Summary
Transplantasjonen av kreftceller er et viktig verktøy for identifisering av kreftmekanismer og terapeutiske responser. Nåværende teknikker er avhengige av immunkompetente dyr. Her beskriver vi en metode for å transplantere zebrafisk-tumorceller til immunkompetente embryoer for langsiktig analyse av tumorcelleadferd og in vivo- medikamentresponser.
Abstract
Tumorcelletransplantasjon er en viktig teknikk for å definere mekanismer som styrer kreftcelletilvekst, migrasjon og vertsrespons, samt å vurdere potensiell pasientrespons på terapi. Nåværende metoder er i stor grad avhengige av bruk av syngene eller immunforstyrrede dyr for å unngå avvisning av tumorgraft. Slike metoder krever bruk av spesifikke genetiske stammer som ofte forhindrer analyse av immunkumor-celleinteraksjoner og / eller er begrenset til spesifikke genetiske bakgrunner. En alternativ metode i sebrafisk utnytter et ufullstendig utviklet immunsystem i den embryonale hjernen før 3 dager, hvor tumorceller transplanteres til bruk i kortsiktige analyser ( dvs. 3 til 10 dager). Imidlertid forårsaker disse metodene vertdødlighet, som forhindrer den langsiktige studien av tumorcelleadferd og medikamentrespons. Denne protokollen beskriver en enkel og effektiv metode for den langsiktige ortototopiske transplantasjonen av zebrafisk hjerne tumorvev iTil den fjerde ventrikel av en 2-dagers ukjent kompetent sebrafisk. Denne metoden tillater: 1) langsiktig studie av tumorcelleadferd, som invasjon og formidling; 2) varig svulstrespons mot rusmidler; Og 3) re-transplantasjon av svulster for studier av tumorutvikling og / eller virkningen av forskjellige vertsgenetiske bakgrunner. Sammendrag, lar denne teknikken kreftforskere å vurdere engraftment, invasjon og vekst på fjerne steder, samt å utføre kjemiske skjermbilder og cellekonkurranseanalyser i mange måneder. Denne protokollen kan utvides til studier av andre svulst typer og kan brukes til å belyse mekanismer for kjemoresistens og metastase.
Introduction
Transplantasjonen av tumorceller til immunkompromitterte dyr, spesielt mus-xenotransplantater, er en allment brukt teknikk som brukes til å studere mekanismer som styrer kreftcelleproliferasjon 1 , 2 , overlevelse, invasjon og metastase 3 , 4 , samt å gi en plattform For screening medikamenter 5 , 6 , 7 . Mer nylig har transplantasjonen av primære svulstprøver i immunkompromitterte mus blitt brukt til å generere pasient-avledede xenograftmodeller (PDX) for diagnostisk og preklinisk narkotika-screening, og er ryggraden i personlig medisin-initiativet 8 , 9 , 10 , 11 . Imidlertid viser signifikant bevis at modulering av immunsystemetStamme kan ha en dramatisk innvirkning på svulsteradferd og pasientutfall 12 , 13 . Dette har drevet redesignet av xenograft-baserte teknikker for å inkludere "humaniserte" mus, hvor immunsystemet til musen rekonstitueres ved samtransplantasjon av humane immunceller med tumorceller. Imidlertid er denne tilnærmingen fortsatt teknisk utfordrende, med variabel reproduserbarhet og toksisiteter forbundet med teknikken, i tillegg til den betydelige kostnaden 14 , 15 . Dermed er det nødvendig med nye transplantasjonsteknikker i immunkompetente dyr for å akselerere oppdagelsen av immun- og tumor-spesifikke mekanismer for kreftprogresjon og narkotika respons.
Sebrafisk er en alternativ dyremodell for studier av menneskelig kreft, med over 20 kreftmodeller etablert nå 16 , inkludert svært ondartet hjerne 17 , mela Noma 18 , 19 , 20 og bukspyttkjertelcancer 21 , 22 , så vel som mange leukemier 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . To egenskaper hos zebrafisksystemet gjør det spesielt egnet for kreftforskning: 1) Den optiske klarheten til gjennomsiktige dyr tillater direkte visualisering av kreftcelleadferdene ( dvs. spredning, overlevelse, invasjon og spredning) ved hjelp av enkle mikroskopiteknikker og 2) Kvinnenes sebrafisk kan produsere opptil 200 embryoer per dag, noe som gjør det mulig å raskt skille dyrnumre til genetisk eller narkotika-screening til en lav pris. I tillegg er kreftgenomene av sebrafisk og mennesker sterkt konserverte (inkludert onkogener og svulster-suppressor-gener)F "> 28, slik at mekanistiske og narkotikafunn raskt kan oversettes til pattedyrsystemer. Disse egenskapene gjør også sebrafisken en ideell dyremodell for transplantasjonsteknikker, som utnytter bildebehandling, skalerbarhet og lave kostnader for systemet.
Tidligere svulsttransplantasjonsstudier i immunforstyrret sebrafisk har gjort det lettere å identifisere selvfornyelsesevner, svulstproblemer og invasjon / spredning 11 , 29 . Kortsiktige studier av tumorcelleadferd kan utføres etter transplantasjon til γ-bestrålede voksne, hvis immunsystem effektivt undertrykkes for ~ 20 dager 11 , 30 . Behandlingen av voksen sebrafisk med dexametason undertrykker B- og T-celler i opptil 30 dager før avvisning skjer 31 . En annen mindre vanlig strategi benytter klonale sebrafiskstammerSom muliggjør langsiktige undersøkelser i en immunkompetent vert 32 . Imidlertid er bare et begrenset antall klonestammer generert og er vanskelig å opprettholde på grunn av lav fecunditet. I tillegg genereres de fleste etablerte sebrafisk-svulstmodeller i andre genetiske bakgrunner, slik at disse svulstene ikke kan transplanteres inn i klonestamlene uten å undertrykke immunsystemet 11 , 33 , 34 . Nyere tilnærminger for å forbedre langsiktige transplantasjonsstudier inkluderer utvikling av rag2 E450fs mutantlinjen , med kompromitterte B- og T-cellefunksjoner, som har blitt brukt til å transplantere flere kreftformer 35 , 36 . For å omgå kravet til klonale sebrafisk linjer eller en immunforstyrret vert, har flere grupper brukt tidlige embryoer ( dvs. > 72 hkOst-befruktning (hpf)) for human tumorcelletransplantasjon, da disse embryoer ennå ikke har utviklet et adaptivt immunsystem 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 . Imidlertid er disse metodene begrenset til kortsiktig analyse av tumorcelleadferd eller medikamentrespons (vanligvis mindre enn 2 uker) fordi de menneskelige kreftceller eller selve transplantasjonsteknikken dræper verten, hindrer langsiktige studier og re-transplantasjon.
Denne protokollen beskriver en modifisert embryonaltransplantasjonsmetode i lumen i den fjerde ventrikel i en 2-dagers post-befruktning (dpf) embryo-hjerne. Det minimerer toksisiteten til verten og kan kombineres med zebrafisk hjerne svulst modeller for langsiktig engraftment av tumorceller. Dermed er denne teknikken alLows for re-transplantasjon av svulstceller til nye verter over mange generasjoner, forenkling av fremtidige studier av tumor heterogenitet, verts / immunrespons, narkotika responser eller metastatisk potensial. Denne metoden er også enkel, effektiv og skalerbar, da opptil 300 transplantasjoner kan utføres av en enkelt bruker per dag, med opptil 90% engraftment. Dette gjør det mulig for rask utbredelse av enkelt primære svulster i hundrevis av embryoer ved 2 dpf for genetiske eller narkotika-screeningsprosjekter eller for direkte å visualisere hjerne-tumorcelleadferd i forskjellige vertsbakgrunner over mange måneder.
Protocol
Alle dyreprosedyrer ble godkjent og fulgte retningslinjer for dyrepleie ved University of Utah Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC # 16-03019).
1. Forbered utstyret for mikroinjeksjon
- Forbereder injeksjonsplaten.
- Forbered en 50 ml løsning av 1,2% agarose oppløst i eggvann (0,6 g / L akvariumsalt i omvendt osmose vann + 0,01 mg / l metylenblå). Kok oppløsningen til agarosen oppløses og deretter tilsett ved å tilsette 0,05 mg / l metylenblå. Hell 25 ml av den endelige løsningen i en 10 cm petriskål og la den størkne. Plasser de resterende 25 ml agaroseoppløsningen i et 42 ° C vannbad til klar for trinn 1.1.2.
- Sett et 2-tommers beger i midten av den størkne overflaten og hell de resterende 25 ml 1,2% agarose.
MERK: Dette skaper en injeksjonsflate på periferien av platen og en kjern i midten, somGir et område for å teste nålestørrelsen og svulstopphengskonsistensen.- Opprettholde injeksjonsplaten ved 28 ° C i minst 30 minutter før injeksjon eller ved 4 ° C for langtidsoppbevaring.
- Forbereder injeksjonsnåler.
- Gjør nålene ved å trekke 10 cm kapillærer med en ytre dimensjon på 1,2 mm og en indre dimensjon på 0,9 mm (uten glødetråd) i to nåler på en nåler.
MERK: Hver nål må måle 6 cm i total lengde, hvor ca 1,5 cm av enden er avsmalnet. - Plasser nålen forsiktig på et mikroskopflippe innpakket i plastparafinfilm. Bruk et knivblad for å kutte enden av nålen i en 45 ° vinkel for å lage en nål med en åpning på spissen.
MERK: Vanligvis blir 0,1 mm til 0,3 mm av nålens ender fjernet. En skråtråd er ikke nødvendig for å utføre injeksjonene.
- Gjør nålene ved å trekke 10 cm kapillærer med en ytre dimensjon på 1,2 mm og en indre dimensjon på 0,9 mm (uten glødetråd) i to nåler på en nåler.
- Forbered mikroinjektionsoppsettet.
- <Li> Ordne en standard mikroinjektionsoppsett, inkludert et stereomikroskop, en manipulator og en mikroinjektor for transplantasjonen.
2. Forbereder embryoer for transplantasjon
- Samle opptil 500 mitfa w2- embryoer 44 (eller embryoer av andre sebrafiskgenotyper som definert av brukeren) som beskrevet 45 og opprettholde i en 28 ° C inkubator.
- Dekkerionere embryoene ved 24 hpf ved å tilsette 100 μl 10 mg / ml protease cocktailoppløsning fortynnet i eggvann og forsiktig stein i ca. 20 minutter. Skyll embryoene 3 ganger med ferskt eggvann for å fjerne resterende protease.
- Skjerm embryoene på 48 hkf for det aktuelle utviklingsstadiet, som definert i standard kriterie serie 45 .
Merk: Bare riktig iscenesatte og morfologisk normale embryoer skal brukes til transplantasjonen. - bedøveOmtrent tjue 48-hpf-embryoer i eggvann inneholdende 0,002% Tricaine-S i en petriskål. Bekreft riktig bedøvelse ved å observere opphør av bevegelse.
3. Lag en tumorcellesuspensjon
MERK: Zebrafish hjernedumormodeller kan genereres av genetisk ingeniørkombinasjoner av onkogener og svulster suppressor gener 17 , 46 , 47 . Her ble sox10- promotor-drevet NRAS WT , p53 zdf1 / zdf1 CNS-PNET sebrafiskmodell brukt, som nylig beskrevet 17 .
- Euthanize en hjerne-svulstbærende fisk hvis tumorbyrde er ca. 20% av den totale kroppsstørrelsen ved bruk av en overdose på 0,4% Tricaine-S etterfulgt av nedsenkning i isvann i henhold til IACUC-godkjente protokoller.
- Disseksér den fluorescensmerkede svulsten med et knivblad og pinsett under fluorescensMikroskop ved hjelp av steril teknikk og plasser den i 5 ml 1x fosfatbuffert saltvann (PBS).
MERK: Eksakte disseksjonsmetoder vil være brukerdefinert og avhengig av type tumor og vev. Se de oppførte referansene for detaljerte prosedyrer for disseksjon av forskjellige zebrafiskorganer og hjernesvulster 17 , 48 . - Manuell forstyrre svulstmassen ved hjelp av en pipette pipette til en jevn, uklar løsning utvikler seg. Fjern store partikler med en pipettespiss eller bruk en 40 μm cellefilter (dette er svulstavhengig). Sentrifuger suspensjonen ved romtemperatur i 5 minutter ved 290 xg og fjern supernatanten.
Merk: Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) utføres ikke for å isolere tumorceller. Dette tillater transplantasjon av en heterogen populasjon av stromale, immun- og tumorceller. - Resuspender tumorcellepelleten i 100 ul steril PBS og overfør den til en 1,5 ml mikroSentrifugerør. Ta 5 μl av cellesuspensjonen og fortynn den i 250 μl PBS. Telle antall celler ved hjelp av et hemocytometer. Sentrifuger suspensjonen i 3 minutter ved 290 xg, fjern supernatanten og resuspender pelleten i sterilt PBS for å oppnå ønsket cellekonsentrasjon.
MERK: Cellene resuspendert i 30-40 μL sterilt PBS gir vanligvis en oppløsning som er viskøs og ugjennomsiktig (cellekonsentrasjon ≥100 celler / nL) og har en tendens til å generere de mest vellykkede transplantasjonene. Cell levedyktighet er ikke vurdert. - Oppbevar svulstesuspensjonen på en 28 ° C varmeblokk under transplantasjonsprosedyren.
4. Injiser tumorsuspensjonen inn i den fjerde ventrikkelen av en 2-dpf-embryo
- Overfør 10-20 bedøvede embryoer (fra trinn 2.4) til periferien av injeksjonsplaten ved hjelp av en overføringspipette; Embryoene skal falle lateralt på injeksjonsplaten, med ventriklene tydelig synlige og tilgjengelige. Bruk en vinklet sonde for å justere embryoene etter behov, og plasser dem vekk fra innsiden av injeksjonsplaten.
- Legg 1-2 μL av tumorcellesuspensjonen i injeksjonsnålen ved hjelp av gelpipetips og sett nålen inn i manipulatoren.
- Manuell senk manipulatoren, hold nålen i en 45 ° vinkel. Juster knappene på mikromekanipulatoren i retningene x, y og z til nålen er rett over og ca. 5 mm til høyre for embryohodet. Se gjennom okularene til stereomikroskopet og sakte justere mikromekanipulatoren i x-retningen til nålen pierces den fjerde ventrikel i embryoen. Ikke la nålen pierce hjertet eller eggeplommen.
- Skyv fotpedalen festet til mikroinjektoren for å injisere tumorcellesuspensjonen.
MERK: Injeksjonstrykket og tiden vil variere ut fra nålehullstørrelsen, men et godt utgangspunkt er 5 - 10 PSI og 50-100 ms.Volumet av injiserte tumorceller kan vurderes ved standard oljedråpsteknikker gjennom injeksjon i mineralolje, om ønsket 49 . Injeksjoner på 500 pL med en dråpediameter på 0,1 mm gir vanligvis de beste resultatene.
- Skyv fotpedalen festet til mikroinjektoren for å injisere tumorcellesuspensjonen.
- Skyll forsiktig de injiserte embryoene fra injeksjonsplaten og inn i en petriskål med fersk eggvann. Oppretthold embryoene i eggvann for de gjenværende prosedyrene eller til de dyrkes i tanker (som beskrevet i trinn 4.9.1).
- Inspiser de injiserte embryoer under et fluorescens stereomikroskop. Bekreft at injeksjonstrykk, vinkel, nålestørrelse og cellesuspensjonsviskositet resulterer i svulstceller som fyller 25-50% av ventrikkelrommet. Juster disse parametrene etter behov.
- Gjenta trinn 4.1-4.5 for eventuelle gjenværende embryoer. Bedøv de ekstra embryoene etter behov (beskrevet i trinn 2.4).
MERK: En erfaren bruker kan injisere opptil 300 embryoer i løpet av 3-4 timer. - Legg embryoene inn igjen28 ° C inkubatoren over natten.
- Neste dag vurderer embryooverlevelse ved å undersøke morfologiske og fysiologiske egenskaper, som for eksempel normal hjerte- og hjerneutvikling, som beskrevet 45 .
- For screening bedøves embryoene, som beskrevet i trinn 2.4, 1 dag etter transplantasjon (dpt).
- Bruk en overføringspipette til å tilsette 4% metylcellulose på midten av en petriskål og legg embryoene til metylcellulose-dråpen. Sett embryoene (ventral side vendt mot lyskilden) med en vinklet sonde og skjerm for en konsistent engraftmentstørrelse ved hjelp av et fluorescensmikroskop. Fjern eventuelle embryoer med svulstceller som ikke er begrenset til ventrikkelen eller de som inneholder tumorceller som kompromitterer mindre enn 25% av ventrikkelrommet.
Merk: Konsistent engraftment er definert som embryoer med en enkelt tumormasse som omfatter 25-50% av ventrikkelrommet 17 . For screening formål, bruk en fluorescens sTereomicroscope med 1X objektiv, en 0,15 numerisk blenderåpning, en forstørrelse som strekker seg fra 0,7-1,6X, og en eksponeringstid på 50 ms til 1 s. For alle bilder, bruk lysfeltkanalen i tillegg til enten GFP- eller RFP-kanalen. - For vedlikehold av svulster, plasser de transplanterte embryoene i tankene å vokse 45 ved 8 dpf (6 dpt).
- Bruk en overføringspipette til å tilsette 4% metylcellulose på midten av en petriskål og legg embryoene til metylcellulose-dråpen. Sett embryoene (ventral side vendt mot lyskilden) med en vinklet sonde og skjerm for en konsistent engraftmentstørrelse ved hjelp av et fluorescensmikroskop. Fjern eventuelle embryoer med svulstceller som ikke er begrenset til ventrikkelen eller de som inneholder tumorceller som kompromitterer mindre enn 25% av ventrikkelrommet.
5. Imaging Transplanted Embryos for Cellular Behaviors
- Bedøv embryoene på 3-8 dpf (1-6 dpt) og fest (dorsal side mot dekselet) i 1,2% lavmeltig agarose. Utfør time-lapse-bildebehandling av de monterte embryoene ved hjelp av et laserskanningskonokulært mikroskop for ønsket lengde for å visualisere cellulær oppførsel, som for eksempel migrasjon, celledeling eller celle-celle-interaksjoner, etter behov, 38 , 43 , 53 .
MERK: Bruk et bildeforhold på 1.024 x 1.024, en skannehastighet på 8 og #181; s / piksel. Bruk skanneverdi og definer dypdimensjonene for å sikre fangst av hele tumormassen (1000-1.500 μm). I tillegg utfører 4-timers tidsforsinkelseseksperimenter, og anskaffer et bilde hver 10.-15. Minutt ved hjelp av et 40x objektiv, for å overvåke invasiv oppførsel. Detektorens følsomhet vil variere avhengig av intensiteten i tumormassen, og laserkraften vil være mikroskopavhengig, men det anbefales vanligvis å være mellom 15 og 40%. - Når bildet er fullført, frigjør det monterte embryoen fra agarosen ved hjelp av en vinklet sonde og overfør den til en petriskål med fersk eggvann.
6. Legemiddeladministrasjon til transplanterte embryoer og vurdering av tumorbyrden 17
- Bedøve embryoer ved 3 dpf og orienter dem i 4% metylcellulose, med ventralsiden mot lyskilden. Bild førbehandlingsembryonene ved hjelp av et fluorescensmikroskop 17 .
- PlaCe de transplanterte embryoer ved 3 dpf i en 12-brønn plate med 10 embryoer per brønn i 0,5 ml eggvann. Tilsett riktig mengde medikament for å oppnå ønsket sluttkonsentrasjon ( f.eks. 50 μM MEK inhibitor) og returner embryoene til en 28 ° C inkubator. Neste dag, fjern det medikamentbehandlede eggvannet med en tynnboreoverføringspipette og legg til frisk behandling. Gjenta dette daglig til embryoene når 8 dpf.
- Ved 8 dpf, fjern embryoene fra narkotikabehandling og legg dem i fersk eggvann. Bedøv embryoene og orienteringen (ventralsiden mot lyskilden) i 4% metylcellulose. Bildeembryoer etterbehandling ved hjelp av et fluorescensmikroskop. Kvantifiser svulsterområdet ved å bruke passende programvare, som beskrevet 17 .
- Separat embryoene som passer per behandling og plasser dem i tanker for å vokse. Etter 4-9 uker bedøv fisken og vurder dem for total tumorbelastning ved å bruke et standard fluorescens-stereomikroskop, som dEscribed 17 .
Representative Results
Tumortransplantasjon og engraftment
En skjematisk oversikt over prosedyren er representert i figur 1 . Fluorescensmerkede tumorceller blir ekstrahert fra det primære orgelstedet, og en en-cellesuspensjon genereres for transplantasjon i den fjerde ventrikel av 2-dpf mitfa w2 sebrafiskembryoer 44 . Figur 2 viser de representative resultatene for denne metoden ved bruk av en sebrafiskmodell av primær nevral ektodermaltumor (CNS-PNET) i sentralnervesystemet , hvor sox10-promotoren driver uttrykk for wildtype NRAS eller aktivert NRAS fusjonert til mCherry i p53- defekte oligonale forløperceller 17 . Den mitfa w2 zebrafish 44 mutanten, som mangler melanophores, ble brukt til å mer visualisereTumorcellene etter transplantasjon og / eller i voksen alder. Andre pigmentmutanter kan også brukes til å gi ytterligere bildeklarhet, slik som Casper 50 . Så tidlig som 24 timer etter transplantasjon, kan tumorceller bli sett inn i omgivende hjernevev ( figur 2A , 3 dpf, piler). Tumortransplantater fortsetter å vokse i ventrikkelen og omkringliggende hjernevev i løpet av neste uke ( Figur 2A , 8 dpf). På denne tiden kan fluorescens også observeres i nyrene ( Figur 2A , stjerner). Dette kan skyldes nyrene som filtrerer den cellulære rusk fra transplantasjonen, noe som er i overensstemmelse med tidligere studier som bruker fluorescerende fargestoffer som en analyse for å evaluere nyrefunksjon 51 . Tumorceller fortsetter å proliferere og invadere, så med 28 dpf kan en tumormasse ses gjennom sebrafiskhjernen ( Figur 2A , 28 dpf).
figur 2B . Tumor engraftment oppnås vanligvis i 80-90% av embryoer, og tumor transplantasjoner vedvarer til voksen alder; Tre representative eksempler er vist i bunnpanelene i figur 2B . Dette tillater at transplantatene blir høstet og frosset eller re-transplantert i flere generasjoner.
Tumor invasjon og rusmiddelresponser
Figur 3A viser et co-transplantasjonsskjema hvor to forskjellige tumorer merket med enten GFP (Tumor A) eller mCherry (Tumor B) høstes av hel-tumEller dissociation (merk at FACS ikke er brukt her, men FACS-sorterte tumorceller kan brukes hvis det er nødvendig). Tumor A og B kan være fra forskjellige steder, indusert med forskjellige onkogener, eller indusert i forskjellige genetiske bakgrunner. Hver tumor blir behandlet til en enkelt-cellesuspensjon, og tumorceller blir så blandet sammen i et 1: 1-forhold og transplantert i 2-dpf-embryoet. Tumoregenskaper, slik som engraftment, vekst, invasjon og formidling av Tumor A mot Tumor B, kan da observeres i samme vert som muliggjør interne kontroller for teknikken og genetisk bakgrunn.
I figur 3B ble en NRAS- drevet, mCherry-merket zebrafisk CNS-PNET fra det optiske tektum og et GFP-merket CNS-PNET fra cerebellum høstet og behandlet til en-cellesuspensjoner. Celler ble telt, og et like antall celler fra hver tumor ble blandet sammen og transplantert i 2-dpf-embryoer. Fire dEtter transplantasjonen ble embryoene avbildet med konfokal mikroskopi. Vist er et representativt embryo som demonstrerer at tektum-tumorceller (rødt) migrerer mer omfattende inn i vertshjernen (piler) enn cerebellarumoren.
Embryoer transplantert med fluorescensmerkede tumorceller kan brukes i legemiddelbehandlingsregimer for å identifisere forbindelser som hemmer tumorvekst. Figur 3C er en typisk tidslinje for behandling og avbildning av tumortransplantasjoner. 24 timer etter transplantasjon, er embryoer tilgjengelige for konsekvent engraftment størrelse og delt inn i behandlingsgrupper. I det angitte eksempelet behandles embryoer transplantert med NRAS- drevne, mCherry-merkede zebrafisk CNS-PNETs med 50 μM dimetylsulfoksid (DMSO) eller MEK-inhibitor (AZD6244). Embryoer behandles i 5 dager og avbildes ved 8 dpf, som angitt i figur 3C . Figur 3D (venstre panel) viser representativ E dyr fra de to behandlingsgruppene. MEK-inhibitorbehandlede embryoer har en signifikant lavere mengde fluorescens enn de som er behandlet med DMSO, som beskrevet 17 . Etter at dyrene er avbildet, blir de overført til tanker uten narkotika og overvåket for vekst i to måneder. I det angitte eksemplet resulterer MEK-inhibitorbehandlingen i en holdbar respons i den voksne fisken ( Figur 3D , høyre paneler). For ytterligere detaljer om stoffbehandling, avbildning og kvantifisering, se referanse 17 .
Figur 1: Protokol skjematisk for tumorcellertransplantasjon i fjerde ventrikel av 2-dpf sebrafiskembryoer. Generell skjema for avsnitt 3 til 4 i protokollen, inkludert alternative endepunktanalyser (seksjoner 4.9-6)./55712/55712fig1large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tumor Engraftment og Progression. (A) Zebrafish primære CNS-PNET 17 tumorceller merket med mCherry ble transplantert i fjerde ventrikel av 2-dpf-embryoer. Ved 3 dpf, ser tumorceller seg inn i omgivende hjernevev (piler). Ved 8 dpf vokser tumorceller i ventrikkelen; Røde svulstceller er også tilstede i det omkringliggende hjernevæv og nyrer (asterisker). Ved 28 dpf har tumorsceller invadert og vokst gjennom vertshjernen. (B) Topppanel. Syv 3-dpf-embryoer transplantert med mCherry-merkede zebrafisk hjerne-tumorceller. Tumorceller kan transplanteres konsekvent i hundrevis av embryoer, med høye engraftment-priser ( dvs. vanligvis 85/100 embryoer). Midt ogBunnplater. Tre representative voksenfisk med transplanterte svulster 4-8 uker etter befruktning (wpf). Tumorer kan visualiseres ved fluorescensmikroskopi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Sammenligning av Tumor Invasion og Drug Response. ( A ) CNS-PNETs 17 fra det optiske tektum eller cerebellum er merket med henholdsvis mCherry eller GFP, behandlet til en enkeltcellesuspensjon, blandet sammen i et 1: 1-forhold og samtransplantert i 2-dpf-embryoer. ( B ) Et 6-dpf-embryo samtransplantert med en blandet suspensjon av GFP-merkede cerebellære tumorceller og mCherry-merkede tumorceller fra optisk tektum. Forskjeller i de invasive egenskapene til hver svulst i tHan samme mottaker kan observeres ved hjelp av fluorescensmikroskopi. I dette eksemplet migrerer mCherry-merkede tumorceller mer omfattende enn de som er merket med GFP (piler). ( C ) Tidslinje for narkotikabehandling på embryoer transplantert med tumorceller. ( D ) Bilder av representative dyr ved slutten av behandlingsregimet (8 dpf) og 8 uker etter behandling (8 wpf), med enten en DMSO-kontroll eller en 50 μM MEK-inhibitor. Tumorbyrden kan måles ved å kvantifisere fluorescens, som beskrevet 17 . I dette forsøket blir veksten av mCherry-merkede tumorceller redusert i MEK-inhibitorbehandlede embryoer og omdannes til en holdbar respons hos voksne. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne protokollen beskriver en enkel og effektiv transplantasjonsanalyse som involverer injeksjon av zebrafisk-tumorceller i ventrikkelen i et 2-dpf-embryo som vil utvikle et fullt kompetent immunsystem. Så langt har zebrafisk CNS-PNET 17 og melanom (data ikke vist) blitt transplantert for langsiktige studier av tumorcelleadferd og invasjon. De kritiske trinnene i denne protokollen inkluderer å sikre riktig nåleborestørrelse og riktig tumorcellesuspensjon og tilstrekkelig bedøvende vertsembryoer. For hver enkelt forsker kan ytterligere optimalisering av denne teknikken omfatte justering av tumorcellekonsentrasjon, injeksjonstrykk og embryoorientering. I tillegg kan det være heterogenitet i viskositeten av suspensjoner som kommer fra forskjellige svulster, slik at forskjellige svulst typer kan være mer eller mindre vanskelige å suspendere og transplantere. Men ved å justere nålens borestørrelse og ved å bruke diffeLeiefortynninger av svulstesuspensjonen, det er mulig å overvinne vanskeligheter forbundet med tumorviskositeter.
Etter vår erfaring er de vanligste årsakene til sparsomme celler / inkonsekvente cellemasse i ventrikkelen som følger: 1) tumorcellesuspensjonen er for fortynnet; 2) nålens borestørrelse er for liten; 3) injeksjonstid og -trykk er for lavt; Og / eller 4) gjenværende vev ble ikke filtrert fra svulsten og innlagt i nålen. Når svulstcellesuspensjonen strømmer ut av ventrikkelen etter injeksjon, skyldes det sannsynligvis: 1) plassering av nålen mot gulvet i ventrikkelen; 2) høyt injeksjonstrykk og tid; Og / eller 3) en nålbore størrelse som er for stor. Lav overlevelse av transplanterte embryoer kan skyldes: 1) bedøvelse av embryoer i lengre tid; 2) forlater embryoer på injeksjonsplaten for å tørke; 3) injeksjon av luftbobler inn i ventrikkelen; Og / eller 4) piercing vitale organer, som hjernen ogHjerte, fordi nålen gikk gjennom ventrikkelen.
Tidligere metoder for tumortransplantasjon hos voksne eller embryonale sebrafiskhjerne stammer fra immunosuppresjon hos voksne (genetisk, farmakologisk eller via stråling) eller er begrenset til kortsiktige studier av humane eller musceller i embryoer 38 , 43 , 52 , 53 , 54 . For eksempel kan musens hjerne-tumorer injiseres intranasalt i deksametason-immunsuppressiv, 30-dpf juvenil sebrafisk for bruk på kortvarige (~ 2 dager) prekliniske legemiddelanalyser 54 . Imidlertid er injeksjonsstedet i disse forsøkene skjult av skallen og hjernevævet og vil sannsynligvis resultere i skade på normalt hjernevæv, noe som reduserer vertslevbarhet og engraftmenteffektivitet. En annen nylig beskrevet metode involverer injeksjon av menneskelig gliobLastoma cellelinjer i midbrain regionen av zebrafish embryoer, som gjorde det mulig for kortsiktig analyse av vekst, invasjon og narkotika respons 43 . Igjen er det nøyaktige stedet for injeksjonsstedet variabelt og sannsynligvis skadet normalt vev. Dermed kompromitterer tidligere metoder for embryonale hjernetransplantasjoner ofte levedyktigheten av vertene, og begrenser disse studiene til kortsiktig analyse ( dvs. 2 til 14 dager), noe som medfører økt variasjon mellom individuelle injeksjoner på grunn av skjulte injeksjonssteder og hindrer langvarig injeksjon. Langsiktig analyse av celleadferd og rusmiddelrespons eller re-transplantasjon over flere generasjoner.
Metoden beskrevet her adresserer nåværende begrensninger i embryonale og immunforstyrrede transplantasjonsteknikker ved å tillate forskere: 1) reproduserbart injiseres på samme sted, med minimal skade på omgivende vev; 2) visualisere direkte injeksjonsstedet for å maksimereEngraftment effektivitet; 3) transplantere hundrevis av embryoer per dag; 4) la svulster vokse i immunkompetente dyr; 5) muliggjøre overvåking av tumorcelleadferd og holdbare legemiddelresponser over livet av sebrafisken; Og 6) tillate re-transplantasjon av svulster over mange generasjoner for potensielle studier på utviklingen av tumor eller mekanismer for tilbakefall av medisiner. Videre tillater denne protokollen forskere å utnytte noen sebrafiskgenotype til vurdering av vertsresponsen, inkludert forskjellige immunpopulasjoner. Disse egenskapene gjør denne metoden lett tilpassbar av alle laboratorier som allerede utfører standard mikroinjeksjoner i sebrafisk. Til slutt, mens denne metoden er ideell for ortopotopiske injeksjoner av zebrafisk hjerne svulster, kan transplantasjonen av andre svulst typer, som lever eller bukspyttkjertel, være viktigere enn immunkompetanse (for eksempel hvis en forsker studerer effekten av stromal Mikromiljø på tumorvekst). I dette scenariet, denNyutviklede, immundefekte zebrafiskmodeller kan være mer hensiktsmessige for å utføre ortotopiske tumortransplantasjoner 11 .
Denne protokollen har blitt brukt til å utføre tumorcellekonkurranseanalyser og å injisere dobbelt merkede svulster. En potensiell behandlingsstrategi for vurdering av effektiviteten av kjemiske forbindelser på tumorigenese, som involverer behandling av embryoer etter transplantasjon via tilsetning av legemidlet til vann, ble også diskutert. En metode for ex vivo behandling av tumorceller før transplantasjon ble også tidligere rapportert 17 . I tillegg er transplanterte svulster blitt samlet for flere runder av re-transplantasjon, som vil være gunstig for studier av tumorutvikling og kjemoresistens 17 . Foreløpig er prekliniske studier avhengig av musen xenografter for å vurdere effekten av potensielle forbindelser. Men disse studiene er tidkrevendeOg kostbart. Med tanke på den høye grad av bevaring av onkogene signalveier mellom sebrafisk og mennesker 28 , kan det forventes at denne metoden vil utfylle konvensjonelle mus- og humancellestudier for å muliggjøre raskere identifisering av effektive forbindelser inn i prekliniske og kliniske studier. Til slutt kan denne metoden vise seg å være nyttig for hurtig kjemisk screening av primære pasienttumorer, noe som ytterligere kunne drive det personlige medisinske initiativet. Imidlertid må forholdene for langvarig vekst av humane celler i sebrafisk (voksen eller embryo) fortsatt identifiseres.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker de to korrekturleserne for gode forslag og forbedringer av manuskriptet. Vi takker også Huntsman Cancer Institute / University of Utah for husdyrhold og vedlikehold. Dette arbeidet ble finansiert av American Cancer Society (# 124250-RSG-13-025-01-CSM), et NIH-stipend (P30 CA042014 CRR-programmet), University of Utah Seed Grant og Huntsman Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
| 50 mL beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
| Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
| Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
| Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
| Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
| Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
| 1,000 µL filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
| 100 µL filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
| 50 mL conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
| 15 mL conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
| 1.7 mL microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
| Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
| Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
| Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
| Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
| Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
| Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
| Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
| Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
| Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
| Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
| Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
| Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
| Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
| Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
| PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
| 12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
| Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
| Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
| N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |
References
- Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer. Mol Ther. 10 (6), 1032-1042 (2004).
- Stephen, R. M., et al. Monitoring the development of xenograft triple-negative breast cancer models using diffusion-weighted magnetic resonance imaging. Exp Biol Med. 237 (11), 1273-1280 (2012).
- Deroose, C. M., et al. Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined small-animal PET, small-animal CT, and bioluminescence imaging. J Nucl Med. 48 (2), 295-303 (2007).
- Saxena, M., Christofori, G. Rebuilding cancer metastasis in the mouse. Mol Oncol. 7 (2), 283-296 (2013).
- Johnson, J. I., et al. Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials. Br J Cancer. 84 (10), 1424-1431 (2001).
- Kerbel, R. S. Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans - Better than commonly perceived - But they can be improved. Cancer Biology & Therapy. 2 (4), S134-S139 (2003).
- Scholz, C. C., Berger, D. P., Winterhalter, B. R., Henss, H., Fiebig, H. H. Correlation of Drug Response in Patients and in the Clonogenic-Assay with Solid Human Tumor Xenografts. Eur J Cancer. 26 (8), 901-905 (1990).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Cho, S. Y., et al. An Integrative Approach to Precision Cancer Medicine Using Patient-Derived Xenografts. Mol Cells. 39 (2), 77-86 (2016).
- Hiroshima, Y., et al. Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy. Oncotarget. 7 (44), 71696-71702 (2016).
- Moore, J. C., Langenau, D. M. Allograft Cancer Cell Transplantation in Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916, 265-287 (2016).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Dranoff, G. Experimental mouse tumour models: what can be learnt about human cancer immunology. Nat Rev Immunol. 12 (1), 61-66 (2011).
- Richmond, A., Su, Y. Mouse xenograft models vs GEM models for human cancer therapeutics. Dis Model Mech. 1 (2-3), 78-82 (2008).
- Bernard, D., Peakman, M., Hayday, A. C. Establishing humanized mice using stem cells: maximizing the potential. Clin Exp Immunol. 152 (3), 406-414 (2008).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Modzelewska, K., et al. MEK Inhibitors Reverse Growth of Embryonal Brain Tumors Derived from Oligoneural Precursor Cells. Cell Rep. 17 (5), 1255-1264 (2016).
- Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Curr Biol. 15 (3), 249-254 (2005).
- Dovey, M., White, R. M., Zon, L. I. Oncogenic NRAS cooperates with p53 loss to generate melanoma in zebrafish. Zebrafish. 6 (4), 397-404 (2009).
- Santoriello, C., et al. Kita driven expression of oncogenic HRAS leads to early onset and highly penetrant melanoma in zebrafish. PLoS One. 5 (12), e15170 (2010).
- Park, S. W., et al. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
- Liu, S., Leach, S. D. Screening pancreatic oncogenes in zebrafish using the Gal4/UAS system. Methods Cell Biol. 105, 367-381 (2011).
- Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
- Langenau, D. M., et al. Cre/lox-regulated transgenic zebrafish model with conditional myc-induced T cell acute lymphoblastic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 6068-6073 (2005).
- Sabaawy, H. E., et al. TEL-AML1 transgenic zebrafish model of precursor B cell acute lymphoblastic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15166-15171 (2006).
- Chen, J., et al. NOTCH1-induced T-cell leukemia in transgenic zebrafish. Leukemia. 21 (3), 462-471 (2007).
- Feng, H., et al. Heat-shock induction of T-cell lymphoma/leukaemia in conditional Cre/lox-regulated transgenic zebrafish. Br J Haematol. 138 (2), 169-175 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Li, P., White, R. M., Zon, L. I. Transplantation in zebrafish. Methods Cell Biol. 105, 403-417 (2011).
- Traver, D., et al. Effects of lethal irradiation in zebrafish and rescue by hematopoietic cell transplantation. Blood. 104 (5), 1298-1305 (2004).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5 (3), 383-394 (2010).
- Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Res. 66 (6), 3120-3125 (2006).
- Tenente, I. M., Tang, Q., Moore, J. C., Langenau, D. M. Normal and malignant muscle cell transplantation into immune compromised adult zebrafish. J Vis Exp. (94), (2014).
- Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
- Geiger, G. A., Fu, W., Kao, G. D. Temozolomide-mediated radiosensitization of human glioma cells in a zebrafish embryonic system. Cancer Res. 68 (9), 3396-3404 (2008).
- Kitambi, S. S., et al. Vulnerability of glioblastoma cells to catastrophic vacuolization and death induced by a small molecule. Cell. 157 (2), 313-328 (2014).
- Lally, B. E., et al. Identification and biological evaluation of a novel and potent small molecule radiation sensitizer via an unbiased screen of a chemical library. Cancer Res. 67 (18), 8791-8799 (2007).
- Vittori, M., Motaln, H., Turnsek, T. L. The study of glioma by xenotransplantation in zebrafish early life stages. J Histochem Cytochem. 63 (10), 749-761 (2015).
- Yang, X. J., et al. A novel zebrafish xenotransplantation model for study of glioma stem cell invasion. PLoS One. 8 (4), e61801 (2013).
- Zhao, H., Tang, C., Cui, K., Ang, B. T., Wong, S. T. A screening platform for glioma growth and invasion using bioluminescence imaging. Laboratory investigation. J Neurosurg. 111 (2), 238-246 (2009).
- Welker, A. M., et al. Correction: Standardized orthotopic xenografts in zebrafish reveal glioma cell-line-specific characteristics and tumor cell heterogeneity. Dis Model Mech. 9 (9), 1063-1065 (2016).
- Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126 (17), 3757-3767 (1999).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (2000).
- Solin, S. L., Shive, H. R., Woolard, K. D., Essner, J. J., McGrail, M. Rapid tumor induction in zebrafish by TALEN-mediated somatic inactivation of the retinoblastoma1 tumor suppressor rb1. Sci Rep. 5, 13745 (2015).
- Ju, B., et al. Oncogenic KRAS promotes malignant brain tumors in zebrafish. Mol Cancer. 14, (2015).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Christou-Savina, S., Beales, P. L., Osborn, D. P. Evaluation of zebrafish kidney function using a fluorescent clearance assay. J Vis Exp. (96), e52540 (2015).
- Rampazzo, E., et al. Wnt activation promotes neuronal differentiation of glioblastoma. Cell Death Dis. 4, (2013).
- Lal, S., La Du,, Tanguay, J., L, R., Greenwood, J. A. Calpain 2 is required for the invasion of glioblastoma cells in the zebrafish brain microenvironment. J Neurosci Res. 90 (4), 769-781 (2012).
- Eden, C. J., et al. Orthotopic models of pediatric brain tumors in zebrafish. Oncogene. 34 (13), 1736-1742 (2015).
