Summary
يصف لنا تقنية تجريبية رواية أن نسميه الحد الأدنى الغازية العضلات التضمين (MIME)، الذي يستند إلى الأدلة أن أنسجة العضلات الهيكلية تحتوي على خلايا شذوذ قابلة للتطبيق يمكن أن تسهل ميوجينيسيس خلية توسطت المانحة عند زرعها في عضلة مضيف.
Abstract
الهيكل العظمى والعضلات تمتلك قدرة التجدد بسبب المقيم في الأنسجة, مدرة من الألياف العضلية (شذوذ) الأقمار الصناعية خلايا (SCs)، التي يمكن أن تشكل ألياف العضلات جديدة تحت الظروف المناسبة. على الرغم من أن يمكن حصادها من أنسجة العضلات المنبوذة ومثقف في المختبر، الخلايا ميوبلاست الناتجة ليست فعالة جداً في تعزيز ميوجينيسيس عند زرعها في العضلات المضيف. جراحيا تعريض عضلة المضيف وترقيع أجزاء من أنسجة العضلات المانحة، أو ألياف العضلات معزولة مع تلك الطوائف المنبوذة على المضيف والعضلات، وتعزز ميوجينيسيس أفضل مقارنة بزرع ميوبلاست. قمنا بتطوير تقنية رواية التي نسميها الحد الأدنى الغازية العضلات التضمين (MIME). MIME ينطوي على تمرير إبرة جراحية من خلال العضلات المضيف ورسم قطعة من الأنسجة العضلية المانحين من خلال مسار الإبرة ثم ترك الأنسجة المانحة جزءا لا يتجزأ من العضلة المضيف حيث أنها قد تكون بمثابة مصدر للطوائف المنبوذة للعضلات المضيف. هنا يصف لنا بالتفصيل الخطوات التي تشترك في أداء MIME في طراز ماوس العوز التي تعرب عن بروتين فلوري أخضر (التجارة والنقل) في جميع خلاياه. نقص المناعة المكتسب في الماوس المضيف يقلل من خطر الرفض المناعي للأنسجة المانحين، وتعبير بروتينات فلورية خضراء يتيح سهولة تحديد المضيف ألياف العضلات (بروتينات فلورية خضراء +) والمستمدة من الخلية المانحة ألياف العضلات (بروتينات فلورية خضراء-). لدينا البيانات التجريبية تشير إلى أنه يمكن استخدام MIME زرع عضلة طويلة (مؤسسة كهرباء لبنان) أصابع باسطة من ماوس مانحة في العضلات (تا) الظنبوبي الأمامي على فأرة الحاسوب المضيف. البيانات المتوفرة لدينا تشير أيضا إلى أنه عندما يتم حقن ميوتوكسين (كلوريد الباريوم، BaCl2) في العضلات المضيف بعد MIME، هناك أدلة ميوجينيسيس المستمدة من الخلية المانحة في العضلات المضيفة، مع حوالي 5%، 26%، 26% و 43% من الألياف في مضيف واحد تا العضلات تظهر لا مساهمة المضيف والمضيفة أدنى مساهمة، ومساهمة المضيف معتدلة ومساهمة المضيف القصوى، على التوالي.
Introduction
صحة الهيكل العظمى والعضلات، حتى ولو بعد الانقسامية، تمتلك قدرة التجدد ممتازة بسبب وجود خلايا الأنسجة-المقيم شذوذ المعروفة باسم الخلايا الأقمار الصناعية (المنبوذة)1،2؛ واستعرضت في3،4. غير أن الظروف المرضية الناجمة عن ضمور العضلات، الصدمات النفسية أو الشيخوخة المتسارعة، وتجديد العضلات قد لا مواكبة انهيار العضلات، وهكذا، يحدث فقدان الألياف العضلية التدريجي5. على الرغم من أن قد وضعت أساليب فعالة لعزل الطوائف المنبوذة من العضلات وتوسيعها في الثقافة لتوليد إعداد كبيرة من ميوبلاستس (وفي وقت لاحق myotubes)، قد محاولات لتوليد الأرقام ذات الصلة فسيولوجيا من ألياف العضلات في العضلات المضيف أسفرت عن نجاح الحد الأدنى فقط6. كما مع العديد من أنواع الخلايا الأخرى، عندما يتم حقن myoblasts وحدها في أنسجة المضيف، ومعظم الخلايا لا انجرافت7،8. وقد أظهرنا أن التحفيز الكهربائي العضلية (NMES) يسهل ميوجينيسيس المستمدة من الخلية المانحة في العضلات الماوس المضيفة تفتقر إلى التجديد التي تم حقن مع ميوبلاستس البشرية8. الآخرين قد أثبتت أن العضلات فحص تطعيم جراحيا أو ألياف العضلات واحدة مع الطوائف المنبوذة المرفقة، تيسير ميوجينيسيس معتدلة حتى بدون NMES، مما يوحي بأن غرس كله ألياف العضلات مع الطوائف المنبوذة قد يكون أكثر فائدة من غرس شذوذ الخلايا وحدها9،10. منذ الجهات المانحة أو أنسجة العضلات هندسيا المطعمة في العضلات المضيف تنتج نتائج أفضل من زرع الخلايا وحدها، فمن الممكن أن الأنسجة أو هياكل مثل الأنسجة قد توفير إشارات حاسمة من أجل engraftment الخلية المانحة؛ مفهوم الذي يتضح بشكل متزايد في علاج الخلايا دراسات تشمل الخلية مختلف أنواع10،،من1112.
البيانات الأخيرة تشير إلى أن الطوائف المنبوذة التي تم الحصول عليها من البشر أكثر من أسبوعين بعد الوفاة توليد ميوتوبيس في الثقافة13. ولذلك نحن عازمون على تقييم ما إذا كان سيتم عكس غرس العضلات أنسجة تحصد الجثة إلى مضيف معيشة فقدان الألياف العضلية. قمنا بتطوير تقنية جديدة تسمى MIME زرع أنسجة العضلات المانحة إلى أنسجة العضلات الهيكلية من مضيف المعيشة من أجل تعزيز ميوجينيسيس المستمدة من الخلية المانحة. MIME ينطوي على تمرير إبرة جراحية من خلال العضلات المضيفة لإنشاء مسار إبرة؛ رسم شريحة صغيرة من أنسجة العضلات المانحة خلال المسار إبرة؛ ترك الأنسجة المانحة جزءا لا يتجزأ من العضلات المضيفة؛ وإغلاق الثقوب إبرة مع لاصق الأنسجة. بعد ممارسة هذا الأسلوب في الفئران euthanized درس في تجارب أخرى، الآن بإجراء MIME في الفئران الحية التي العوز ونعرب عن أوبيكويتوسلي بروتين فلوري أخضر (التجارة والنقل)، والمتابعة في 3 و 14 يوما بعد انتهاء MIME. في MIME بعد 3 أيام، ونحن نؤكد أن المانحين الماوس (بروتينات فلورية خضراء-) مؤسسة كهرباء لبنان العضلات مزروع في الماوس المضيف (بروتينات فلورية خضراء +) تا العضلات، يظل جزءا لا يتجزأ من العضلات المضيف. في MIME بعد 14 يوما، بعد إصابة ميوتوكسين2 BaCl للحث على الأضرار وميوجينيسيس، أننا نؤكد أن حوالي 5%، 26%، 26% و 43% من الألياف في مضيف واحد العضلات تا إظهار لا مساهمة المضيف، مساهمة المضيف الحد الأدنى، والمضيف معتدل مساهمة، والأعلى مساهمة، المضيف على التوالي. ويعتبر التنو المركزية (علامة انحطاط وتجديد لاحقة) في حوالي 95% ألياف العضلات تا بعد حقن MIME وميوتوكسين.
نحن دراسة العضلات تا 14 يوما بعد MIME + BaCl2 لأن هذه النقطة من الوقت يلتقط المرحلة المتوسطة للتجديد، عندما يتم مركزياً المنبسطة أغلبية من الألياف المجددة. نقوم بدراسة التجارة والنقل + الفئران كمضيفين ل MIME، حتى أنه عندما نحن في نهاية المطاف زرع الأعضاء البشرية العضلات المأخوذة في الفئران المضيف، أننا سوف تكون قادرة على سهولة التمييز بين ألياف العضلات من أصل البلدان المضيفة والمانحة. نحن استخدام الماوس العضلات مؤسسة كهرباء لبنان الأنسجة المانحة التجريبية، حيث أظهرت الألياف واحدة من هذه العضلة إمكانات شذوذ أكبر من العضلات تا9. عضلة مؤسسة كهرباء لبنان هو أيضا التآزري للعضلات تا وتكوين الألياف من نوع مماثل. أن البيانات الأولية تشير إلى أن MIME قادرة على تيسير ميوجينيسيس المستمدة من الخلية المانحة في العضلات المضيف.
Protocol
جميع الدراسات التي تنطوي على الحيوانات الحية معتمدة من قبل "مؤسسة رعاية الحيوان" واستخدام اللجنة (إياكوك) في جامعة ولاية وأين، ديترويت، ميشيغان، الولايات المتحدة الأمريكية، وهي وفقا لدليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية ( الطبعة الثامنة، عام 2011، التي نشرتها "الصحافة الأكاديميات الوطنية"، 500 الخامس شارع، NW، Lockbox 285، واشنطن، العاصمة 20055، الولايات المتحدة الأمريكية). وفقا للبروتوكولات المعتمدة IACUC، أجريت الإجراءات التي تنطوي على الألم و/أو الشدة تحت التخدير العام، الذي فعل وصيانته باستنشاق إيسوفلوراني (1.5-5% إلى تأثير). تم التحقق من التخدير بعدم الانسحاب إلى أخمص القدمين قرصه، وعدم وجود بالبيبرال أو الردود بيبرس (وقد زادت نسبة isoflurane حسب الحاجة للحفاظ على الأثر). نظراً لطبيعة البروتوكولات، مينيملي " نصائح العقيمة " كان يتبع أسلوب. بينما الحيوانات تحت التخدير، تم تطبيق هلام البترول للعين لمنع جفاف. لا توجد علاجات خاصة كانت المطلوبة؛ ومع ذلك، قدم جل النظام الغذائي للحيوانات ل 24 ساعة عقب الإجراءات التي تنطوي على التخدير العام. وافقت المحقق IACUC حجب التسكين بعد MIME، منذ الإجراء لا ينطوي على تعريض جراحيا المضيف العضلات، لأنها تقتصر على اللكتات أحد ولا تؤثر على وظيفة طبيعية، ونظرا لأن العديد من الأدوية مسكن مشترك من المعروف أن تؤثر على التجدد الطبيعي العضلات.
1. نماذج حيوانية
- الفئران المضيف ل MIME
- الفئران استخدام مجموعة موردي المواد النووية-التجارة والنقل (8-10 أسابيع، الذكور) كمضيفين للعضلات ترقيع الدراسات-
ملاحظة: هذه الفئران تستضيف مثالية ترقيع العضلات متمكنة لأنها تفتقر إلى اللمفاويات T و B الناضجة والخلايا القاتلة الطبيعية الوظيفية، وتعاني من نقص في إشارات سيتوكين، وقد استخدمت قبل الآخرين لخلايا العضلات غير اللوجرافتينج أو إكسينوجرافتينج < سوب الطبقة = "xref" > 14. تعبير بروتينات فلورية خضراء في كل مكان يسمح لسهولة تحديد المضيف (بروتينات فلورية خضراء +) والمستمدة من الخلية المانحة (بروتينات فلورية خضراء-) ألياف العضلات.
- الفئران استخدام مجموعة موردي المواد النووية-التجارة والنقل (8-10 أسابيع، الذكور) كمضيفين للعضلات ترقيع الدراسات-
- الفئران المانحة ل MIME
- استخدام C57BL/6J الفئران (12-16 أسبوع) كالفئران المانحة.
ملاحظة: هذه الفئران هي الفئران المانحة مناسبة لأنها جينوم الكامل معينة، وليست معروفة لدى أي أمراض الهيكل العظمى والعضلات، متاحة بسهولة واقتصادا، ولا تعبر عن التجارة والنقل-
- استخدام C57BL/6J الفئران (12-16 أسبوع) كالفئران المانحة.
2. إعداد "أنسجة العضلات المانحة"
- "ربط خيوط التوجيهية" وحصاد المانحة مؤسسة كهرباء لبنان العضلات
- Euthanize الفئران المانحين بالتفسخ عنق الرحم وثوراكوتومي تحت التخدير العام التي يديرها الطاولة المرذاذ isoflurane مدفوعا بالأوكسجين الطبي (isoflurane المستنشقة؛ 2-5% إلى تأثير). استخدام
- للحصول على العضلات، ومؤسسة كهرباء لبنان زوج من مقص الجراحة لفتح الجلد على السطح الأمامي للساق. موقع تا العضلات في الساق الأمامية وإزالته لتصور العضلات مؤسسة كهرباء لبنان الذي يقع خلف العضلات تا. الشريحة غيض من زوج من الملقط خلف العضلات مؤسسة كهرباء لبنان وتطبيق الجر لطيف لرؤية إذا كان تمديد الأصابع (وهذا يؤكد أن العضلات هو مؤسسة كهرباء لبنان).
ملاحظة: ينبغي أن يكون مجال الأنسجة المانحة جراحيا، أسيبتيكالي هيأهم قبل الحصاد. - استخدام ~ شرائح 10 سم من الحرير 4-0 وخياطة مجدول، غير الامتصاص، عقيمة، وجعل اثنين عقده مزدوجة لتطبيق خيوط التوجيهية على الأوتار الدانية والبعيدة للعضلات مؤسسة كهرباء لبنان. ( الشكل 1A).
- قطع وتر مؤسسة كهرباء لبنان القاصي وتعكس العضلات مؤسسة كهرباء لبنان وقطع وتر الدانية.
- مكان عضلات الجهة المانحة مؤسسة كهرباء لبنان في طبق بتري مليئة بحل المسابقة الماوس.
3. إعداد "الفئران المضيف" MIME
- التخدير
- ضع الماوس المضيف تحت التخدير العام (isoflurane المستنشقة؛ 1.5-5% إلى تأثير) تديرها المبخر isoflurane منضدية مدفوعا بالأوكسجين الطبي- حمل التخدير في دائرة التعريفي
- وثم نقل الماوس إلى مخروط آنف للحفاظ على التخدير أثناء تنفيذ إجراءات أخرى على الحيوان. تقديم الدعم الحراري مع جل متحاور تدفئة وسادة بينما الحيوان تحت التخدير.
- إعداد الجلد
- لإزالة هذا الحيوان ' s الفراء، تطبيق كريم مزيل الشعر على الجانب الأمامي من الساق الخلفية اليسرى. الساق اليمنى بمثابة ساقه تحكم للإجراءات اللاحقة-
- إجازة كريم مزيل الشعر على للحد الأدنى 2 نظيفة قبالة كريم مزيل الشعر جنبا إلى جنب مع فصل الفراء مع مناديل غارقة في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). وبعد إزالة الفراء، فرك الجلد بمناديل التناوب ثلاثة من الإيثانول الحل و 70% تنقية بوفيدون-
- إنشاء مسار إبرة في العضلات تا المضيف
- يمر (طويل في 1) 18-قياس إبرة جراحية من خلال مركز البلد المضيف العضلات تا على طول العضلات ' s المحور الطويل ( الشكل 1B). تمرير الإبرة في اتجاه سيفالو والذيلية، وعلى طول العضلات تا، ومن خلال مركز البطن العضلات ( الشكل 1B).
ملاحظة: الغرض من هذه الخطوة هو لإنشاء مسار إبرة، الذي قد يكون مضمناً قطعة من العضلات المانحة. تضمين الأنسجة المانحين في وسط العضلات تا يحتمل أن يسمح المنبوذة من الأنسجة المانحة الهجرة وتسهيل ميوجينيسيس عبر المضيف كامل العضلات تا-
- يمر (طويل في 1) 18-قياس إبرة جراحية من خلال مركز البلد المضيف العضلات تا على طول العضلات ' s المحور الطويل ( الشكل 1B). تمرير الإبرة في اتجاه سيفالو والذيلية، وعلى طول العضلات تا، ومن خلال مركز البطن العضلات ( الشكل 1B).
- الأنسجة المانحة تضمينها في مسار إبرة المضيف العضلات تا
- بمجرد الإبرة الجراحية داخل البلد المضيف العضلات تا، تمرير خيوط التوجيهية في نهاية واحدة من الأنسجة المانحين من خلال التجويف الإبرة الجراحية في الاتجاه الرأسي كيودو ( الشكل 1).
- رسم الأنسجة المانحين من خلال المسار إبرة كما يتم سحب الإبرة من العضلات المضيف تا في اتجاه الرأسي كيودو.
- استخدام خيوط التوجيهية في نهايات الأنسجة المانحة والذيلية والرأسي لضبط موضع الأنسجة المانحين. ضمان أن يتم متخفيين الأنسجة المانحة داخل البلد المضيف تا العضلات ( الشكل 1).
- بمجرد وضع الأنسجة المانحة هو الأمثل، قطع خيوط التوجيهية، جعل أي تعديلات نهائية على وضع الأنسجة المانحة مع غرامة ذات الرؤوس الملقط.
- ختم الجلدي إبرة الجراح ( 1E الرقم -و) بتقارب على حافة الجرح بالملقط وتطبيق لاصق الأنسجة البيطرية بطرف إبرة جراحية 27-قياس.
4. حقن ميوتوكسين العضلي للحث على ضمور العضلات متضافرة والتجديد
- بعد MIME، بحقن 50-60 ميليلتر من 1.2% BaCl 2 (ميوتوكسين) للحث على الأضرار واسعة النطاق من الألياف العضلية في العضلات المضيف المضيف العضلات تا و الأنسجة المانحة المضمنة ضمنه 15.
- حقن BaCl 2 في 3 مواقع على طول المضيف تا العضلات (القريبة والمتوسطة والبعيدة ثلث البطن العضلات)-
ملاحظة: حقن ميوتوكسينس مثل BaCl 2 وكارديوتوكسينس ونوتيكسين في الهيكل العظمى والعضلات يدفع الضرر الألياف العضلية متضافرة متبوعاً بتجديد 16-
- حقن BaCl 2 في 3 مواقع على طول المضيف تا العضلات (القريبة والمتوسطة والبعيدة ثلث البطن العضلات)-
5. رعاية الحيوان الإجرائية بعد
- بعد MIME وحقن 2 BaCl، تنظيف الماوس المضيف ' s هند اليسرى في الساق مع الإيثانول وتطبيق طبقة رقيقة من الفازلين لحماية البشرة.
- بعد العناية بالبشرة بعد إجرائي، إزالة الماوس المضيف من مخروط الآنف.
- ضع الماوس في قفص انتعاش الانفرادي دون فراش. تقديم الدعم الحراري للحيوان يتعافى من خلال لوحة تدفئة جل متحاور توضع تحت نصف القفص الانتعاش.
ملاحظة: واحد نصف لا يسخن حتى هذا الحيوان قد التحرك بعيداً عن لوحة تدفئة إذا لزم الأمر- - بعد الماوس المضيف وتعافي تماما من التخدير، يعود الحيوان إلى قفصة الأصلي. ضع ظهر الحيوان في منشأة الحيوان حتى يتم إجراء التجارب المتابعة. رصد الماوس المضيف يوميا حتى يكون جاهزاً للمتابعة – مثال: في 3 أو 14 يوما بعد انتهاء MIME. عقب MIME، الحيوانات تخضع العاملين في المختبرات، وكذلك موظفي الطب البيطري – هذا ينطوي أساسا على تقييم إذا كانت الحيوانات مشرق والإنذار والاستجابة؛ وكذلك تقييم حالة الحيوانات تظهر علامات العلني من الألم أو صعوبة الانتقال والتغذية والشرب والاستمالة.
6. جمع الأنسجة
- حصاد المضيف العضلات
- Euthanize الفئران المضيف بالتفسخ عنق الرحم وثوراكوتومي تحت التخدير العام التي يديرها المبخر isoflurane منضدية مدفوعا بالأوكسجين الطبي ( إيسوفلوراني المستنشق؛ 2-5% إلى تأثير). قد المحقق أيضا الموافقة على IACUC للحصاد تا العضلات تحت التخدير العام قبل القتل الرحيم.
- للوصول إلى المضيف تا العضلات، استخدام زوج من مقص الجراحة لفتح الجلد على السطح الأمامي للساق. تحديد موقع العضلات تا في الساق الأمامية وقطع وتر القاصي، تعكس العضلات وقص العضلات الدانية المرفقات (انظر الفرع 2-1)-
- جمع اليسار (تجريبية) وحق (تحكم) تا عضلات.
- المفاجئة عضلات المقطوع تجميد
- وزن العضلات المقطوع بوضع على وزن الورق ويزن مقياس. باختصار تراجع
- العضلات في الزيوت المعدنية كريوبروتيكتيون. لطخة قبالة فائض من النفط- العضلات
- مكان في رقائق الألومنيوم، والأداة تجميد العضلات بسرعة أغرق لهم في النتروجين السائل ملء ديوار. نقل العينات إلى المسمى كريوفيالس وتخزين العينات في ثلاجة-80 درجة مئوية لدراسات لاحقة-
7. دراسات نسيجية
- كريوسيكتيونينج النسيج العضلي لجمع المقاطع العرضية المسلسل
- نقل العينات من الثلاجة-80 درجة مئوية إلى كريوستات بوضعها في ديوار المحتوية على النتروجين السائل.
- في كريوستات، التعامل مع عينة واحدة في وقت واحد. مع شفرة حلاقة باردة (بليد المخزنة في كريوستات)، قطع العينة مرتين في منتصف بطن عضلة تا لإنتاج جزء من العضلات التي حوالي 1-2 مم. الاحتفاظ بهذا الجزء لصنع المقاطع كريوستات وإرجاع الأجزاء المتبقية من العضلات لما كريوفيال-
- مع قطع الأمثل درجة الحرارة (OCT) تجميد مجمع، تأمين الجزء السميك من الأنسجة على قرص عينة كريوستات. ضع القرص العينة على صاحب العينة.
- الخام-الوجه العينة بقطع المقاطع 20 ميكرومتر. جمع بضعة أبواب ميكرومتر 20 على الشرائح الزجاجية للأبواب كريوستات.
- وإذا كانت جودة الأقسام 20 ميكرومتر مرضية، تغيير سمك القطع إلى 5 ميكرومتر وجمع بعض الأقسام لتقييم النوعية. في حالة مرضية في نوعية المقاطع 5 ميكرومتر، جمع مقاطع المسلسل. جمع الأجزاء 2-3 كل شريحة، وجمع ما يكفي المقاطع للشرائح 3-
- جمع مقاطع من التجريبية (يسار) والتحكم (يمين) تا عضلات كل حيوان.
- التعبير "دراسة التجارة والنقل"
ملاحظة: تعيين مجموعة واحدة من الشرائح المعدة (القسم 7.1) لدراسة التعبير بروتينات فلورية خضراء في ألياف العضلات. تطبيق ~ 50 ميليلتر من المتوسطة تتلاشى المضادة على الأقسام- وتطبيق ساترة من زجاج. ختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر واضح.
- استخدام مجهر فلوري والضوء (انظر الجدول للمواد)، دراسة المقاطع مع 10 × الهدف ومرشح مناسب لتصور التجارة والنقل.
- جمع الصور الرقمية (~ 15) تداخل الحقول البصرية لتغطية القسم عبر كامل عضلة تا. جمع الصور على النقيض المرحلة لكل حقل من الحقول البصرية عن طريق التحول من الأسفار إلى مرحلة وضع التباين في المجهر.
- فتح الصور مع برنامج تصوير مناسبة التي يمكن تجانب الصور الفردية لإنتاج صورة مركبة واحدة؛ مثلاً، استخدام " الدمج الصوري " الخيار ضمن "القائمة ملف" في برنامج أخذ الصور المدرجة في الجدول للمواد-
- فتح الصور fluorescence بروتينات فلورية خضراء مع برمجيات تحليل صورة مناسبة (مثلاً، إيماجيج). دائرة ألياف العضلات الفردية باستخدام " دوروا أداة " وسجل "كثافة Fluorescence يعني" لكل الألياف.
- حساب كثافة "التجارة والنقل كحد أقصى" (الأسفار) بأخذ متوسط "كثافة Fluorescence يعني" الألياف 10 التي تظهر ارتفاع بروتينات فلورية خضراء التعبير ومورفولوجيا العادي. حساب % "كثافة التجارة والنقل كحد أقصى" لكل الألياف بتقسيم "كثافة التنوير يعني" لكل الألياف "كثافة التجارة والنقل كحد أقصى" وضرب 100. جدولة نتائج تحليل التجارة والنقل لكل العضلات تا كما هو موضح في الشكل 3 أي.
- دراسة موقع النزاهة وميونوكلير الألياف العضلية بوصفها إيمونوفلوريسسينت من ديسمين و 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)، على التوالي.
ملاحظة: تعيين مجموعة واحدة من الشرائح، على النحو المذكور أعلاه، استعداد لدراسة العلامات ديسمين في ألياف العضلات. الأقسام- الإصلاح مع بارافورمالدهيد 2% في برنامج تلفزيوني للحد الأدنى 10 يغسل المقاطع ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
تنبيه: ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (معدات الوقاية الشخصية) عند التعامل مع عند التعامل مع بارافورمالدهيد. - أقسام كتلة مع 3% ألبومين المصل البقري المخفف في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.01 ٪ X100 تريتون لمدة 30 دقيقة. ويشار إلى الآخرة كهذا الحل حظر مخفف الابتدائية-
- تضعف جسم ديسمين مكافحة الأرانب ز (IgG) في مخفف الأولية (1: 200)-
- بعد عرقلة اكتمال، تطبيق الأجسام المضادة الأساسي المخفف على الأقسام واحتضان بين عشية وضحاها في ثلاجة في ~ 4 ° C. الغسيل المقاطع مرة واحدة (5 دقائق) مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1% X-100 تريتون. هذا الحل ويشار إلى الآخرة كالمخزن المؤقت الغسيل الأول.
- تغسل الأجزاء 3 مرات (5 دقيقة للمياه والصرف الصحي) مع برنامج تلفزيوني.
- تحضير الأجسام المضادة الثانوية بتمييع الماعز المضادة لأرنب مفتش (مترافق بصبغة الفلورسنت الأحمر) في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.01 ٪ Triton X-100-
- تطبيق جسم الثانوي المخفف على الأقسام واحتضان في درجة حرارة الغرفة (~ 23 درجة مئوية) على 60 دقيقة أغسل
- المقاطع مرة واحدة (5 دقائق) مع المخزن المؤقت الغسيل الأول. تغسل الأجزاء 3 مرات (5 دقيقة للمياه والصرف الصحي) مع برنامج تلفزيوني. أغسل
- تطبيق DAPI للحد الأدنى 3 الأقسام 3 مرات (1 دقيقة لكل المياه والصرف الصحي) مع برنامج تلفزيوني. تطبيق ~ 50 ميليلتر المتوسطة المضادة تتلاشى في الفروع وتطبيق ساترة زجاجية. ختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر واضح.
- استخدام مجهر فلوري والضوء (انظر الجدول للمواد)، دراسة صبغ مقاطع المسلسل مع 10 × الهدف ومرشح مناسب لتصور الأحمر نيون.
- جمع الصور الرقمية (~ 15) الحقول البصرية المتداخلة لتغطية القسم عبر كامل عضلة تا. جمع صور fluorescence DAPI وضع العلامات لكل حقل من الحقول البصرية عن طريق التحول إلى إعداد عامل التصفية المناسب.
- فتح وتحليل الصور باستخدام برنامج تصوير مناسبة كما هو موضح في الخطوات 7.2.3-7.2.4-
ملاحظة: دراسة الصور لتحديد، ألياف العضلات التي تكون معطوبة (ديسمين السلبية)، ألياف العضلات التي التنو المركزية (ديسمين إيجابية الألياف التي لها أنوية المسمى DAPI يقع داخليا بدلاً من محيطيا)، والمجالات التي للقسم التهاب و/أو التليف (في المناطق التي لديها العديد من أنوية المسمى DAPI تتجمع معا، ولكن تخلو ألياف العضلات)-
- الإصلاح مع بارافورمالدهيد 2% في برنامج تلفزيوني للحد الأدنى 10 يغسل المقاطع ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
Representative Results
وترد الجهة المانحة مؤسسة كهرباء لبنان التي يتم زرعها قبل MIME MIME بعد 3 أيام، داخل حجرة العضلات تا المضيف (الشكل 2A–ج). كما هو متوقع، المقاطع العرضية للعضلات تا من الفئران المانحين، درس تحت البصريات الأسفار، وعدم إظهار الفلورية الخضراء نظراً لأنها لا تعبر عن التجارة والنقل (الشكل 2D). وفي المقابل، إظهار المقاطع العرضية للعضلات تا من الفئران المضيف التي يتم زرعها لا مع الأنسجة المانحين، الفلورية الخضراء موحدة في ألياف العضلات تا، كما الألياف التعبير عن التجارة والنقل (الشكل 2E). في المقاطع العرضية للعضلات مزروع ب MIME مع أنسجة العضلات المانحة، هناك خط ترسيم الحدود بين ألياف العضلات المضيف (بروتينات فلورية خضراء +) وألياف العضلات المانحة (بروتينات فلورية خضراء-). تعرض الصور على النقيض المرحلة الحقول البصرية المعروضة في 2D الرقم–و في الشكل 2E'–و' ، وتشير إلى أن هناك بالفعل ألياف العضلات الموجودة في المناطق حيث يوجد لا التجارة والنقل إشارة.
في MIME بعد 14 يوما وحقن2 BaCl، عن طريق دراسة عبر التسلسلي غير مسمى الأقسام عضلة تا التي تركت أو المسماة بالأجسام المضادة إلى ديسمين (الشكل 3)، ونحن نعلم أن يعبر عن إشارة التجارة والنقل بجميع ألياف العضلات في العضلات غير المعالجة من الفئران المضيف، ولكن ليس في العضلات تعامل MIME (وسم ديسمين الأحمر يكشف ألياف العضلات قابلة للتطبيق). العضلة المضيف تا تعامل مع حقن2 MIME و BaCl، ميوجينيسيس المستمدة من الخلية المانحة يتضح من وجود الكثير من ألياف العضلات desmin(+) التي تظهر أي إشارة بروتينات فلورية خضراء لا يمكن اكتشافها (الشكل 3–د، ج 3 ' –د'). ويمكن الكشف عن تشيميريك ألياف العضلات الناجمة عن انصهار المحتمل للخلايا المضيفة والمانحة شذوذ من المنخفض إلى مستويات معتدلة من الأسفار التجارة والنقل التي أظهرتها هذه الألياف. تظهر العديد من ألياف تشيميريك عبر قطر كامل تا العضلات مما يوحي بأن الجهة المانحة المنبوذة قادرة على ترحيل عدة مئات من ميكرون داخل ابيميسيوم عضلة المضيف. ويبين كوانتيتيشن للتجارة والنقل + ألياف 3E الشكل. ويبين الشكل 4 تضخم عالية صور من مقاطع المسلسل أكمله MIME + BaCl2 تعامل تا العضلات.
الشكل 1 . الخطوات المتضمنة في الحد الأدنى الغازية العضلات التضمين (MIME).
MIME تتم تحت التخدير العام. أنها تنطوي على وضع ~ 10 ملغ من المانحين العضلات (الماوس المانحة مؤسسة كهرباء لبنان) في حل المسابقة وربط خيوط التوجيهية لأطرافه (A). إبرة عيار 18 يتم تمريرها من خلال المحور الطويل للعضلات المضيفة (ب) ويتم رسمها الأنسجة المانحين من خلال المسار إبرة (ج). الأنسجة المانحة اليسار مضمن في العضلات المضيف (د)وهي قطع خيوط التوجيهية والثقوب إبرة مختومة بمادة لاصقة الأنسجة (ه). يتم الإشارة إلى الجراح إبرة مختومة مع الأسهم (F). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . دراسات عضلة تا 3 أيام بعد MIME.
العضلات المضيف التي تم جمعها بعد MIME؛ 3 أيام ملاحظة إبرة علامات على المضيف تا (الأسهم؛ أ-ب). وتؤكد البيانات كذلك أن الماوس المانحة مضمن مؤسسة كهرباء لبنان هو متخفيين داخل حجرة العضلات تا (ب-ج). صور الأسفار للعضلات تا إظهار المقاطع العرضية لا الفلورية الخضراء في العضلات تا البرية من نوع (د)والأسفار الأخضر الساطع في العضلات "تا" مجموعة موردي المواد النووية-التجارة والنقل (ه)تمييز بين الحكومات المضيفة والمانحة العضلية في العضلات "تا" مجموعة موردي المواد النووية-التجارة والنقل في 3 أيام بعد MIME (F). الصور التباين المرحلة الحقول البصرية في د إف ترد في د 'و'، على التوالي. الخط الأحمر في اللوحات و وو ' يظهر خط ترسيم الحدود بين الأنسجة المضيفة والمانحة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . دراسات للعضلات تا 14 يوما بعد MIME.
جمع بيانات 14 يوما وترد MIME بعد. إشارة حمراء من وسم إيمونوفلوريسسينت من ديسمين (إشارة إيجابية ديسمين تعني أن ميوفيبيرس قابلة للتطبيق)، إشارة زرقاء DAPI (البقع نوى)، وإشارة خضراء من التجارة والنقل. في "تا التحكم" العضلات (حق اللكتات) تحصد من الماوس المضيف، كما هو متوقع، ميوفيبيرس ما يقرب من جميع الإيجابية ديسمين، مما يوحي بأن هذه ميوفيبيرس قابلة للتطبيق (A؛ إشارة حمراء). بالإضافة إلى ذلك، استناداً إلى تلطيخ DAPI، فمن الواضح أن ميونوكلي من ميوفيبيرس كلها تقريبا تقع محيطيا، كما هو متوقع في العضلات صحية (A؛ إشارة زرقاء). وتظهر المقاطع المسلسل عضلة "التحكم تا" أن ما يقرب من جميع ألياف العضلات أخضر ساطع، مما يعني ضمناً أن تكون إيجابية بالنسبة للتجارة والنقل. في MIME + BaCl2 -تعامل تا العضلات (اليسار اللكتات)، ميوجينيسيس خلية توسطت المانحة يتضح من وجود الكثير من ألياف العضلات desmin(+) التي تظهر لا يمكن كشفها fluorescence بروتينات فلورية خضراء (د ج، ج '-د'). ألياف العضلات Desmin(+) مع منخفضة إلى معتدلة بروتينات فلورية خضراء الفلورية (ألياف العضلات تشيميريك) موجودة عبر قطر العضلات تا كامل، مما يوحي بأن MIME توفر الجهات المانحة المنبوذة التي يمكن أن تهاجر داخل ابيميسيوم عضلة تا وتعزيز ميوجينيسيس المستمدة من الخلية المانحة. أ '--D' صور عالية التكبير من مناطق داخل مربعات زرقاء في ألف-دال وترد كوانتيتيشن من ألياف GFP(+) وألياف الأنوية مركزياً في ه. تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر (أ-د) و 50 ميكرون (A '-د'). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
rc="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55731/55731fig4.jpg"/>
الشكل 4 . أدلة على أضرار واسعة النطاق والتجديد 14 يوما بعد حقن2 MIME و BaCl.
تضخم عالية، يتم عرض المقاطع العرضية المسلسل أكمله MIME + BaCl2 تعامل تا العضلات. وتشير البيانات إلى أن الكثير من ألياف العضلات، ومعتدلة أو بشدة بروتينات فلورية خضراء + قد يقع نوى (أ-ب؛ والأحمر إشارة في ألف من ديسمين وإشارة زرقاء في ألف من DAPI، وإشارة خضراء في ب من التجارة والنقل). تشير هذه البيانات إلى أن الانحطاط وتجديدها بعد حقن2 BaCl لا يؤثر على التعبير التجارة والنقل. وفي هذا السياق، تقترح وجود ألياف العضلات الأنوية مركزياً في MIME + BaCl2 تعامل تا العضلات، مع القليل إلى أي تعبير بروتينات فلورية خضراء، أن هذه الألياف هي النتيجة المحتملة ميوجينيسيس (أو التجديد) مع مساهمة كبيرة من بروتينات فلورية خضراء-شذوذ الخلايا. يمكن التحقق هذه الملاحظات كذلك في الصور التكبير عالية من الحقول المحددة (ج-F؛ جيم ودال وهاء وواو، على التوالي، هي تداخل مناطق من المسلسل المقاطع العرضية؛ الترميز باللون لحدود الصورة تدل على موقع تلك المناطق في A و B). تغيير حجم أشرطة = 100 ميكرومتر (أ-ب) و 50 ميكرون (ج-F). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
نقدم هنا، بروتوكول مفصل لتقنية تجريبية الرواية المعروفة MIME، نمواً في المختبر، زرع أنسجة العضلات المانحة إلى أنسجة العضلات المضيف. وهذا هو تكييف العضلات مفتوحة تطعيم الأسلوب الذي قد ثبت بالفعل أن تكون فعالة في تشجيع الجهات المانحة-خلية-توسط ميوجينيسيس في مضيف العضلات9،،من1017.
وهدف MIME هو عدم تمكن engraftment أنسجة العضلات المانحة نفسها في العضلات المضيف (حاليا لا نعرف إذا كان هذا يحدث)، ولكن بدلاً من ذلك على توفير مصدر للمانحين المنبوذة التي يمكن أن تسهم في ميوجينيسيس في العضلات المضيف تحت الظروف التي تحفز م تجديد أوسكلي. وأملنا هو أن بعد تم الأمثل MIME واختبارها في الدراسات الأساسية والاكلينيكية، يمكن أن توفر معلومات قيمة لتوجيه العلاجات السريرية تهدف إلى زيادة تجديد العضلات في عضلات الهيكل العظمى التي خضعت لفقدان العضلات شذوذ.
وهناك العديد من الأسئلة التي لا يزال يتعين الإجابة عليها فيما يتعلق بكيفية MIME يمكن أن تترجم إلى علاج السريري، وعلى سبيل المثال: كيف يمكننا مراقبة نوعية الأنسجة المانحة؟ كيف يمكننا التحكم الرفض المناعي للخلايا والأنسجة المانحة؟ يتم مسح الأنسجة المانحة بعد توفير الخلايا ميوجينيسيس أو أنه ترك ندبة تليفية؟ هل يؤثر نوع ألياف العضلات المانحة و/أو المضيف ميوجينيسيس خلية توسطت المانحة؟ العضلات التي يمكن أن تستفيد عمليا من MIME؟ ونقوم حاليا بتوسيع لدينا دراسات تقييم ما إذا كان MIME آمنة وفعالة، وتحديد العلاجات مرافقة التي يمكن زيادة ميوجينيسيس المستمدة من الجهات المانحة، والإجابة على العديد من الأسئلة، المذكورة أعلاه.
بعد الانتهاء من تجاربنا من الماوس لزرع متمكنة مع MIME، خطوتنا التالية لأداء MIME الإنسان للماوس مع الأنسجة البشرية المأخوذة لتقييم إمكانات شذوذ أنسجة العضلات المأخوذة. ونتوقع أن تؤدي هذه التجارب إلى خط جديد للبحوث الأساسية ومتعدية الجنسيات، الذي ينطوي على أنسجة العضلات من الجهات المانحة، التي تسجل في مبادرات مثل "البرنامج وصية الهيئة" للتعليم والبرنامج "هدية من الحياة" للتبرع بالأعضاء .
ممثلة من البيانات المعروضة في هذه المخطوطة تشير إلى أن 14 يوما بعد MIME، هناك عدة ميوفيبيرس قابلة للحياة التي تفتقر إلى التجارة والنقل أو مستويات منخفضة من التجارة والنقل. وتفسيرنا لهذه البيانات أن الخلايا الأقمار الصناعية التجارة والنقل والجهات المانحة ساهمت في ميوجينيسيس في العضلات المضيف. ونحن إجراء هذه التجربة استعدادا لزرع الأنسجة البشرية المأخوذة في العضلات ماوس مضيف. ليثبت دون لبس أن الخلايا الأقمار الصناعية المانحة المساهمة في ميوجينيسيس في العضلات المضيف بعد MIME، سيكون من المفيد زرع الأنسجة المانحة التي تعرب عن مراسل نيون، التي يمكن تمييزها بسهولة من التجارة والنقل (مثلاً، الأحمر نيون البروتين معربا عن الأنسجة المانحة مزروع في التجارة والنقل + العضلات المضيف).
ويحد هذا الأسلوب أساسا طبيعة الطوائف المنبوذة في الأنسجة المانحين. إذا المنبوذة في الأنسجة المانحة قابلة للتطبيق، التقنية التي من المرجح أن تيسير ميوجينيسيس خلية توسطت المانحين، في حين إذا لم تكن قابلة للاستمرار، ولا تحدث ميوجينيسيس. ومع ذلك، منذ المنبوذة جداً مرنة وقابلة للتطبيق لحوالي 2 أسابيع بعد الوفاة، أنه من المحتمل جداً أن تيسر الأنسجة المانحين التي تم زرعها في غضون دقائق قليلة بعد الحصاد لأغراض تجريبية، خلية توسطت المانحة ميوجينيسيس13 . بالإضافة إلى ذلك، وكما أشير أعلاه، فمن الممكن أنه منذ النسيج العضلي كله (الذي يحتوي على الطوائف المنبوذة، وألياف العضلات ناضجة، فضلا عن المقيمين العضلات الليفية) مضمن في العضلات المضيف، يمكن أن يحدث التليف. ومع ذلك، هذا الافتراض يحتاج إلى دراسة تجريبية. الأدب في العضلات الضرر الناجم عن تقلصات الضارة، وكريوينجوري، وميوتوكسينس التجريبية، يوحي بأن الخلايا المناعية (أساسا الضامة) قادرة على إزالة الحطام الخلوية من الألياف التالفة ويعيد البناء بفعالية 18من المصفوفة خارج الخلية. ولذلك، فمن الممكن أن بعد حقن2 MIME و BaCl، طالما الخلايا المناعية المضيف الحصول على ألياف العضلات المانحة تردي، أنهم يمكن مسح الحطام، تاركين وراءهم فقط الجهة المانحة المنبوذة. أخيرا، مدى ميوجينيسيس المستمدة من المانحين يعتمد على مقدار أنسجة العضلات المانحة المضمنة في العضلات المضيف. في ترتيب لحجرة العضلات المضيف يكون repopulated تماما من ميوفيبيرس المستمدة من الخلية المانحة، يتطلب أسلوب مثل التشعيع X أو أشعة غاما يجتذ المضيف العضلات المنبوذة وتتطلب أيضا إجراءات MIME المتكررة.
وقد ثبت أن جراحيا تعريض عضلة مضيف وخياطة قطعة من الأنسجة المانحين على العضلات المضيف يمكن أن ييسر خلية توسطت المانحة ميوجينيسيس9،،من1017. هذا النهج الجراحية المفتوحة قد استخدمت في الماضي لتعقب تقدم ميوجينيسيس وتوليد نماذج الماوس من أمراض العضلات البشرية. الجانب الابتكاري لتقنية MIME هو أنه يتم كسبها ولا تنطوي على تعريض عضلة المضيف جراحيا. وهذا يقلل من خطر العدوى علاجية المنشأ والدرجة من عدم الراحة في الحيوان المضيف، وبالتالي جعلها أكثر جدوى لتنفيذ MIME مرارا وتكرارا على العضلات المضيف نفسه إذا لزم الأمر.
نحن نتوقع أن تقنية MIME قد صقل مناسبة للنهج الجراحية المفتوحة المتبع حاليا زرع أنسجة العضلات المانحة إلى ماوس مضيف. وهذا يمكن أن يعجل توليد نماذج الماوس أنسنة، عن طريق تضمين فحص العضلات البشرية في العضلات الماوس المضيف. بالإضافة إلى ذلك، استناداً إلى البيانات الأولية من الماوس لتطعيم، ونحن نتوقع أن MIME ستكون فعالة في تحقيق ميوجينيسيس المانحة الخلية-بوساطة من الأنسجة البشرية المأخوذة من الجهات المانحة ما دامت قابلة للمانحين المنبوذة. وأخيراً، مع إجراء اختبارات إضافية، والتحقق من صحة، نأمل أن تقنية MIME سيساعد في تطوير علاجات جديدة لتسهيل ميوجينيسيس المانحة-خلية-توسط في البشر المصابين بأمراض العضلات.
أن نجاح هذا الأسلوب MIME يتوقف بصورة حاسمة على التحديد تضمين الأنسجة المانحين داخل المقصورة اللفافي (ابيميسيوم) للعضلات المضيف. إلا إذا تم وضع الأنسجة المانحين داخل حجرة العضلات المضيف، سوف تكون قادرة على تقديم الطوائف المنبوذة للعضلات المضيف بشكل دقيق. إذا تم وضع الأنسجة المانحة خارج العضلات المضيف، أنها غير واضحة بشأن ما سيكون مصيرها. في نموذجنا التجريبي ل MIME، نستخدم العضلات تا كالعضلات المضيف، نظراً لأنها بارزة وسطحي يوضع في الجانب أنتيرولاتيرال من الساق. حجم واتجاه وموقف التشريحية للعضلات تا، يجعل من السهل لتأكيد أن الأنسجة المانحة يتم وضعها بشكل صحيح داخل عضلة المضيف تا بعد MIME. في هذه الورقة، وقد قدمنا الأدلة التجريبية أن الأنسجة المانحة إعادةأنابيب المضمنة في المضيف العضلات تا في MIME بعد 3 أيام، وأن هناك من ميوجينيسيس خلية توسطت المانحين في العضلات المضيف في MIME بعد 14 يوما.
Disclosures
المؤلفين قد لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
هذا العمل أمكن "منحة الطيار" من التحالف للتجدد تأهيل البحث والتدريب (ع3T) ومجموعة بدء التشغيل كلية من جامعة ولاية وين بجرة. AR3T تدعمه يونيس كينيدي شرايفر الوطني معهد صحة الطفل والتنمية البشرية (NICHD) والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية و "السكتة الدماغية" (NINDS)، والوطني معهد للطب الحيوي التصوير و "الهندسة الحيوية" (نيبيب ) من المعاهد الوطنية للصحة بموجب قرار التحكيم رقم P2CHD086843. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية "المعاهد الوطنية للصحة".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NSG-GFP mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #021937 | Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #000664 | Control donor mice |
| Tabletop isoflurane vaporizer | VetEquip (Livermore, CA) | Item #901801 | Inhaled anesthesia system |
| Magic depilatory crea | Softsheen Carson (New York, NY) | N/A | Razorless hair removal cream |
| 4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures | Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD) | SUT106631 | Guiding sutures for donor tissue |
| VetBond veterinary tissue adhesive | 3M (Maplewood, MN) | Catalog #1469Sb | Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure |
| Barium chloride | Ricca Chemical Company (Arlington, TX) | Product #R0854000-500A 854-16 | Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration |
| Deltaphase isothermal gel heating pad | Braintree Scientific (Braintree, MA) | Item #39DP | Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia |
| HM525NX cryostat | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog #HM525NX | Cryostat to make frozen sections of muscle |
| Vectashield Antifade Medium | Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) | Catalog Number: H-1000 | Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples |
| Rabbit anti Desmin Antibody | Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA) | RB9014P | Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling |
| Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog#: A-21069 | Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Seracare (Milford, MA) | Catalog #5930-0006 or 71-03-01 | Reagent for fluorescent labeling of nuclei |
| Axio Scope.A1 microscope | Carl Zeiss (Peabody, MA) | Product #Axio Scope.A1 | Light and fluorescence microscope |
| Photoshop CS4 | Adobe Systems (San Jose, CA) | Photoshop CS4 | Imaging Software for perform image tiling |
| Image J | National Institutes of Health (Bethesda, MD) | Image J for Windows 64-bit Operating System | Imaging Software for quantitative fluorescence analysis |
References
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
- Robertson, T. A., Grounds, M. D., Papadimitriou, J. M. Elucidation of aspects of murine skeletal muscle regeneration using local and whole body irradiation. J Anat. 181 (Pt 2), 265-276 (1992).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).
- Brack, A. S., Rando, T. A. Tissue-specific stem cells: lessons from the skeletal muscle satellite cell. Cell Stem Cell. 10 (5), 504-514 (2012).
- Krag, T. O., Hauerslev, S., Sveen, M. L., Schwartz, M., Vissing, J. Level of muscle regeneration in limb-girdle muscular dystrophy type 2I relates to genotype and clinical severity. Skelet Muscle. 1 (1), 31 (2011).
- Skuk, D., et al. Dystrophin expression in myofibers of Duchenne muscular dystrophy patients following intramuscular injections of normal myogenic cells. Mol Ther. 9 (3), 475-482 (2004).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Sakellariou, P., et al. Neuromuscular electrical stimulation promotes development in mice of mature human muscle from immortalized human myoblasts. Skelet Muscle. 6 (1), 4 (2015).
- Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Zhang, Y., et al. Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders. Hum Mol Genet. 23 (12), 3180-3188 (2014).
- Juhas, M., Engelmayr, G. C. Jr, Fontanella, A. N., Palmer, G. M., Bursac, N. Biomimetic engineered muscle with capacity for vascular integration and functional maturation in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5508-5513 (2014).
- Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution. Tissue Eng Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).
- Latil, M., et al. Skeletal muscle stem cells adopt a dormant cell state post mortem and retain regenerative capacity. Nat Commun. 3, 903 (2012).
- Maykel, J., et al. NOD-scidIl2rg (tm1Wjl) and NOD-Rag1 (null) Il2rg (tm1Wjl) : a model for stromal cell-tumor cell interaction for human colon cancer. Dig Dis Sci. 59 (6), 1169-1179 (2014).
- Casar, J. C., et al. Heparan sulfate proteoglycans are increased during skeletal muscle regeneration: requirement of syndecan-3 for successful fiber formation. J Cell Sci. 117 (Pt 1), 73-84 (2004).
- Hardy, D., et al. Comparative Study of Injury Models for Studying Muscle Regeneration in Mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
- Roberts, P., McGeachie, J. K., Grounds, M. D., Smith, E. R. Initiation and duration of myogenic precursor cell replication in transplants of intact skeletal muscles: an autoradiographic study in mice. Anat Rec. 224 (1), 1-6 (1989).
- Tidball, J. G. Mechanisms of muscle injury, repair, and regeneration. Compr Physiol. 1 (4), 2029-2062 (2011).
