Summary
خلايا الخلايا العصبية الماوس مثقف على صفائف متعدد القطب عرض زيادة في الاستجابة التالية التحفيز الكهربائي. يوضح هذا البروتوكول كيفية زراعة الخلايا العصبية، وكيفية تسجيل النشاط، وكيفية إنشاء بروتوكول لتدريب الشبكات للرد على أنماط التحفيز.
Abstract
ويمكن استخدام صفائف الإلكترودات الدقيقة (مياس) للتحقيق في سمية الدواء، ونماذج تصميم الجيل التالي من الطب الشخصي، ودراسة ديناميات الشبكة في الثقافات العصبية. وعلى النقيض من الأساليب التقليدية الأخرى، مثل التصحيح اللقطي، الذي لا يسجل سوى نشاط خلية واحدة، يمكن للاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف أن تسجل في وقت واحد من مواقع متعددة في الشبكة، دون الحاجة إلى المهمة الشاقة المتمثلة في وضع كل قطب على حدة. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق العديد من تكوينات التحكم والتحفيز بسهولة في نفس الإعداد التجريبي، مما يسمح لمجموعة واسعة من الديناميات التي سيتم استكشافها. واحدة من الديناميات الرئيسية للاهتمام في هذه الدراسات في المختبر هو مدى عرض الشبكات المستزرعة خصائص تدل على التعلم. خلايا الخلايا العصبية الماوس المستزرعة على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف تظهر زيادة في الاستجابة بعد التدريب الناجم عن التحفيز الكهربائي. يوضح هذا البروتوكول كيفية زراعة الخلايا العصبية على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف. بنجاحالحبل من أكثر من 95٪ من الأطباق مطلي. ووضع بروتوكول لتدريب الشبكات على الاستجابة لأنماط التحفيز؛ والفرز، والمؤامرة، وتفسير النتائج من هذه التجارب. ويتجلى استخدام نظام الملكية لتحفيز وتسجيل الثقافات العصبية. وتستخدم حزم البرمجيات أيضا لفرز وحدات الخلايا العصبية. يتم استخدام واجهة المستخدم الرسومية المصممة خصيصا لتصور الرسوم البيانية وقت ما بعد التحفيز، فترات بين انفجر، ومدة انفجار، وكذلك لمقارنة الاستجابة الخلوية للتحفيز قبل وبعد بروتوكول التدريب. وأخيرا، نوقشت النتائج التمثيلية والتوجهات المستقبلية لهذا الجهد البحثي.
Introduction
الصفائف الدقيقة القطب (مياس) يمكن استخدامها للتحقيق في سمية المخدرات، وتصميم نماذج للجيل القادم من الطب شخصية، ودراسة ديناميات الشبكة في الثقافات العصبية 1 . على النقيض من الأساليب التقليدية أكثر مثل التصحيح لقط، والتي يمكن أن تسجل فقط النشاط من خلية واحدة، أو تسجيل الحقل مع ماصة الزجاج، والتي يمكن أن تسجل ردود خارج الخلية من الخلايا العصبية المحيطة القطب في موقع واحد يمكن لل مياس في وقت واحد سجل من مواقع متعددة في ثقافة الخلية دون الحاجة إلى مهمة شاقة وضع كل قطب على حدة. وهذا يسمح لدراسة التفاعلات الديناميكية بين مجموعات من الخلايا التي تشكل شبكة داخل تلك الثقافة. وعلاوة على ذلك، فإن آثار التحفيز الكهربائي على أنماط اطلاق الشبكة 2 ، 3 ، 4 ، 5 ومراقبة الشبكة 6 </ سوب> في الثقافات العصبية تم توثيقها بشكل جيد، والعديد من تكوينات التحفيز الكهربائي والضوابط يمكن تطبيقها بسهولة في نفس الإعداد التجريبي، مما يسمح لمجموعة واسعة من الديناميات المكانية والزمانية إلى استكشافها.
واحدة من الديناميات الرئيسية للاهتمام في هذه الدراسات في المختبر وقد تم عرض مدى الشبكات المستزرعة عرض خصائص تدل على التعلم 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 . فحص بيكسوتو مختبر سابقا آثار إشارات التدريب عالية التردد، كما هو موضح في رورو وآخرون. 14 ، على شبكات من الخلايا العصبية الماوس مطلي على صفائف ميكرولكترود 15 . في هذه التجارب، أظهرت الشبكات زيادة في استجابة المتابعةز التدريب الناجم عن التحفيز الكهربائي. واعتبرت زيادة الاستجابة شكلا من أشكال التعلم عن طريق الاعتراف التحفيز، حيث استجابت الشبكات بطريقة متسقة لتغيير في التحفيز بعد تطبيق بروتوكول التحفيز ( أي التدريب) محددة.
يوضح هذا البروتوكول كيفية زراعة الخلايا العصبية على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، وسجل بنجاح من أكثر من 95٪ من الأطباق مطلي، وإنشاء بروتوكول لتدريب الشبكات للرد على أنماط التحفيز، نوع النشاط وحدة واحدة، رسم بياني مؤامرة، وتفسير النتائج من مثل هذه التجارب. ويظهر استخدام نظام الملكية (انظر جدول المواد ) لتحفيز وتسجيل الثقافات العصبية، فضلا عن تطبيق حزم البرمجيات (انظر جدول المواد ) لفرز وحدات الخلايا العصبية. يتم استخدام واجهة مستخدم رسومية مصممة خصيصا (انظر جدول المواد ) لتصور ما بعد الصورةالوقت الرسم البياني الوقت، فترات بين انفجر، ومدة انفجار، وكذلك لمقارنة الاستجابة الخلوية للتحفيز قبل وبعد بروتوكول التدريب.
Protocol
تتبع جميع الإجراءات الحيوانية المبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة و / أو سياسة الخدمات الصحية العامة المتعلقة بالرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية وهي تخضع لبروتوكول رعاية الحيوان واستخدامه (إاكوك) المعتمد من المؤسسات في جامعة جورج ماسون.
1. إعداد المواد
- الأوتوكلاف المواد التالية: 5.75 بوصة ماصات الزجاج طويلة مرتبة عموديا في (2) 500 مل الأكواب، ما يقرب من 24 قطعة من ورقة الترشيح (150 ملم قطرها، كل واحد مقطعة إلى 8 أسافين، وحجم المسام لا يهم)، 1000 ميكرولتر ماصة تصفيتها نصائح، 200 ميكرولتر نصائح ماصة تصفيتها، 10 ميكرولتر نصائح ماصة تصفيتها، وغير المتأينة (دي) المياه لغسل (على الأقل 200 مل).
- إعداد الكواشف ووسائل الإعلام.
- إعداد جميع الكواشف ووسائل الإعلام في بيوهود باستخدام تقنيات العقيم.
- إعداد بولي- D- يسين (بدل) وفقا للجدول 1 .
- خلط بدل مع الماء دي العقيمة إلى النهائي جتركيز 50 ميكروغرام / مل، على النحو التالي. استخدام ماصة مصلية معقمة لنقل 96 مل من الماء دي العقيمة إلى زجاجة كاشف الزجاج تعقيمها.
- استخدام ماصة المصلية العقيمة لإضافة 4 مل من الماء دي العقيمة إلى قارورة الصانع التي تحتوي بدل. حل بدل بواسطة بيبتينغ. استخدام ماصة نفسه لنقل حل بدل إلى زجاجة كاشف الزجاج التي تحتوي على 96 مل من المياه دي العقيمة.
- كاب زجاجة بإحكام قبل إزالته من بيوهود ودوامة الحل. في بيوهود، وتقسيم الحل إلى قسامات 5 مل. تجميد أي حل غير المستخدمة في -20 درجة مئوية. إذابة بدل يمكن إعادة تجميد مرة واحدة. تجاهل الحل المذاب إذا إعادة تجميد قبل.
- إعداد حل لامينين كما هو موضح في الجدول 2 .
- مزيج لامينين مع برنامج تلفزيوني إلى تركيز النهائي من 20 ميكروغرام / مل، على النحو التالي. استخدام ماصة المصلية العقيمة لنقل 49 مل من برنامج تلفزيوني إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
- استخدام سيرولوجيكا العقيمةل ماصة لإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني إلى قارورة الصانع التي تحتوي على الوزن المناسب من لامينين. حل لامينين بواسطة بيبتينغ. استخدام ماصة نفسه لنقل الحل لامينين إلى 50 مل أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على 49 مل من برنامج تلفزيوني.
- كاب أنبوب بإحكام قبل إزالته من بيوهود ودوامة الحل. في بيوهود، وتقسيم الحل إلى 5 مل أليكوتس. تجميد أي حل غير المستخدمة في -20 درجة مئوية. لا يمكن إعادة تجميد لامينين إذابة. تجاهل أي حل ذوبان غير المستخدمة.
- إعداد وسط التخزين، وفقا للجدول 3 .
ملاحظة: يستخدم وسط التخزين لتخزين الأنسجة لمدة تصل إلى شهر في مستويات كو 2 المحيطة. يمكن شراؤها (انظر جدول المواد)، أو يمكن إعداده باستخدام وصفة عامة من: محيط كو 2 خلية التخزين المتوسطة + 2٪ الملحق خالية من مصل الخلايا العصبية ثقافة + 0.5 ملم خلية ثقافة المتوسطة التي تحتوي على استقرت شكل من الجلوتامين L (انظر جدول المواد).- لجعل 10 مل من وسط التخزين، ونقل 10 مل من وسط التخزين للأنسجة الجنينية دون كاكل 2 إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. إضافة 210 ميكرولتر من الملحق خالية من مصل للخلية الخلية العصبية و 55 ميكرولتر من شكل استقرت من L- الجلوتامين. مزيج بلطف عن طريق انقلاب.
- كما وسط التخزين حساسة للضوء، وحمايته من خلال تغطية أنابيب الطرد المركزي 15 مل مع رقائق الألومنيوم. قسامة 2 مل من وسائط التخزين في أنبوب ما مجموعه 5 قسامات. تخزينها في الثلاجة لمدة تصل إلى 2 أسابيع أو حتى جاهزة للاستخدام، ولكن لا تجميد.
- إعداد دمم 5/5 المتوسطة، وفقا للجدول 4 .
- أليكوتس ذوبان الجليد من الملحق خالية من مصل للخلية الخلايا العصبية، مصل الحصان (هس)، مصل بقري الجنين (فبس)، وحمض الاسكوربيك. ذوبان الجليد قسامة من القلم بكتيريا، إذا لزم الأمر، للسيطرة على التلوث الجرثومي. ماصة كل عنصر في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. تأكد من أن نصائح ماصة لا تلمس أي الأسطح أو أوبجيكالخبر.
- داخل بيوهود، قم بتوصيل المرشح إلى أنبوب فراغ مع فراغ لا يزال خارج. صب الخليط في أعلى مرشح وإغلاقه. بدوره على فراغ في بيوهود والسماح للتصفية المتوسطة إلى الجزء السفلي من الحاوية. افصل الفلتر من الفراغ قبل إيقاف الفراغ.
- تشديد الغطاء على حاوية متوسطة معقمة، وتسمية عليه، وتخزين أي المتوسطة غير المستخدمة في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. فتح الحاويات داخل بيوهود للحفاظ على معقمة المتوسطة.
- إعداد دمم + المتوسطة، وفقا للجدول 5 .
- أليكوتس ذوبان الجليد من الملحق خالية من المصل لخلية الخلايا العصبية وحمض الاسكوربيك (وقلم بكتيريا، إذا لزم الأمر). ماصة كل عنصر في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. كرر الخطوات من 1.2.5.2-1.2.5.3 للعملية المتبقية.
2. صفيف / إعداد طبق
ملاحظة: الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف المستخدمة في الإجراء هي صفائف 60 قناة سرغنيزد في 8 × 8 مربع. مسافة إنتيرلكترود هو 200 ميكرون، وكل القطب هو 10 ميكرون في القطر. المواد التي يتم إجراءها للمسارات هي التيتانيوم، والأقطاب نفسها مصنوعة من تين. الحلقة الزجاجية حول الأقطاب هي 6 مم عالية، مع القطر الخارجي 24 ملم. ويستخدم غطاء مصنوع من بوليوكسي ميثيلين (بوم) لتغطية منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا، ويتم استخدام فيلم إيثيلين بروبيلين (فيب) من مادة نفاذية / سائل غير منفذة للغاز لمنع التلوث أثناء جلسات التسجيل والتحفيز.
- قبل يوم الطلاء.
- جعل الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف غير المستخدمة ماء عن طريق تعريضها للبلازما. وهذا عادة لا يكون ضروريا بعد أول استخدام. تأكد من أن كوفرسليبس الزجاج المستخدمة لثقافات السيطرة أيضا الحصول على العلاج البلازما.
ملاحظة: أطباق بتري البلاستيك (35 ملم) ويمكن أيضا أن تستخدم كأطباق التحكم ولا تحتاج إلى أي ما قبل المعالجة.- إدارة العلاج البلازما باستخدام إيتشر البلازما لمدة 40-60 ثانية في نصف السلطة (50 W)، وايث تعيين ضغط الغرفة إلى 100-150 مت.
- على الفور ملء الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف مع المياه دي. غمر كوفرسليبس في طبق بتري مليئة بالماء دي. ترك المياه دي في اتصال مع الأسطح المعالجة لمدة 15 دقيقة تقريبا.
- داخل بيوهود، شفط المياه دي. ملء الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف إلى حافة مع الايثانول 70٪. إزالة المياه دي من طبق بتري تحتوي على كوفرسليبس وملء طبق بتري مع الإيثانول حتى كوفرسليبس مغمورة تماما. السماح لهذا للجلوس لمدة 10-15 دقيقة.
- تسمية جميع أطباق بتري وأطباق التحكم مع معرف ميي #، تاريخ الجراحة، نوع الخلية، والأحرف الأولى. ثم، ضع كل ميي في طبق بيتري المسمى.
- وضع الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف في أطباق بتري الفردية وإزالة الإيثانول باستخدام شفط فراغ. ملء الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف مع الماء دي العقيمة لإزالة أي الإيثانول المتبقية. استخدام شفط فراغ لإزالة المياه دي. السماح لل مياس الهواء الجاف داخل بيوهود.
- إضافة 40-70 ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل بولي-D- يسينه (بدل؛ الوزن الجزيئي العالي، على الأقل 50 كيلو دالتون) إلى وسط كل ميي و 0.2 مل إلى الضوابط باستخدام نصائح ماصة معقمة.
ملاحظة: تأكد من عدم لمس وسط ميي مع ماصة، طرف كما قد يؤدي ذلك إلى تلف الأقطاب الكهربائية. كمية الدقيق بدل استغناء يعتمد على هدروفيليسيتي من السطح. - وضع قطعة صغيرة من ورقة الأنسجة المختبر في كل طبق والرطب مع الماء المعقم لتجنب بدل التبخر بين عشية وضحاها. تغطية جميع الأطباق قبل إزالتها من بيوهود. وضع الأطباق في حاضنة عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
- جعل الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف غير المستخدمة ماء عن طريق تعريضها للبلازما. وهذا عادة لا يكون ضروريا بعد أول استخدام. تأكد من أن كوفرسليبس الزجاج المستخدمة لثقافات السيطرة أيضا الحصول على العلاج البلازما.
- تصفيح، ضوء.
- في يوم الطلاء، ذوبان الجليد 1 قسامة من لامينين (20 ميكروغرام / مل). كل ميي يتطلب 40-50 ميكرولتر من لامينين، ولكل طبق التحكم يتطلب 0.2 مل من لامينين. حساب حجم اللامينين اللازمة استنادا إلى عدد من الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف وضوابط لاستخدامها.
- نقل جميع الأطباق من الحاضنة إلى بيوهود.
- ملء جميع الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف مع عقيمةدي المياه باستخدام ماصة المصلية العقيمة والسماح لهم للجلوس لمدة 10-15 دقيقة. نضح المياه دي باستخدام ماصات باستير العقيمة وتكرار العملية مرتين.
- إضافة 40 - 50 ميكرولتر من لامينين ذوبان إلى وسط كل ميي و 0.2 مل من لامينين لوحات التحكم باستخدام نصائح ماصة معقمة. تغطية جميع الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف وأطباق التحكم في بيوهود ونقلها إلى حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- إزالة بعناية لامينين الزائد من وسط الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف باستخدام شفط مع ماصات باستير معقمة والسماح للسطح الهواء الجاف قبل الطلاء.
- ترك الأطباق في بيوهود، أو وضعها في حاضنة حتى جاهزة لصفيحة الخلايا.
ملاحظة: يمكن للأطباق البقاء في الحاضنة حتى اليوم التالي. ومع ذلك، إذا كان هناك حاجة إلى مزيد من الوقت، فمن المستحسن لتنظيف الأطباق والبدء من جديد من بولي-D- يسين (بدل) الخطوة (الخطوة 2.1.6).
3. إزالة الجنين والدماغاستخلاص
- صب L-15 (ليبوفيتز) المتوسطة إلى 4 من أطباق بتري 100 ملم. تغطية لهم ووضعها في -20 درجة مئوية الفريزر حتى المتوسطة لديها اتساق طين ولكن ليس المجمدة الصلبة (~ 40-60 دقيقة).
- هل هذا حوالي 40 دقيقة إلى 1 ساعة قبل تشريح.
ملاحظة: هذا سوف يبرد الأجنة والعقول بسرعة، بحيث لديهم الاتساق الثابت ولا تتفكك عند الاستخراج. - إعداد منطقة تشريح لإزالة الجنين.
- وضع علبة مع الثلج بالقرب من بالوعة ووضع الأدوات الجراحية والمواد لإزالة الجنين. وتشمل هذه 4 أطباق بتري مع الباردة L-15 "طين"، والمناشف الورقية، زجاجة رذاذ مع الايثانول 70٪، ملقط الإبهام حادة الأنف ، ملقط غرامة، مقص جراحي صغير، مقص كبير ( الشكل 1 ).
- إعداد منطقة تشريح لاستخراج الدماغ.
- وضع طبق بيتري الزجاج فاسي أسفل في علبة كاملة من الجليد.
- وضع الأدوات والمواد الجراحية لاستخراج المخ، بما في ذلك المناشف الورقية، مقص الجراحية الصغيرة، ملعقة رقيقة مزدوجة العضوية، زجاجة رذاذ مليئة الايثانول 70٪، وكيس من البلاستيك للتخلص من الذبيحة ( الشكل 2 ).
- ضع على معطف المختبر، قناع الوجه، والقفازات. رذاذ جميع الأسطح العمل، بما في ذلك القفازات، مع 70٪ من الإيثانول.
ملاحظة: على الرغم من أن هذا ليس إجراء معقمة، فمن الأفضل للحد من فرص التلوث قدر الإمكان. - الموت ببطء الماوس E17 توقيت الحوامل التالية المبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة 16 و / أو سياسة الخدمات الصحية العامة على الرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية وبموجب بروتوكول رعاية الحيوان واستخدامها مؤسسيا (إاكوك) للاختناق كو 2 . تأكد من الافراج عن غاز ثاني أكسيد الكربون ببطء في الغرفة على مدى فترة تتراوح من 3 إلى 5 دقائق لتجنب إثارة الذعر أو الديسكومفورت في الماوس.
- قطع رأس الماوس ووضعه على منشفة ورقية، الجانب البطني يصل. رش أسفل البطن مع الايثانول 70٪. باستخدام مقص جراحي صغير، وجعل قطع على شكل V من خلال الجلد والدهون تحت الجلد من أسفل البطن، وتمديد قطع إلى نهايات البعيدة من تجويف الصدري وفضح الرحم.
- باستخدام ملقط، ورفع بعناية الرحم بين الأجنة. قطع بعيدا النسيج الضام مع مقص تشريح حتى الرحم بأكمله هو حر. شطف لفترة وجيزة الرحم مع الايثانول 70٪ لإزالة أي دم ووضعه في واحدة من 4 أطباق بتري مليئة الباردة L-15.
- الافراج عن كل جنين من الرحم والاكتئاب الجنينية الداخلية باستخدام زوج من ملقط غرامة ذات الرؤوس. تأكد من قطع الحبل السري وإزالة كيس المشيمة. وضع الأجنة المحررة في الطبق الثاني الكامل من L-15 الباردة. قطع رأس الأجنة مع ملقط ومقص. باستخدام ملقط، ونقل رؤساء إلى طبق بيتري الثالث والهيئاتإلى الرابع، على حد سواء الكامل من L-15 الباردة.
4. الجبهي إزالة اللحاء
- في بيوهود، ضع إسفين من ورقة مرشح تعقيمها على مرحلة طبق الزجاج بيتري المبردة. وضع رأس الجنين واحد على ورقة الترشيح. قبضة الجمجمة عن طريق وضع زوج من ملقط من خلال تجاويف العين مع اليد غير المهيمنة. إزالة الجلد والأنسجة العضلية الكامنة مع زوج من مقص القزحية.
- وضع حافة القطع من محض أقل من القزحية مقص في قاعدة الجمجمة. الحفاظ على أقل محض ضد السطح الداخلي للجمجمة، بعيدا عن الدماغ، وقطع من خلال لوحة القذالي ثم على طول خط الوسط بين لوحات الجداري. مواصلة قطع روسترالي، بين لوحات الجمجمة الأمامية الغضروفية.
- بدءا من وسط لوحة القذالي، وجعل قطع عمودي على اليسار وإلى يمين قطع مركز.
- إزالة الدماغ عن طريق انزلاق بعناية ملعقة صغيرة بين السطح البطنيمن الدماغ وصفيحة الجمجمة أسفل حتى هو تماما تحت الدماغ. رفع ملعقة تصل. فإن الدماغ كله يخرج سليمة.
- وضع بضع قطرات من L-15 المتوسطة على ورقة الترشيح بحيث الدماغ لا تلتصق ورقة وتنزلق بلطف الدماغ من ملعقة على ورقة الترشيح، الجانب البطني إلى أسفل. قطع بعناية بعيدا لمبة الشم مع غيض من ملعقة.
- باستخدام ملعقة نظيفة، تشريح الفص الجبهي في نمط شبه منحرف. نقل الأنسجة إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على وسط التخزين. كرر ما سبق مع الأجنة المتبقية. تأكد من استخدام إسفين جديد من ورق الترشيح في كل مرة ( أي إسفين واحد من ورق الترشيح لكل رأس).
5. خلية التفكك
- في البيوهود، تجميع العناصر المدرجة في الجدول 6 .
- استخدام ماصة مصلية معقمة لإضافة 5 مل من دمم + إلى قارورة من غراء. تحسنت دمم + يمكن استخدامها لتحسين حل غراء. بلطفماصة لخلط الحل.
- استخدام ميكروبيبيت معقمة لإضافة 0.5 مل من دمم + إلى قارورة من الدناز. تجنب بيبتينغ قوية في حين جعل الحل الدناز، لأن الدناز حساس لقلب تمسخ.
- نقل 2.5 مل من محلول غراء إلى أنبوب الطرد المركزي العقيمة وإضافة 125 ميكرولتر من الدناز إلى نفس الأنبوب. خلط الحل عن طريق عكس بلطف أنبوب الطرد المركزي توج حوالي 8 مرات.
- باستخدام معقمة، على نطاق واسع ماصة، إزالة الأنسجة من أنبوب يحتوي على وسط التخزين ووضعه في معقمة، طبق بتري 35 ملم. جمع متوسطة قدر الإمكان. استخدام ماصة معقمة لإزالة أكبر قدر ممكن من التخزين الفائض ممكن دون إزالة الأنسجة. الأنسجة لا ينبغي أن تطفو في المتوسطة، ولكن يجب أن تكون رطبة.
- استخدام اثنين من شفرات مشرط العقيمة على اللحم المفروم الأنسجة. استخدام ماصة المصلية العقيمة لإضافة 2.5 مل من الخليط الدناز / غراء إلى الأنسجة المفروم في طبق بتري. دوامة بلطف طبق بتري لضمان رقبعة جميع الأنسجة مجانا في الحل وعدم الانضمام إلى الجزء السفلي من الطبق. وضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- في بيوهود، استخدام معقمة، واسعة-- تتحمل نقل ماصة لنقل جميع وسائل الإعلام والأنسجة إلى أنبوب معقم، 5 مل المبردة. ضع غيض من نفس ماصة نقل تتحمل واسعة بالقرب من الجزء السفلي من الأنبوب. تريتورات بلطف ببطء بيبتينغ صعودا وهبوطا 10-15 مرات.
- تجنب تشكيل فقاعات بينما بيبتينغ. كرر العملية باستخدام ماصة نقل صغيرة تتحمل حتى يتم تحقيق خليط متجانسة. إذا لم يتم فصل الأنسجة، تريتورات باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
- إضافة 2 مل من تحسنت دمم 5/5 إلى خليط الخلية فصلها. كاب أنبوب الطرد المركزي في حين أنه لا يزال في بيوهود. مزيج بلطف عن طريق انقلاب. أجهزة الطرد المركزي في حوالي 573 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية).
- في بيوهود، واستخدام ماصة المصلية العقيمة لإزالة وتجاهل كل طاف، دون كسربيليه. استخدام ماصة معقمة لإضافة 1 مل من دمم تحسنت 5/5 إلى بيليه في أنبوب لإعادة تعليق الخلايا. استخدام معقمة، صغيرة تتحمل ماصة نقل لتفريق بيليه بيبتينغ بلطف صعودا وهبوطا حتى خليط متجانس.
ملاحظة: تجنب تشكيل فقاعات بينما بيبتينغ. إذا تم جمع القليل جدا من الأنسجة، إضافة فقط 0.5 مل من دمم 5/5. - داخل بيوهود، واستخدام ماصة معقمة لنقل 10 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب ميكروسنتريفوج. خارج بيوهود، إضافة 10 ميكرولتر من الأزرق تريبان إلى 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب ميكروسنتريفوج.
ملاحظة: هذه الخطوة لا تتطلب العقم. - تحميل 10 ميكرولتر من تريبان تعليق خلية زرقاء في رقاقة الكريات الدم القابل للتصرف من أجل حساب الخلايا.
6. الطلاء الخلايا
- في بيوهود، واستخدام ميكروبيبيت معقمة لنقل 50 ميكرولتر من تعليق خلية إلى مركز كل صفيف وكل طبق بتري السيطرة. استخدام واحد بيبيت تلميح لكل طبق. تأكد من وضع الخلايا بالضبط في وسط الصفيف. إعادة الرطب ورقة الأنسجة المختبر الذي كان في الطبق مع الماء المعقم، أو وضع ورقة الأنسجة الجديدة في كل طبق. تغطية الأطباق.
- وضع أطباق بتري مغطاة في حاضنة مجموعة إلى 37 درجة مئوية و 10٪ كو 2 لمدة 3-4 ح.
- في بيوهود، إضافة بلطف 1 مل من دمم تحسنت 5/5 لكل ميي.
ملاحظة: تجنب غسل الخلايا بعيدا عن مجموعة المركز عند إضافة الوسيط (مهم!). بعناية فائقة، واستخدام ميكروبيبيت معقمة لإضافة قطرة واحدة في وقت حول حواف الداخل. - وضع غطاء يحتوي على غشاء فيب الغاز نفاذية على كل ميي. إعادتها إلى الحاضنة لمدة يومين.
ملاحظة: الغطاء يمنع التلوث والتبخر. اتبع تقنية العقيم، وتجفيف القبعات في بيوهود مع الايثانول 100٪ قبل وضعها على الشرق الأوسط وأفريقيا. يجب أن تكون الثقافات توج في بيوهود ويجب أن تبقى توج في جميع الأوقات.
7. الرئيسيةتاينينغ الثقافات
- بعد يومين، إجراء استبدال المتوسطة كاملة مع تحسنت دمم +.
- نقل سوى عدد قليل من الأطباق من الحاضنة إلى بيوهود في وقت لتجنب التأكيد على الثقافات لفترة طويلة جدا.
- استخدام العقيمة ميكروبيبيت 1 مل لرسم كل وسيلة من الطبق عن طريق وضع بعناية غيض من ماصة على الجدار الداخلي للطبق، وتجنب لمس الخلايا في المركز. استخدام تلميح ماصة واحد فقط في الطبق لتجنب انتشار التلوث.
- استخدام ميكروبيبيت معقمة للاستغناء 1 مل من دمم الحارة +، ووضع بعناية غيض من ماصة على الجدار الداخلي للطبق.
- إجراء تغييرات متوسطة بنسبة 50٪ مع دمم + تحسنت، كما هو موضح أعلاه، 2-3 مرات في الأسبوع، مع ما لا يزيد عن 4 أيام بين العلف.
- استخدام العقيمة ميكروبيبيت 1 مل لاستخلاص 500 ميكرولتر من المتوسط من الطبق. استخدام ميكروبيبيت العقيمة للاستغناء 500 ميكرولتر من دمم الحارة +. </ لى>
8. التفتيش البصرية والتسجيل
- فحص عينات طبق كل يوم تحت المجهر للبحث عن تغطية الخلية عبر مجموعة (باستخدام 4X و 10 X التكبير) والتلوث (باستخدام التكبير 20X)، إما البكتيريا أو الفطرية.
ملاحظة: ويبين الشكل 3A مثالا على تغطية الخلايا الأمثل، في حين يبين الشكل 3B ثقافة مع كثافة الخلايا الفقيرة. - بعد أسبوعين من الطلاء، اختبار عينة من أطباق الشرق الأوسط وأفريقيا للنشاط العفوي. سجل من الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، كما هو موضح أدناه، لمدة 3-5 دقائق. سيتم الكشف عن المسامير إذا كان النشاط موجودا ( الشكل 4 ).
ملاحظة: الأمر متروك للمجرب لتحديد متى تبدأ الاختبار استنادا إلى نوع التجربة والفرضية التي يجري التحقيق فيها.- لتسجيل النشاط في الشرق الأوسط وأفريقيا، استخدم المعدات التالية: امدادات الطاقة، مكبر للصوت، هيدستاج / المضخم، تحكم في درجة الحرارة، ومولد التحفيز (انظر الجدول من المواد والشكل 5 ).
- قبل أخذ الثقافات من الحاضنة، قم بتوصيل وحدة التحكم في درجة الحرارة وتشغيل النظام عن طريق التحول على إمدادات الطاقة (وفقا لتعليمات الشركة الصانعة)، مما يسمح لوحة قاعدة ساخنة من المضخم الأولي لتصل إلى 35 درجة مئوية.
- وضع الثقافة توج في المضخم بحيث الخط الأسود في الشرق الأوسط وأفريقيا جيدا يتوافق مع الأرض المرجعية. تأكد من أن دبابيس المضخم المسبق يصطف، أن الجزء العلوي من المضخم هو تأمين، وأن غطاء الثقافة لا يزال على.
- بمجرد وضع الثقافة في لوحة، قم بإلغاء تحديد خيار "تغيير ميي" على برنامج الحصول على البيانات (انظر جدول المواد لأسماء البرامج وأدلة المستخدم). بالإضافة إلى ذلك، قم بإلغاء تحديد المربع المسمى "بلانكينغ" قبل القيام بأي تسجيلات.
- حدد "تحميل" في "MEA_Select" بعد ريتم وضع الثقافة في النظام. تحقق من أن البرنامج يظهر "تحميل موافق" قبل المتابعة.
- اضغط على "ابدأ" في بيئة البرنامج لبدء تصور الإشارات. في النافذة الرئيسية، حدد: "المسامير" → "كشف" → "تلقائي"، قم بتغيير قيمة "ستد ديف" إلى "5"، ثم انقر فوق "تحديث" لإعادة تعيين الحد الأدنى.
ملاحظة: نافذة "المسامير" يظهر المسامير التي مرت العتبة. - في النافذة الرئيسية، حدد "مسجل" → "مسجل" → "تصفح". تغيير المسار واسم الملف لتحديد التاريخ والوقت والصحن، والتجربة. تعيين المهلة (على سبيل المثال، إلى 5 دقائق). انقر على "إيقاف" و "تسجيل" و "تشغيل". لاحظ أن التسجيل يتوقف تلقائيا.
- فتح برنامج التحفيز. اختر "مسجل" → "مسجل" → "استعراض" لإنشاء ملف وتعيين الوقته الحد. انقر على "إيقاف" و "تسجيل" و "تشغيل" لتسجيل مرة أخرى. انقر على "تحميل وبدء" (على برنامج التحفيز) لتحفيز ليتم تسليمها إلى الطبق.
- حدد زر "تغيير ميي" في برنامج التحكم من أجل تغيير الأطباق.
ملاحظة: لا تبقي الثقافة خارج الحاضنة لأكثر من 30 دقيقة في وقت واحد دون نظام للحفاظ على جو كو 2 حول الثقافة. إذا كانت هناك حاجة إلى جلسات تسجيل أطول، استخدم محول متاح تجاريا لتوريد ثاني أكسيد الكربون.
9. شبكات التدريب
ملاحظة: يوضح الشكل 6 لمحة عامة عن الخطوات 9.1-9.3، الموصوفة أدناه.
- سجل خط الأساس 5 دقائق من النشاط التلقائي من ثقافة الخلية (كما هو موضح في الخطوة 8). وبمجرد أن يتم إنشاء خط الأساس، وإدارة 5 دقائق قبل التدريب التحفيز التحقيق تتألف من 0.5 هرتز ثنائي الطورنبض مع 200 μs مدة النبض وسعة نبض 900-مف ( الشكل 7A ) من خلال أقطاب التحفيز المحدد، كما هو مبين في الشكل 8 (انظر دليل البرامج في جدول المواد للحصول على تفاصيل حول كيفية اختيار أقطاب التحفيز).
- عند الانتهاء من التحفيز قبل التدريب، وإدارة بروتوكول "التدريب" للشبكات باستخدام نفس الأقطاب كما في التحفيز التحقيق. تسليم القطارات عالية التردد مرة واحدة كل 2 ق، كما هو موضح في هاميلتون وآخرون. 15 ( الشكل 7 ب والشكل 7 ج ).
ملاحظة: تتألف إشارة التدريب من 40 قطارا نبضيا. ويتألف كل قطار نبضي من 100 نبضة ثنائية الطور، مع 4 مس بين النبضات ومدة نبضة قدرها 200 μs، وسعة نبضة 900 مف. - بعد الانتهاء من فترة التدريب، وإدارة 5 دقائق بعد التدريب التحفيز إلى الخلايا،متطابقة مع التحفيز قبل التدريب. مرة واحدة ينتهي التحفيز بعد التدريب، سجل 5 دقائق من النشاط التحفيزي بعد التحفيز من الشبكة (كما هو موضح في الخطوة 8).
- استخدام مجموعة مراقبة منفصلة من الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف لمراعاة التغييرات المحتملة في استجابة الشبكة بسبب التقلبات الطبيعية أو عدم استقرار النظام. إدارة نفس البروتوكول التجريبي الموصوف أعلاه لتلك المجموعات الضابطة، باستثناء أن مجموعات السيطرة تتلقى فترة تدريب صورية لا تدار فيها إشارة تدريب فعلية.
10. تحليل البيانات
ملاحظة: يتم حفظ ملفات البيانات وفرزها لاحقا إلى وحدات الخلايا العصبية باستخدام برنامج الفرز الملكية (انظر جدول المواد). وتستخدم واجهة مستخدم رسومية مخصصة (غوي) لتحميل الوحدات وتحليل أنماط النشاط في الثقافات، والفواصل بين انفجر، مدة الاندفاع، الرسم البياني الوقت ما بعد التحفيز (بسث) (انظر جدول المواد). و بسث هوالرسم البياني الأكثر أهمية التي سيتم تحليلها، لأنها تعرض نشاط الشبكة في أحجام بن (من طول متغير)، وبالتالي توفير تمثيل مرئي لاستجابة الشبكة إلى التحفيز المقدمة.
- تحويل ملفات البيانات .mcd إلى تنسيق .plx باستخدام برنامج فرز الملكية (انظر جدول المواد لأسماء البرامج وأدلة المستخدم). تصدير ملف .plx إلى ملف .plx جديد ضمن نفس البرنامج. فرز القنوات إلى وحدات الخلايا العصبية ( الشكل 9 ). بمجرد اكتمال الفرز، تصدير البيانات كملف .nex.
- فتح ملف .nex في البرنامج المناسب (انظر المواد الجدول ) وحفظه كملف .mat ليتم تحليلها مع واجهة المستخدم الرسومية حسب الطلب، وهي متاحة بحرية (انظر الجدول المواد ).
ملاحظة: واجهة المستخدم الرسومية (انظر جدول المواد) مؤامرات بسث وفقا لإدخال المستخدم ( أي بسث السكان، بسث متوسط متحيز، أو قناة P الفرديةسث)، مما يسمح لمحة عامة عن تجربة التحفيز والمقارنة الفورية بين ما بعد وما قبل التحفيز الملفات. كما يرسم المؤهلات الأولية مقابل النهائية بسثس، الذي يقارن استجابة الشبكة لأول 6 و 6 المحفزات الأخيرة. وتؤدي واجهة المستخدم الرسومية عدة وظائف أخرى، مثل معدل السنبلة، والفاصل بين الفاصل الزمني، والمسامير في الرشقة، والفاصل بين الفاصل الزمني، ومدة الرشقة، لكل من ملفات التحفيز والملفات ذات النشاط العفوي. - أولا، حدد ملف .mat مع المتغيرات التي تحتوي على قطارات سبايك ومتغير واحد يحتوي على قطعة أثرية التحفيز. فإن البرنامج النصي تحليل البيانات، وسوف واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية يطفو على السطح مع الرسم البياني متوسط بسث على اليمين ( الشكل 10 ).
- انقر على أزرار القطب النشط لرؤية بسث الفردية (باللون الأزرق) بالمقارنة مع متوسط بسث (باللون الأحمر).
ملاحظة: سوف تكون ملونة الأقطاب النشطة لإظهار خريطة الحرارة، حيث أعلى القيم (أكثر الحمراء) تمثل أكبرذروة القيم بسث، مما يدل على استجابة أقوى للتحفيز. - حدد خيار التحليل باستخدام القائمة المنبثقة. حدد زر "المتوسط المتحيز" لتحديد مجموعة فرعية من الأقطاب الكهربائية ورسم متوسط تلك المجموعة الفرعية؛ وهذا مفيد لمقارنة سلوك الشبكة الفرعية داخل الثقافة.
ملاحظة: هناك خيارات تحليل مختلفة متعددة مختارة من خلال القائمة المنبثقة، ويتم شرح كل ذلك في زر "مساعدة" في البرنامج. - حدد زر "حفظ الرسم البياني" لحفظ الرسم البياني المعروض حاليا كملف جبيغ مع ارتفاع القرار. حدد الزر "جدول البيانات" لتصدير البيانات إلى جدول بيانات.
- انقر على أزرار القطب النشط لرؤية بسث الفردية (باللون الأزرق) بالمقارنة مع متوسط بسث (باللون الأحمر).
Representative Results
باستخدام الإجراء المعروض هنا ( الشكل 11 ) ، تم تحضين مياس 60 قناة مطلي مع الخلايا العصبية الماوس E17 حتى تغطي الثقافات صفائف في سجادة صحية من الخلايا ( الشكل 12 والشكل 3A ) . بعد 3 أسابيع من الحضانة عند 10٪ كو 2 و 37 درجة مئوية، تم فحص الثقافات للنشاط العفوي باستخدام نظام تسجيل تجاري (انظر جدول المواد ). تم الحفاظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية خلال إجراء التسجيل باستخدام جهاز تحكم في درجة الحرارة، لأن درجة الحرارة يؤثر على نشاط الخلايا العصبية ومعدلات اطلاق النار.
اختبار النشاط
وعادة ما تظهر الشبكات النشطة عفويا أنماط إشارة متفاوتة. يمكن للثقافة النشطة المتوسطة تسجيل النشاط فيما يقرب من 40٪ من الأقطاب الكهربائية. من هذه المواقع القطب نشطة، ما يقرب من نصف تسجيل إشارات عفوية، مع معدلات اطلاق النار تتراوح بين 5-10 هرتز. ويرد مخطط النقطية ممثل النشاط العفوي في الشكل 4A . وتشير علامات القراد إلى الطوابع الزمنية لإمكانيات العمل المسجلة من 9 أقطاب نشطة خلال فترة 20 ثانية بمعدل اكتساب قدره خز 25 ومدى مرشاح ممر عريض بين 300 هرتز و 3 خز. ويبين الشكل 4B الضوضاء الأساسية والإشارة خارج الخلية الخام التي تمت تصفيتها خلال 8 رشقات من النشاط قبل إجراء الفرز. لفصل إمكانيات العمل من الضوضاء، يتم تعيين عتبات لكل قناة إلى 5 أضعاف الانحراف المعياري للضوضاء الأساسية ويتم حسابها عبر نافذة مس 500 15 .
قبل التحليل، تم فرز المسامير المسجلة لكل القطب حاليا للتمييز بين الفيزياءالنشاط المنطقي والتحف التحف باستخدام خوارزمية k- يعني والتحليل عنصر المبدأ. تم تجميع الإشارات التي تم تحديدها على أنها ردود فعل فسيولوجية معا لخلق استجابة للسكان في كل قطب كهربائي ( الشكل 13 والشكل 9 ) 15 .
تدريب الشبكات العصبية مع التحفيز الكهربائي
تم تدريب الشبكات باستخدام التحفيز الكهربائي المطبق على الثقافة مباشرة من خلال أقطاب ميي باستخدام مولد التحفيز (انظر جدول المواد). في هذه المجموعة من النتائج التمثيلية، تم استخدام تكوين "L" على شكل يتكون من 13 أقطاب ( الشكل 8 )، على الرغم من أن العديد من التشكيلات الأخرى يمكن تطبيقها. واستند التحفيز والتدريب والتحقيق على المعلمات المحددة في رورو وآخرون. 14 .
تم تعيين خط الأساس في البداية عن طريق تسجيل 5 دقائق من النشاط العفوي قبل التحفيز. وبمجرد إنشاء خط الأساس، تم إعطاء 5 دقائق قبل التدريب التحفيز التحقيق تتألف من نبض ثنائي الطور هرتز 0.5 مع مدة النبضة 200 μs و نبض نبض 900 السعة ( الشكل 7A ) من خلال مواقع التحفيز مختارة ( أي "L" على شكل). وتم بعد ذلك تدبير بروتوكول تدريبي إلى الشبكات كل 2 ثانية باستخدام نفس مجموعة الأقطاب الكهربائية. وتألفت إشارة التدريب من 40 قطارا نبض، يحتوي كل منها على 100 نبضة ثنائية الطور، مع فترة نبضة بين 4 مس، ومدة نبضة قدرها 200 μs، وسعة نبضة 900 مف ( الشكل 7b والشكل 7c ). ثم أعقبت فترة التدريب هذه مرحلة بعد التدريب مدتها 5 دقائق، على غرار مرحلة التحفيز السابقة للتدريب. وكان البروتوكول ثماختتم مع تسجيل 5 دقائق من النشاط التحفيز بعد عفوية.
تم تطبيق نفس البروتوكول التجريبي لمجموعة السيطرة من الثقافات لحساب التقلبات الطبيعية في استجابة الشبكة. بيد أن الاختلاف الوحيد في بروتوكول التحكم هو تطبيق فترة تدريب على التصوير، لم يتم خلالها إعطاء أي إشارة تدريب فعلية.
وأجريت التحليلات الإحصائية لمجموعات البيانات ( أي التدريب مقابل السيطرة) باستخدام أنوفا أحادي الاتجاه، مع "التدريب" المتغير باعتباره عاملا بين الموضوع. واستخدم الكمون كعامل داخل الموضوع. إذا تم العثور على تفاعل كبير، تم إجراء توكي ما بعد مخصصة. وأظهرت النتائج استجابة ما قبل التدريب في غضون 20 مللي ثانية بعد التحفيز، على الرغم من أن مجموعة من النشاط غير متناسقة بعد الاستجابة الأولى. ومع ذلك، أظهر نشاط ما بعد التدريب ليس فقط أر إسبونس داخل أول 20 مللي ثانية بعد التحفيز، كما رأينا خلال مرحلة ما قبل التدريب، لكنه عرض أيضا نشاطا كبيرا 30-50 مللي ثانية بعد التحفيز ( الشكل 14 والشكل 15 ) 15 . كان هناك أيضا ارتباط ذو دلالة إحصائية بين "تردد السنبلة" مقابل "الوقت بعد التحفيز" و "الوثوقية العالية" مقابل "الوقت بعد التحفيز". ويمكن تعريف "الموثوقية سبايك" على أنها احتمال رؤية استجابة الشبكة إلى التحفيز، حيث يتم تعيين استجابة لكل حافز قيمة قصوى من 1. ويبين الشكل 16 ما يقرب من زيادة بنسبة 50٪ في تردد ارتفاع، فضلا عن 30 -50٪ زيادة في الموثوقية ارتفاع للشبكات المدربة مقابل السيطرة في نطاق 20-50 مللي ثانية بعد التحفيز. وتشير هذه النتائج إلى أن التدريب قد غير ديناميكية الشبكة بشكل أساسي.
1 "كلاس =" زفيجيمغ "سرك =" / فيليز / ftp_upload / 55726 / 55726fig1.jpg "/>
الشكل 1 : الأدوات والمواد المستخدمة لإزالة الجنين. ( A ) صينية مليئة بالثلج. ( B ) أطباق بتري مليئة الباردة L-15 "طين". ( C ) منشفة ورقية. ( D ) زجاجة رذاذ مع الايثانول 70٪. ( E ) ملقط غرامة (X2). ( F ) مقص جراحي صغير. ( ز ) ملقط الأنف بلانت الأنف. ( H ) مقص كبير. ( I ) حقيبة الجسم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 : الأدوات والمواد المستخدمة لاستخراج الدماغ. ( أ B ) طبق بتري تحتوي على رؤساء الجنين. ( C ) أنبوب الطرد المركزي مغطاة احباط مع وسط التخزين. ( D ) زجاج مقلوب طبق بتري. ( E ) تعقيمها ورقة الترشيح. ( F ) كوب مع الايثانول 70٪. ( g ) البلاستيك ماصة. ( H ) مقص ايريس. ( I ) ملقط غرامة. ( J ) رقيقة ملعقة مزدوجة العضوية. ( K ) منشفة ورقية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 : المثلى مقابل الثقافات غير المثلى. ( A ) سجادة صحية من الخلايا التي تغطي المصفوفات، على النقيض من ( B )،التي يوجد فيها تكاثر الخلايا الفقراء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 : نتائج ممثل النشاط العفوي. ( A ) مؤامرة النقطية الممثل من النشاط العفوي. وتشير علامات القراد إلى إمكانيات العمل المسجلة من 9 أقطاب نشطة خلال فترة 20 ثانية بمعدل اكتساب قدره خز 25 ومرشاح نطاق الموجة العريضة بين خز 3 و 300 هز. ( ب ) ممثل تصفيتها عمل خارج الخلية المحتملة من موقع نشط. الشكل المعدل من المرجع 15 . الرجاء انقر هنا لعرض أكبر فيسيوn من هذا الرقم.
الشكل 5 : تسجيل الإعداد. ( A ) مولد التحفيز. ( b ) تحكم في درجة الحرارة. ( c ) امدادات الطاقة. ( D ) مكبر للصوت. ( e ) هادستاج / بريامبليفيه. ( F ) توجها الشرق الأوسط وأفريقيا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6 : التمثيل التخطيطي لبروتوكول التدريب الكهربائي. سجل خط الأساس الأولي لمدة 5 دقائق والتحفيز التحقيق لمدة 3 دقائق. تطبيق ستيمولاتي كزاز لمدة 90 ثانية، والتي لم يتم تسجيلها. تطبيق وتسجيل التحفيز التحقيق الثاني لمدة 3 دقائق وخط الأساس النهائي لمدة 5 دقائق. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشکل : 7 معلمات تحفیز التدریب والتدریب. ( A ) تحفيز التحفيز يتكون من ± 900 مف نبضات ثنائية الطور تدار على تردد 0.5 هرتز. ( B ) تتكون قطارات النبضات من نبضات ثنائية الطور ذات ± 002 ± مف على تردد 250 هرتز. ( C ) تتألف إشارة التدريب من 40 قطار نبضة تدار كل 2 ثانية. الشكل المعدل من المرجع 15 ."_blank"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8 : تمثيل تكوين "L" -shape. الساحات تمثل الأقطاب الفردية من ميي. المربعات الزرقاء تشير الأقطاب المستخدمة للتحفيز، في حين أن جميع الآخرين تستخدم للتسجيل. الشكل المعدل من المرجع 15 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9 : وحدات التمييز من التحف الضجيج والتحفيز. العديد من الألواح العلوية ( A -
الشكل 10 : الرسم البياني الزمني بعد التحفيز (بسث). واجهة المستخدم الرسومية (انظر جدول المواد ) قطع بسثس وفقا لإدخال المستخدم ( أي بسث السكان، بسث متوسط متحيز، أو فردقناة بسث)، مما يسمح لمحة عامة عن تجربة التحفيز والمقارنة الفورية بين ما بعد وما قبل التحفيز الملفات. كما أنه يرسم المؤش رات الأولية (بسثس) الأولية مقابل النهائية؛ وهذا يقارن استجابة الشبكة لأول 6 و 6 المحفزات الأخيرة. وتؤدي واجهة المستخدم الرسومية عدة وظائف أخرى، مثل معدل السنبلة، والفاصل بين الفاصل الزمني، والمسامير في الرشقة، والفاصل بين الفاصل الزمني، ومدة الرشقة، لكل من ملفات التحفيز والملفات ذات النشاط العفوي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 11 : نظرة عامة على إعداد الخلايا والطلاء. ( A ) يتم الموت الرحيم الماوس E17 الحامل مع كو 2 . ( ب ) الماوس هو ديكابيتاتإد والرحم تتم إزالة. ( C ) يتم الافراج عن الأجنة وقطع رأسه. ( D ) يتم استخراج الدماغ من كل جنين ويتم إزالة الفص الجبهي. ( E ) يتم فصل الخلايا. ( F ) يتم فصل الخلايا فصل في المتوسطة. ( G ) يتم تعليق الخلايا المعلقة على صفائف متعددة القطب 60 قناة (مياس). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 12 : الثقافات العصبية مطلي على صفائف ميكرولكترود. يتم مطلي الخلايا العصبية الماوس الجنينية على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف 60 قناة، والتي تسمح للتسجيل في وقت واحد من نشاط الخلايا العصبية عبر الشبكة من كل القطب. (الشكل المعدلمن المرجع 15 ). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 13 : برنامج الفرز المستخدم لترتيب أشكال الموجة من كل قناة. يقوم برنامج الفرز (انظر جدول المواد ) بتحميل ملف البيانات ويعرض جميع الوحدات التي تم الحصول عليها في البداية لكل قناة. ويتم اختيار إحدى الطرق العديدة لتخصيص إشارات لوحدات معينة. في هذا المثال، تم اختيار خوارزمية تجميع k-مين، وتم تحديد الوحدة الصفراء (المسمى "الوحدة أ" في النافذة السفلية). ثم يتم استخدام برنامج آخر (انظر جدول المواد ) لتصدير ملف .nex إلى ملف .mat، وهو ملف الإدخال لواجهة المستخدم الرسومية حسب الطلب (انظر
الشكل 14 : تغيير نشاط الشبكة استجابة للتحفيز بعد فترة التدريب. ممثل النقطية مؤامرة النشاط من ثمانية أقطاب. يشير الخط الأحمر العمودي إلى وقت التحفيز، وتشير علامات القراد السوداء إلى إمكانات العمل. في مرحلة ما قبل التدريب ( A )، هناك استجابة فورية لنبض التحفيز عبر القنوات. في مرحلة ما بعد التدريب ( B )، تظهر الشبكة استجابة النشاط أكثر لفترات طويلة، فضلا عن الاستجابة الفورية للتحفيز 15 ..jove.com / فيليز / ftp_upload / 55726 / 55726fig14large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 15 : الشبكات المدربة ذات ترددات كبيرة متغيرة. ويحسب تواتر الشبكة لشبكات التحكم عن طريق دمج عدد المسامير على مس 50 مباشرة بعد كل التحفيز وتقسيم تلك الفترة. ويظهر متوسط 12 شبكة مدربة و 10 شبكات تحكم (تشير أشرطة الخطأ إلى الخطأ المعياري للمتوسط). تشير العلامة النجمية (*) إلى وجود فرق إحصائي ( قيمة P <0.05) بين مجموعتي البيانات. الشكل المعدل من المرجع 15 . الرجاء انقر هنا لعرض لارنسخة جير من هذا الرقم.
الشكل 16 : الردود بوساطة متشابك تعدل بشكل ملحوظ في الشبكات المدربة. ( A ) موثوقية ارتفاع، يقاس في 10 مس صناديق وتطبيع إلى شبكات التحكم، لا يظهر أي تغيير للتفعيل المباشر من الخلايا العصبية بالقرب من الأقطاب الكهربائية (0-20 مس). وبالتالي لا يوجد فرق إحصائي بين الضوابط والشبكات المدربة لتلك الحزم. ومن ناحية أخرى، تكون الاستجابات الأطول زمنيا (30-50 مللي ثانية) متوازية بشكل متشابك، مما يشير إلى أن هذه الطريقة توفر تحقيقا أكثر تفصيلا للموثوقية مما هو عليه في الشكل 15 أعلاه. ( B ) يكرر تردد ارتفاع عدد السكان سلوك الموثوقية ويظهر أي تعديل للتفعيل المباشر (0-20 مس)، في حين أن قانوناتم العثور على فرق كبير إيكتيكالي للردود على المدى الطويل (30-50 مللي ثانية). ويتسق هذا السلوك مع النتائج المتوسطة في الشكل السابق 15 . أما أشرطة الخطأ فهي الخطأ المعياري للمتوسط، المحسوبة في 10 شبكات تحكم و 12 شبكة مدربة. (*) p- فالو <0.05؛ (**) p- فالو <0.001. الشكل المعدل من المرجع 15 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الكمية | بند |
| 1 | يعقم زجاج كاشف زجاجة (على الأقل 100 [مل] حجم) |
| 20 | 15 مل أنابيب الطرد المركزي العقيمة |
| 1 | 10 مل ماصة مصلية معقمة |
| 4 | 25 مل ستيريلe ماصة المصلية |
| 2 | 50 مل ماصة مصلية معقمة |
| 1 | الطرد المركزي أنبوب الرف |
| 150 مل | معقم دي المياه |
| 5 ملغ | قنينة بولي-D-ليسين |
الجدول 1: إعداد بدل - قائمة المواد والكواشف.
| الكمية | بند |
| 1 | 50 مل أنابيب الطرد المركزي معقمة |
| 10 | 15 مل أنابيب الطرد المركزي العقيمة |
| 2 | 1 مل ماصة مصلية معقمة |
| 2 | 50 مل ماصة مصلية معقمة |
| 1 | الطرد المركزي أنبوب الرف |
| 1 مل | فوسفات العازلة المالحة (بس) |
| 1 ملغ | Laminin |
الجدول 2: إعداد لامينين - قائمة المواد والكواشف.
| الكمية | بند |
| 1 | يعقم زجاج كاشف زجاجة (على الأقل 100 [مل] حجم) |
| 20 | 15 مل أنابيب الطرد المركزي العقيمة |
| 1 | 10 مل ماصة مصلية معقمة |
| 4 | 25 مل ماصة المصلية العقيمة |
| 2 | 50 مل ماصة مصلية معقمة |
| 1 | الطرد المركزي أنبوب الرف |
| 150 مل | معقم دي المياه |
| 5 ملغ | قنينة بولي-D-ليسين |
أس = "jove_content" فو: كيب-together.within-بادج = "1"> الجدول 3: إعداد وحدة التخزين - قائمة المواد والكواشف.
| الكمية | بند |
| 44 مل | دمم مع شكل ستابيلزد من L- الجلوتامين (انظر جدول المواد) |
| 1 مل | الملحق خالية من مصل للخلية الخلايا العصبية (انظر جدول المواد) |
| 2.5 مل | مصل الحصان |
| 100 ميكرولتر | حمض الاسكوربيك [4 مغ / مل] |
| 2.5 مل | مصل بقري جنيني (فبس) |
| 0.5 مل | القلم ستريب (اختياري) |
| 1 | 50 مل أنابيب الطرد المركزي معقمة |
| 2 | 25 مل ماصة المصلية العقيمة |
| 2 | 10 مل ماصة المصلية العقيمة </ td> |
| 2 | 1 مل ماصة مصلية معقمة |
| 1 | 250 مل مرشح |
الجدول 4: دمم 5/5 إعداد متوسط - قائمة المواد والكواشف.
| الكمية | بند |
| 49 مل | دمم مع شكل ستابيلزد من L- الجلوتامين (انظر جدول المواد) |
| 1 مل | الملحق خالية من مصل للخلية الخلايا العصبية (انظر جدول المواد) |
| 100 ميكرولتر | حمض الاسكوربيك [4 مغ / مل] |
| 0.5 مل | القلم ستريب (اختياري) |
| 1 | 50 مل أنابيب الطرد المركزي معقمة |
| 2 | 25 مل ماصة المصلية العقيمة |
| 2 | 1 مل ماصة مصلية معقمة |
| 1 | 250 مل مرشح |
الجدول 5: دمم + إعداد متوسط - قائمة المواد والكواشف.
| الكمية | بند |
| 1 | بابين 140 U / قارورة |
| 1 | الدناز 1،260 U / قارورة |
| 7 مل | دمم + (مبردة) |
| 5 مل | دمم 5/5 (تحسنت) |
| 10 ميكرولتر | تريبان الأزرق |
| 2 | شفرات مشرط |
| 1 | 35 ملم طبق بتري العقيمة |
| 4 | 15 مل أنابيب الطرد المركزي العقيمة |
| 2 | 5 مل أنابيب المبردة معقمة |
| 2 | 2 مل أنابيب المبردة معقمة |
| 1 | 50 مل أنابيب الطرد المركزي معقمة |
| 1 | أنبوب ميكروسنتريفوج |
| 2 | كبير ماصة نقل تتحمل |
| 3 | صغيرة تتحمل ماصة نقل |
| 5 | 2 مل ماصة مصلية معقمة |
| 5 | 1 مل ماصة مصلية معقمة |
| 2 | 10 ميكرولتر نصائح ميكروبيبيت العقيمة |
| 1 | 1000 ميكرولتر نصائح ميكروبيبيت العقيمة |
| 1 | هيموسيتوميتر رقاقة |
الجدول 6: تفكك الخلية - قائمة المواد والكواشف.
Discussion
الخطوات المبينة في هذا البروتوكول توفر تفاصيل كافية للمبتدئين لوحة له / لها الثقافات الخلايا العصبية الخاصة على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف وسجل نشاط الشبكة. وهذا البروتوكول يساعد على ضمان أن الثقافات تلتزم بشكل صحيح، وتشكيل طبقة السجاد من الخلايا على صفائف القطب، وتبقى صحية والملوثة خالية لعدة أشهر.
على الرغم من أنه من الأفضل أن تلتزم جميع أجزاء البروتوكول، وهناك خطوات في جميع مراحل العملية التي تعتبر حاسمة في النتيجة الناجحة. استخدام تقنية العقيم طوال العملية برمتها أمر حتمي لمنع الثقافات من أن تصبح ملوثة. يجب أن تكون الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف جديدة ماء، كما هو موضح في البروتوكول، وإلا سوء التصاق الخلية سيؤدي. تجنب بيبتينغ قاسية وتشكيل فقاعات الهواء خلال التفكك سوف يقلل من عدد الخلايا التالفة مطلي وسوف يؤدي إلى عائد أعلى وأكثر صحة. التبديل من دمم 5/5 إلى دمم + بعد أولالتغذية هي أيضا مهمة. دمم 5/5 يحتوي على مصل الحصان، الأمر الذي سيسبب الخلايا الدبقية للسيطرة على الثقافة إذا ما استخدمت بشكل مستمر، وسوف يؤدي إلى ضعف نشاط الخلايا العصبية، على الرغم من أن الثقافات سوف تظهر صحية 17 . تغذية الثقافات كما كان مقررا وحفظها في ظروف احتضان المناسبة أمر بالغ الأهمية أيضا.
طلاء الثقافات الخلية على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف ينطوي على العديد من المتغيرات التي يمكن أن تؤدي إلى نتائج أقل من الأمثل. على الرغم من أن الهدف هو "السجاد" الكمال من الخلايا، والفشل في معالجة الخطوات الحاسمة المذكورة أعلاه يؤدي إلى ضعف نضج الخلايا أو في التلوث. ضعف التصاق الخلايا، والذي يختلف عن ضعف نضج الخلايا، هو أيضا مصدر قلق. يمكن أن يكون سبب ذلك عدة عوامل، بما في ذلك سوء إعداد ميي قبل الطلاء أو استخدام المتوسطة القديمة. إذا كان الوسيط القديم يحتوي على شكل مستقر من L- الجلوتامين والمكمل خالية من المصل لاستزراع الخلايا العصبية (انظر جدول المواد)، وتلتزم الخلايا في البداية ولكن ثم تطفو بعيدا بعد حوالي أسبوعين. إذا كان التلوث البكتيري هو مشكلة مستمرة، يمكن إضافة مضاد حيوي، مثل الأمبيسلين أو القلم، بكتيريا، إلى الوسط. وهناك أيضا مبيدات الفطريات المتاحة لعلاج التلوث الفطري. هذه هي بعض المتغيرات الأكثر شيوعا التي يمكن أن تؤثر على نتائج الثقافات. هناك العديد من الآخرين التي لن تواجه إلا بعد الوقت والخبرة.
بالمقارنة مع استخدام ميكرولترودس الزجاج، وهذه التقنية ممتازة لدراسة ديناميات الشبكة والاستجابات الدوائية. فإنه يتيح استخدام العديد من مختلف أنماط التحفيز المكاني والزماني ويسمح لتسجيل ردود الخلايا العصبية من مناطق متعددة في وقت واحد. وقد أظهرت المجموعات السابقة نتائج مثيرة للاهتمام باستخدام بروتوكولات مماثلة لتلك الموصوفة هنا 18 . منذ الثقافات تستمر لأسابيع أو أشهر، ويمكن إعادة استخدام نفس الثقافات، وهذه التقنية أيضا أيضاعف تجارب متعددة مع مرور الوقت على نفس الشبكة.
ومع ذلك، هناك قيود على هذه التقنية. الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف غير الغازية. لذلك، فإنها يمكن أن تسجل فقط النشاط خارج الخلية، بدلا من التصحيح لقط أو تسجيل داخل الخلايا مع ماصات. وعلاوة على ذلك، لأن كل قطب في صفيف يتم تغطيتها من قبل عدة خلايا، فإنه ليس من الممكن حل نشاط الخلايا العصبية واحدة. على العكس من ذلك، لأن هذه هي في المختبر الثقافات، فإنها لا يمكن أن تتكاثر تماما الخصائص الهيكلية للشبكات في الدماغ. أيضا، يمكن تسجيل النشاط فقط لمدة أقل من 30 دقيقة في وقت واحد دون بعض آلية توفير جو كو 2 للخلايا للحفاظ على توازن درجة الحموضة.
وبمجرد أن يتقن هذه التقنية، يمكن استكشاف التلاعب الدوائية مع أو بدون التحفيز الكهربائي. ويمكن أيضا تصميم بروتوكولات جديدة للتحقيق في التعلم وتكوين الذاكرة في الشبكات العصبية واختبارها، جنبا إلى جنب مع صروتوكولز لشبكات الحصين أو الحبل الشوكي. وقد تم نشر بروتوكولات لتحفيز وتدريب الشبكات سابقا، وبعضها تم تطويرها في بروتوكولات في الجسم الحي ، مثل "التكيف الانتقائي" التي اقترحها إيتان وآخرون. 19- تم اختبار العديد من البروتوكولات. ومع ذلك، فقط نتائج من تعديل لإجراء الكزاز التي اقترحها رورو في عام 2005 وترد هنا 14 ، 20 .
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية منحة كمي-1300007. نود أن نعترف أعضاء المختبر السابق، الذين ساعدوا في تصميم هذه البروتوكولات ومع الحفاظ على الثقافات لأكثر من خمس سنوات في جامعة جورج ميسون: الدكتور جوزيف J. بانكرازيو، الدكتور حامد شرخار، الدكتور غريتشن كناك ، والدكتور فرانز هاميلتون، ومايكل ماكيرا، وروبرت غراهام.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | Make 4 mg/mL aliquots |
| B-27 | Invitrogen | 17504-044 | Serum-free supplement for neural cell culture. Make 1 mL aliquots and freeze |
| Beakers - glass - 100 mL | VWR | 13912-160 | |
| Beakers - glass - 500 mL | VWR | 10754-956 | |
| Blunt-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 500365-G | |
| Cryogenic vial - sterile, 2 mL | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Cryogenic vial - sterile, 5 mL | Fisher Scientific | 10-500-27 | |
| DMEM with Glutamax | Gibco Life Technology | 10569-010 | Cell culture media that contains a stabilized form of L-glutamine |
| DNase | Worthington Biochemical | LK003172 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2030 | |
| Fine-tipped thumb forceps | World Precision Instruments | 501324-G | |
| Glass Pipets | VWR | 14673-010 | |
| GlutaMAX -- I (100X) | Gibco Life Technology | 35050-061 | A stabilized form of L-glutamine used as a suplement |
| Hemocytometer chip | Fisher Scientific | 22-600-101 | |
| Hibernate EB complete | BrainBits | D00118 | Ambient CO2 cell storage media |
| Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12195H | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
| MCS filter amplifier | MultiChannel System | FA60SBC | |
| MCS headstage/pre-amplifier | MultiChannel System | MEA1060-INV | |
| MCS microelectrode array | MultiChannel System | 60MEA200/10iR-ITO | |
| MCS power supply | MultiChannel System | PS20W | |
| MCS signal divider | MultiChannel System | SDMEA | |
| MCS stimulus generator | MultiChannel System | STG4002 | |
| MCS temperature controller | MultiChannel System | TC02 | |
| Media storage bottle - glass 500 mL | VWR | 10754-818 | Autoclave |
| Microcentrifuge tubes - 0.4 mL | Thermo Fisher | 3485 | Autoclave |
| Microcentrifuge tubes - 2 mL | Thermo Fisher | 3434ECONO | Autoclave |
| Micropipette tips - 10 μL | VWR | 37001-166 | Autoclave |
| Micropipette tips - 1,000 μL | VWR | 13503-464 | Autoclave |
| Micropipette tips - 200 μL | VWR | 37001-596 | Autoclave |
| Micropipetter - 10 μL | Thermo Fisher | 4641170N | |
| Micropipetter - 1,000 μL | Thermo Fisher | 4641210N | |
| Micropipetter - 200 μL | Thermo Fisher | 4641230N | |
| Papain - 0.22 Filtered | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Thermo Fisher | 15070063 | |
| Petri dishes -100 mm disposable | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Petri dishes -100 mm glass | VWR | 10754-788 | |
| Petri dishes -35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| Phosphate buffer saline (PBS) (1x) | Corning | 21-040-CV | |
| Plasma Cleaning System | Plasma Etch, Inc. | PE-50 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide (PDL) | Sigma Aldrich | P6407-5MG | |
| Polyethylene conical (centrifuge) tube -15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Polypropylene conical (centrifuge) tube -50 mL | Falcon | 352070 | |
| Procedure masks | Imco | 1530-imc | |
| Pyruvate | Sigma Aldrich | P4562-5G | |
| Scalpel blades | World Precision Instruments | 500237-G | |
| Scissors - iris | World Precision Instruments | 14111-G | |
| Scissors - large | World Precision Instruments | 14214 | |
| Scissors - small surgical | World Precision Instruments | 501733-G | |
| Serological pipette - sterile, 1 mL | VWR | 89130-892 | |
| Serological pipette - sterile, 2 mL | VWR | 89130-894 | |
| Serological pipette - sterile, 25 mL | VWR | 89130-900 | |
| Serological pipette - sterile, 50 mL | VWR | 89130-902 | |
| Software: Matlab GUI | Peixoto Lab | npeixoto@gmu.edu | Used to analyze .mat files. Available for free upon request. Contact npeixoto@gmu.edu to request a copy. |
| Software: MCS MC_Rack | MultiChannel System | N/A | Used for data acquisition |
| Software: NeuroExplorer | Plexon | http://www.plexon.com/products/neuroexplorer | Used to convert .nex files to .mat |
| Software: Offline Sorter | Plexon | http://www.plexon.com/products/offline-sorter | Used to sort neural spikes and convert data files to .plx and then to .nex |
| Software Manual: MCS MC_Rack | MultiChannel System | https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf | |
| Software Manual: NeuroExplorer | Plexon | https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf | |
| Software Manual: Offline Sorter | Plexon | www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf | |
| Spatula - small double-ended | World Precision Instruments | 503440 | |
| Stericup 0.22 µm pore filter - 250 mL | Millipore | SCGVU02RE | |
| Transfer pipette - large bore | Thermo Fisher | 335-1S | |
| Transfer pipette - small bore | Thermo Fisher | 242-1S | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | T8154-20ML | |
| Whatman filter paper | Whatman | 1442 150 | Cut into 8 pie wedges and autoclave in a glass Petri dish |
References
- Charkhkar, H., Frewin, C., et al. Use of cortical neuronal networks for in vitro material biocompatibility testing. Biosens Bioelectron. 53, 316-323 (2014).
- Bologna, L. L., Nieus, T., Tedesco, M., Chiappalone, M., Benfenati, F., Martinoia, S. Low-frequency stimulation enhances burst activity in cortical cultures during development. Neuroscience. 165 (3), 692-704 (2010).
- Fröhlich, F., McCormick, D. A. Endogenous electric fields may guide neocortical network activity. Neuron. 67 (1), 129-143 (2010).
- Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. Ephaptic coupling of cortical neurons. Nature Neurosci. 14 (2), 217-223 (2011).
- Ozen, S., Sirota, A., et al. Transcranial electric stimulation entrains cortical neuronal populations in rats. J. Neurosci. 30 (34), 11476-11485 (2010).
- Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation. J. Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).
- Shahaf, G., Marom, S. Learning in networks of cortical neurons. J. Neurosci. 21 (22), 8782-8788 (2001).
- Marom, S., Shahaf, G. Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: lessons beyond anatomy. Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).
- Marom, S., Eytan, D. Learning in ex-vivo developing networks of cortical neurons. Prog Brain Res. 147, 189-199 (2005).
- Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Luo, Q. Dynamics of learning in cultured neuronal networks with antagonists of glutamate receptors. Biophys. J. 93 (12), 4151-4158 (2007).
- Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Liu, M., Luo, Q. Characterization of synchronized bursts in cultured hippocampal neuronal networks with learning training on microelectrode arrays. Biosens Bioelectron. 22 (12), 2976-2982 (2007).
- Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. Network plasticity in cortical assemblies. Eur. J. Neurosci. 28 (1), 221-237 (2008).
- le Feber, J., Stegenga, J., Rutten, W. L. C. The effect of slow electrical stimuli to achieve learning in cultured networks of rat cortical neurons. PloS one. 5 (1), 8871 (2010).
- Ruaro, M. E., Bonifazi, P., Torre, V. Toward the neurocomputer: image processing and pattern recognition with neuronal cultures. IEEE Trans Biomed Eng. 52 (3), 371-383 (2005).
- Hamilton, F., Graham, R., et al. Time-Dependent Increase in Network Response to Stimulation. PloS one. 10 (11), 0142399 (2015).
- Guidelines for Euthanasia of Rodents Using Carbon Dioxide. , Available from: https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf (2016).
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells: Business Source. , MIT Press. Cambridge. (1998).
- Gullo, F., Maffezzoli, A., Dossi, E., Wanke, E. Short-latency cross-and autocorrelation identify clusters of interacting cortical neurons recorded from multi-electrode array. J. Neurosci. Methods. 181, 186-198 (2009).
- Eytan, D., Brenner, N., Marom, S. Selective Adaptation in Networks of Cortical Neurons. J. Neurosci. 23 (28), (2003).
- Bonifazi, P., Ruaro, M. E., Torre, V. Statistical properties of information processing in neuronal networks. Eur. J. Neurosci. 22 (11), 2953-2964 (2005).
