Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Minimalt Invasive muskel Embedding (MIME) - en roman eksperimentel teknik til at lette Donor-celle-medieret Myogenesis

Published: August 24, 2017 doi: 10.3791/55731
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Health Care Sciences, Physical Therapy Program, College of Pharmacy and Health Sciences, Wayne State University

Summary

Vi beskriver en ny eksperimenterende teknik, som vi kalder minimalt Invasive muskel Embedding (MIME), som er baseret på beviser, skeletmuskulatur væv indeholder levedygtige myogenic celler, der kan lette donor-celle-medieret myogenesis når implanteret i en vært muskel.

Abstract

Skeletmuskulatur besidder regenerative kapacitet på grund af væv-resident, muskel-fiber-generering (myogenic) satellit celler (SCs), som kan danne nye muskelfibre under de rette betingelser. Selv om SCs kan høstes fra muskelvæv og kulturperler i vitro, er de resulterende myoblast celler ikke meget effektive til at fremme myogenesis når transplanteret ind i værten muskel. Kirurgisk udsætter vært muskel og podning segmenter af donor muskelvæv eller de isolerede muskelfibre med deres SCs på vært muskel, fremmer bedre myogenesis i forhold til myoblast transplantation. Vi har udviklet en ny teknik, som vi kalder minimalt Invasive muskel Embedding (MIME). MIME indebærer passerer en kirurgisk nål gennem host muskel, tegning et stykke af donor muskelvæv gennem nålen spor og derefter forlader donorvæv indlejret i vært muskel, således at det kan fungere som en kilde til SCs for værten muskel. Her beskriver vi i detaljer trin involveret i at udføre MIME i en immundefekte musemodel, der udtrykker en grøn fluorescerende proteiner (NGL) i alle dens celler. Immundefekt i host-mus reducerer risikoen for immun afvisning af donorvæv, og normal god landbrugspraksis udtryk giver mulighed for nem identifikation af vært muskelfibre (normal god landbrugspraksis +) og donor-celle-afledte muskelfibre (normal god landbrugspraksis-). Vores pilot data tyder på at MIME kan bruges til implantatet en extensor digitorum longus (EDL) muskel fra en donor mus i tibialis anterior (TA) muskel vært musen. Vores data tyder også på, når en myotoxin (bariumchlorid, BaCl2) indsprøjtes i vært muskel efter MIME, der er bevis for, at donor-celle-afledte myogenesis i host muskel, med ca. 5%, 26%, 26% og 43% af fibrene i en enkelt vært TA muskel viser ingen vært bidrag, minimal vært bidrag, moderat vært bidrag og maksimal vært bidrag, henholdsvis.

Introduction

Sund skeletmuskulatur, selvom post mitotiske, besidder fremragende regenerative kapacitet på grund af tilstedeværelsen af væv-resident myogenic celler kendt som satellit celler (SCs)1,2; og gennemgik i3,4. Dog under patologiske tilstande forårsaget af muskuløse dystrophies, traume eller accelereret ældning, muskler regeneration kan ikke holde op med muskel opdeling, og dermed, progressive muskel fiber tab opstår5. Selv om effektive metoder er blevet udviklet for at isolere SCs fra muskel og udvide dem i kultur til at generere store mængder af myoblasts (og senere myotubes), har forsøg på at generere fysiologisk relevante tal af muskelfibre i vært muskel gav kun minimal succes6. Som med mange andre celletyper, når myoblasts er alene injiceres værten væv, de fleste af cellerne ikke indpode7,8. Vi har vist, at neuromuskulære elektrisk stimulation (NMES) letter donor-celle-afledte myogenesis i regenerering-mangelfuld vært mus muskel, der blev sprøjtet med menneskelige myoblasts8. Andre har vist, at kirurgisk podning biopsi muskel eller enkelt muskelfibre med vedlagte SCs, lette moderat myogenesis selv uden NMES, tyder på, at implantere hele muskelfibre med SCs kunne være mere fordelagtig end implanterer myogenic celler alene9,10. Da donor eller manipuleret muskelvæv podet ind vært muskel producerer bedre resultater end omplantning celler alene, er det muligt at væv eller væv-lignende strukturer kan give afgørende stikord til donor-celle engraftment; et koncept, som bliver stadig mere tydeligt i celle-terapi undersøgelser, hvor forskellige celle typer10,11,12.

De seneste data tyder på, at SCs fremstillet af mennesker mere end 2 uger efter slagtning generere myotubes i kultur13. Vi agter derfor at vurdere hvis implantering af muskel væv høstet slagtning i en levende vært vil vende muskel fiber tab. Vi har udviklet en ny teknik kaldet MIME for at implantere donor muskelvæv i skeletmuskulatur væv af en levende vært for at fremme donor-celle-afledte myogenesis. MIME indebærer passerer en kirurgisk nål gennem host musklen til at skabe en nål spor; tegning et lille segment af donor muskelvæv gennem nålen spor; forlader donorvæv indlejret i vært musklen; og lukke nålen hullerne med væv klæbemiddel. Efter at øve teknik i aflivede mus studerede i andre eksperimenter, vi har nu udført MIME i levende mus, der er immundefekte og allestedsnærværende udtrykker en grøn fluorescerende proteiner (normal god landbrugspraksis), og opfølgning på 3 og 14 dage efter MIME. På 3 dage efter MIME bekræfter vi, at donor mus (normal god landbrugspraksis-) EDL muskel implanteret i vært mus (normal god landbrugspraksis +) TA muskel, forbliver integreret i vært muskel. På 14 dage efter MIME, bekræfte efter back2 myotoxin skade at fremkalde skader og myogenesis, vi, at cirka 5%, 26%, 26% og 43% af fibrene i en enkelt vært TA muskel viser ingen vært bidrag, minimal vært bidrag, moderat vært bidrag og maksimal vært bidrag, henholdsvis. Centrale Nukleering (en markør af degeneration og efterfølgende regenerering) ses hos ca 95% af TA muskelfibre efter MIME og myotoxin injektion.

Vi studere TA muskler 14 dage efter MIME + BaCl2 fordi dette tidspunkt indfanger den mellemliggende fase af regenerering, når et flertal af regenererede fibre er centralt nukleeret. Vi studere normal god landbrugspraksis + mus som værter for MIME, så at når vi i sidste ende transplantation menneskelige dødt muskel til vært mus, vil vi kunne let skelne muskelfibre af værten og donor oprindelse. Vi bruger musen EDL muskel som den eksperimentelle donorvæv, da enkelt fibre fra denne muskel har vist større myogenic potentiale end TA muskler9. EDL muskel er også synergistisk til TA muskel og har lignende fiber-type sammensætning. Vores foreløbige data tyder på at MIME er i stand til at lette donor-celle-afledte myogenesis i host muskel.

Protocol

alle undersøgelser, hvor levende dyr er godkendt af den Institution Animal Care og brug udvalg (IACUC) på Wayne State University, Detroit, Michigan, USA, og er i overensstemmelse med vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr ( 8. udgave, 2011, udgivet af nationale akademier presse, 500 femte Street NW, Lockbox 285, Washington, DC 20055, USA). Henhold til de godkendte IACUC protokoller, blev procedurer, der involverer smerte og/eller nød udført under fuld narkose, som er induceret og vedligeholdes af isofluran indånding (1,5-5% effekt). Anæstesi blev bekræftet ved manglende tilbagetrækning til tå knivspids, og af palpebral eller vibrissae svar (procentdel af isofluran blev øget efter behov for at opretholde effekt). På grund af minimalt invasive karakteren af protokollerne, en " sterile tips " teknik blev fulgt. Mens dyr var under bedøvelse, blev Vaselin anvendt på øjnene at forhindre tørhed. Ingen specielle behandlinger var påkrævet; dog blev kost gel givet til dyrene i 24 timer efter procedurer, der involverede generelle anæstesi. investigator er godkendt af IACUC til at tilbageholde analgesi efter MIME, da proceduren indebærer kirurgisk udsætter værten muskel, fordi det er begrænset til ét hindlimb og påvirker ikke normal funktion, og fordi mange almindelige smertestillende lægemidler er kendt for at påvirke normal muskel regenerering.

1. Dyremodeller

  1. Host mus for MIME-
    1. Brug NSG-NGL mus (8-10 uge, mandlige) som værter for muskel podninger undersøgelser.
      Bemærk: Disse mus er ideel værter for allogene muskel podninger fordi de mangler modne T- og B-lymfocytter og funktionelle naturlige dræberceller, er mangelfuld i cytokin signalering, og er blevet brugt af andre for allografting eller xenografting ikke-muskelceller < sup Class = "xref" > 14. Allestedsnærværende normal god landbrugspraksis udtryk giver mulighed for nem identifikation af host (normal god landbrugspraksis +) og donor-celle-afledte (normal god landbrugspraksis-) muskelfibre.
  2. Donor mus for MIME-
    1. Brug C57BL/6J mus (12-16 uge) som donor mus.
      Bemærk: Disse mus er egnet donor mus, fordi de har et fuldt tilknyttet genom, er ikke kendt for at have nogen skeletmuskulatur Patologi, er let tilgængelige og økonomisk, og ikke give udtryk for normal god landbrugspraksis.

2. Forberede Donor muskelvæv

  1. binde vejledende suturer og høst donor EDL muskler
    1. Euthanize donor mus af cervikal dislokation og torakotomi udføres under generel anæstesi administreres af bordplade isofluran vaporizer drevet af medicinsk ilt (inhaleret isofluran, 2-5% effekt).
    2. Adgang til EDL muskler, bruger et par af kirurgisk saks til at åbne huden over den forreste overflade af benet. Find TA muskel i den forreste ben og fjerne det for at visualisere den EDL muskel, der ligger bag TA muskel. Skub spidsen af et par pincet bag EDL muskel og anvende blide trækkraft for at se hvis tæerne udvide (dette bekræfter, at musklen er EDL).                                                                                                                                                          
      Bemærk: Donor væv område bør være kirurgisk, aseptisk prepped forud for høst.
    3. Brug ~ 10 cm segmenter af 4-0 silke, flettet, ikke-resorberbare, sterile sutur og gøre to dobbelt knob til at anvende de vejledende suturer til de proksimale og distale sener af EDL muskel. ( figur 1A).
    4. Skære den distale EDL senen, afspejler EDL muskel og skære den proksimale senen.
    5. Sted, donoren EDL muskler i en petriskål fyldt med musen Ringer løsning.

3. Forberede vært mus for MIME-

  1. anæstesi
    1. placere vært musen under generel anæstesi (inhaleret isofluran, 1,5-5% effekt) administreres af en bordplade isofluran vaporizer drevet af medicinsk ilt.
    2. Fremkalde anæstesi i en induktion kammer og derefter overføre musen til en næse-kegle til at opretholde anæstesi under udførelse af andre procedurer på dyret. Termisk støtte med en isotermisk gel varme pad, mens dyret er under anæstesi.
  2. Huden forberedelse
    1. til at fjerne dyret ' s pels, anvende en depilatory cremen over den forreste del af den venstre bagben. Højre ben fungerer som en kontrol ben for efterfølgende procedurer.
    2. Ferie depilatory cremen på i 2 min. Rens off depilatory cremen sammen med de fritstående pels med klude dyppet i phosphat bufferet saltvand (PBS). Efter pels fjernelse, skrub huden med tre skiftevis klude povidon-jod skrubbe løsning og 70% ethanol.
  3. At skabe en nål spor i vært TA muskel
    1. passere en 18-gauge (1 i lange) kirurgisk nålen igennem midten af værten TA muskel langs musklen ' s lange akse ( figur 1B). Passere nålen i en cephalo-caudale retning langs længden af TA muskel, og gennem midten af musklen mave ( figur 1B).
      Bemærk: Formålet med dette trin er at oprette en nål spor, som et stykke af donor muskel kan integreres. Indlejring af donorvæv midt i TA muskel ville potentielt give SCs fra donorvæv til at migrere og lette myogenesis på tværs af hele værten TA muskel.
  4. Indlejring donorvæv i nål spor af vært TA muskel
    1. når kirurgisk nålen er inden for værten TA muskel, passere de ledende suturer i den ene ende af donorvæv gennem lumen af kirurgisk nål i en caudo-cephalic retning ( figur 1 c).
    2. Tegner donorvæv gennem nålen spor som nålen er trukket tilbage fra værten TA muskel i en caudo-cephalic retning.
    3. Bruger de ledende suturer i de caudale og cephalic ender af donorvæv for at justere placeringen af donorvæv. Sikre at donorvæv er forskanset i vært TA muskel ( fig. 1 d).
    4. Når donor væv placering er optimeret, afbrød de ledende suturer, foretage endelige justeringer til donor væv placering med bøde-tippet pincet.
    5. Seal kutane nål sår ( figur 1E -F) ved at tilnærme sår kant med pincet og anvende veterinære væv lim med spidsen af en 27-gauge kirurgisk nål.

4. Intramuskulær Myotoxin injektion til at fremkalde samordnet muskel Degeneration og Regeneration

  1. efter MIME, tilføre vært TA muskel til at fremkalde omfattende muskel fiber skader i vært musklen 50-60 µL af 1,2% BaCl 2 (myotoxin) og af donorvæv indlejret i det 15.
    1. Indsprøjtes BaCl 2 på 3 lokaliteter langs længden af værten TA muskel (proksimale, midten og distale tredjedel af musklen mave).
      Bemærk: Indsprøjtning myotoxins som BaCl 2, cardiotoxins og notexin i skeletmuskulaturen inducerer samordnet muskel fiber skader efterfulgt af regenerering 16.

5. Post proceduremæssige Animal Care

  1. efter MIME og BaCl 2 injektion, ren vært mus ' s venstre bagben ben med ethanol og Påfør et tyndt lag vaseline til at beskytte huden.
  2. Efter post proceduremæssige hudpleje, fjerne vært musen fra næsen kegle.
  3. Placere musen i et ensomt opsving bur uden strøelse. Give termisk support inddrive dyret gennem en isotermisk gel varmepude placeret under halvdelen af recovery bur.
    Bemærk: En halv er ikke opvarmet så dyret kan bevæge sig væk fra den hede afrivningsblok, hvis nødvendigt.
  4. Efter host musen har helt genvundet fra anæstesi, returnere dyret til sit oprindelige bur. Sted den animalske tilbage i det animalske facilitet, indtil Opfølgning eksperimenter er udført. Overvåge vært musen dagligt, indtil det er klar til opfølgning – eksempel: på 3-14 dage efter MIME. Efter MIME, dyr overvåges af laboratoriepersonalet samt veterinære personale – det hovedsagelig drejer sig om vurdering af, om dyrene er lyse, alarm og lydhør; og også vurdere hvis dyr viser åbenlys tegn på smerte eller har problemer med at flytte, fodring, drikke og grooming.

6. Væv indsamling

  1. høst vært muskel
    1. Euthanize vært mus af cervikal dislokation og torakotomi udføres under generel anæstesi administreres af en bordplade isofluran vaporizer drevet af medicinsk ilt ( inhaleret isofluran; 2-5% effekt). investigator har også IACUC godkendelse til høst TA musklerne under generel anæstesi før eutanasi.
    2. hen til adgang vært TA musklerne, bruger et par af kirurgisk saks til at åbne huden over den forreste overflade af benet. Find TA muskel i den forreste ben, skære den distale senen, afspejler musklen og skære de proksimale muskel vedhæftede filer (Se afsnit 2.1).
    3. Indsamler både venstre (eksperimentel) og højre (kontrol) TA muskler.
  2. Snap indefrysning høstede muskler
    1. vejer de høstede muskler ved at placere på afveje papir og vejning skala.
    2. Dyppe kortvarigt muskler i mineralsk olie til cryoprotection. DUP off den overskydende olie.
    3. Sted muskler på aluminiumsfolie, og snap lamme musklerne af hurtigt nedsænke dem i flydende nitrogen fyldt i en Dewar. Overføre prøverne at mærket cryovials og gemme prøverne i et-80 ° C fryser for senere studier.

7. Histologiske undersøgelser

  1. Cryosectioning muskelvæv at indsamle seriel tværsnit
    1. overføre prøverne fra-80 ° C fryser til en kryostaten ved at placere dem i en Dewar, som indeholder flydende nitrogen.
    2. i kryostaten, håndtere én prøve ad gangen. Med en kold barberblad (klinge opbevares i kryostaten), skåret prøve to gange på midten bugen af TA musklen til at producere et segment af muskel, der er omkring 1-2 mm tykke. Holde dette segment for at gøre frysemikrotomsnit og returnere de resterende dele af musklen til sin cryovial.
    3. Med optimal opskæring temperatur (OLT), frysning sammensatte, sikre den tykke segment af væv på en kryostaten objektpladen. Placer objektpladen på præparatholderen.
    4. Ru-ansigt prøven ved skæring 20 µm sektioner. Indsamle et par 20 µm sektioner på glas dias til frysemikrotomsnit.
    5. Hvis kvaliteten af afsnittene 20 µm er tilfredsstillende, ændre skære tykkelse til 5 µm og indsamle et par sektioner for at vurdere kvaliteten. Hvis sektionerne 5 µm er tilfredsstillende i kvalitet, indsamle seriel sektioner. Indsamle 2-3 sektioner pr. slide og indsamle nok sektioner for 3 dias.
    6. Indsamle sektioner fra både eksperimentelle (venstre) og kontrol (højre) TA muskler af hvert dyr.
  2. At studere NGL udtryk
    Bemærk: udpege ét sæt forberedt dias (afsnit 7.1) at studere normal god landbrugspraksis udtryk i muskelfibrene.
    1. Gælder ~ 50 µL af anti-fade medium på afsnittene og dækglas glas. Forsegle coverslip kanter med klar neglelak.
    2. Bruge lys og fluorescerende mikroskop (Se Tabel af materialer), studere sektioner med en 10 X mål og en passende filter til at visualisere normal god landbrugspraksis.
      1. Indsamle digitale billeder (~ 15) af overlappende visuelle felter for at dække hele tværsnittet af TA muskel. Indsamle fase kontrast billeder for hver af de visuelle felter ved at skifte fra fluorescens til fase kontrast på mikroskopet.
    3. Åbne billeder med en egnet billedbehandling software, der kan flise enkelte billeder for at producere en enkelt sammensat billede; f.eks. brug af " photomerge " indstilling under menuen filer i den billedbehandlingsprogrammer listet i Tabel af materialer.
    4. Åbne normal god landbrugspraksis fluorescens billeder med et passende billede analyse software (fx ImageJ). Cirkel enkelte muskelfibre ved hjælp af den " værktøjet til Afkastningsgrad " og optage betyde fluorescens intensitet for hver fiber.
      1. Beregn maksimal normal god landbrugspraksis (Fluorescens) intensiteten ved at tage gennemsnittet af betyde fluorescens intensiteten af 10 fibre, der viser høj normal god landbrugspraksis udtryk og har normal morfologi. Beregne % maksimal lysstyrke på normal god landbrugspraksis for hver fiber ved at dividere betyde fluorescens intensitet for hver fiber ved den maksimale normal god landbrugspraksis intensitet og multiplikation med 100. Tabulate resultaterne af normal god landbrugspraksis analyse for hver TA muskel, som vist i figur 3E.
  3. At studere muskelfiber integritet og myonuclear placering ved immunfluorescent mærkning af desmin og 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), hhv.
    Bemærk: Udpege ét sæt dias parat, som ovenfor, til at studere desmin mærkning i muskelfibrene.
    1. Fix sektioner med 2% PARAFORMALDEHYD i PBS for 10 min. vask i afsnit tre gange med PBS.
      Forsigtig: Bære passende personlige værnemidler (PPE) når håndtering ved omgangen med PARAFORMALDEHYD.
    2. Blok sektioner med 3% bovint serumalbumin fortyndes i PBS, som indeholder 0,01% Triton-X100 i 30 min. Denne blokering løsning omtales i det følgende benævnt som den primære fortyndingsmiddel.
    3. Fortyndes kanin anti-desmin immunoglobulin G (IgG) i den primære fortyndingsmiddel (1:200).
    4. Efter blokering er færdig, anvendes de fortyndede primære antistoffer på sektioner og inkuberes natten over i køleskab ved ~ 4 ° C. vask afsnittene én gang (5 min) med PBS, som indeholder 0,1% Triton X-100. Denne løsning omtales herefter som den første vaskebuffer.
    5. Vask afsnittene 3 gange (5 min pr. vask) med PBS.
    6. Forbered den sekundær antistof ved fortynding ged anti-kanin IgG (konjugeret med rødt fluorescerende farvestof) i PBS, som indeholder 0,01% Triton X-100.
    7. Anvende den fortyndede sekundær antistof på afsnittene og inkuberes ved stuetemperatur (~ 23 ° C) for 60 min.
    8. Vaske afsnittene én gang (5 min) med den første wash buffer. Vask i afsnit 3 gange (5 min pr. vask) med PBS.
    9. Anvend DAPI i 3 min. vask afsnittene 3 gange (1 min pr. vask) med PBS. Anvende ~ 50 µL af den anti-fade medium på afsnittene og anvende glas coverslip. Forsegle coverslip kanter med klar neglelak.
    10. Bruge lys og fluorescerende mikroskop (Se Tabel af materialer), undersøgelse seriel sektioner med en 10 X mål og en passende filter til at visualisere rødt fluorescerende farvestof.
    11. Indsamle de digitale billeder (~ 15) af de overlappende visuelle felter til at dække hele tværsnittet af TA muskel. Indsamle fluorescens-billeder af DAPI mærkning for hver af de visuelle felter ved at skifte til den relevante filterindstilling.
    12. Open og analysere billeder ved hjælp af en egnet billedbehandlingsprogrammer, som beskrevet i trin 7.2.3 - 7.2.4.
      Bemærk: Studere billeder til at identificere, hvilke muskelfibre er beskadiget (desmin negative), hvilke muskelfibre har centrale Nukleering (desmin positive fibre, der har DAPI-mærket kerner beliggende internt i stedet for perifert), og hvilke områder af afsnittet har betændelse og/eller fibrose (områder, der har mange DAPI-mærket kerner grupperet sammen, men er muskelfibre).

Representative Results

På 3 dage efter MIME er donor EDL, der er implanteret af MIME indeholdt i vært TA muskel rum (figur 2A-C). Som forventet, tværsnit af TA muskel fra donor mus, studerede under fluorescens optik, viser ikke grønne fluorescens, fordi de ikke udtrykke normal god landbrugspraksis (figur 2D). Derimod Vis tværsnit af TA muskel fra værten mus, der ikke implanteres med donorvæv, ensartede grønne fluorescens i muskelfibre TA da fibrene udtryk for normal god landbrugspraksis (figur 2E). I tværsnit af muskler implanteret af MIME med donor muskelvæv, er der en linje af afgrænsning mellem værten muskelfibre (normal god landbrugspraksis +) og donor muskelfibre (normal god landbrugspraksis-). Fase kontrast billeder af de visuelle felter vises i figur 2D-F er præsenteret i figur 2E«-F' og foreslår, at der faktisk er muskelfibre i områder hvor der ikke er nogen normal god landbrugspraksis signal.

På 14 dage efter MIME og BaCl2 indsprøjtning, ved at studere serie tværs afsnit i TA musklen der er overladt umærket eller er mærket med antistoffer mod desmin (figur 3), vi lære, at normal god landbrugspraksis signal er udtrykt ved alle muskelfibre i de ubehandlet muskel fra værten mus, men ikke i MIME-behandlede muskel (rød desmin mærkning registrerer levedygtige muskelfibre). I den vært TA muskel behandles med MIME og BaCl2 injektion, de donor-celle-afledte myogenesis fremgår af tilstedeværelsen af mange desmin(+) muskelfibre, der viser ingen påviselige normal god landbrugspraksis signal (figur 3 c-D, 3 C' -D'). Kimære muskelfibre skyldes sandsynligvis fusion af de vært og donor myogenic celler kan påvises ved lav til moderat niveauer af normal god landbrugspraksis fluorescens udstillet af disse fibre. Talrige kimære fibre vises på tværs af hele diameteren af TA muskel tyder på, donoren SCs er i stand til at migrere flere hundrede mikron inden for epimysium af vært muskel. Kvantitering af normal god landbrugspraksis + fibre er vist i figur 3E. Figur 4 viser høj forstørrelse billeder af serielle tværsnit af en hel MIME + BaCl2 behandlet TA muskel.

Figure 1
Figur 1 . Trin involveret i minimalt invasiv muskel Embedding (MIME).
MIME udføres under fuld narkose. Det indebærer markedsføring ~ 10 mg af donor muskel (donor mus EDL) i Ringer løsning og binde de ledende suturer til dets ender (A). En 18-gauge kanyle er passeret gennem den lange akse af vært muskel (B) og donorvæv er trukket gennem nålen spor (C). Af donorvæv er venstre indlejret i vært muskel (D), de ledende suturer er skåret, og nålen hullerne er forseglet med væv lim (E). Forseglet nål sår er angivet med pile (F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Undersøgelser af TA muskel 3 dage efter MIME.
Værten muskel indsamlet 3 dage efter MIME; Bemærk nål mærker på vært TA (pile; A-B). Data yderligere bekræfte, at den integrerede donor mus EDL er forskanset i TA muskel rum (B-C). Fluorescens billeder af TA muskel tværsnit viser ingen grønne fluorescens i wild-type TA muskel (D), lyse grønne fluorescens i NSG-normal god landbrugspraksis TA muskel (E)og en skelnen mellem vært og donor muskel i NSG-normal god landbrugspraksis TA muskel på 3 dage post MIME (F). Fase kontrast billeder af visuelle felter i D-F er vist i D'-F', henholdsvis. Den røde linje i paneler F og F' viser linjen af afgrænsning mellem værten og donor væv. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Undersøgelser af TA muskel 14 dage efter MIME.
Data indsamlet 14 dage efter MIME præsenteres. Det røde signal er fra immunfluorescent mærkning af desmin (et positivt signal for desmin betegner, at myofibers er levedygtige), den blå signal er fra DAPI (pletter kerner), og det grønne signal fra normal god landbrugspraksis. I kontrol TA muskel (højre hindlimb) høstet fra værten mus, som forventet, er næsten alle myofibers positive for desmin, antyder, at disse myofibers er levedygtige (A; røde signal). Derudover baseret på DAPI farvning, det er tydeligt, at myonuclei af næsten alle myofibers er perifert beliggende, som man ville forvente i sund muskel (A; blå signal). Seriel afsnit af kontrol TA muskel viser, at næsten alle muskelfibre er lysegrønt, hvilket indebærer, at de positive for normal god landbrugspraksis. I MIME + BaCl2 -behandlet TA muskel (venstre hindlimb), donor-celle-medieret myogenesis fremgår af tilstedeværelsen af mange desmin(+) muskelfibre, der viser ingen påviselige normal god landbrugspraksis fluorescens (C-D, C'-D'). Desmin(+) muskelfibre med lav til moderat normal god landbrugspraksis fluorescens (kimære muskelfibre) er til stede på tværs af diameter af hele TA musklen, hvilket tyder på, at MIME giver donor SCs, der kan overføre inden for epimysium af TA muskel og fremme donor-celle-afledte myogenesis. A'-D' er høj forstørrelse billeder af regionerne i de blå boksene i A-D. Kvantitering af GFP(+) fibre og centralt nukleeret fibre er vist i E. Skalere barer = 100 µm (A-D) og 50 µm (A'-D'). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4RC="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55731/55731fig4.jpg" / >
Figur 4 . Beviser for omfattende skader og regenerering 14 dage efter MIME og BaCl2 injektion.
Høj forstørrelse, seriel tværsnit af en hel MIME + BaCl2 behandlet TA muskel er præsenteret. Dataene viser, at mange muskelfibre, som er moderat eller stærkt normal god landbrugspraksis + har centralt kerner (A-B, rødt signal i A er fra desmin og blå signal i A er fra DAPI grønne signal i B er fra normal god landbrugspraksis). Disse data tyder på, at degeneration og regeneration efter BaCl2 injektion ikke påvirker normal god landbrugspraksis udtryk. I denne sammenhæng antyder tilstedeværelsen af centralt nukleeret muskelfibre i MIME + BaCl2 behandlet TA muskel, med lidt at ingen normal god landbrugspraksis udtryk, at disse fibre er sandsynligvis resultatet af myogenesis (eller regenerering) med bidrag fra Normal god landbrugspraksis - myogenic celler. Disse observationer kan kontrolleres yderligere i høj forstørrelse billeder af markerede felter (C-F; C og D, og E og F, henholdsvis er overlappende områder fra seriel tværsnit; farvekodning af image grænser betegne placeringen af disse regioner i A og B). Skalere barer = 100 µm (A-B) og 50 µm (C-F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for den nye eksperimentelle teknik kendt som MIME, udviklet i vores laboratorium, til implantatet donor muskelvæv i vært muskelvæv. Dette er en tilpasning af en åben muskel podning teknik, der allerede har vist sig for at være effektive til at fremme donor-celle-medieret myogenesis i en vært muskel9,10,17.

Målet med MIME er ikke at aktivere engraftment af donor muskelvæv selv i vært musklen (vi ikke ved i øjeblikket, hvis dette sker), men snarere at give en kilde til donor SCs, der kan bidrage til myogenesis i host musklen under betingelser, der stimulerer m muskelstyrke regenerering. Vores håb er, at efter MIME er blevet optimeret og testet i grundlæggende og prækliniske undersøgelser, kunne det give værdifuld indsigt til at vejlede kliniske behandlinger til formål at øge muskel regenerering i skeletmuskulatur, der har undergået myogenic muskeltab.

Der er mange spørgsmål, der endnu mangler at blive besvaret med hensyn til hvordan MIME kunne oversættes til en klinisk behandling, for eksempel: Hvordan vil vi kontrollere kvaliteten af donorvæv? Hvordan vil vi styre immun afvisning af donorvæv og celler? Af donorvæv fjernes efter at levere celler til myogenesis eller det efterlader et fibrotisk ar? Påvirker donor og/eller vært muskel fiber type donor-celle-medieret myogenesis? Hvilke muskler kan praktisk gavn MIME? Vi udvider i øjeblikket vores undersøgelser at vurdere hvis MIME er sikker og effektiv, identificere tillægsbehandling behandlinger, der kan forøge donor-stammer myogenesis, og besvare mange af de spørgsmål, der er anført ovenfor.

Efter at have afsluttet vores test af mus til mus allogen transplantation med MIME, er vores næste skridt at udføre menneskelige til musen MIME med dødt menneskelige væv for at evaluere de myogenic potentiale af dødt muskelvæv. Vi forventer, at disse forsøg vil føre til en ny linje af grundlæggende og Translationel forskning, der indebærer muskelvæv fra donorer, der er registreret i initiativer som kroppen testamentarisk gave Program for uddannelse og livets gave program for organdonation .

De repræsentative data præsenteret i dette manuskript foreslår, at 14 dage efter MIME, er flere levedygtige myofibers, der enten mangler normal god landbrugspraksis eller har lave niveauer af normal god landbrugspraksis. Vores fortolkning af disse data er, at normal god landbrugspraksis-donor satellit celler bidrog til myogenesis i host muskel. Vi udførte dette eksperiment i forberedelse til implantering af menneskelige dødt væv i en vært mus muskel. For at demonstrere utvetydigt at donor satellit celler bidrager til myogenesis i host musklen efter MIME, ville det være nyttigt at implantere donorvæv, der udtrykker en fluorescerende reporter, som kan skelnes let fra normal god landbrugspraksis (f.eks., rødt fluorescerende proteiner udtrykker donorvæv implanteret i normal god landbrugspraksis + vært muskel).

Denne teknik er hovedsageligt begrænset arten af SCs i donorvæv. Hvis SCs i donorvæv er levedygtige, teknikken er tilbøjelige til at lette donor-celle-medieret myogenesis, mens hvis de ikke er levedygtige, myogenesis kan ikke forekomme. Men da SCs er meget modstandsdygtige og er rentabelt for ca 2 uger post mortem, det er meget sandsynligt, at til forsøgsformål, de donorvæv, der er implanteret i et par minutter efter høst vil lette donor-celle-medieret myogenesis13 . Desuden som hentydede til ovenfor, er det muligt, at siden den hele muskelvæv, (der indeholder SCs samt modne muskelfibre og muskel-resident fibroblaster) er indlejret i vært musklen, fibrose kan forekomme. Denne antagelse skal dog undersøges empirisk. Litteratur på muskelskader som følge af skadevoldende sammentrækninger, cryoinjury og eksperimenterende myotoxins, tyder på, at immun celler (hovedsagelig makrofager) er i stand til at effektivt clearing cellular vragdele fra beskadigede fibre og remodeling det ekstracellulær matrix18. Det er derfor muligt, at efter MIME og BaCl2 indsprøjtning, så længe værten immunceller har adgang til udarter donor muskelfibre, kunne de klare aflejringskegler, efterlod blot donor SCs. Endelig, omfanget af donor-stammer myogenesis er afhængig af mængden af donor muskelvæv, der er integreret i vært musklen. For at vært muskel rum til at være helt genbefolket af donor-celle-afledte myofibers, ville det kræve en metode som X - eller gamma-bestråling til ablate vært muskel SCs og også kræve gentagne MIME-procedurer.

Det er blevet påvist, at kirurgisk udsætter en vært musklen og suturering et stykke af donorvæv på vært muskel kan lette donor-celle-medieret myogenesis9,10,17. Denne åbne kirurgisk tilgang har været anvendt i tidligere til at spore udviklingen af myogenesis og til at generere musemodeller for menneskelig muskel sygdomme. Det innovative aspekt af MIME-teknik er, at det er minimalt invasiv og ikke indebærer kirurgisk udsætter vært muskel. Dette reducerer risikoen for iatrogen infektion og graden af ubehag i vært dyr, derfor at gøre det mere realistisk at udføre MIME gentagne gange på den samme vært muskel hvis nødvendigt.

Vi forventer, at MIME-teknik kan være et egnet raffinement åben kirurgisk tilgang, der er i øjeblikket følges for at implantat donor muskelvæv i en vært mus. Dette kunne fremskynde generation af humaniseret musemodeller, ved at integrere biopsi menneskelige muskel i vært mus muskel. Derudover forventer baseret på vores foreløbige data fra mus til mus podning, vi, at MIME vil være effektiv i at opnå donor-celle-medieret myogenesis fra menneskelige dødt donorvæv som donor SCs er levedygtige. Endelig, med yderligere test og validering, vi håber at MIME teknik vil hjælpe med at udvikle nye behandlingsformer for at lette donor-celle-medieret myogenesis hos mennesker med muskel sygdomme.

Succes af MIME-teknik er kritisk afhængige af netop indlejring donorvæv inden for den fascial rum (epimysium) host musklen. Kun hvis donorvæv placeres inden for værten muskel rum, vil det kunne give vært muskel SCs i en præcis måde. Hvis donorvæv er placeret uden for værten muskel, er det uklart, hvad der ville være sin skæbne. I vores eksperimentel model for MIME bruger vi TA muskel som vært muskel, da det er fremtrædende og overfladisk placeret i det anterolaterale aspekt af benet. Størrelse, retning og anatomisk stilling TA musklen, gør det nemt at bekræfte at donorvæv er placeret korrekt i vært TA muskel efter MIME. I dette papir, vi har givet eksperimentelle bevismateriale, donorvæv relysnettet indlejret i vært TA muskel på 3 dage efter MIME, og at der er donor-celle-medieret myogenesis i host muskel på 14 dage efter MIME.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev muliggjort af en Pilot-ydelse fra Alliancen til regenerativ rehabilitering forskning og uddannelse (AR3T) og et fakultet start pakke fra Wayne State University til KRUKKE. AR3T understøttes af Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health og menneskelige udvikling (NICHD), National Institute for neurologiske forstyrrelser og slagtilfælde (NINDS), og nationale Institut for biomedicinsk Imaging og bioteknologi (NIBIB ) af de nationale kontorer i sundhed under Award nummer P2CHD086843. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NSG-GFP mice The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) Stock #021937 Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein
C57BL/6J mice The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)  Stock #000664 Control donor mice
Tabletop isoflurane vaporizer  VetEquip (Livermore, CA) Item #901801 Inhaled anesthesia system
Magic depilatory crea Softsheen Carson (New York, NY) N/A Razorless hair removal cream
4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD) SUT106631 Guiding sutures for donor tissue
VetBond veterinary tissue adhesive 3M (Maplewood, MN) Catalog #1469Sb Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure
Barium chloride  Ricca Chemical Company (Arlington, TX) Product #R0854000-500A 854-16  Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration
Deltaphase isothermal gel heating pad  Braintree Scientific (Braintree, MA)  Item #39DP Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia
HM525NX cryostat   ThermoFisher (Waltham, MA) Catalog #HM525NX  Cryostat to make frozen sections of muscle
Vectashield Antifade Medium Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) Catalog Number: H-1000 Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples
Rabbit anti Desmin Antibody Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA) RB9014P Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling
Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody ThermoFisher (Waltham, MA) Catalog#: A-21069 Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)  Seracare (Milford, MA) Catalog #5930-0006 or 71-03-01 Reagent for fluorescent labeling of nuclei
Axio Scope.A1 microscope Carl Zeiss (Peabody, MA)  Product #Axio Scope.A1 Light and fluorescence microscope
Photoshop CS4 Adobe Systems (San Jose, CA) Photoshop CS4 Imaging Software for perform image tiling
Image J National Institutes of Health (Bethesda, MD) Image J for Windows 64-bit Operating System Imaging Software for quantitative fluorescence analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
  2. Robertson, T. A., Grounds, M. D., Papadimitriou, J. M. Elucidation of aspects of murine skeletal muscle regeneration using local and whole body irradiation. J Anat. 181 (Pt 2), 265-276 (1992).
  3. Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).
  4. Brack, A. S., Rando, T. A. Tissue-specific stem cells: lessons from the skeletal muscle satellite cell. Cell Stem Cell. 10 (5), 504-514 (2012).
  5. Krag, T. O., Hauerslev, S., Sveen, M. L., Schwartz, M., Vissing, J. Level of muscle regeneration in limb-girdle muscular dystrophy type 2I relates to genotype and clinical severity. Skelet Muscle. 1 (1), 31 (2011).
  6. Skuk, D., et al. Dystrophin expression in myofibers of Duchenne muscular dystrophy patients following intramuscular injections of normal myogenic cells. Mol Ther. 9 (3), 475-482 (2004).
  7. Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
  8. Sakellariou, P., et al. Neuromuscular electrical stimulation promotes development in mice of mature human muscle from immortalized human myoblasts. Skelet Muscle. 6 (1), 4 (2015).
  9. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
  10. Zhang, Y., et al. Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders. Hum Mol Genet. 23 (12), 3180-3188 (2014).
  11. Juhas, M., Engelmayr, G. C. Jr, Fontanella, A. N., Palmer, G. M., Bursac, N. Biomimetic engineered muscle with capacity for vascular integration and functional maturation in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5508-5513 (2014).
  12. Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution. Tissue Eng Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).
  13. Latil, M., et al. Skeletal muscle stem cells adopt a dormant cell state post mortem and retain regenerative capacity. Nat Commun. 3, 903 (2012).
  14. Maykel, J., et al. NOD-scidIl2rg (tm1Wjl) and NOD-Rag1 (null) Il2rg (tm1Wjl) : a model for stromal cell-tumor cell interaction for human colon cancer. Dig Dis Sci. 59 (6), 1169-1179 (2014).
  15. Casar, J. C., et al. Heparan sulfate proteoglycans are increased during skeletal muscle regeneration: requirement of syndecan-3 for successful fiber formation. J Cell Sci. 117 (Pt 1), 73-84 (2004).
  16. Hardy, D., et al. Comparative Study of Injury Models for Studying Muscle Regeneration in Mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
  17. Roberts, P., McGeachie, J. K., Grounds, M. D., Smith, E. R. Initiation and duration of myogenic precursor cell replication in transplants of intact skeletal muscles: an autoradiographic study in mice. Anat Rec. 224 (1), 1-6 (1989).
  18. Tidball, J. G. Mechanisms of muscle injury, repair, and regeneration. Compr Physiol. 1 (4), 2029-2062 (2011).

Tags

Medicin sag 126 skeletmuskulatur muskler regeneration muskel podning satellit celler myogenesis muskel sygdom minimalt invasive muskel indlejring
Minimalt Invasive muskel Embedding (MIME) - en roman eksperimentel teknik til at lette Donor-celle-medieret Myogenesis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roche, J. A., Begam, M., Galen, S.… More

Roche, J. A., Begam, M., Galen, S. S. Minimally Invasive Muscle Embedding (MIME) - A Novel Experimental Technique to Facilitate Donor-Cell-Mediated Myogenesis. J. Vis. Exp. (126), e55731, doi:10.3791/55731 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter