Summary
El trasplante de células cancerosas es una herramienta importante para la identificación de mecanismos de cáncer y respuestas terapéuticas. Las técnicas actuales dependen de animales inmuno-incompetentes. En este artículo, describimos un método para trasplantar células tumorales de pez cebra en embriones inmune-competentes para el análisis a largo plazo del comportamiento de las células tumorales y las respuestas in vivo a los fármacos.
Abstract
El trasplante de células tumorales es una técnica importante para definir los mecanismos que controlan el crecimiento de las células cancerosas, la migración y la respuesta del huésped, así como para evaluar la respuesta potencial del paciente a la terapia. Los métodos actuales dependen en gran medida del uso de animales singénicos o inmunocomprometidos para evitar el rechazo del injerto tumoral. Tales métodos requieren el uso de cepas genéticas específicas que a menudo impiden el análisis de interacciones de células inmunitarias y / o se limitan a antecedentes genéticos específicos. Un método alternativo en el pez cebra se aprovecha de un sistema inmunológico incompleto desarrollado en el cerebro embrionario antes de 3 días, donde las células tumorales se trasplantan para su uso en ensayos a corto plazo ( es decir, de 3 a 10 días). Sin embargo, estos métodos causan letalidad del hospedador, lo que impide el estudio a largo plazo del comportamiento de las células tumorales y la respuesta de fármacos. Este protocolo describe un método simple y eficiente para el trasplante ortotópico a largo plazo de tejido cerebral de cerebro de pez cebra enAl cuarto ventrículo de un pez cebra inmune-competente de 2 días de edad. Este método permite: 1) el estudio a largo plazo de las conductas de las células tumorales, como la invasión y la diseminación; 2) respuesta duradera del tumor a los fármacos; Y 3) retrasplante de tumores para el estudio de la evolución tumoral y / o el impacto de diferentes fondos genéticos del huésped. En resumen, esta técnica permite a los investigadores del cáncer evaluar el injerto, la invasión y el crecimiento en sitios distantes, así como realizar pruebas químicas y ensayos de competición celular durante muchos meses. Este protocolo se puede extender a estudios de otros tipos de tumores y puede usarse para elucidar mecanismos de quimiorresistencia y metástasis.
Introduction
El trasplante de células tumorales en animales inmunocomprometidos, en particular los xenoinjertos de ratón, es una técnica ampliamente utilizada utilizada para estudiar mecanismos que controlan la proliferación de células cancerígenas 1 , 2 , supervivencia, invasión y metástasis 3 , 4 , ası como proporcionar una plataforma Para el cribado de fármacos 5 , 6 , 7 . Más recientemente, se ha utilizado el trasplante de muestras de tumores primarios en ratones inmunocomprometidos para generar modelos de xenoinjerto (PDX) derivados de pacientes para fines de diagnóstico y preclínicos de detección de fármacos y es la columna vertebral de la iniciativa de medicina personalizada 8 , 9 , 10 , 11 . Sin embargo, evidencia significativa demuestra que la modulación de la inmunidad syTallo puede tener un impacto dramático en el comportamiento del tumor y el resultado del paciente [ 12 , 13] . Esto ha impulsado el rediseño de técnicas basadas en xenoinjertos para incluir ratones "humanizados", en los que el sistema inmune del ratón se reconstituye mediante el co-trasplante de células inmunes humanas con células tumorales. Sin embargo, este enfoque sigue siendo técnicamente desafiante, con reproducibilidad variable y toxicidades asociadas con la técnica, además del costo significativo 14 , 15 . Por lo tanto, se necesitan nuevas técnicas de trasplante en animales inmunocompetentes para acelerar el descubrimiento de mecanismos específicos del tumor y de la inmunidad de la progresión del cáncer y la respuesta del fármaco.
El pez cebra es un modelo animal alternativo para el estudio del cáncer humano, con más de 20 modelos de cáncer ahora establecidos 16 , incluyendo el cerebro muy maligno 17 , mela Noma 18 , 19 , 20 y cánceres pancreáticos 21 , 22 , así como muchas leucemias 23 , 24 , 25 , 26 , 27 . Dos atributos del sistema de pez cebra lo hacen especialmente adecuado para la investigación del cáncer: 1) la claridad óptica de los animales translúcidos permite la visualización directa de las conductas de las células cancerosas ( es decir, la proliferación, la supervivencia, la invasión y la diseminación) El pez cebra femenino puede producir hasta 200 embriones por día, lo que permite el rápido escalamiento de los números de animales para la detección genética o de drogas a un bajo costo. Además, los genomas de cáncer de pez cebra y humanos son altamente conservados (incluyendo oncogenes y genes supresores de tumores)F "> 28, permitiendo que los descubrimientos mecánicos y de fármacos se traduzcan rápidamente a sistemas de mamíferos, lo que hace que el pez cebra sea un modelo animal ideal para técnicas de trasplante que aprovechan la imagen, escalabilidad y bajo costo del sistema.
Estudios previos de trasplante de tumores en el pez cebra con compromiso inmunológico han facilitado la identificación de capacidades de auto-renovación, malignidad tumoral e invasión / diseminación 11 , 29 . Los estudios a corto plazo del comportamiento de las células tumorales pueden realizarse tras el trasplante en adultos irradiados con γ, cuyos sistemas inmunológicos se suprimen eficazmente durante ~ 20 días [ 11 , 30] . El tratamiento del pez cebra adulto con dexametasona suprime las células B y T durante hasta 30 días antes de que se produzca el rechazo 31 . Otra estrategia menos común emplea clonal cebra cepasQue permiten investigaciones a largo plazo en un huésped inmune-competente 32 . Sin embargo, sólo se ha generado un número limitado de cepas clonales y son difíciles de mantener debido a su baja fecundidad. Además, la mayoría de los modelos establecidos tumor de pez cebra se generan en otros antecedentes genéticos, por lo que estos tumores no pueden ser trasplantados en las cepas clonales sin suprimir el sistema inmunológico [ 11 , 33 , 34] . Los enfoques más recientes para mejorar los estudios de transplante a largo plazo incluyen el desarrollo de la línea mutante rag2 E450fs , con funciones B y T comprometidas, que se ha utilizado para trasplantar con éxito varios tipos de cáncer 35 , 36 . Para eludir el requisito de las líneas clonales de pez cebra o un huésped inmunocomprometido, varios grupos han utilizado embriones en etapa temprana ( es decir, > 72 CVOst-fertilization (hpf)) para el trasplante de células tumorales humanas, ya que estos embriones aún no han desarrollado completamente un sistema inmune adaptativo 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 . Sin embargo, estos métodos se limitan al análisis a corto plazo del comportamiento de las células tumorales o la respuesta a fármacos (usualmente menos de 2 semanas) debido a que las células cancerosas humanas o la técnica de trasplante por sí misma matan al huésped, evitando estudios a largo plazo y retrasplante.
Este protocolo detalla un método de trasplante embrionario modificado en el lumen del cuarto ventrículo de un cerebro de embrión de 2 días después de la fecundación (dpf). Minimiza la toxicidad para el huésped y puede combinarse con modelos de tumor cerebral de pez cebra para el injerto a largo plazo de células tumorales. Así, esta técnica alBajos para el re-transplante de células tumorales en nuevos huéspedes durante muchas generaciones, lo que facilita estudios futuros sobre la heterogeneidad tumoral, respuestas huésped / inmune, respuestas a fármacos o potencial metastásico. Este método también es simple, eficiente y escalable, ya que hasta 300 trasplantes pueden ser realizados por un solo usuario por día, con hasta 90% de injerto. Esto permite la propagación rápida de tumores primarios individuales en cientos de embriones a 2 dpf para proyectos genéticos o de detección de fármacos o para visualizar directamente el comportamiento de células tumorales cerebrales en diferentes fondos de acogida durante muchos meses.
Protocol
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados y siguieron las directrices de cuidado de animales del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucionales de la Universidad de Utah (IACUC # 16-03019).
1. Preparación del equipo para la microinyección
- Preparación de la placa de inyección.
- Preparar una solución de 50 ml de agarosa al 1,2% disuelto en agua de huevo (0,6 g / L de sal de acuario en agua de ósmosis inversa + 0,01 mg / L de azul de metileno). Hervir la solución hasta que la agarosa se disuelve y luego completar con la adición de 0,05 mg / L de azul de metileno. Verter 25 ml de la solución final en una placa de Petri de 10 cm y dejar que se solidifique. Colocar los 25 ml restantes de solución de agarosa en un baño de agua a 42 ° C hasta que esté listo para el paso 1.1.2.
- Colocar un vaso de precipitados de 2 pulgadas de diámetro en el centro de la superficie solidificada y verter los 25 ml restantes de agarosa al 1,2%.
NOTA: Esto crea una superficie de inyección en la periferia de la placa y un núcleo en el centro, queProporciona un área para probar el tamaño de la aguja y la consistencia de la suspensión del tumor.- Mantener la placa de inyección a 28 ° C durante al menos 30 minutos antes de la inyección o a 4 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
- Preparación de agujas de inyección.
- Haga las agujas tirando capilares de 10 cm con una dimensión exterior de 1,2 mm y una dimensión interna de 0,9 mm (sin filamento) en dos agujas en un extractor de aguja.
NOTA: Cada aguja debe medir 6 cm de longitud total, donde aproximadamente 1,5 cm del extremo es cónico. - Coloque cuidadosamente la aguja en una lámina de microscopio envuelta en película de parafina de plástico. Use una cuchilla de afeitar para cortar el extremo de la aguja en un ángulo de 45 ° para crear una aguja con una abertura en la punta.
NOTA: Normalmente, se retiran 0,1 mm a 0,3 mm del extremo de la aguja. No se requiere una punta biselada para realizar las inyecciones.
- Haga las agujas tirando capilares de 10 cm con una dimensión exterior de 1,2 mm y una dimensión interna de 0,9 mm (sin filamento) en dos agujas en un extractor de aguja.
- Prepare la configuración de la microinyección.
- <Li> Organizar una configuración estándar de microinyección, incluyendo un estereomicroscopio, un manipulador y un microinyector para el trasplante.
2. Preparación de embriones para trasplante
- Recoja hasta 500 embriones mitfa w2 44 (o embriones de cualquier otro genotipo de pez cebra según lo definido por el usuario) como se describe en 45 y se mantiene en una incubadora a 28ºC.
- Dechorionate los embriones a 24 hpf mediante la adición de 100 μ l de 10 mg / mL solución de cóctel de proteasa diluido en agua de huevo y suavemente rock durante aproximadamente 20 min. Enjuague los embriones 3 veces con agua fresca de huevo para eliminar la proteasa residual.
- Examinar los embriones a 48 hpf para la etapa de desarrollo apropiada, tal como se define en los criterios estándar de la serie de estadificación 45 .
Nota: Para el trasplante sólo se deben utilizar embriones correctamente colocados y morfológicamente normales. - AnestesiarAproximadamente veinte embriones de 48 hpf en agua de huevo que contenía 0,002% de Tricaine-S en una placa de Petri. Confirme la anestesia adecuada observando el cese del movimiento.
3. Realización de una suspensión de células tumorales
NOTA: Los modelos de tumor cerebral de Zebrafish pueden ser generados por combinaciones genéticamente ingeniosas de oncogenes y genes supresores de tumores 17 , 46 , 47 . Aquí, se utilizó el modelo NRAS WT , p53 zdf1 / zdf1, del modelo zebrafish CNS-PNET impulsado por el promotor sox10, tal como se describió recientemente 17 .
- Eutanasiar un tumor portador de tumores cerebrales cuya carga tumoral es aproximadamente el 20% del tamaño total del cuerpo usando una sobredosis de Tricaine-S al 0,4% seguido de inmersión en agua helada según los protocolos aprobados por IACUC.
- Diseccionar el tumor marcado fluorescentemente con una cuchilla de afeitar y pinzas bajo una fluorescenciaUtilizando una técnica estéril y colocarlo en 5 ml de solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS).
NOTA: Los métodos de disección exactos serán definidos por el usuario y dependen del tipo de tumor y la ubicación del tejido. Ver las referencias listadas para procedimientos detallados para la disección de diferentes órganos de pez cebra y tumores cerebrales 17 , 48 . - Interrumpa manualmente la masa del tumor usando una pipeta p1000 hasta que se desarrolle una solución uniforme y turbia. Elimine partículas grandes con una punta de pipeta o usando un tamiz de células de 40 μm (esto depende del tumor). Centrifugar la suspensión a temperatura ambiente durante 5 min a 290 xg y eliminar el sobrenadante.
Nota: La clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) no se realiza para aislar las células tumorales. Esto permite el trasplante de una población heterogénea de células estromales, inmunes y tumorales. - Resuspender el sedimento de células tumorales en 100 μL de PBS estéril y transferirlo a un micro de 1,5 mltubo centrífugo. Tomar 5 μL de la suspensión celular y diluirla en 250 μl de PBS. Cuente el número de células usando un hemocitómetro. Centrifugar la suspensión durante 3 min a 290 xg, retirar el sobrenadante y resuspender el sedimento en PBS estéril para obtener la concentración celular deseada.
NOTA: Típicamente, las células resuspendidas en 30-40 μl de PBS estéril producen una solución viscosa y opaca (concentración celular ≥ 100 células / nL) y tienden a generar los trasplantes más exitosos. La viabilidad celular no se evalúa. - Guarde la suspensión del tumor en un bloque de calor a 28 ° C durante el procedimiento de trasplante.
4. Inyección de la suspensión del tumor en el cuarto ventrículo de un embrión de 2 dpf
- Transferir 10-20 embriones anestesiados (desde el paso 2.4) a la periferia de la placa de inyección usando una pipeta de transferencia; Los embriones deben caer lateralmente sobre la placa de inyección, con los ventrículos claramente visibles y accesibles. Utilice una sonda angulada para ajustar los embriones según sea necesario y posicionelos lejos del borde exterior de la placa de inyección.
- Cargar 1-2 μL de la suspensión de células tumorales en la aguja de inyección usando puntas de pipeta de carga de gel e insertar la aguja en el manipulador.
- Baje manualmente el manipulador, sujetando la aguja en un ángulo de 45 °. Ajuste las perillas del micromanipulador en las direcciones x, y y z hasta que la aguja esté justo encima y aproximadamente 5 mm a la derecha de la cabeza del embrión. Mire a través de los oculares del estereomicroscopio y ajuste lentamente el micromanipulador en la dirección x hasta que la aguja atraviese el cuarto ventrículo del embrión. No permita que la aguja perfore el corazón o la yema.
- Empuje el pedal de pie unido al microinyector para inyectar la suspensión de células tumorales.
NOTA: La presión y el tiempo de inyección variarán en función del diámetro de la aguja, pero un buen punto de partida es 5 - 10 PSI y 50 - 100 ms.El volumen de células tumorales inyectadas se puede evaluar con técnicas estándar de gota de aceite mediante la inyección en aceite mineral, si se desea 49 . Las inyecciones de 500 pL con un diámetro de gota de 0,1 mm típicamente dan los mejores resultados.
- Empuje el pedal de pie unido al microinyector para inyectar la suspensión de células tumorales.
- Enjuague suavemente los embriones inyectados de la placa de inyección y en una placa de Petri usando agua fresca de huevo. Mantener los embriones en agua de huevo para los procedimientos restantes o hasta que se cultiven en tanques (como se describe en el paso 4.9.1).
- Inspeccione los embriones inyectados bajo un estereomicroscopio de fluorescencia. Confirme que la presión de inyección, el ángulo, el tamaño de la aguja y la viscosidad de la suspensión celular dan como resultado células tumorales que llenan el 25-50% del espacio ventricular. Ajuste estos parámetros según sea necesario.
- Repita los pasos 4.1-4.5 para los embriones restantes. Anestesiar los embriones adicionales según sea necesario (descrito en el paso 2.4).
NOTA: Un usuario experimentado puede inyectar hasta 300 embriones en 3-4 h. - Coloque los embriones de nuevo enEl 28 ° C incubadora durante la noche.
- Al día siguiente, evaluar la supervivencia del embrión mediante el examen de características morfológicas y fisiológicas, como el corazón normal y el desarrollo del cerebro, como se describe [ 45] .
- Para el cribado, anestesiar los embriones, como se describe en el paso 2.4, al día 1 después del trasplante (dpt).
- Utilice una pipeta de transferencia para agregar 4% de metilcelulosa en el centro de una placa de petri y agregue los embriones a la gota de metilcelulosa. Oriente los embriones (lado ventral hacia la fuente de luz) usando una sonda angular y una pantalla para un tamaño de injerto consistente usando un microscopio de fluorescencia. Elimine cualquier embrión con células tumorales no confinadas al ventrículo o aquellas que contengan células tumorales que abarquen menos del 25% del espacio ventricular.
Nota: El injerto consistente se define como embriones con una sola masa tumoral que abarca 25-50% del espacio ventricular 17 . Para fines de cribado, utilice una fluorescencia sTereomicroscopio con un objetivo 1X, una apertura numérica de 0,15, una ampliación que va de 0,7-1,6X, y un tiempo de exposición de 50 ms a 1 s. Para todas las imágenes, utilice el canal de campo brillante además del canal GFP o RFP. - Para el mantenimiento de los tumores, coloque los embriones trasplantados en los tanques para crecer 45 a 8 dpf (6 dpt).
- Utilice una pipeta de transferencia para agregar 4% de metilcelulosa en el centro de una placa de petri y agregue los embriones a la gota de metilcelulosa. Oriente los embriones (lado ventral hacia la fuente de luz) usando una sonda angular y una pantalla para un tamaño de injerto consistente usando un microscopio de fluorescencia. Elimine cualquier embrión con células tumorales no confinadas al ventrículo o aquellas que contengan células tumorales que abarquen menos del 25% del espacio ventricular.
5. Imagen de embriones trasplantados para los comportamientos celulares
- Anestesiar los embriones a 3-8 dpf (1-6 dpt) y montar (lado dorsal frente a la cubreobjetos) en 1,2% de agarosa de bajo punto de fusión. Realizar imágenes de lapso de tiempo de los embriones montados utilizando un microscopio confocal de barrido láser durante el tiempo deseado para visualizar comportamientos celulares, tales como migración, división celular o interacciones célula-célula, según sea necesario 38 , 43 , 53 .
NOTA: Utilice una relación de aspecto de 1.024 x 1.024, una velocidad de exploración de 8 & #181; s / píxel. Emplear el promedio de la exploración y definir las dimensiones de la profundidad z para asegurar la captura de toda la masa tumoral (1.000-1.500 μm). Además, realice experimentos de lapso de tiempo de 4 horas, adquiriendo una imagen cada 10-15 minutos usando un objetivo de 40x, para monitorear comportamientos invasivos. La sensibilidad del detector variará dependiendo de la intensidad de la masa tumoral, y la potencia del láser dependerá del microscopio, pero generalmente se recomienda que esté entre 15 y 40%. - Una vez completada la imagen, libere el embrión montado de la agarosa usando una sonda angulada y transfiérala a una placa petri con agua de huevo fresca.
6. Administración de fármacos a los embriones trasplantados y la evaluación de la carga tumoral 17
- Anestesiar los embriones a 3 dpf y orientarlos en 4% de metilcelulosa, con el lado ventral hacia la fuente de luz. Imagen de los embriones de pretratamiento utilizando un microscopio de fluorescencia [ 17] .
- PlaCe los embriones trasplantados a 3 dpf en una placa de 12 pocillos, con 10 embriones por pocillo en 0,5 mL de agua de huevo. Añadir la cantidad apropiada de fármaco para obtener la concentración final deseada ( por ejemplo, inhibidor MEK 50 μM) y devolver los embriones a una incubadora a 28ºC. Al día siguiente, retire el agua de huevo tratada con fármaco con una pipeta de transferencia de ánima fina y agregue un nuevo tratamiento. Repita esto diariamente hasta que los embriones alcancen 8 dpf.
- A 8 dpf, retire los embriones del tratamiento farmacológico y colóquelos en agua fresca de huevo. Anestesiar los embriones y orientar (lado ventral frente a la fuente de luz) en metilcelulosa al 4%. Imagen embriones post-tratamiento con un microscopio de fluorescencia. Cuantificar el área del tumor utilizando un software apropiado, como se describe 17 .
- Separar los embriones según sea apropiado por tratamiento y colocarlos en tanques para crecer. Después de 4-9 semanas, anestesiar el pescado y evaluarlos para la carga global del tumor utilizando un estereomicroscopio de fluorescencia estándar, como dEscrito 17 .
Representative Results
Trasplante de tumores y injerto
Un esquema esquematizado del procedimiento se representa en la Figura 1 . Las células tumorales marcadas fluorescentemente se extraen del sitio del órgano primario, y se genera una suspensión de una sola célula para el trasplante en el cuarto ventrículo de 2-dpf mitfa w2 embriones de pez cebra 44 . La figura 2 muestra los resultados representativos para este método usando un modelo de pez cebra de tumor ectodérmico neural primitivo del sistema nervioso central (CNS-PNET), en el que el promotor sox10 impulsa la expresión de NRAS de tipo salvaje o NRAS activado fusionado a mCherry en células precursoras oligoneurales deficientes en p53 17 . El mitade w2 zebrafish 44 mutante, que carece de melanóforos, se utilizaron para visualizar más fácilmenteLas células tumorales después del trasplante y / o en la edad adulta. Otros pigmentos mutantes también podrían usarse para proporcionar claridad de imagen adicional, como Casper 50 . Tan pronto como las 24 h postrasplante, las células tumorales pueden verse invadiendo el tejido cerebral circundante ( Figura 2A , 3 dpf, flechas). Los injertos tumorales continúan creciendo en el ventrículo y el tejido cerebral circundante durante la semana siguiente ( Figura 2A , 8 dpf). En este momento, la fluorescencia también se puede observar en la región de los riñones ( Figura 2A , asteriscos). Esto puede deberse a que los riñones filtran los restos celulares del trasplante, lo cual es consistente con estudios previos que usan colorantes fluorescentes como un ensayo para evaluar la función renal 51 . Las células tumorales continúan proliferando e invadiendo, por lo que en 28 dpf, se puede observar una masa tumoral en todo el cerebro de pez cebra ( Figura 2A , 28 dpf).
Figura 2B . El injerto tumoral se alcanza típicamente en 80-90% de embriones, y los trasplantes de tumores persisten en la edad adulta; Se muestran tres ejemplos representativos en los paneles inferiores de la Figura 2B . Esto permite que los trasplantes de tumores sean cosechados y congelados o re-trasplantados durante varias generaciones.
Invasión tumoral y respuestas a los fármacos
La Figura 3A muestra un esquema de co-trasplante en el que dos tumores diferentes marcados con GFP (Tumor A) o mCherry (Tumor B) se cosechan por todo el tumorO disociación (tenga en cuenta que FACS no se utiliza aquí, pero FACS-clasificado células tumorales podrían ser utilizados si es necesario). Los tumores A y B pueden ser de diferentes localizaciones, inducidos con diferentes oncogenes, o inducidos en diferentes fondos genéticos. Cada tumor se procesa en una suspensión de célula única, y las células tumorales se mezclan a continuación en una proporción de 1: 1 y se trasplantan en el embrión de 2 dpf. Las propiedades tumorales, tales como el injerto, el crecimiento, la invasión y la diseminación del tumor A frente al tumor B pueden observarse entonces en el mismo huésped que permite controles internos de la técnica y antecedentes genéticos.
En la Figura 3B , se cosechó un CNS-PNET de pez cebra, marcado con NRAS, marcado con mCherry a partir del tectum óptico y un CNS-PNET marcado con GFP del cerebelo y se procesó en suspensiones de una sola célula. Se contaron las células y se mezcló un número igual de células de cada tumor y se trasplantaron en embriones de 2 dpf. Cuatro dDespués del trasplante, los embriones se fotografiaron con microscopía confocal. Se muestra un embrión representativo que demuestra que las células del tumor tectum (rojo) migran más ampliamente en el cerebro del huésped (flechas) que el tumor cerebeloso.
Los embriones trasplantados con células tumorales marcadas fluorescentemente pueden usarse en regímenes de tratamiento con fármacos para identificar compuestos que inhiben el crecimiento del tumor. La Figura 3C es una línea de tiempo típica para tratar e imaginar trasplantes de tumores. 24 h después del trasplante, se accede a los embriones para un tamaño de injerto consistente y se dividen en grupos de tratamiento. En el ejemplo proporcionado, los embriones transplantados con CNS-PNET de Zebrafish marcados con NRAS , tratados con NRAS, se tratan con dimetilsulfóxido (DMSO) 50 μM o inhibidor de MEK (AZD6244). Los embriones se tratan durante 5 días y se forman imágenes a 8 dpf, como se indica en la Figura 3C . La figura 3D (paneles de la izquierda) muestra E animales de los dos grupos de tratamiento. MEK inhibidor de los embriones tratados tienen una cantidad significativamente menor de fluorescencia que los tratados con DMSO, como se describe [ 17] . Después de que los animales se forman imágenes, se transfieren a tanques sin fármacos y se monitorizan para el crecimiento del tumor durante dos meses. En el ejemplo proporcionado, el tratamiento con inhibidor de MEK da como resultado una respuesta duradera en los peces adultos ( Figura 3D , paneles de la derecha). Para más detalles sobre el tratamiento farmacológico, la imagen y la cuantificación, véase la referencia 17 .
Figura 1: Esquema del protocolo de trasplante de células tumorales en el cuarto ventrículo de 2 dpf pez cebra embriones. Esquema general de las secciones 3 a 4 del protocolo incluyendo análisis de puntos finales alternativos (secciones 4.9-6)./55712/55712fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Injerto de Tumor y Progresión. (A) Zebrafish primario CNS-PNET 17 células tumorales marcadas con mCherry fueron trasplantados en el cuarto ventrículo de 2 dpf embriones. A 3 dpf, las células tumorales se ven invadiendo en el tejido cerebral circundante (flechas). A 8 dpf, las células tumorales están creciendo en el ventrículo; Las células rojas del tumor están también presentes en el tejido circundante del cerebro y los riñones (asteriscos). A 28 dpf, las células de los tumores han invadido y crecido a través del cerebro del anfitrión. (B) Panel superior. Siete embriones de 3 dpf trasplantados con células tumorales de cerebro de Zebrafish marcadas con mCherry. Las células tumorales pueden ser trasplantadas consistentemente en cientos de embriones, con altas tasas de injerto ( es decir, típicamente 85/100 embriones). Medio yPaneles inferiores. Tres peces adultos representativos con tumores trasplantados 4-8 semanas después de la fecundación (wpf). Los tumores se pueden visualizar mediante microscopía de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Comparación de la invasión de tumores y la respuesta de fármacos. ( A ) CNS-PNET 17 del tıtulo óptico o cerebelo están marcados con mCherry o GFP, respectivamente, procesados en una suspensión de una sola célula, mezclados juntos en una proporción de 1: 1, y co-transplantados en embriones de 2 dpf. ( B ) Un embrión de 6 dpf co-transplantado con una suspensión mixta de células tumorales cerebelosas marcadas con GFP y células tumorales marcadas con mCherry del tıtulo óptico. Las diferencias en las propiedades invasivas de cada tumor en tEl mismo receptor se puede observar usando microscopía de fluorescencia. En este ejemplo, las células tumorales marcadas con mCherry migran más extensamente que las marcadas con GFP (flechas). ( C ) Cronograma para el tratamiento farmacológico en embriones trasplantados con células tumorales. ( D ) Imágenes de animales representativos al final del régimen de tratamiento (8 dpf) ya las 8 semanas después del tratamiento (8 wpf), con un control de DMSO o un inhibidor de MEK 50 μM. La carga tumoral se puede medir cuantificando la fluorescencia, como se describe [ 17] . En este experimento, el crecimiento de células tumorales marcadas con mCherry se reduce en embriones tratados con inhibidor MEK y se traduce en una respuesta duradera en el adulto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Este protocolo detalla un ensayo de trasplante simple y eficiente que implica la inyección de células tumorales de pez cebra en el ventrículo de un embrión de 2 dpf que desarrollará un sistema inmune plenamente competente. Hasta el momento, el pez cebra CNS-PNET 17 y el melanoma (datos no mostrados) han sido trasplantados con éxito para estudios a largo plazo del comportamiento de las células tumorales y la invasión. Los pasos críticos de este protocolo incluyen asegurar el tamaño apropiado del agujero de la aguja y la suspensión adecuada de células tumorales y embriones huésped adecuadamente anestesiantes. Para cada investigador individual, la optimización adicional de esta técnica puede incluir el ajuste de la concentración de células tumorales, la presión de inyección y la orientación del embrión. Además, puede haber heterogeneidad en la viscosidad de las suspensiones originarias de diferentes tumores, por lo que diferentes tipos de tumores pueden ser más o menos difíciles de volver a suspender y trasplantar. Sin embargo, ajustando el diámetro de la aguja y utilizandoAlquil diluciones de la suspensión del tumor, es posible superar las dificultades asociadas con las viscosidades tumorales.
En nuestra experiencia, las razones más comunes para células escasas / masas de células inconsistentes en el ventrículo son las siguientes: 1) la suspensión de células tumorales es demasiado diluido; 2) el diámetro de la aguja es demasiado pequeño; 3) el tiempo y la presión de inyección son demasiado bajos; Y / o 4) el tejido restante no se filtró del tumor y se aloja en la aguja. Cuando la suspensión de células tumorales sale del ventrículo después de la inyección, es probablemente debido a: 1) la colocación de la aguja contra el suelo del ventrículo; 2) una alta presión y tiempo de inyección; Y / o 3) un diámetro de aguja demasiado grande. La baja supervivencia de los embriones trasplantados puede ser causada por: 1) embriones anestesiados durante un período de tiempo prolongado; 2) dejar secar los embriones en la placa de inyección; 3) la inyección de burbujas de aire en el ventrículo; Y / o 4) piercing órganos vitales, como el cerebro yCorazón, porque la aguja pasó por el ventrículo.
Los métodos anteriores de trasplante de tumores en el cerebro de pez cebra adulto o embrionario dependen de la inmunosupresión en adultos (genéticamente, farmacológicamente o vía radiación) o se limitan a estudios a corto plazo de células humanas o de ratón en embriones 38 , 43 , 52 , 53 , 54 . Por ejemplo, los tumores cerebrales de ratón se pueden inyectar intranasalmente en dexametasona-inmunosuprimido, 30-dpf, pez cebra juvenil para su uso en corto plazo (~ 2 días) los ensayos de fármacos preclínicos [ 54] . Sin embargo, el sitio de inyección en estos experimentos es obscurecido por el cráneo y el tejido cerebral y probablemente da lugar a daño al tejido cerebral normal, lo que reduce la viabilidad del huésped y la eficacia del injerto. Otro método descrito recientemente implica la inyección de gliob humanoLastoma en la región del cerebro medio de los embriones de pez cebra, lo que permitió el análisis a corto plazo del crecimiento, la invasión y la respuesta de fármacos [ 43] . De nuevo, la localización precisa del sitio de inyección es variable y probablemente daña el tejido normal. Por lo tanto, los métodos previos de trasplante de cerebro embrionario comprometen a menudo la viabilidad de los huéspedes, limitando estos estudios a un análisis a corto plazo ( es decir, 2 a 14 días), causando una mayor variabilidad entre las inyecciones individuales debido a sitios de inyección oscurecidos, A largo plazo de los comportamientos celulares y de las respuestas a los fármacos o de re-trasplante a través de múltiples generaciones.
El método descrito aquí se refiere a las limitaciones actuales en las técnicas de trasplante embrionario e inmunocompuesto de pez cebra, permitiendo a los investigadores: 1) inyectar reproduciblemente en el mismo lugar, con un daño mínimo al tejido circundante; 2) visualizar directamente el sitio de inyección para maximizarEficacia del injerto; 3) trasplantar cientos de embriones por día; 4) permitir que los tumores crezcan en animales inmunes a la competencia; 5) permitir el seguimiento del comportamiento de las células tumorales y las respuestas duraderas de fármacos durante la vida del pez cebra; Y 6) permiten el re-transplante de tumores durante muchas generaciones para estudios potenciales sobre la evolución tumoral o mecanismos de recaída de fármacos. Además, este protocolo permite a los investigadores utilizar cualquier genotipo de pez cebra para la evaluación de la respuesta del huésped, incluyendo diferentes poblaciones inmunes. Estos atributos hacen que este método sea fácilmente adaptable por cualquier laboratorio que ya realiza microinyecciones estándar en el pez cebra. Por último, si bien este método es ideal para las inyecciones ortotópicas de tumores cerebrales de pez cebra, al trasplantar otros tipos de tumores, como el hígado o el páncreas, el sitio ortotópico puede ser más importante que la competencia inmunológica ( por ejemplo, si un investigador está estudiando los efectos del estroma Microambiente en el crecimiento tumoral). En este escenario, laRecientemente desarrollados, los modelos de peces cebra con deficiencia inmunitaria pueden ser más apropiados para realizar trasplantes de tumores ortotópicos [ 11] .
Este protocolo se ha utilizado para realizar ensayos de competición de células tumorales e inyectar tumores marcados doblemente. También se discutió una estrategia de tratamiento potencial para la evaluación de la efectividad de compuestos químicos en la tumorigénesis, que implica el tratamiento de embriones post-trasplante mediante la adición del fármaco al agua. También se informó previamente de un método para el tratamiento ex vivo de células tumorales antes del trasplante 17 . Además, los tumores trasplantados se han agrupado para múltiples rondas de re-transplante, que será beneficioso para los estudios de evolución tumoral y quimiorresistencia [ 17] . Actualmente, los estudios preclínicos dependen de los xenoinjertos de ratón para evaluar la eficacia de los compuestos potenciales. Sin embargo, estos estudios consumen mucho tiempoY costoso. Teniendo en cuenta el alto grado de conservación de las vías de señalización oncogénicas entre el pez cebra y los seres humanos [ 28] , es de esperar que este método complementará estudios convencionales de células de ratón y humanos para permitir la identificación más rápida de compuestos eficaces entrando preclínicos y ensayos clínicos. En última instancia, este método podría resultar útil para la detección química rápida de los tumores de pacientes primarios, lo que podría impulsar aún más la iniciativa de la medicina personalizada. Sin embargo, las condiciones para el crecimiento a largo plazo de las células humanas en el pez cebra (adulto o embrión) todavía necesitan ser identificados.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Damos las gracias a los dos revisores por excelentes sugerencias y mejoras al manuscrito. También agradecemos Huntsman Cancer Institute / Universidad de Utah por la cría de animales y mantenimiento. Este trabajo fue financiado por la Sociedad Americana del Cáncer (# 124250-RSG-13-025-01-CSM), una subvención NIH (P30 CA042014 programa CRR), la Universidad de Utah Seed Grant y la Huntsman Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Egg water | in house | maintaining embryos, making injection plate | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | add to egg water to prevent fungal growth |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | housing embryos, making injection plate |
| 50 mL beaker (2 inch diameter) | Any commercial brand | making injection plate | |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | making injection plate |
| Glass Container | Any commercial brand | making injection plate | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | tumor dissection |
| Razor Blade | Thermo Fisher | 12640 | needle preparation, tumor dissection |
| Glass slide wrapped in parafilm | Any commercial brand | needle preparation | |
| Phosphate Buffered Saline 1x, pH 7.4 | Life Technologies | 10010023 | tumor resuspension |
| Cell strainer, 40 µm | Corning Falcon | 352340 | tumor resuspension |
| 1,000 µL filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
| 100 µL filter tips | any commercial brand | tumor resuspension | |
| 50 mL conical tubes | Genesee Scientific | 21-108 | tumor resuspension |
| 15 mL conical tubes | Genesee Scientific | 21-103 | tumor resuspension |
| 1.7 mL microtubes | Genesee Scientific | 24-281 | tumor resuspension |
| Micropipettes | Any commercial brand | tumor resuspension and transplantation | |
| Glass capillary (no filament) | World Precision Instruments | TW120-4 | tumor transplantation |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-97 | tumor transplantation |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | tumor transplantation |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-90 | tumor transplantation |
| Tricaine-S (MS-222) | Western Chemical | TRS1 | tumor transplantation, anesthetic |
| Angled Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | embryo manipulation |
| Transfer Pipette | Any commercial brand | embryo manipulation | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | required during tumor resuspension |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | required during tumor resuspension |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | tumor transplantation |
| Fluorescent Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | imaging tumor transplants |
| Microscope Camera | Olympus | DP-72 | imaging tumor transplants |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | imaging tumor transplants |
| Incubator | Any commercial brand | maintaining embryos, warming up injection plate | |
| Microwave | Any commercial brand | making injection plate | |
| Scale | Any commercial brand | making injection plate | |
| Gloves | Any commercial brand | all aspects of the protocol | |
| Low Melt Agarose | Any commercial brand | confocal imaging of embryos | |
| Glass Bottom Dish | Mattek Corporation | P35G-1.0-20-C | confocal imaging of embryos |
| Laser-scanning confocal microscope | Olympus | FLUOVIEW FV1200 | confocal imaging of embryos |
| Pronase | Roche Diagnostics | 11459643001 | dechorionate embryos |
| PBS | Any commercial brand | resuspend tumor/tumor cells | |
| 12-well plate | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
| Thin-bore transfer pipette | Any commercial brand | drug treatment of embryos | |
| Hemocytometer | Any commericial brand | For counting tumor cells in suspension | |
| N2 | Any commericial brand | For microinjector set up |
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