Summary
Il trapianto di cellule tumorali è un importante strumento per l'identificazione dei meccanismi del cancro e delle risposte terapeutiche. Le tecniche correnti dipendono dagli animali immuno-incompetenti. Qui descriviamo un metodo per il trapianto di cellule tumorali di zebrafish in embrioni immuni-competenti per l'analisi a lungo termine del comportamento delle cellule tumorali e delle risposte in vivo .
Abstract
Il trapianto di cellule tumorali è una tecnica importante per definire i meccanismi che controllano la crescita delle cellule tumorali, la migrazione e la risposta dell'ospite, nonché per valutare la potenziale risposta del paziente alla terapia. I metodi correnti dipendono in larga misura dall'utilizzo di animali singenici o immunizzati per evitare il rigetto dell'innesto tumorale. Tali metodi richiedono l'impiego di ceppi genetici specifici che spesso impediscono l'analisi delle interazioni di cellule immunitarie e / o sono limitate a specifici ambiti genetici. Un metodo alternativo nel zebrafish approfitta di un sistema immunitario incompletamente sviluppato nel cervello embrionale prima di 3 giorni, in cui le cellule tumorali vengono trapiantate per essere utilizzate nei test a breve termine ( ovvero da 3 a 10 giorni). Tuttavia, questi metodi provocano la letalità dell'ospite, che impedisce lo studio a lungo termine del comportamento delle cellule tumorali e della risposta ai farmaci. Questo protocollo descrive un metodo semplice ed efficiente per il trapianto ortotopico a lungo termine del tessuto tumorale cerebrale di zebrafish inAl quarto ventricolo di un zebrafish di 2 giorni di immune competenza. Questo metodo consente: 1) studio a lungo termine dei comportamenti delle cellule tumorali, come invasione e disseminazione; 2) risposta tumorale durevole alle droghe; E 3) rintracciamento dei tumori per lo studio dell'evoluzione del tumore e / o l'impatto di diversi background genetici dell'home. In sintesi, questa tecnica consente ai ricercatori del cancro di valutare l'ingestione, l'invasione e la crescita nei siti lontani, nonché per eseguire schermi chimici e test di concorrenza cellulare per molti mesi. Questo protocollo può essere esteso a studi di altri tipi di tumore e può essere utilizzato per chiarire i meccanismi di chemoresistenza e metastasi.
Introduction
Il trapianto di cellule tumorali in animali compromessi dall'immunizzazione, in particolare i xenograft di mouse, è una tecnica ampiamente usata per studiare meccanismi che controllano la proliferazione delle cellule tumorali 1 , 2 , la sopravvivenza , l' invasione e la metastasi 3 , 4 , oltre a fornire una piattaforma Per la screening dei farmaci 5 , 6 , 7 . Più recentemente, il trapianto di campioni tumorali primari in topi immunitari compromessi è stato usato per generare modelli di xenograft (PDX) derivanti dal paziente per scopi diagnostici e preclinici di screening dei farmaci e costituisce la spina dorsale dell'iniziativa 8 , 9 , 10 , 11 della medicina personalizzata . Tuttavia, evidenze significative mostrano che modulare l'immune syLo stelo può avere un impatto drammatico sul comportamento del tumore e sul risultato del paziente 12 , 13 . Ciò ha spinto il ridisegno delle tecniche basate su xenograft a includere i topi "umanizzati", in cui il sistema immunitario del mouse viene ricostituito co-trapianto di cellule immunitarie umane con cellule tumorali. Tuttavia, questo approccio è ancora tecnicamente impegnativo, con riproducibilità variabile e tossicità associate alla tecnica, oltre al costo significativo 14 , 15 . Pertanto, sono necessarie nuove tecniche di trapianto in animali immunitario-competenti per accelerare la scoperta di meccanismi specifici immunologici e tumorali di progressione del cancro e risposta ai farmaci.
Zebrafish sono un modello alternativo di animali per lo studio del cancro umano, con oltre 20 modelli di cancro ora stabiliti 16 , tra cui cervello altamente maligno 17 , mela Noma 18 , 19 , 20 e tumori del pancreas 21 , 22 , così come molte leucemie 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Due attributi del sistema zebrafish rendono particolarmente adattabile alla ricerca sul cancro: 1) la chiarezza ottica degli animali traslucidi consente la visualizzazione diretta dei comportamenti delle cellule tumorali (proliferazione, sopravvivenza, invasione e diffusione) utilizzando semplici tecniche di microscopia e 2) Gli zebrafish femmine possono produrre fino a 200 embrioni al giorno, consentendo la rapida riduzione dei numeri di animali per lo screening genetico o di droga ad un costo ridotto. Inoltre, i genomi del cancro dei pesci zebra e degli esseri umani sono altamente conservati (inclusi oncogeni e geni-soppressori tumorali)F "> 28, permettendo alla meccanica e alle scoperte di droga di essere rapidamente tradotte nei sistemi di mammiferi. Questi attributi rendono anche i zebrafish un modello animale ideale per le tecniche di trapianto, che sfruttano l'imaging, la scalabilità e il basso costo del sistema.
Precedenti studi di trapianto tumorale in zebrafish immunitario compromettono l'identificazione delle capacità di auto-rinnovamento, malignità tumorale e invasione / diffusione 11 , 29 . Studi di breve durata del comportamento delle cellule tumorali possono essere condotte dopo il trapianto negli adulti γ-irradiati, i cui sistemi immunitari sono effettivamente soppressi per ~ 20 giorni 11 , 30 . Il trattamento di zebrafish adulte con dexametasone sopprime le cellule B e T fino a 30 giorni prima del rigetto 31 . Un'altra strategia meno comune utilizza ceppi clonal zebrafishChe consentono indagini a lungo termine in un ospite immunitario-competente 32 . Tuttavia, solo un numero limitato di ceppi clonali sono stati generati e sono difficili da mantenere a causa della bassa fecondità. Inoltre, la maggior parte dei modelli tumorali di zebrafish stabiliti vengono generati in altri background genetici, per cui questi tumori non possono essere trapiantati nei ceppi clonal senza sopprimere il sistema immunitario 11 , 33 , 34 . Gli approcci più recenti per migliorare gli studi sul trapianto a lungo termine includono lo sviluppo della linea mutante di rag2 E450fs , con compromesso delle funzioni di B e T che sono state utilizzate per il trapianto di tumori multipli 35 , 36 . Per aggirare il requisito per le linee di zebrafish clonari o per un host immunitario compromesso, un certo numero di gruppi hanno utilizzato embrioni di fase precoce ( cioè > 72 HPFecondazione ost (hpf)) per il trapianto di cellule tumorali umane, poiché questi embrioni non hanno ancora sviluppato completamente un sistema immunitario adattativo 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 . Tuttavia, questi metodi sono limitati all'analisi a breve termine del comportamento delle cellule tumorali o della reazione di farmaci (di solito meno di 2 settimane) in quanto le cellule tumorali umane o la tecnica di trapianto uccidono l'ospite, impedendo studi a lungo termine e rintracciamenti.
Questo protocollo descrive un metodo di trapianto embrionale modificato nel lumen del quarto ventricolo di un cervello embrionale di fecondazione a due giorni (dpf). Minimizza la tossicità per l'ospite e può essere combinata con i modelli tumorali cerebrali di zebrafish per l'inserimento a lungo termine delle cellule tumorali. Così, questa tecnica alBassi per il reintegro delle cellule tumorali in nuovi padroni di casa per molte generazioni, facilitando studi futuri su eterogeneità tumorale, risposta host / immunitaria, risposte farmacologiche o potenziale metastatico. Questo metodo è anche semplice, efficiente e scalabile, in quanto fino a 300 trapianti possono essere eseguiti da un singolo utente al giorno, fino al 90% di assunzione. Ciò consente la rapida diffusione di singoli tumori primari in centinaia di embrioni a 2 dpf per progetti di screening genetico o di droga o per visualizzare direttamente il comportamento delle cellule tumorali cerebrali in diversi background ospitanti per molti mesi.
Protocol
Tutte le procedure animali sono state approvate e sono state seguite le linee guida per la cura degli animali del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università degli Utah (IACUC # 16-03019).
1. Preparazione dell'apparecchiatura per la microinezione
- Preparazione della piastra di iniezione.
- Preparare una soluzione di 50 mi di agarosio 1,2% disciolto in acqua di uovo (0,6 g / L di acquario in acqua osmosi inversa + 0,01 mg / l blu metilenico). Boil la soluzione fino a quando l'agarosio si scioglie e quindi si integra aggiungendo 0,05 mg / l blu metilenico. Versare 25 ml della soluzione finale in un piatto di Petri da 10 cm e lasciarlo solidificare. Posizionare la restante 25 mL di soluzione agarosa in un bagno d'acqua di 42 ° C fino a preparare per la fase 1.1.2.
- Impostare un bicchiere da 2 pollici al centro della superficie solidificata e versare le restanti 25 mi di agarosio 1,2%.
NOTA: Questo crea una superficie di iniezione sulla periferia della piastra e un nucleo al centro, cheFornisce un'area per testare la dimensione dell'ago e la consistenza della sospensione del tumore.- Mantenere la piastra di iniezione a 28 ° C per almeno 30 minuti prima dell'iniezione oa 4 ° C per la conservazione a lungo termine.
- Preparazione di aghi da iniezione.
- Effettuare gli aghi tirando capillari da 10 cm con una dimensione esterna di 1,2 mm e una dimensione interna di 0,9 mm (senza filamento) in due aghi su un tiratore d'ago.
NOTA: Ogni ago deve misurare 6 cm in lunghezza totale, dove circa 1,5 cm dell'estremità è affusolata. - Posizionare con cura l'ago su una diapositiva del microscopio avvolta in pellicola di paraffina di plastica. Utilizzare una lama di rasoio per tagliare l'estremità dell'ago ad un angolo di 45 ° per creare un ago con un'apertura alla punta.
NOTA: In genere, vengono rimossi da 0,1 mm a 0,3 mm della fine dell'ago. Non è richiesta una punta smussata per eseguire le iniezioni.
- Effettuare gli aghi tirando capillari da 10 cm con una dimensione esterna di 1,2 mm e una dimensione interna di 0,9 mm (senza filamento) in due aghi su un tiratore d'ago.
- Preparare l'impostazione della microinezione.
- <Li> Organizzare una configurazione standard di microinjection, tra cui uno stereomicroscopio, un manipolatore e un microinjector per il trapianto.
2. Preparazione degli embrioni per il trapianto
- Raccogliere fino a 500 embrioni 44 di mitfa w2 (o embrioni di qualsiasi altro genotipo zebrafish come definito dall'utente) come descritto 45 e mantenere in un incubatore a 28 ° C.
- Dechorionate gli embrioni a 24 hpf aggiungendo 100 μL di 10 mg / ml soluzione di cocktail di proteasi diluita in acqua di uovo e delicatamente roccia per circa 20 minuti. Sciacquare gli embrioni 3 volte con acqua fresca d'uovo per rimuovere la proteasi residua.
- Schermate gli embrioni a 48 hpf per la fase di sviluppo appropriata, come definito dai criteri della serie di stadi standard 45 .
Nota: per il trapianto devono essere impiegati solo embrioni normali e morfologicamente normali. - AnestetizzareCirca venti embrioni 48-hpf in acqua d'uovo contenenti 0,002% Tricaine-S in un piatto di Petri. Confermare l'anestesia corretto osservando la cessazione del movimento.
3. Realizzare una sospensione di cellule tumorali
NOTA: i modelli tumorali cerebrali di Zebrafish possono essere generati mediante combinazioni genetiche di oncogeni e geni del soppressore tumorale 17 , 46 , 47 . Qui è stato utilizzato il modello NRAS WT guidato da promotore sox10 , il modello zebrafish p53 zdf1 / zdf1 CNS-PNET, come descritto di recente 17 .
- Eutanizzare un pesce a cuscinetto cerebrale, il cui carico tumorale è di circa il 20% della dimensione totale del corpo utilizzando un sovradosaggio di Tricaine-S dello 0,4% seguito da immersione in acqua di ghiaccio secondo protocolli approvati da IACUC.
- Disseccare il tumore fluorescente con una lama di rasoio e pinzette sotto una fluorescenzaMicroscopio usando la tecnica sterile e collocarlo in 5 ml di soluzione salina fosfato-tamponata (PBS).
NOTA: I metodi di dissezione esatta saranno definiti dall'utente e dipendono dal tipo di tumore e dalla localizzazione del tessuto. Vedere i riferimenti elencati per le procedure dettagliate per la dissezione di diversi organi di zebrafish e tumori cerebrali 17 , 48 . - Ridurre manualmente la massa tumorale usando una pipetta p1000 fino a sviluppare una soluzione uniforme e nuvolosa. Rimuovere particelle di grandi dimensioni con una punta pipetta o utilizzando un filtro da 40 μm (questo dipende dal tumore). Centrifugare la sospensione a temperatura ambiente per 5 minuti a 290 xg e rimuovere il surnatante.
Nota: La selezione delle cellule attivata con fluorescenza (FACS) non viene eseguita per isolare le cellule tumorali. Ciò consente il trapianto di una popolazione eterogenea di cellule stromali, immunitarie e tumorali. - Resuspendere il pellet di cellule tumorali in 100 μl di PBS sterile e trasferirlo in un micro di 1,5 mlTubo centrifuga. Prendere 5 μL di sospensione cellulare e diluirlo in 250 μl di PBS. Conta il numero di cellule usando un emocitometro. Centrifugare la sospensione per 3 min a 290 xg, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in PBS sterile per ottenere la concentrazione cellulare desiderata.
NOTA: Tipicamente, le cellule sono riossidate in 30-40 μL di PBS sterile, producendo una soluzione viscosa e opaca (concentrazione cellulare ≥ 100 cellule / nL) e tendono a generare i trapianti più riusciti. La vitalità cellulare non è valutata. - Conservare la sospensione tumorale in un blocco termico di 28 ° C durante la procedura di trapianto.
4. Iniettare la sospensione tumorale nel quarto ventricolo di un embrione 2-dpf
- Trasferire 10-20 embrioni anestetizzati (dal punto 2.4) alla periferia della piastra di iniezione usando una pipetta di trasferimento; Gli embrioni dovrebbero cadere lateralmente sulla piastra di iniezione, con i ventricoli chiaramente visibili e accessibili. Utilizzare una sonda angolata per regolare gli embrioni come necessario e posizionarli dal bordo esterno della piastra di iniezione.
- Caricare 1-2 μL della sospensione della cellula tumorale nell'ago iniettore usando punte di pipetta per il caricamento del gel e inserire l'ago nel manipolatore.
- Abbassare manualmente il manipolatore tenendo l'ago ad un angolo di 45 °. Regolare le manopole sul micromanipolatore nelle direzioni x, y e z fino a quando l'ago è appena sopra e circa 5 mm a destra della testa embrionale. Guardate gli oculari dello stereomicroscopio e regolate lentamente il micromanipolatore nella direzione x finché l'ago non penetra il quarto ventricolo dell'embrione. Non lasciare che l'ago perforare il cuore o il tuorlo.
- Spingere il pedale attaccato al microinjector per iniettare la sospensione della cellula tumorale.
NOTA: La pressione e il tempo di iniezione variano in base alla dimensione del foro, ma un buon punto di partenza è di 5 - 10 PSI e 50 - 100 ms.Il volume delle cellule tumorali iniettate può essere valutato con tecniche standard di caduta dell'olio attraverso l'iniezione in olio minerale, se lo si desidera 49 . Le iniezioni di 500 pL con un diametro di goccia di 0,1 mm tipicamente forniscono i migliori risultati.
- Spingere il pedale attaccato al microinjector per iniettare la sospensione della cellula tumorale.
- Sciacquare delicatamente gli embrioni iniettati dalla piastra di iniezione e in un piatto di Petri utilizzando acqua fresca d'uovo. Mantenere gli embrioni nell'acqua d'uovo per le rimanenti procedure o fino a quando non vengono coltivate in serbatoi (come descritto nel passaggio 4.9.1).
- Ispezionare gli embrioni iniettati sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza. Confermare che la pressione di iniezione, l'angolo, la dimensione dell'ago e la viscosità della sospensione cellulare producano cellule tumorali che riempiono il 25-50% dello spazio ventricolo. Regolare questi parametri, se necessario.
- Ripetere i passaggi 4.1-4.5 per qualsiasi embrione rimanente. Anestetizzare eventualmente gli embrioni supplementari (descritti nel passaggio 2.4).
NOTA: Un esperto può iniettare fino a 300 embrioni per 3-4 h. - Riposiziona gli embrioniL'incubatore a 28 ° C durante la notte.
- Il giorno successivo, valutare la sopravvivenza dell'embrione esaminando caratteristiche morfologiche e fisiologiche, come lo sviluppo normale del cuore e del cervello, come descritto 45 .
- Per la screening, anestetizzano gli embrioni, come descritto nel passaggio 2.4, a un giorno di trapianto post-trapianto (dpt).
- Utilizzare una pipetta di trasferimento per aggiungere 4% di metilcellulosa al centro di un piatto di Petri e aggiungere gli embrioni alla goccia di metilcellulosa. Orientare gli embrioni (lato ventrale rivolto verso la sorgente luminosa) utilizzando una sonda angolata e una schermata per una grandezza coerente con un microscopio a fluorescenza. Rimuovere tutti gli embrioni con cellule tumorali non limitate al ventricolo o quelle che contengono cellule tumorali che escono meno del 25% dello spazio ventricolo.
Nota: l'ingranaggio coerente è definito come embrioni con una singola massa tumorale che comprende 25-50% dello spazio ventricolo 17 . Per scopi di screening, utilizzare una fluorescenzaTereomicroscopio con obiettivo 1X, apertura numerica 0,15, ingrandimento compreso tra 0,7-1,6X e tempo di esposizione da 50 ms a 1 s. Per tutte le immagini, utilizzare il canale di campo luminoso in aggiunta al canale GFP o RFP. - Per la manutenzione dei tumori, posizionare gli embrioni trapiantati in vasche per crescere 45 a 8 dpf (6 dpt).
- Utilizzare una pipetta di trasferimento per aggiungere 4% di metilcellulosa al centro di un piatto di Petri e aggiungere gli embrioni alla goccia di metilcellulosa. Orientare gli embrioni (lato ventrale rivolto verso la sorgente luminosa) utilizzando una sonda angolata e una schermata per una grandezza coerente con un microscopio a fluorescenza. Rimuovere tutti gli embrioni con cellule tumorali non limitate al ventricolo o quelle che contengono cellule tumorali che escono meno del 25% dello spazio ventricolo.
5. Imaging di embrioni trapiantati per i comportamenti cellulari
- Anestetizzare gli embrioni a 3-8 dpf (1-6 dpt) e montare (lato dorsale rivolto verso il coperchio) in 1,2% di agarosio a bassa tensione. Eseguire un'immagine a tempo trascorsa degli embrioni montati usando un microscopio confocale a scansione laser per la durata desiderata per visualizzare i comportamenti cellulari, come ad esempio la migrazione, la divisione cellulare o le interazioni delle cellule cellulari, se necessario 38 , 43 , 53 .
NOTA: utilizzare un rapporto di aspetto di 1.024 x 1.024, una velocità di scansione di 8 & #181; s / pixel. Impiegare la scansione media e definire le dimensioni della profondità z per garantire la cattura di tutta la massa tumorale (1.000-1.500 μm). Inoltre, eseguite esperimenti a 4 ore, acquisendo un'immagine ogni 10-15 minuti utilizzando un obiettivo 40x per monitorare i comportamenti invasivi. La sensibilità del rivelatore varia a seconda dell'intensità della massa tumorale e la potenza laser dipenderà dal microscopio, ma generalmente si consiglia di essere compreso tra il 15 e il 40%. - Una volta che l'imaging è completo, liberare l'embrione montato dall'agarosio usando una sonda angolata e trasferirlo a un piatto di petri con acqua fresca d'uovo.
6. Amministrazione farmacologica agli embrioni trapiantati e valutazione del carico tumorale 17
- Anestetizzare gli embrioni a 3 dpf e orientarli in 4% di metilcellulosa, con il lato ventrale di fronte alla sorgente luminosa. Immagini gli embrioni di pre-trattamento usando un microscopio a fluorescenza 17 .
- PlaCe gli embrioni trapiantati a 3 dpf in un piatto da 12 pozzetti, con 10 embrioni per pozzo in 0,5 ml di acqua di uovo. Aggiungere la quantità appropriata di farmaco per ottenere la concentrazione finale desiderata ( es. 50 μM inibitore MEK) e restituire gli embrioni ad un incubatore a 28 ° C. Il giorno dopo, rimuovere l'acqua di uovo trattata con droga con una pipetta a trasferimento sottile e aggiungere un trattamento fresco. Ripetere questo quotidiano finché gli embrioni non raggiungono 8 dpf.
- A 8 dpf, rimuovere gli embrioni dal trattamento farmacologico e collocarli in acqua fresca d'uovo. Anestetizzare gli embrioni e orientare (lato ventrale di fronte alla sorgente luminosa) in 4% metilcellulosa. Post-trattamento di embrioni di immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza. Quantificare l'area del tumore utilizzando un software appropriato, come descritto 17 .
- Separare gli embrioni come opportuno per trattamento e posizionarli in vasche per crescere. Dopo 4-9 settimane, anestetizzano i pesci e li valutano per l'onere tumorale complessivo usando un stereomicroscopio standard di fluorescenza, dIscritto 17 .
Representative Results
Trapianto di tumore e incrostazione
Uno schema schematizzato della procedura è rappresentato in Figura 1 . Le cellule tumorali a fluorescenza vengono estratte dal sito dell'organo primario e viene generata una sospensione a singola cellula per il trapianto nel quarto ventricolo di embrioni di 2-dpf mitfa w2 zebrafish 44 . La figura 2 mostra i risultati rappresentativi di questo metodo utilizzando un modello di zebrafish del tumore ectodermico primitivo primitivo del sistema nervoso centrale (CNS-PNET), in cui il promotore di sox10 esegue l' espressione di NRAS di tipo selvatico o di NRAS attivato fuso in mCherry in p53 -defettivi cellule precursori oligonurali 17 . Il mutante w2 zebrafish 44 mutante, che manca di melanofori, è stato usato per visualizzare più facilmenteLe cellule tumorali dopo il trapianto e / o nell'età adulta. Altri mutanti di pigmento potrebbero anche essere utilizzati per fornire una maggiore chiarezza dell'immagine, come Casper 50 . Fino a 24 h post-trapianto, si possono vedere cellule tumorali che invadono nel tessuto cerebrale circostante ( figura 2A , 3 dpf, frecce). Gli innesti tumorali continuano a crescere nel ventricolo e nel tessuto cerebrale circostante durante la prossima settimana ( Figura 2A , 8 dpf). A questo punto, la fluorescenza può essere osservata anche nella regione dei reni ( figura 2A , asterischi). Ciò può essere dovuto ai reni che filtrano i detriti cellulari dal trapianto, che è coerente con studi precedenti che utilizzano coloranti fluorescenti come un dosaggio per valutare la funzionalità renale 51 . Le cellule tumorali continuano a proliferare e invadere, quindi per 28 dpf, una massa tumorale può essere osservata in tutto il cervello zebrafish ( Figura 2A , 28 dpf).
Figura 2B . L'ingrasso tumorale è tipicamente raggiunto nell'80-90% degli embrioni e i trapianti tumorali persistono in età adulta; Tre esempi rappresentativi sono mostrati nei pannelli inferiori della Figura 2B . Ciò consente che i trapianti tumorali siano raccolti e congelati o ricostituiti in diverse generazioni.
Invasione tumorale e risposte farmacologiche
La figura 3A mostra uno schema di co-trapianto in cui vengono raccolti due diversi tumori etichettati con GFP (tumore A) o mCherry (tumore B)O dissociazione (si noti che FACS non viene utilizzato qui, ma le cellule tumorali ordinate FACS potrebbero essere utilizzate se necessario). Il tumore A e B possono essere provenienti da diverse posizioni, indotte da differenti oncogeni, o indotti in diversi ambiti genetici. Ogni tumore viene trasformato in una sospensione a singola cellula e le cellule tumorali vengono quindi mescolate insieme ad un rapporto 1: 1 e trapiantate nell'embrione 2-dpf. Possono poi essere osservate proprietà del tumore, come l'ingrasso, la crescita, l'invasione e la diffusione del tumore A nei confronti del tumore B nello stesso host che consente controlli interni per la tecnica e per il background genetico.
Nella figura 3B , un CNS-PNET zebrafish etichettato con NRC, dal tectto ottico e da un CNS-PNET etichettato con GFP dal cervelletto, è stato raccolto e trasformato in sospensioni a cellule singole. Le cellule sono state contate e un numero uguale di cellule da ogni tumore sono state mescolate insieme e trapiantate in embrioni a 2 dpf. Quattro dAys dopo il trapianto, gli embrioni sono stati imaged con microscopia confocale. Mostrato è un embrione rappresentativo che dimostra che le cellule tumorali tectum (rosso) migrano più estesamente nel cervello ospite (frecce) rispetto al tumore cerebellare.
Gli embrioni trapiantati con cellule tumorali etichettate con fluorescenza possono essere utilizzate nei regimi di trattamento farmacologico per identificare composti che inibiscono la crescita del tumore. La figura 3C è una tipica linea temporale per il trattamento e l'imaging dei trapianti tumorali. 24 h post-trapianto, gli embrioni sono accessibili per una coerenza costante e diviso in gruppi di trattamento. Nell'esempio fornito, gli embrioni trapiantati con NRAS , trattati con CNS-PNET di zebrafish etichettati con mCherry , vengono trattati con 50 μM dimetil sulfossido (DMSO) o inibitore MEK (AZD6244). Gli embrioni vengono trattati per 5 giorni e imaged a 8 dpf, come descritto in Figura 3C . Figura 3D (pannelli a sinistra) mostra un rappresentativo E animali provenienti dai due gruppi di trattamento. Gli embrioni trattati con inibitori MEK hanno una quantità notevolmente minore di fluorescenza rispetto a quelli trattati con DMSO, come descritto 17 . Dopo che gli animali vengono immaginati, vengono trasferiti in cisterne senza farmaci e monitorati per la crescita del tumore per due mesi. Nell'esempio fornito, il trattamento dell'inibitore MEK provoca una risposta durevole nei pesci adulti ( Figura 3D , pannelli a destra). Per ulteriori dettagli sul trattamento farmacologico, sull'immagine e sulla quantificazione, vedere il riferimento 17 .
Figura 1: Schema del protocollo del trapianto di cellule tumorali nel quarto ventricolo di 2-dpf Zebrafish Embryos. Schema generale delle sezioni da 3 a 4 del protocollo, incluse le analisi di endpoint alternative (sezioni 4.9-6)./55712/55712fig1large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: L'allattamento e la progressione del tumore. (A) Le cellule tumorali primarie CNS-PNET 17 di Zebrafish etichettate con mCherry sono state trapiantate nel quarto ventricolo di embrioni a 2 dpf. A 3 dpf, le cellule tumorali si vedono invadere nel tessuto cerebrale circostante (frecce). A 8 dpf, le cellule tumorali crescono nel ventricolo; Le cellule tumorali rosse sono presenti anche nel tessuto cerebrale circostante e nei reni (asterischi). A 28 dpf, le cellule tumorali hanno invaso e crescono in tutto il cervello ospite. (B) Pannello superiore. Sette embrioni 3-dpf trapiantati con cellule tumorali cerebrali di zebrafish etichettate con mCherry. Le cellule tumorali possono essere trapiantate costantemente in centinaia di embrioni, con elevati tassi di engraftment ( cioè tipicamente 85/100 embrioni). Medio ePannelli inferiori. Tre pesci adulti rappresentati con tumori trapiantati 4-8 settimane dopo la fecondazione (wpf). I tumori possono essere visualizzati mediante microscopia a fluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: confronto dell'invasione tumorale e risposta ai farmaci. ( A ) CNS-PNETs 17 dal tectum ottico o dal cervelletto sono etichettati rispettivamente con mCherry o GFP, trasformati in una sospensione a singola cellula, mescolati insieme ad un rapporto 1: 1 e co-trapiantati in embrioni a 2 dpf. ( B ) un embrione 6-dpf co-trapianto con una sospensione mista di cellule tumorali cerebellari etichettate con GFP e cellule tumorali etichette mCherry dal tecto ottico. Differenze nelle proprietà invasive di ogni tumore in tLo stesso ricevente può essere osservato usando la microscopia a fluorescenza. In questo esempio, le cellule tumorali con etichetta mCherry migrano più ampiamente di quelle contrassegnate con GFP (frecce). ( C ) Timeline per il trattamento farmacologico su embrioni trapiantati con cellule tumorali. ( D ) Immagini di animali rappresentativi alla fine del regime di trattamento (8 dpf) e a 8 settimane di trattamento (8 wpf) con un controllo DMSO o un inibitore MEK 50 μM. L'onere tumorale può essere misurato quantificando la fluorescenza, come descritto 17 . In questo esperimento, la crescita di cellule tumorali etichette mCherry è ridotta negli embrioni trattati con inibitori di MEK e si traduce in una risposta durevole nell'adulto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Questo protocollo descrive un esame di trapianto semplice ed efficiente che coinvolge l'iniezione di cellule tumorali di zebrafish nel ventricolo di un embrione a 2 dpf che svilupperà un sistema immunitario completamente competente. Finora, i zebrafish CNS-PNET 17 e il melanoma (dati non mostrati) sono stati trapiantati con successo per studi a lungo termine del comportamento e dell'invasione delle cellule tumorali. Le fasi critiche di questo protocollo comprendono l'adeguata dimensione del foro e la corretta sospensione delle cellule tumorali e l'anestesia adeguata degli embrioni dell'ospite. Per ogni singolo ricercatore, un'ulteriore ottimizzazione di questa tecnica può includere la regolazione della concentrazione delle cellule tumorali, della pressione di iniezione e dell'orientamento degli embrioni. Inoltre, possono esserci eterogeneità nella viscosità delle sospensioni provenienti da tumori diversi, in modo che i diversi tipi di tumore possono essere più o meno difficili da ri-sospendere e trapiantare. Tuttavia, regolando la dimensione del foro e utilizzando diffeÈ possibile superare le difficoltà associate alle viscosità tumorali.
Nella nostra esperienza, le ragioni più comuni per le cellule sparse / le masse di cellule incoerenti nel ventricolo sono le seguenti: 1) la sospensione della cellula tumorale è troppo diluita; 2) la dimensione del foro è troppo piccola; 3) il tempo di iniezione e la pressione sono troppo bassi; E / o 4) i tessuti rimanenti non sono stati filtrati dal tumore e sono alloggiati nell'ago. Quando la sospensione della cellula tumorale esce dal ventricolo dopo l'iniezione, è probabile che: 1) il posizionamento dell'ago sul pavimento del ventricolo; 2) una pressione e un tempo di iniezione elevata; E / o 3) una dimensione del foro che è troppo grande. La bassa sopravvivenza di embrioni trapiantati può essere causata da: 1) l'anestesia di embrioni per un lungo periodo di tempo; 2) lasciare embrioni sulla piastra di iniezione per asciugare; 3) l'iniezione di bolle d'aria nel ventricolo; E / o 4) organi vitali piercing, come il cervello eCuore, perché l'ago ha attraversato il ventricolo.
I metodi precedenti di trapianto tumorale nel cervello adulto o embriotico si basano sull'immunosoppressione negli adulti (geneticamente, farmacologicamente o mediante radiazioni) o sono limitati a studi a breve termine di cellule umane o di topi negli embrioni 38 , 43 , 52 , 53 , 54 . Ad esempio, i tumori al cervello del mouse possono essere iniettati intranazionalmente in dessametasone-immunosoppresso, 30-dpf, zebrafish giovanile per l'uso in analisi cliniche pre-cliniche a breve termine (~ 2 giorni) 54 . Tuttavia, il sito di iniezione in questi esperimenti è oscurato dal tessuto del cranio e del cervello e probabilmente provoca danni al tessuto cerebrale normale, che riduce la vitalità dell'ospite e l'efficienza di lavorazione. Un altro metodo recentemente descritto prevede l'iniezione di gliob umanoLinee di cellule del lastoma nella regione del midbrain di embrioni di zebrafish, che hanno permesso l'analisi a breve termine della crescita, dell'invasione e della risposta farmacologica 43 . Ancora una volta, la posizione precisa del sito di iniezione è variabile e probabilmente danneggia il tessuto normale. Pertanto, i metodi precedenti dei trapianti di cervello embrionale spesso compromettono la vitalità degli ospiti, limitando questi studi ad analisi a breve termine ( vale a dire da 2 a 14 giorni), causando una maggiore variabilità tra le singole iniezioni a causa di siti d'iniezione oscurati e prevenendo il lungo- Analisi a lungo termine dei comportamenti delle cellule e delle risposte alle droghe o del rintracciamento in molteplici generazioni.
Il metodo qui descritto affronta le limitazioni attuali nelle tecniche di trapianto embrionale di zebrafish e di immune compromessi, consentendo ai ricercatori di: 1) ripetere l'iniezione nella stessa posizione, con minimi danni al tessuto circostante; 2) visualizzare direttamente il sito di iniezione per massimizzareEfficienza di lavorazione; 3) trapianto centinaia di embrioni al giorno; 4) permettono ai tumori di crescere negli animali immunocompetenti; 5) consentire il monitoraggio del comportamento delle cellule tumorali e delle risposte durevoli della droga durante la vita dei pesci zebra; E 6) consentire il rintracciamento dei tumori in molte generazioni per studi potenziali sull'evoluzione del tumore o sui meccanismi di recupero di farmaci. Inoltre, questo protocollo consente ai ricercatori di utilizzare qualsiasi genotipo di zebrafish per la valutazione della risposta dell'ospite, comprese diverse popolazioni immunitarie. Questi attributi rendono questo metodo facilmente adattabile da qualsiasi laboratorio che effettua già microiniziamenti standard in zebrafish. Infine, mentre questo metodo è ideale per le iniezioni ortopediche dei tumori cerebrali di zebrafish, quando il trapianto di altri tipi di tumori, come il fegato o il pancreas, il sito ortotopico può essere più importante della competenza immunitaria ( ad esempio se un ricercatore sta studiando gli effetti dello stromale Microambiente sulla crescita del tumore). In questo scenario, ilI modelli sviluppati di recente sviluppato e difettoso di zebra possono essere più appropriati per eseguire trapianti tumorali ortopediche 11 .
Questo protocollo è stato usato per eseguire i test di concorrenza delle cellule tumorali e per iniettare tumori a doppio etichettatura. Si è inoltre discusso di una strategia di trattamento potenziale per la valutazione dell'efficacia dei composti chimici sulla tumorigenesi, che prevede il trattamento di embrioni post-trapianto mediante l'aggiunta del farmaco all'acqua. È stato anche riportato un metodo per il trattamento ex vivo delle cellule tumorali prima del trapianto. Inoltre, i tumori trapiantati sono stati raggruppati per diversi cicli di ri-trapianto, che saranno utili per studi sull'evoluzione del tumore e sulla chemoresistenza 17 . Attualmente, gli studi pre-clinici dipendono da xenografts del mouse per valutare l'efficacia dei potenziali composti. Tuttavia, questi studi richiedono molto tempoE costoso. Considerando l'elevato grado di conservazione dei percorsi di segnalazione oncogena tra zebrafish e umani 28 , si può prevedere che questo metodo complementerà gli studi di cellule umane e umane convenzionali per consentire una più rapida identificazione di composti efficaci che entrino in studi clinici e clinici. In definitiva, questo metodo potrebbe rivelarsi utile per lo screening chimico rapido dei tumori primari del paziente, che potrebbe spingere ulteriormente l'iniziativa della medicina personalizzata. Tuttavia, devono ancora essere individuate le condizioni per la crescita a lungo termine delle cellule umane in zebrafish (adulto o embrio).
Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo i due recensori per ottimi suggerimenti e miglioramenti al manoscritto. Ringraziamo anche Huntsman Cancer Institute / University of Utah per la zootecnia e la manutenzione. Questo lavoro è stato finanziato dalla American Cancer Society (n. 124250 - RSG-13-025-01-CSM), una sovvenzione NIH (programma P30 CA042014 CRR), l'Università di Utah Seed Grant e la Huntsman Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
| 50 mL beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
| Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
| Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
| Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
| Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
| Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
| 1,000 µL filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
| 100 µL filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
| 50 mL conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
| 15 mL conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
| 1.7 mL microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
| Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
| Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
| Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
| Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
| Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
| Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
| Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
| Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
| Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
| Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
| Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
| Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
| Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
| Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
| PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
| 12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
| Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
| Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
| N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |
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