Summary
Burada bir rekombinant adeno ilişkili virüs serotip 9 nöromuskuler hastalık bir fare model kullanma mikroRNA teslimini açıklayın. Sürekli miRNA overexpression kas ve motor nöronlar, bir fırsat çalışma miRNA işlevi ve tedavi edici potansiyel içinde vivosağlayan bir tek çevresel yönetim farelerde sonuçlandı.
Abstract
RNA müdahale endojen miRNA yolu üzerinden çoğu gen susturmak yoluyla protein sentezini kontrol ederek gen ekspresyonu düzenlemektedir. Son yıllarda miRNA-aracılı gen düzenlemesi işlev mekanizması toksik bir kazanç tarafından neden sinir hastalıkları tedavisi için potansiyel göstermiştir. Ancak, hedef dokulara verimli bir şekilde teslim uygulama sınırlıdır. Burada omurilik ve bulber kas atrofisi için (KALAKLAN) bir transgenik fare modeli kullanılan, nöromüsküler bir hastalık polyglutamine genişleme androjen reseptör (AR) Gen tarafından susturulması test etmek için yeni bir tespit AR hedefleme miRNA, miR-298 neden oldu. MiR-298 rekombinant adeno ilişkili virüs (rAAV) serotip 9 vektör iletim hücre bölünmesi kolaylaştırmak için kullanarak overexpressed. Tek bir kuyruk-damar enjeksiyon KALAKLAN farelerde sürekli ve yaygın overexpression miR-298 kas iskelet ve motor nöronlar ile indüklenen ve farelerde nöromüsküler fenotip iyileşme sonuçlandı.
Introduction
MiRNAs RNA'ların, Gen ifadesinin düzenlenmesi ve çeşitli hücresel ve metabolik yollar kontrol önemli bir rol oynamaktadır 21-23 nükleotid uzunluğunda, kodlamayan. 1 gen ekspresyonu esas olarak çoğu gen susturmak veya mRNA yıkımı inducing tarafından düzenlenir. 2 MiRNAs genellikle 5' UTR bağlama rağmen genler, kodlama ve Kodlayıcı bölgeler mRNA'da açıklanan hedef için 3' çevrilmeyen bölgesi (UTR) tamamlayıcı niteliktedir. 3
MiRNA insan hastalıkların patogenezinde rol geçerli anlayışı yaygınlaştıkça, bireysel miRNAs veya miRNA aileler farmakolojik modülasyon giderek uygun bir tedavi seçeneği haline geliyor. Diğer RNA inhibisyon stratejileri için karşılaştırıldığında, miRNAs pek çok avantajı var: miRNAs daha az toksik ve daha az immunojenik ve kolayca hücrelere küçük boyutlarından dolayı teslim edilebilir. 4 , 5 , 6 MiRNAs genellikle hücresel ağları içerisinde birçok hedefleri bu nedenle potansiyel hedef kapalı efektleri ve verimli bir şekilde teslim hedef dokulara birlikte dikkate alınması gereken güvenlik endişeleri var.
Nöromüsküler hastalıklar iktisap veya kas ve motor nöronlar etkileyen koşullar miras. Kas iskelet ilaçlara hedefleme nerede tedavi penceresi içinde yaygın dağıtım elde etmek için büyük zorluk olduğunu ortaya çıkan araştırma, alanıdır. 7 ilaç erişim kan beyin bariyerini tarafından ağırlıklı olarak durdurulmasını emretti çünkü Motor nöronlar hedeflemek, daha zordur.
Hücre kültür ve fare modelleri omurilik ve bulber kas atrofisi (KALAKLAN) Bu çalışmada kullanılmıştır. KALAKLAN işlev mekanizması, kas ve motor nöronlar etkilenen toksik bir kazanç tarafından neden nöromüsküler bir hastalıktır. 8 , 9 KALAKLAN (Kennedy'nin hastalığı; OMIM #313200) bir kas güçsüzlüğü tarafından karakterize hastalik, X'e bağlı ve atrofi, bir genişletilmiş polyglutamine yolu AR protein kodlar AR gen CAG tekrar genişleme nedeniyle. 10 hastalığı değiştirme tedavisi yok Bu bozukluk için şu anda mevcuttur. Bu çalışmada kullanılan transgenik fare modeli özellikleri cinsiyet özgüllük, motor nöron patoloji ve ilerleyici kas atrofi gibi hastalığın beyannamedir. 11
Bu çalışmada, çabalarımızı odaklı bir miRNA belirlenmesi üzerinde doğrudan downregulates ifade mutant AR transgene ve bir güvenli ve etkin modu miRNA omurilik için ve bizim hastalık fare modeli kas iskelet tasarımı.
Burada biz bir nispeten uncharacterized miRNA, miRNA-298 (katılım numarası MIMAT0004901), doğrudan mutant AR ifade KALAKLAN modellerinde azaltmak için12 tespit. MiR-298 teslimini hedef dokulara elde etmek için biz viral strateji, rekombinant adeno ilişkili virüs serotip 9 (rAAV9) ile kullanılır. rAAV9 kan beyin bariyerini geçiş ve uzun vadeli gen ekspresyonu hücrelerdeki nöronlar dahil olmayan bölme, arabuluculuk yeteneğine sahiptir. 13 AAV9-miR-298, tek bir sistemik yönetimi miRNA, kas ve motor nöronlar etkili iletim, aşağı-AR ifade Yönetmeliği ve hastalık fenotip KALAKLAN farelerde iyileşme sürekli ifade sonuçlandı. 14 Bu metodoloji miRNA veya antagomirs overexpression vivosağlamak için kullanılabilir.
Protocol
Tüm yordamları Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri uygun olarak bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları için yapılmıştır (8th ed., Ulusal Akademiler Press, revize 2011) ve NINDS hayvan bakımı Komitesi tarafından onaylanmış.
1. AAV9-miRNA tasarım stratejisi ve miRNA seçimi
- MiRWalk tahmini veritabanı mRNA 3' UTR bölgenin hedef gen ile etkileşim aday miRNAs seçmek için kullanın. 15
Not: miRNA sıra uzunluğu en az tohum için en az 7 nükleotit kısıtlayın. Diğer kurulan miRNA tahmin programları (miRanda, miRDB, Targetscan) karşılaştırmalı analiz için seçin. Bu seçim ölçütleri temel alarak, burada, miR-185, miR-298, miR-873 ve miR-877 daha fazla değerlendirme için seçildi. - Seçili miRNA dizisi miRBase (http://www.mirbase.org/) almak.
- PRI mir clone (60-70 nts) ve her iki tarafta genomik sırası veya sahte bir sıra kanat, 250-300 nts uygun AAV CIS vektör.
Not: Kanat sıra doğru PRI-mir ifade ve olgun mikroRNA işleme için gereklidir. Örneğin seçili miRNA veya sahte sıra tarafından takip bir insan uzama faktör-1 alfa (EIF1α) organizatörü ve cDNA kodlayarak takip insan sitomegalovirüs (CMV) Organizatörü oluşan bir ifade kaset ile bir çift-organizatörü rAAV CIS vektör seçin GFP floresan etiket. Yalıtım en az risk ile istikrarlı ve homojen ifade garanti çünkü EIFα organizatörü seçildi. Doku belirli veya koşullu rehberleri, belirli uygulamalara bağlı olarak kullanılabilir. - Hazırlamak, arındırmak ve AAV, aşağıdaki yayımlanmış protokolleri titre. 16
Not: Burada, PRI-mir AAV klonlama vektör ve viral üretim bir dış üreticisi tarafından yapıldı.
2. kuyruk ven enjeksiyon AAV miRNA plazmid
Not: Bu adım hedef gen ve yaş ve fareler ağırlığına göre ayarlamaya gerek. Doz aralığı, hacim ve yaş ve fareler ağırlığına göre idarenin en iyi rota belirlemek için kurumsal ve hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) yönergeleri kullanın. GFP floresans sinyal ve miRNA ifade düzeyleri hedef dokulara tepe 2 hafta sonra enjeksiyon başlangıç için bekleniyor. Aşağıdaki iletişim kuralı erkek fareler için erken yetişkinlik anlamına gelir. AAV Biyogüvenlik seviye 1 kurallar altında bir biohazard olarak ele alınmalıdır.
- 100-200 µL aliquots steril fosfat tamponlu tuz (PBS) kullanarak bir viral yük mL (vg/mL) başına 1010-1011 viral genleri içeren AAV miRNA plazmid stokta bölün. Laboratuvar biohazard kişisel koruyucu ekipman AAV çözüm işlemek için kullanılır.
Not: bir aliquot çözdürülen bir kez bu 4 ° C'de iki haftaya kadar saklanabilir. Viral stok-80 ° C dondurucuda saklanabilir. - Piyasada bulunan restrainers uygun boyutta plastik veya konik plastik film tüp gibi fare dizginlemek.
- % 70 alkol mendil kuyruklu yüzeyini temizlemek.
- Sıcak yastık (28-30 ° C) vazodilatasyon 30 artırmak için kuyruk altında tutun alternatif olarak s., kırmızı ısı lamba (2-3 feet mesafede) kullanarak hayvanlar sıcak veya kuyruk sıcak suya daldırma tarafından.
-
Distal kuyruk kısmından başlayarak, iğne (27-30 G) ile viral aliquot yüklü eklemek, damar içine kuyruk üzerinden 15 ° eğim. Enjeksiyon önce iğneyi doğru takıldığından emin olun.
- Direnç enjeksiyon sırasında hissedilir veya deri altında şişlik görünür, yordamı durdurun. İğneyi çıkarın ve önceki enjeksiyon yeri yukarıda iğne yeniden takın.
Not: Alternatif olarak, bu iğneyi yavaşça aspirating ve kan gözlemleyerek elde edilebilir. Zor aspirasyon kuyruk ven daraltabilirsiniz. Enjeksiyon sırasında damar blanches iğne doğru şekilde eklenir.
- Direnç enjeksiyon sırasında hissedilir veya deri altında şişlik görünür, yordamı durdurun. İğneyi çıkarın ve önceki enjeksiyon yeri yukarıda iğne yeniden takın.
- Enjeksiyon tamamlandıktan sonra iğne yükselterek önce birkaç saniye bekleyin.
- Kanama enjeksiyon izi gözlemlemek. İki parmak kadar kanama durur siteye kullanarak Orta basınç uygulayın.
- Hayvan onun kafes dönmek.
3. davranışsal deneyleri
Not: Tüm deneylerin körü körüne bir üçüncü şahıs tarafından benzersiz olarak kodlanmış şişeleri tedavilerin gizleme ile tarafından yapılmıştır. Tedaviler sırasını randomize. Aşağıda açıklanan testleri gerçekleştirirken, deneysel koşullar (Oda tipi) ve günün saati varyasyon azaltmak için kontrol edilmesi gerekmektedir. Bu test güvenilir sonuçlar elde etmek için dört hafta eski fareler üzerinde yapılmalıdır. Fare davranış değerlendirme daha önce 5 hafta-in yaş temel normal performans elde etmek için viral enjeksiyon uygulandı. Viral enjeksiyon sonra 48 saat sonra enjeksiyon, başlangıç kadar 40 hafta-in yaş haftada fareler değerlendirildi.
- Testlere başlamadan önce gürültü veya diğer bozuklukları en az 30 dk arındırılmış olduğu bir sessiz, karanlık odada AAV ile enjekte fare getir. Hayvanlar iklimlendirme bu dönemde rahatsız etmeyin.
- Yeni Oda 30 dk için fare parkenizin ve aşağıdaki davranış deneyleri (adım 3.3 ve 3.4) başlatın. 10 dk her davranış tahlil arasında bir boşluk tutmak.
-
Asılı tel test
Not: Bu testi kas gücü ve motor fonksiyon bozukluğu izler.- Bir yastık hareket için doldurma sayfasını kullanın. Fare kuyruğunu tarafından almak ve Tel ızgara raf ortasına yerleştirin. 15-20 santim yüzey üzerinden raf yükseltmek ve yavaş yavaş onun kavrama üstünde belgili tanımlık perde ayarlamak hayvan izin vermek belgili tanımlık perde tersine çevirin.
- Raf tamamen ters bir kez sayacı başlatmak ve düşmek için zaman kayıt.
Not: Fare ile dört bacaklarda bir ızgara üzerinde askıda kalacaktır. Tel çok düşük ayarlanmışsa, fare-ebilmek asmak değil. Fareler kapalı ızgara önce 60 düşersen s, ızgara üzerine koyup, sayacı sıfırlamak ve iki daha fazla çalışır kadar bu yordamı yineleyin. En iyi performans kayıt. - Ne zaman zaman sınırı 60 / s ulaşıldığında, kafes hayvan geri döndürür.
-
Ayak baskı tahlil
Not: Emici sayfası dar pist yaklaşık 70 cm uzun ve 5 cm ile 5 cm yüksek duvarlar geniş olması gerekir.- Fareyi yavaşça bir el ile tutun ve açık pençeleri ve bir fırça ile arka paws için mavi mürekkep kırmızı mürekkep uygulanır.
- Emici sayfadan dar bir pist yere konumlandırın.
- Fare yürümek ya da pist düz bir çizgide bir emici sheet üzerinde bir ucundan diğerine çalıştırmak için izin verir.
- İşlemi iki kez daha taze bir emici sayfasını kullanarak fare ile yineleyin.
- İki ardışık adımda ileri hareketi arasındaki mesafeyi ölçmek. İlk eklemek ve burada hayvan sadece başlatılıyor ve onun koşmak bitirdikten birkaç ayak izleri son değil.
4. ötenazi ve doku hasat
- Ötenazi odası veya bir Sırça Fanus kullanın. Sırça Fanus kullanıyorsanız, bir duman başlık altında yordamı gerçekleştirin.
- Pamuk isoflurane ile ıslatın ve bell kavanoza yerleştirin. Hayvan anestezi malzeme ile fiziksel temas tutmak için fiziksel bir ayırıcı kullanın. Hayvan hemen bu adımdan sonra kavanoza yerleştirin.
Not: Sırça Fanus ile isoflurane hipoksemi hayvanlarda olasılığını önlemek için önceden şarj edilmiş olmamalıdır. - İsoflurane pozlama 30'a kadar devam durur nefes sonra s.
- Fare kavanozdan hemen çıkardıktan sonra servikal çıkığı tarafından ötenazi.
Not: Bu adım doku yıkımı önlemek için mümkün olduğunca hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir. -
Spinal kordon ilk hasat ve o zaman kuadriseps kas iskelet.
- Omurilik hasat için fareyi ters ortaya çıkarmak ve diseksiyon kurulu tarafında dört bacaklarda düzeltin.
- Diseksiyon % 70 etanol ile sitenin yıkayın.
- Servikal çıkığı keskin makas kullanarak gerçekleştirin.
- Medyan hattı deride bir kesi yapmak. Kesme veya transvers düzlemde yukarı ve kafasına pelt çekerek takip derinin dikkatli yırtılma pelt kaldırın. Baş altında kürek kemikleri ve C1-2 bölge (kafatasının için bitişik bulunan) sütun, makasla kesme tarafından kaldırın.
- Karın duvarı kas ventral tarafta kesmek ve yanal, omurga ulaşılıncaya kadar bir defada bir yönde devam ediyor.
- Servikal spinal kord başlayan bir keskin makas kaldır vertebra kullanarak. Vertebra yanal parçalarını vertebra kemerler, her iki taraf arasında kesim tarafından kaldırmak.
- Tüm vertebra çıkardıktan sonra spinal kord serbest bırakın.
-
Ek önceden soğutulmuş 2-istimal ertesi gün Yöntem methylbutane içinde hasat dokular dondurma:
- Yarım bir paslanmaz çelik kase 2-methylbutane ile doldurmak ve sıvı azot ile dolu bir kap içinde kase alt dörtte daldırın.
- 2-methylbutane 1-2 min için sıvı azot önceden chill.
- Beyaz olana 2-methylbutane forseps ile kas iskelet yerleştirin. Hemen buz makinası ve sonra-80 ° C'de depolamak için doku transferi
- Spinal kord immunostaining için doku parafin blok daha önce açıklandığı gibi buz gibi ek oda sıcaklığında katıştırın. 17
- Biyokimyasal analiz ve miRNA miktar,1 hasat doku bir cryovial yerleştirin ve sıvı azot içinde dondurma. Örnekleri-80 ° C'de depolayın
Representative Results
AAV9-miR-298 1011 vg bir viral yük 5 haftalık KALAKLAN fareler içine tek bir kuyruk-damar enjeksiyon yoluyla enjekte ettiler. Bu fareler insan AR transgene AR (AR97Q) normal olmayan bir şekilde genişletilmiş polyglutamine yolu ile taşımak ve nöromüsküler hastalığın belirtileri tarafından 10 hafta-in yaş (kilo kaybı, kambur arka ve kas atrofi) geliştirmek. 11 lomber spinal kord ve kuadriseps kas miRNA miktar, biyokimyasal tahlil ve immünhistokimya (Şekil 1) için 2, 4, 8 ve 12 hafta sonra yönetim, hasat edildi. Tedavi ve sonraki analizlerin İdaresi kör müfettişler tarafından gerçekleştirilen.
qRT-PCR analiz miR-298 ifade kas iskelet ve omurilik iki hafta ve tedaviden sonra dört hafta içinde sırasıyla 8 hafta kas iskelet ve spinal kord enjeksiyon (Şekil 2 sonra 12 hafta itibariyle en yüksek ifade seviyeleri ile gösterdi. ). Bir mikroskop (Axiovert 100 M) kullanarak, yeşil floresans sinyal kas dokusu ve omurilik motor nöronlar GFP ve motor nöron marker Kolin asetiltransferaz (sohbet) 10 hafta sonra farelerin göstermek başlattığınızda tedavi, Co yerelleştirme tarafından algılandı hastalık belirtileri (Şekil 2).
Aynı doz rejimi kullanarak, KALAKLAN fareler oluşan bir kohort ya miR-298 almak veya kuyruk ven enjeksiyon yolu ile yaş biyokimyasal analizler ve fonksiyonel karakterizasyonu için 7 hafta, alay için randomize. Enjeksiyon haftalık ağırlık ve davranışsal değerlendirme için 40 hafta-in yaş takip etti. qRT-PCR analiz miR-298 tedavi mutant AR (Şekil 3), etkilenen dokularda düzeyde azaltır ve vücut ağırlığı arttı ve geliştirilmiş motor performansı (Şekil 4) 10 hafta sonra enjeksiyon başlayan gösterdi.
Şekil 1: çalışma tasarım şematik. MiR-298 içinde vivo ifade düzeylerini artırmak için biz KALAKLAN fareler GFP ve miR-298 veya sahte ifade (A) çift organizatörü AAV vektör plazmid ile enjekte. (B) fareler 7 hafta-in yaş (önceden semptomatik sahne), tek bir kuyruk boşuna enjeksiyon yoluyla enjekte edildi. Spinal kord ve kuadriseps kas doku dağıtım Analizi (yeşil) için farklı zaman noktalarda KALAKLAN farelerin bir kohort üzerinden toplanmıştır. KALAKLAN fareler oluşan bir kohort tedavi ve, 16 hafta-in yaş biyokimyasal analizler (kırmızı) için feda etti. Ağırlık ve davranışsal deneyleri haftalık kadar 40 hafta-in yaş için fonksiyonel karakterizasyonu (mavi) için yapıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: AAV9-miR-298 teslim farelerde. Burada açıklanan yöntemi kullanarak, fareler AAV9-miR-298-GFP veya AAV9-sahte-GFP İntravenöz enjeksiyon aldım. Toplam miRNA lomber spinal kord ve kuadriseps kas 2,4,8 ve 12 hafta sonra enjeksiyon toplanmıştır. miR-298(a)kuadriseps kas düzeyini ifade tahmin etmek için gerçekleştirilen qRT-PCR (n = 5) (B) lomber spinal kord (n = 5, P < 0,01). Tüm verileri ± standart hata demek anlamına gelir olarak bildirilir. 10 hafta sonra tedavi GFP için (C) kuadriseps kas (özgün büyütmeye, 10 X. boyama yerelleştirme tarafından doğrulandı, hasat dokularda AAV vektör yaygın iletim Ölçek çubuğu = 100 µm) ve (D) motor nöronlar lomber spinal kord (özgün büyütmeye, 40 X. Ölçek çubuğu 10 µm. GFP (yeşil), DAPI (mavi) ve sohbet (kırmızı) =. Rakam doi değiştiren: 10.1038/mt.2016.13. 14 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: MiRNA-298 aşırı ifade downregulates mutant AR spinal kord ve kuadriseps kas farelerde. qRT-PCR AR mRNA(a)lomber spinal kord ve (B) kuadriseps kas AAV9-miR-298-GFP veya AAV9-sahte-GFP ile tedavi düzeyde ifade tahmin etmek için gerçekleştirildi. Transkript düzeyleri snoRNA202 için normalleştirilmiş (n = 5 tedavi başına). * P < 0,05, ** P < 0,01. Tüm verileri ± standart hataları anlamına gelir olarak bildirilir. Rakam doi değiştiren: 10.1038/mt.2016.13. 14
Şekil 4: MiR-298 aşırı ifade motor fonksiyonu iyileştirir ve kilo kaybı azaltır. Davranışsal değerlendirme haftada bir kez (w), hafta 5-40 arasında gerçekleştirildi. Vücut ağırlığı (solda) ve asılı tel (sağda) performans farelerin (n = 15 grup başına). Tüm verileri ± standart hataları anlamına gelir olarak bildirilir. Rakam doi değiştiren: 10.1038/mt.2016.13. 14
Discussion
Burada seçin ve rAAV9 kas iskelet ve motor nöronlar farelerde hedeflemek için viral vektör olarak kullanarak bir miRNA kuyruk enjeksiyon yolu ile teslim için son derece verimli ve erişilebilir bir metodoloji göstermektedir. 14 diğer RNAi stratejileri, miRNAs daha az toksik ve daha az immünojenik karşılaştırılır. 18 Ayrıca, onları iyi viral vektörler sınırlı paketleme kapasitesine uygun yapmak onların küçük büyüklük. 2 sözde miRNA-mRNA hedefleri tanımlaması hesaplama algoritmaları ve tahmin araçları sağlar. Bir kez tespit, hedef gen ekspresyonu miRNA etkilerini kontrol edilmelidir. Ortak bir yaklaşım verilen miRNA vitro overexpress ve hedef protein ifade düzeyleri Batı analizi ile tespit etmektir. 14 , 19
Çeşitli çalışmalar viral ve non-viral stratejiler miRNAs teslim etmek için kullandık. 13 burada biz adeno ilişkili virüs (AAV) bir gen teslim aracı olarak kullandı. Diğer viral vektörler için karşılaştırıldığında, AAV aydınlığa çıkartıyor düşük immünojenisite, uzun vadeli gen transferi sağlar ve tropism bölme içinde geniş bir yelpazede sahiptir ve hücreleri olmayan bölme. 18 bu teslim yöntemi işlevsellik ve özgüllük RNA molekülünün etkileyebilecek kimyasal değişiklik ihtiyacını da değiştirebilir. Çoğunlukla kapsid protein bileşimi tarafından belirlenir, AAV, birkaç serotipi vardır. Bu serotipleri ve onların tropism farklı farklı hücre tipleri transduce. Hedef doku göz önünde bulundurarak doğru serotip seçmek gereklidir. Biz rAAV9, merkezi sinir sistemi ve çevresel yönetim19,20aşağıdaki iskelet kası yüksek iletim verimliliği nedeniyle seçildi. Bu yaklaşım daha fazla iletim etkinliği Yetişkin hayvanlar, hücre dışı matriks kompozisyon, nöron glia oranı ve kan-beyin bariyerini olgunluk farklılıklar nedeniyle büyük olasılıkla göre neonatal hayvanlarda göstermiştir. 21 , 22
Bu iletişim kuralı konusunda önemli bir adım ifade vektör tasarımıdır. İkinci gen düzenleyici yanındaki ilk gen ile karşılaştırıldığında daha düşük ifade tarafından engel vardır, bicistronic vektörler ile karşılaştırıldığında çift organizatörü vektör miRNA ve EGFP, yüksek ifadesi böylece verimli bir arka arkaya yapılandırma sağlar miRNA yerelleştirilmesini fare dokusunda ayirt tarafından izin.
AAV9 İntravenöz enjeksiyon yüksek verimli ve homojen iletim hedef dokulara, iskelet kası ve motor nöronlar sonuçlandı. Bu rota enjeksiyon sistemik dolaşım ulaşmak ve merkezi sinir sistemi hedefleme tedaviler için önemlidir beyin kan bariyerini çapraz yönetilen doz sağlar. Ayrıca, teslim edilmek üzere MSS non-invaziv bir yöntemdir. MiR-298 ifade 5 hafta-in yaş, tek bir periferik enjeksiyon ile 2-4 hafta sonra spinal kord ve kas arttı. Otelde tek iplikçikli genom AAV vektörel çizimler, ikinci DNA zinciri de novo sentezi kullanarak gecikmeli iletim için sorumlu olabilir. 23
İnsan miR-298 düzeyde kronik hastalıklar için birden fazla enjeksiyonları bir terapötik yarar ulaşmak için gerekli olabilir düşündüren bir tek yönetim sonra 20 hafta tedavi farelerde tespit edilemez. Bir ömür boyu yinelenen yönetim gerekli olduğunda ancak, zaman içinde miRNA bozulması sınırlayıcı. Buna ek olarak, edinilmiş bağışıklığın AAV vektörel çizimler için başarılı gen teslim başka bir engel oluşturabilir. 24 immunologically etkisiz AAV vektörel çizimler nesil böylece yinelenen yönetim ve gelecek vaat eden bu iletim sistemi ile uzun vadeli etkileri ulaşmak için çok önemlidir. 25
Bir kullanımı miRNA bir tedavi stratejisi olarak hedef kapalı etkileri risk kısıtlamasıdır. MiRNAs aracılığıyla incomplementary baz eşleşmesi diğer gen tutanaklar ile hangi bir güvenlik riski bu yaklaşım ile etkileşime girebilir. Kanonik olmayan miRNAs, mirtrons gibi kullanımı dahil RNAi dizilerinin tasarımı hangi mikro işlemci karmaşık atlamak ve geliştirilmiş geniş uzun vadeli güvenlik ve tolerabilite çalışmalar kritik bir kasa bu strateji tercüme önce ve etkili tedavi. 26 , 27 , 28
Burada anlatılan yöntem aslında miRNA overexpression için geliştirilmiş, ancak aynı zamanda antagomirs kullanarak miRNA inhibisyon tedavisi için yararlı olabilir.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim. SignaGen Laboratuvarları (Rockvile, MD, ABD) AAV9 virüs üretimi için teşekkür ederiz. Bu araştırma NINDS, NIH Intramural araştırma programı tarafından desteklenmiştir. Philip R. Lee NICHD Intramural araştırma bölümü fonlarından desteklenen bir durumdu. Carlo Rinaldi Derneği Française contre les Myopathies (AFM) bir bursu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | Purification of miRNA and total RNA |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4366596 | A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs |
| snoRNA202 Primer | ThermoFisher Scientific | 1232 | Taqman miRNA control assay in mouse |
| miR-298 Primer | ThermoFisher Scientific | 2190 | Taqman miRNA-298 assay in mouse |
| Anti-GFP antibody | abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP - ChIP Grade |
| Red ink pad | Dovecraft Essentials | ||
| Blue ink pad | Dovecraft Essentials | ||
| AAV9-GFP vector | SignaGen Laboratories | SL100840 | Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification |
| mmu-miR-298-5p | ThermoFisher Scientific | MC12525 | mirVana miRNA mimic |
| AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP | Vector Biosystems Inc |
References
- Broderick, J. A., Zamore, P. D. miRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104-1110 (2011).
- Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nat Rev Genet. 12, 861-874 (2011).
- Pickering, B. M., Willis, A. E. The implications of structured 5' untranslated regions on translation and disease. Semin Cell Dev Biol. 16, 39-47 (2005).
- Bilen, J., Liu, N., Burnett, B. G., Pittman, R. N., Bonini, N. M. MicroRNA pathways modulate polyglutamine-induced neurodegeneration. Mol Cell. 24, 157-163 (2006).
- Lee, Y., Samaco, R. C., Gatchel, J. R., Thaller, C., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. miR-19, miR-101 and miR-130 co-regulate ATXN1 levels to potentially modulate SCA1 pathogenesis. Nat Neurosci. 11, 1137-1139 (2008).
- Liu, N., et al. The microRNA miR-34 modulates ageing and neurodegeneration in Drosophila. Nature. 482, 519-523 (2012).
- Ebner, D. C., et al. Strategies for skeletal muscle targeting in drug discovery. Curr Pharm Des. 10, 1327-1336 (2015).
- Giorgetti, E., Lieberman, A. P. Polyglutamine androgen receptor-mediated neuromuscular disease. Cell Mol Life Sci. 73, 3991-3999 (2016).
- Grunseich, C., Rinaldi, C., Fischbeck, K. H. Spinal and bulbar muscular atrophy: pathogenesis and clinical management. Oral Dis. 20, 6-9 (2014).
- La Spada, A. R., Wilson, E. M., Lubahn, D. B., Harding, A. E., Fischbeck, K. H. Androgen receptor gene mutations in X-linked spinal and bulbar muscular atrophy. Nature. 352, 77-79 (1991).
- Katsuno, M., Adachi, H., Kume, A., Li, M., Nakagomi, Y., Niwa, H., Sang, C., Kobayashi, Y., Doyu, M., Sobue, G. Testosterone reduction prevents phenotypic expression in a transgenic mouse model of spinal and bulbar muscular atrophy. Neuron. 35, 843-854 (2002).
- Boissonneault, V., Plante, I., Rivest, S., Provost, P. MicroRNA-298 and microRNA-328 regulate expression of mouse beta-amyloid precursor protein-converting enzyme 1. J Biol Chem. 284, 1971-1981 (2009).
- Choudhury, S. R., et al. Widespread central nervous system gene transfer and silencing after systemic delivery of novel AAV-AS vector. Mol Ther. 24, 726-735 (2016).
- Pourshafie, N., et al. MiR-298 counteracts mutant androgen receptor toxicity in spinal and bulbar muscular atrophy. Mol Ther. 24, 937-945 (2016).
- Dweep, H., Sticht, C., Pandey, P., Gretz, N. miRWalk--database: prediction of possible miRNA binding sites by "walking" the genes of three genomes. J Biomed Inform. 44, 839-847 (2011).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. (57), e3348 (2011).
- Stuard, D. A., Oorschot, D. E. Embedding, sectioning, immunocytochemical and stereological methods that optimise research on the lesioned adult rat spinal cord. J Neurosci Methods. 61, 5-14 (1995).
- Huang, F., et al. miR-25 alleviates polyQ-mediated cytotoxicity by silencing ATXN3. FEBS Lett. 588, 4791-4798 (2014).
- Kuhn, D. E., Martin, M. M., Feldman, D. S., Terry, A. V., Nuovo, G. J., Elton, T. S. Experimental validation of miRNA targets. Methods. 44, 47-54 (2008).
- Yang, N. An overview of viral and nonviral delivery systems for microRNA. Int J Pharm Investig. 5, 179-181 (2015).
- Bourdenx, M., Dutheil, N., Bezard, E., Dehay, B. Systemic gene delivery to the central nervous system using Adeno-associated virus. Front Mol Neurosci. 7, 50 (2014).
- Foust, K. D., Nurre, E., Montgomery, C. L., Hernandez, A., Chan, C. M., Kaspar, B. K. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
- Wang, Z., Ma, H. -I., Li, J., Sun, L., Zhang, J., Xiao, X. Rapid and highly efficient transduction by double-stranded adeno-associated virus vectors in vitro and in vivo. Gene Therapy. 10, 2105-2111 (2003).
- Saunders, N. R., Joakim Ek, C., Dziegielewska, K. M. The neonatal blood-brain barrier is functionally effective, and immaturity does not explain differential targeting of AAV9. Nat Biotechnol. 27, 804-805 (2009).
- Boudreau, R. L., Spengler, R. M., Davidson, B. L. Rational design of therapeutic siRNAs: minimizing off-targeting potential to improve the safety of RNAi therapy for Huntington’s disease. Mol Ther. 19, 2169-2177 (2011).
- Duque, S., Joussemet, B., Riviere, C., Marais, T., Dubreil, L., Douar, A. M., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol Ther. 17, 1187-1196 (2009).
- Lowenstein, P. R. Crossing the rubicon. Nat Biotechnol. 27, 42-44 (2009).
- Sibley, C. R., Seow, Y., Curtis, H., Weinberg, M. S., Wood, M. J. Silencing of Parkinson's disease-associated genes with artificial mirtron mimics of miR-1224. Nucleic Acids Res. 40, 9863-9875 (2012).
