1 CNS-PNET דג הזברה המודל שימש, כפי שתואר לאחרונה 17 .
- להרדים דגים נושאי גידול במוח, אשר נטל הגידול שלהם הוא כ 20% של גודל הגוף הכולל באמצעות מינון יתר של Tricaine-S 0.4% ואחריו טבילה במי קרח בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי IACUC.
- לנתח את הגידול שכותרתו fluorescently עם סכין גילוח ו פינצטה תחת פלואורסצנטימיקרוסקופ באמצעות טכניקה סטרילית ומקום זה 5 מ"ל של 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS).
הערה: שיטות דיסקציה מדויקות יהיו מוגדרים על ידי המשתמש ותלות בסוג הגידול ובמיקום הרקמות. ראה את הפניות המפורטות עבור נהלים מפורטים לנתיחה של איברים דג הזברה שונים וגידולים במוח 17 , 48 . - באופן ידני לשבש את מסת הגידול באמצעות פיפטה p1000 עד פתרון מעונן, אחיד מפתחת. הסרת חלקיקים גדולים עם קצה פיפטה או באמצעות מסננת תא 40 מיקרומטר (זה תלוי בגידול). צנטריפוגה ההשעיה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות ב x0 290 ולהסיר את supernatant.
הערה: פלואורסצנטי המופעל מיון תאים (FACS) לא מבוצעת כדי לבודד תאים סרטניים. זה מאפשר השתלת אוכלוסייה הטרוגנית של תאים סטרומה, החיסונית, ואת הגידול. - Resuspend תא הגידול גלולה μL 100 של PBS סטרילית ולהעביר אותו מיקרו 1.5 מ"לצינור צנטריפוגה. קח 5 μL ההשעיה התא לדלל אותו μL 250 של PBS. ספירת מספר תאים באמצעות hemocytometer. צנטריפוגה ההשעיה במשך 3 דקות ב x0 290, להסיר את supernatant, ו resuspend גלולה סטרילי PBS כדי להשיג את הריכוז התא הרצוי.
הערה: בדרך כלל, תאים resuspended ב 30-40 μL של סטרילי PBS התשואה פתרון זה צמיג אטום (ריכוז התא ≥100 תאים / nL) ונוטים לייצר את ההשתלות המוצלחות ביותר. הכדאיות התא אינה מוערכת. - אחסן את ההשעיה הגידול על בלוק חום 28 ° C במהלך ההשתלה.
4. הזרקת ההשעיה הגידול לתוך החדר הרביעי של העובר 2-DPF
- העברת 10-20 עוברים הרדים (משלב 2.4) לפריפריה של צלחת ההזרקה באמצעות פיפטה העברת; העוברים צריכים ליפול רוחבית על צלחת ההזרקה, עם החדרים גלוי בבירור ונגיש. השתמש בדיקה זווית כדי להתאים את העוברים לפי הצורך ומיקום אותם מהקצה החיצוני של צלחת ההזרקה.
- טען 1-2 μL ההשעיה תא הגידול לתוך מחט הזרקת באמצעות ג'ל טעינה טיפים פיפטה ולהכניס את המחט לתוך מניפולטור.
- ידנית להוריד את המניפולטור, מחזיק את המחט בזווית של 45 °. התאם את הכפתורים על micromanipulator ב x, y, ו- z כיוונים עד המחט הוא רק מעל וכ 5 מ"מ בצד ימין של הראש העובר. להסתכל דרך העיניים של stereomicroscope ולאט לאט להתאים את micromanipulator בכיוון x עד מחט חודר החדר הרביעי של העובר. אל תאפשר את המחט כדי לחדור את הלב או חלמון.
- דחוף את דוושת הרגל המצורפת microinjector להזריק את ההשעיה תא הגידול.
הערה: לחץ ההזרקה והזמן ישתנו בהתאם לגודלם של המחט, אך נקודת התחלה טובה היא 5-10 PSI ו- 50 - 100 ms.נפח של תאים מוזרק הגידול ניתן להעריך עם תקן טיפת שמן טכניקות באמצעות הזרקה לתוך שמן מינרלי, אם תרצה 49 . הזרקות של 500 pL עם קוטר ירידה של 0.1 מ"מ בדרך כלל לתת את התוצאות הטובות ביותר.
- דחוף את דוושת הרגל המצורפת microinjector להזריק את ההשעיה תא הגידול.
- בעדינות לשטוף את העוברים מוזרק את צלחת ההזרקה לתוך צלחת פטרי באמצעות מי ביצים טריים. לשמור על העוברים במי ביצים עבור ההליכים הנותרים או עד שהם גדלים טנקים (כמתואר בשלב 4.9.1).
- בדוק את העוברים מוזרק תחת stereomicroscope פלואורסצנטי. ודא כי לחץ הזרקת, זווית, גודל המחט, צמיג צמיחת תאים התוצאה תאים סרטניים מילוי 25-50% של שטח החדר. התאם פרמטרים אלה לפי הצורך.
- חזור על שלבים 4.1-4.5 עבור כל עוברי הנותרים. להרדים את העוברים נוספים לפי הצורך (המתואר בשלב 2.4).
הערה: משתמש מנוסה יכול להזריק עד 300 עוברי מעל 3-4 שעות. - מניחים את העוברים בחזרה28 ° C חממה לילה.
- למחרת, להעריך את הישרדות העובר על ידי בחינת תכונות מורפולוגיות ופיזיולוגיות, כגון הלב נורמלי התפתחות המוח, כמתואר 45 .
- להקרנה, להרדים את העוברים, כמתואר בשלב 2.4, ב 1 יום שלאחר השתלת (dpt).
- השתמש פיפטה העברת להוסיף methylcellulose 4% על גבי צלחת פטרי ולהוסיף את העוברים לירידה methylcellulose. אוריינט את העוברים (הצד הגחון מול מקור האור) באמצעות בדיקה זווית המסך עבור גודל engraftment עקבית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הסר כל עוברי עם תאים סרטניים לא מוגבל לחדר החדר או אלה המכילים תאים סרטניים emcompassing פחות מ 25% של שטח החדר.
הערה: engraftment עקבי מוגדר כעוברים עם מסת גידול אחת המקיפה 25-50% של שטח החדר 17 . למטרות סקר, השתמש פלואורסצנציה של sTereomicroscope עם מטרה 1X, 0.15 הצמצם המספרי, הגדלה החל 0.7-1.6X, וזמן חשיפה של 50 אלפיות לשנייה. עבור כל התמונות, לנצל את ערוץ שדה בהיר בנוסף גם את ה- GFP או ערוץ RFP. - עבור תחזוקה של גידולים, במקום עוברים המושתלים בטנקים לגדול 45 ב 8 dpf (6 dpt).
- השתמש פיפטה העברת להוסיף methylcellulose 4% על גבי צלחת פטרי ולהוסיף את העוברים לירידה methylcellulose. אוריינט את העוברים (הצד הגחון מול מקור האור) באמצעות בדיקה זווית המסך עבור גודל engraftment עקבית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הסר כל עוברי עם תאים סרטניים לא מוגבל לחדר החדר או אלה המכילים תאים סרטניים emcompassing פחות מ 25% של שטח החדר.
5. הדמיה עוברים מושתלים עבור התנהגויות סלולר
- להרדים את העוברים ב 3-8 dpf (1-6 dpt) ו הר (הצד הגב מול קסרבליפ) ב 1.2% נמוך להמיס agarose. בצע הדמיה לשגות זמן של העוברים רכוב באמצעות מיקרוסקופ confocal לייזר confocal עבור אורך הזמן הרצוי לדמיין התנהגויות הסלולר, כגון הגירה, חלוקת התא, או תא תאים אינטראקציות, לפי הצורך 38 , 43 , 53 .
הערה: השתמש ביחס גובה-רוחב של 1,024 x 1,024, מהירות סריקה של 8 & #181; s / pixel. להעסיק סריקה ממוצעים ולהגדיר את הממדים עומק z כדי להבטיח את לכידת גוש המסה כולו (1,000-1,500 מיקרומטר). בנוסף, לבצע 4 שעות שעה לשגות ניסויים, רכישת תמונה כל 10-15 דקות באמצעות מטרה 40x, כדי לפקח על התנהגויות פולשניות. הרגישות גלאי ישתנה בהתאם לעוצמת המסה הגידול, ואת כוח לייזר יהיה תלוי מיקרוסקופ, אבל זה מומלץ בדרך כלל להיות בין 15 ל 40%. - לאחר ההדמיה תושלם, חינם העובר רכוב מן agarose באמצעות בדיקה זווית ולהעביר אותו בצלחת פטרי עם מי ביצים טריים.
6. סמים מינהל עוברי מושתלים הערכה של נטל הגידול 17
- להרדים עוברי ב 3 dpf ו לכוון אותם methylcellulose 4%, עם הצד הגחון מול מקור האור. תמונה עוברי טרום טיפול באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 17 .
- פלהלסה"נ את העוברים המושתלים ב 3 dpf בצלחת 12 גם, עם 10 עוברי לכל טוב 0.5 מ"ל של מי ביצים. הוסף את הכמות המתאימה של התרופה כדי להשיג את הריכוז הסופי הרצוי ( למשל, 50 מיקרומטר MEK inhibitor) ולהחזיר את העוברים ל 28 ° C חממה. למחרת, להסיר את התרופה מטופלים ביצה במים עם פיפטה העברת דקים ולהוסיף טיפול טרי. חזור על זה כל יום עד עוברים להגיע 8 dpf.
- ב 8 dpf, להסיר את העוברים מן הטיפול בסמים ומניחים אותם ביצים טריות. להרדים את העוברים ואת האוריינט (צד הגחון מול מקור האור) ב methylcellulose 4%. תמונה עוברי שלאחר הטיפול באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לכמת את שטח הגידול באמצעות התוכנה המתאימה, כמתואר 17 .
- להפריד את העוברים בהתאם לכל טיפול ומניחים אותם טנקים לגדול. לאחר 4-9 שבועות, להרדים את הדג להעריך אותם עבור נטל הגידול הכולל באמצעות stereomicroscope פלואורסצנטי סטנדרטי, כמו ד17 .
Representative Results
השתלת הגידול ו engraftment
מתאר מתמטי של הפרוצדורה מיוצג באיור 1 . תאים בתאי fluorescently שכותרתו מופקים מאתר האיברים העיקרי, ההשעיה תא בודד מופק להשתלה לתוך החדר הרביעי של 2- dff mitfa w2 עוברי דג הזברה 44 . איור 2 מציג את התוצאות נציג עבור שיטה זו באמצעות מודל דג הזברה של מערכת העצבים המרכזית פרימיטיבי עצבי ectodermal גידול (CNS-PNET), שבו האמרגן sox10 כוננים ביטוי של NRAS wildtype או NRAS מופעל התמזגו mCherry ב p53-מבשר תאים מבשר oligoneural 17 . מיטפה w2 דג הזברה 44 מוטציה, אשר חסר melanophores, שימשו יותר בקלות לדמיין את תאי הגידול לאחר השתלה ו / או לבגרות. אחר מוטציות פיגמנט יכול לשמש גם כדי לספק בהירות הדמיה נוספת, כגון Casper 50 . מוקדם ככל 24 שעות שלאחר ההשתלה, תאים סרטניים ניתן לראות פולשים לתוך רקמת המוח שמסביב ( איור 2 א , 3 dpf, חיצים). גידול שתלים ממשיכים לצמוח בחדר וברקמת המוח הסובבת במהלך השבוע הבא ( איור 2 א , 8 dpf). בשלב זה, פלואורסצנטי ניתן גם לראות באזור הכליות ( איור 2 א , כוכביות). זה יכול להיות בגלל הכליות סינון פסולת הסלולר מן ההשתלה, אשר עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים להשתמש צבעים ניאון כמו assay להעריך תפקוד כליות 51 . תאים סרטניים ממשיכים להתרבות לפלוש, כך על ידי 28 dpf, מסה הגידול ניתן לראות בכל המוח דג הזברה ( איור 2 א , 28 dpf).
טכניקה זו מאפשרת השתלה מהירה של תאים סרטניים למאות עוברים עם עקביות לשחזור, כמו אתר ההזרקה יכול להיות ממוקד במדויק עם נזק מזערי המארח. קבוצה מייצגת של עוברים המושתלים עם mCherry שכותרתו תאים סרטניים במוח מוצג בלוח העליון של איור 2 ב . Engraftment הגידול מושגת בדרך כלל 80-90% של עוברים, השתלות הגידול נמשכים לבגרות; שלוש דוגמאות נציג מוצגים לוחות התחתון של איור 2 ב . זה מאפשר את השתלות הגידול להיות שנקטפו וקפא או מחדש מושתלים על פני כמה דורות.
הפלישה הגידול ותגובות סמים
איור 3 א מראה תוכנית השתלת שיתוף שבו שני גידולים שונים שכותרתו או GFP (גידול A) או mCherry (גידול B) נקצרים על ידי טום שלםאו דיסוציאציה (שימו לב כי FACS אינו בשימוש כאן, אבל FACS מיון תאים סרטניים ניתן להשתמש במידת הצורך). גידול A ו- B יכול להיות ממקומות שונים, המושרה עם אונקוגנים שונים, או המושרה ברקעים גנטיים שונים. כל גידול מעובד לתוך ההשעיה תא בודד, תאים סרטניים אז מתערבבים יחד ביחס 1: 1 ו מושתלים לתוך העובר 2-dpf. מאפייני הגידול, כגון engraftment, צמיחה, הפלישה, והפצה של הגידול A לעומת הגידול B ואז ניתן לראות באותו המארח המאפשר בקרה פנימית על הטכניקה ועל רקע גנטי.
בתרשים 3B , NRAS -driven, mCherry שכותרתו דג הזברה CNS-PNET מן הטקטום האופטי ואת ה- GFP שכותרתו CNS-PNET מן המוח הקטן היו לקצור ומעובד לתוך השעיות תא בודד. תאים נספרו, ומספר שווה של תאים מכל גידול היו מעורבים יחד ומשתלבים לעוברים דו-גפיים. ארבעה דAys לאחר ההשתלה, העוברים היו צילמו עם מיקרוסקופיה confocal. המוצג הוא עוברי נציג הוכיח כי תאים טקטום הגידול (אדום) נודדים יותר בהרחבה למוח המארח (חיצים) מאשר הגידול cerebellar.
עוברים המושתלים עם תאים סרטניים שכותרתו fluorescently ניתן להשתמש במשטרי טיפול תרופתי לזהות תרכובות המעכבות גידול הגידול. איור 3C הוא ציר זמן טיפוסי לטיפול והדמיה השתלות הגידול. 24 שעות שלאחר ההשתלה, עוברים ניגשים לגודל engraftment עקבי ו לפצל לקבוצות טיפול. בדוגמה המוצעת, עוברים המושתלים עם NRAS -driven, mCherry שכותרתו דג הזברה CNS-PNETs מטופלים עם 50 מיקרומטר dimethyl sulfoxide (DMSO) או מעכב MEK (AZD6244). עוברים מטופלים במשך 5 ימים צילמו 8 dpf, כפי שמתואר באיור 3 ג . איור 3D (לוחות שמאל) מציג representativ חיות משתי קבוצות הטיפול. מעכבי MEK מטופלים יש כמות נמוכה משמעותית של הקרינה מאלה שטופלו DMSO, כמתואר 17 . לאחר החיות הם צילמו, הם מועברים טנקים ללא סמים פיקוח על גידול הגידול במשך חודשיים. בדוגמה המוצעת, טיפול מעכבי ה- MEK גורם לתגובה עמידה בדגים הבוגרים ( איור 3 איור , לוחות ימין). לפרטים נוספים על טיפול תרופתי, הדמיה וכימות, ראה התייחסות 17 .
איור 1: פרוטוקול סכמטי של השתלת תאים סרטניים לתוך החדר הרביעי של עוברי דג הזברה 2-dpf. כללי סכמטי של סעיפים 3 עד 4 של הפרוטוקול כולל ניתוח נקודות קצה אלטרנטיביות (סעיפים 4.9-6)./55712/55712fig1large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: Engraftment הגידול והקדמה. (א) דג הזברה העיקרי CNS-PNET תאים סרטניים שכותרתו עם mCherry הושתלו לתוך החדר הרביעי של 2-dpf עוברים. ב 3 dpf, תאי הגידול נפלטים לתוך רקמת המוח שמסביב (חיצים). ב 8 dpf, תאי הגידול גדלים בחדר; תאים סרטניים אדומים נמצאים גם ברקמת המוח הסובבת כליות (כוכביות). ב 28 dpf, תאים גידולים פלשו לגדול ברחבי המוח המארח. (B) הלוח העליון. שבעה עוברי 3-dpf המושתלים עם mCherry שכותרתו תאים סרטניים דג הזברה. תאים סרטניים יכולים להיות מושתלים באופן עקבי למאות עוברים, עם שיעורי engraftment גבוהה ( כלומר, בדרך כלל עוברים 85/100). התיכון ולוחות התחתונה. שלושה דג מבוגר מייצג עם גידולים המושתלים 4-8 שבועות לאחר ההפריה (wpf). גידולים יכולים להיות דמיינו ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: השוואה בין הפלישה הגידול ותגובה לסמים. ( A ) CNS-PNETs 17 מ טקטום אופטי או המוח הקטן מסומנים עם mCherry או GFP, בהתאמה, מעובד לתוך ההשעיה תא בודד, מעורבב יחד ביחס 1: 1, ושיתוף השתיל לתוך 2-dpf עוברים. ( ב ) עובש 6-dpf שיתוף השתיל עם השעיית מעורבות של GFP שכותרתו תאים סרטניים cerebellar ו mCherry שכותרתו תאים סרטניים מן הטקטום אופטי. הבדלים בתכונות הפולשניות של כל גידול ב- tהוא הנמען אותו ניתן לראות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדוגמה זו, תאי הגידול שכותרתם mCherry נודדים באופן נרחב יותר מאלה שכותרתם ב- GFP (חצים). ( ג ) ציר הזמן לטיפול תרופתי על עוברים המושתלים עם תאים סרטניים. ( D ) תמונות של בעלי חיים מייצגים בסוף טיפול הטיפול (8 dpf) וב 8 שבועות לאחר הטיפול (8 wpf), עם שליטה DMSO או מעכב 50 מיקרומטר MEK. נטל הגידול ניתן למדוד על ידי כימות פלואורסצנטי, כמתואר 17 . בניסוי זה, הצמיחה של תאי סרטן שכותרתו mCherry מצטמצמת בעוברים עם מעכבי MEK ומתרגמת לתגובה עמידה למבוגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
פרוטוקול זה פרטים assay השתלה פשוטה ויעילה הכוללת הזרקת תאים סרטניים דג הזברה לתוך החדר של העובר 2-dpf כי יפתחו מערכת החיסון המוסמכת לחלוטין. עד כה, דג הזברה CNS-PNET 17 ומלנומה (נתונים לא מוצגים) כבר השתיל בהצלחה למחקרים לטווח ארוך של התנהגות התא הגידול הפלישה. השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה כוללים הבטחת המחט המתאימה נשא גודל ואת ההשעיה תא הגידול הנכון כראוי עוברי המארח anesthetizing. עבור כל חוקר בודד, אופטימיזציה נוספת של טכניקה זו עשויה לכלול את ההתאמה של ריכוז תאי הגידול, לחץ הזרקה, ואת העובר אוריינטציה. בנוסף, יכולה להיות הטרוגניות בצמיגות של השעיות שמקורן בגידולים שונים, ולכן סוגים שונים של גידולים עלולים להיות פחות או יותר קשים להשעייה מחדש ולהשתלה. עם זאת, על ידי התאמת המחט נשא את גודל ושימוש diffeדילולים להשכרה של ההשעיה הגידול, ניתן להתגבר על קשיים הקשורים צמיגות הגידול.
מניסיוננו, הסיבות הנפוצות ביותר עבור תאים דלילים / מסת תאים לא עקביים בחדר הם כדלקמן: 1) ההשעיה תא הגידול הוא מדולל מדי; 2) המחט נשא את גודל קטן מדי; 3) זמן ההזרקה והלחץ נמוכים מדי; ו / או 4) רקמות הנותרים לא מסוננים מן הגידול והם תקועים במחט. כאשר ההשעיה תא הגידול זורם מתוך החדר לאחר הזריקה, סביר להניח בשל: 1) המיקום של המחט נגד הרצפה של החדר; 2) לחץ הזרקת זמן גבוהה; ו / או 3) מחט נשא גודל גדול מדי. הישרדות נמוכה של עוברים המושתלים יכולה להיגרם על ידי: 1) עוברים הרדמה במשך תקופה ארוכה של זמן; 2) עוזב עוברים על צלחת ההזרקה להתייבש; 3) הזרקה של בועות אוויר לתוך החדר; ו / או 4) איברים חיוניים, כגון המוחהלב, כי המחט עברה דרך החדר.
שיטות קודמות של השתלת הגידול במוח מבוגר או דג הזברה עובריים מסתמכים על דיכוי חיסוני במבוגרים (גנטית, פרמקולוגית או באמצעות קרינה) או מוגבלים למחקרים קצרי טווח של תאים אנושיים או עכברים בעוברים 38 , 43 , 52 , 53 , 54 . לדוגמה, גידולים במוח העכבר יכול להיות מוזרק intranasally לתוך dexamethasone-immunosuppressed, 30-dpf, דג הזברה לנוער לשימוש לטווח קצר (~ 2 ימים) לפני בדיקות קליני סמים 54 . עם זאת, האתר של הזרקת בניסויים אלה הוא מוסתר על ידי הגולגולת ואת רקמות המוח ואת התוצאות הסבירות נזק לרקמת המוח הרגילה, אשר מפחית את הכדאיות המארחת ויעילות engraftment. שיטה נוספת המתוארת לאחרונה כרוכה בהזרקה של גלובוס אנושישורות תאים האחרון לתוך אזור המוח התיכון של עוברי דג הזברה, אשר אפשרה ניתוח לטווח קצר של צמיחה, פלישה, ותגובת סמים 43 . שוב, המיקום המדויק של אתר ההזרקה משתנה ונזק סביר לרקמה רגילה. לכן, שיטות קודמות של השתלות מוח עובריות לעיתים קרובות לסכן את הכדאיות של המארחים, הגבלת מחקרים אלה לטווח קצר ניתוח ( כלומר, 2 עד 14 ימים), גרימת השתנות מוגברת בין הזרקות בודדות בשל אתרי הזרקה מוסתר, ניתוח לטווח ארוך של התנהגויות התא תגובות סמים או השתלה מחדש על פני דורות מרובים.
השיטה המתוארת כאן כתובות המגבלות הנוכחיות דג הזברה טכניקות השתלת החיסון נפגעת על ידי המאפשר לחוקרים: 1) להזריק לשחזור באותו מקום, עם נזק מינימלי לרקמה הסובבת; 2) לדמיין ישירות את האתר של הזרקת למקסםיעילות engraftment; 3) השתלת מאות עוברים ביום; 4) לאפשר לגידול לצמוח בחוסן המוסמכת בעלי חיים; 5) לאפשר ניטור של התנהגות תאים סרטניים ותגובות עמידות על פני החיים של דג הזברה; ו 6) לאפשר השתלה מחדש של גידולים על פני דורות רבים עבור מחקרים פוטנציאליים על אבולוציה הגידול או מנגנוני הישנות סמים. יתר על כן, פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לנצל כל גנוטיפ דג הזברה להערכת התגובה המארחת, כולל אוכלוסיות שונות החיסון. תכונות אלה להפוך את השיטה הזו בקלות להתאמה על ידי כל מעבדה כי כבר מבצע microinjections תקן דג הזברה. לבסוף, בעוד שיטה זו אידיאלית להזרקות אורטופוטיות של גידולי מוח דג הזברה, כאשר השתלת סוגים אחרים של הגידול, כגון כבד או לבלב, האתר האורתופטי עשוי להיות חשוב יותר מאשר היכולת החיסונית ( למשל, אם חוקר לומד את ההשפעות של stromal Microenvironment על הגידול הגידול). בתרחיש זה,פיתח, דגמי דג הזברה חסרים החיסון עשוי להיות מתאים יותר לביצוע השתלות הגידול Orththotopic 11 .
פרוטוקול זה נעשה שימוש כדי לבצע בדיקות תאי גזע הגידול להזריק פעמיים שכותרתו גידולים. כמו כן, נדון באסטרטגיה טיפולית פוטנציאלית להערכת יעילותם של תרכובות כימיות על גידולים, הכוללים את הטיפול בעוברים שלאחר ההשתלה באמצעות הוספת התרופה למים. שיטה לטיפול vivo לשעבר של תאים סרטניים לפני ההשתלה דווח בעבר גם 17 . בנוסף, גידולים המושתלים נאספו עבור מספר סיבובים של השתלה מחדש, אשר יהיה מועיל למחקרים על התפתחות אבולוציה chemoresistance 17 . נכון לעכשיו, מחקרים פרה קליניים תלויים xenografts העכבר כדי להעריך את היעילות של תרכובות פוטנציאליות. עם זאת, מחקרים אלה הם זמן רבויקר. בהתחשב במידת השימור הגבוהה של נתיבי איתות אונקוגניים בין דג הזברה לבני אדם 28 , יש לצפות ששיטה זו תשלים את הערכים הקונבנציונאליים של עכבר ותאי תאים אנושיים, על מנת לאפשר זיהוי מהיר יותר של תרכובות יעילות הנכנסות לניסויים קדם-קליניים וקליניים. בסופו של דבר, שיטה זו יכולה להיות שימושית עבור ההקרנה הכימית המהירה של גידולים המטופל העיקרי, אשר יכול להמשיך להניע את היוזמה הרפואה מותאמת אישית. עם זאת, התנאים לצמיחה ארוכת הטווח של תאים אנושיים דג הזברה (מבוגר או עובר) עדיין צריך להיות מזוהה.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לשני המבקרים על הצעות מצוינות ושיפורים בכתב היד. אנו מודים גם צייד סרטן המכון / אוניברסיטת יוטה עבור בעלי חיים אחזקה ותחזוקה. עבודה זו מומנה על ידי האגודה האמריקאית לסרטן (# 124250-RSG-13-025-01-CSM), מענק NIH (תכנית P30 CA042014 CRR), מענק הזרעים של אוניברסיטת יוטה וקרן הסרטן של צייד האנטסמן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
| 50 mL beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
| Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
| Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
| Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
| Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
| Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
| 1,000 µL filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
| 100 µL filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
| 50 mL conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
| 15 mL conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
| 1.7 mL microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
| Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
| Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
| Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
| Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
| Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
| Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
| Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
| Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
| Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
| Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
| Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
| Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
| Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
| Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
| PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
| 12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
| Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
| Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
| N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |
References
- Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer. Mol Ther. 10 (6), 1032-1042 (2004).
- Stephen, R. M., et al. Monitoring the development of xenograft triple-negative breast cancer models using diffusion-weighted magnetic resonance imaging. Exp Biol Med. 237 (11), 1273-1280 (2012).
- Deroose, C. M., et al. Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined small-animal PET, small-animal CT, and bioluminescence imaging. J Nucl Med. 48 (2), 295-303 (2007).
- Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).
- Johnson, J. I., et al. Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials. Br J Cancer. 84 (10), 1424-1431 (2001).
- Kerbel, R. S. Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans - Better than commonly perceived - But they can be improved. Cancer Biology & Therapy. 2 (4), S134-S139 (2003).
- Scholz, C. C., Berger, D. P., Winterhalter, B. R., Henss, H., Fiebig, H. H. Correlation of Drug Response in Patients and in the Clonogenic-Assay with Solid Human Tumor Xenografts. Eur J Cancer. 26 (8), 901-905 (1990).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Cho, S. Y., et al. An Integrative Approach to Precision Cancer Medicine Using Patient-Derived Xenografts. Mol Cells. 39 (2), 77-86 (2016).
- Hiroshima, Y., et al. Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy. Oncotarget. 7 (44), 71696-71702 (2016).
- Moore, J. C., Langenau, D. M. Allograft Cancer Cell Transplantation in Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916, 265-287 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Dranoff, G. Experimental mouse tumour models: what can be learnt about human cancer immunology. Nat Rev Immunol. 12 (1), 61-66 (2011).
- Richmond, A., Su, Y. Mouse xenograft models vs GEM models for human cancer therapeutics. Dis Model Mech. 1 (2-3), 78-82 (2008).
- Bernard, D., Peakman, M., Hayday, A. C. Establishing humanized mice using stem cells: maximizing the potential. Clin Exp Immunol. 152 (3), 406-414 (2008).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Modzelewska, K., et al. MEK Inhibitors Reverse Growth of Embryonal Brain Tumors Derived from Oligoneural Precursor Cells. Cell Rep. 17 (5), 1255-1264 (2016).
- Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Curr Biol. 15 (3), 249-254 (2005).
- Dovey, M., White, R. M., Zon, L. I. Oncogenic NRAS cooperates with p53 loss to generate melanoma in zebrafish. Zebrafish. 6 (4), 397-404 (2009).
- Santoriello, C., et al. Kita driven expression of oncogenic HRAS leads to early onset and highly penetrant melanoma in zebrafish. PLoS One. 5 (12), e15170 (2010).
- Park, S. W., et al. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
- Liu, S., Leach, S. D. Screening pancreatic oncogenes in zebrafish using the Gal4/UAS system. Methods Cell Biol. 105, 367-381 (2011).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
- Langenau, D. M., et al. Cre/lox-regulated transgenic zebrafish model with conditional myc-induced T cell acute lymphoblastic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 6068-6073 (2005).
- Sabaawy, H. E., et al. TEL-AML1 transgenic zebrafish model of precursor B cell acute lymphoblastic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15166-15171 (2006).
- Chen, J., et al. NOTCH1-induced T-cell leukemia in transgenic zebrafish. Leukemia. 21 (3), 462-471 (2007).
- Feng, H., et al. Heat-shock induction of T-cell lymphoma/leukaemia in conditional Cre/lox-regulated transgenic zebrafish. Br J Haematol. 138 (2), 169-175 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Li, P., White, R. M., Zon, L. I. Transplantation in zebrafish. Methods Cell Biol. 105, 403-417 (2011).
- Traver, D., et al. Effects of lethal irradiation in zebrafish and rescue by hematopoietic cell transplantation. Blood. 104 (5), 1298-1305 (2004).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5 (3), 383-394 (2010).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Tenente, I. M., Tang, Q., Moore, J. C., Langenau, D. M. Normal and malignant muscle cell transplantation into immune compromised adult zebrafish. J Vis Exp. (94), (2014).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Geiger, G. A., Fu, W., Kao, G. D. Temozolomide-mediated radiosensitization of human glioma cells in a zebrafish embryonic system. Cancer Res. 68 (9), 3396-3404 (2008).
- Kitambi, S. S., et al. Vulnerability of glioblastoma cells to catastrophic vacuolization and death induced by a small molecule. Cell. 157 (2), 313-328 (2014).
- Lally, B. E., et al. Identification and biological evaluation of a novel and potent small molecule radiation sensitizer via an unbiased screen of a chemical library. Cancer Res. 67 (18), 8791-8799 (2007).
- Vittori, M., Motaln, H., Turnsek, T. L. The study of glioma by xenotransplantation in zebrafish early life stages. J Histochem Cytochem. 63 (10), 749-761 (2015).
- Yang, X. J., et al. A novel zebrafish xenotransplantation model for study of glioma stem cell invasion. PLoS One. 8 (4), e61801 (2013).
- Zhao, H., Tang, C., Cui, K., Ang, B. T., Wong, S. T. A screening platform for glioma growth and invasion using bioluminescence imaging. Laboratory investigation. J Neurosurg. 111 (2), 238-246 (2009).
- Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Dis Model Mech. 9 (9), 1063-1065 (2016).
- Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126 (17), 3757-3767 (1999).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- Solin, S. L., Shive, H. R., Woolard, K. D., Essner, J. J., McGrail, M. Rapid tumor induction in zebrafish by TALEN-mediated somatic inactivation of the retinoblastoma1 tumor suppressor rb1. Sci Rep. 5, 13745 (2015).
- Ju, B., et al. Oncogenic KRAS promotes malignant brain tumors in zebrafish. Mol Cancer. 14, (2015).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. J Vis Exp. (96), e52540 (2015).
- Rampazzo, E., et al. Wnt activation promotes neuronal differentiation of glioblastoma. Cell Death Dis. 4, (2013).
- Lal, S., La Du,, Tanguay, J., L, R., Greenwood, J. A. Calpain 2 is required for the invasion of glioblastoma cells in the zebrafish brain microenvironment. J Neurosci Res. 90 (4), 769-781 (2012).
- Eden, C. J., et al. Orthotopic models of pediatric brain tumors in zebrafish. Oncogene. 34 (13), 1736-1742 (2015).
