Summary
We beschrijven een nieuwe experimentele techniek die wij minimaal invasieve spier insluiten (MIME), die is gebaseerd op het bewijsmateriaal bellen dat skelet spierweefsel levensvatbare myogenic cellen, die vergemakkelijken donor-cel-gemedieerde myogenesis bevat kunnen wanneer ingeplant een host spier.
Abstract
Skeletspieren bezit regeneratief vermogen als gevolg van weefsel-ingezeten, spier vezel-genererende (myogenic) satelliet cellen (gcv), die nieuwe spiervezels onder de juiste omstandigheden kan vormen. Hoewel SCs kunnen worden geoogst van spierweefsel en in vitro gekweekt, zijn de resulterende myoblast cellen niet zeer effectief in het bevorderen van myogenesis als in host spier getransplanteerd. Operatief bloot van de host-spier en enten van segmenten of donor spierweefsel, de geïsoleerde spiervezels met hun SCs op host spier, bevordert betere myogenesis in vergelijking met myoblast transplantatie. We hebben een nieuwe techniek die wij minimaal invasieve spier insluiten (MIME noemen) ontwikkeld. MIME omvat het passeren van een chirurgische naald door de host-spier, tekening van een stuk van donor spierweefsel via de naald weg en dan het verlaten van het donorweefsel die is ingesloten in de host-spier, zodat het als een bron van SCs voor de host spier fungeren kan. Hier beschrijven we in detail de stappen betrokken bij het uitvoeren van MIME in een immunodeficiëntie muismodel die een groen fluorescente proteïne (GFP) uitdrukt in alle van de cellen. Immuundeficiëntie in de host-muis vermindert het risico van immuun afwijzing van het donorweefsel en GFP expressie kunt gemakkelijke identificatie van de host spiervezels (GFP +) en de donor-cell-derived spiervezels (GFP-). Onze pilot gegevens suggereren dat MIME kan worden gebruikt om het implantaat een extensor digitorum longus (EDL) spier van de muis van een donor in de tibialis anterior (TA) spier van de muis van een host. Onze gegevens suggereren ook dat wanneer een myotoxin (bariumchloride, BaCl2) wordt geïnjecteerd in de host-spier na MIME, er bewijs van donor-cell-derived in de host-spier, met ongeveer 5%, 26%, 26% en 43% van de vezels in één host TA myogenesis is spier tonen geen host bijdrage, minimale host bijdrage, matige host bijdrage en maximale host bijdrage, respectievelijk.
Introduction
Gezonde skeletspieren, alhoewel na mitotische, bezit uitstekende regeneratief vermogen als gevolg van de aanwezigheid van weefsel-ingezeten myogenic cellen bekend als satelliet cellen (gcv)1,2; en gerecenseerd in3,4. Echter, onder pathologische omstandigheden veroorzaakt door muscular dystrophie, trauma of versnelde veroudering, de regeneratie van de spier mogelijk niet bijbenen spier verdeling, en zo progressieve spiervezel verlies treedt op5. Hoewel het effectieve methoden zijn ontwikkeld om te isoleren van SCs van spier en hen uit te breiden in cultuur voor het genereren van grote aantallen myoblasts (en later myotubes), hebben pogingen voor het genereren van fysiologisch relevante nummers van spiervezels in host spier leverde slechts minimale succes6. Als met veel andere celtypen, doen wanneer myoblasts alleen worden ingespoten in gastheer weefsel, allermeest naar de cellen niet engraft7,8. We hebben aangetoond dat neuromusculaire elektrische stimulatie (NMES) vergemakkelijkt donor-cell-derived myogenesis in regeneratie-deficiënte host muis spier die werd ingespoten met menselijke myoblasts8. Anderen hebben aangetoond dat operatief praktijk biopsied spier of enkele spiervezels met bijgevoegde SCs, gematigde myogenesis zelfs zonder NMES, wat suggereert dat het implanteren van hele spiervezels met SCs voordeliger dan het implanteren wellicht vergemakkelijken myogenic cellen alleen9,10. Aangezien de donor of gemanipuleerde spierweefsel op host spier geënt betere resultaten produceert dan het transplanteren van cellen alleen, is het mogelijk dat weefsel of weefsel-achtige structuren cruciale aanwijzingen voor donor-cel engraftment geven kunnen; een concept dat is steeds duidelijker in celtherapie studies waarbij verschillende cel typen10,11,12.
Recente gegevens suggereren dat SCs verkregen mens meer dan 2 weken na het slachten myotubes in cultuur13 genereren. Daarom zullen wij beoordelen of innesteling van spier weefsel geoogst post mortem in een levende gastheer spiervezel verlies zal worden afgewikkeld. We hebben een nieuwe techniek genaamd MIME om het implantaat donor spierweefsel in skeletspieren weefsel van een levende gastheer ter bevordering van de donor-cell-derived myogenesis ontwikkeld. MIME impliceert het passeren van een chirurgische naald door de host spier maken een naald track; tekening van een klein segment van donor spierweefsel via de naald weg; verlaten van het donorweefsel ingebed in de spier van de gastheer; en sluiten de naald gaatjes met weefsel lijm. Nadat het beoefenen van de techniek in muizen euthanized studeerde in andere experimenten, we hebben nu uitgevoerd MIME in levende muizen die immunodeficiëntie en overal express een groen fluorescente proteïne (GFP) en follow-up op 3 en 14 dagen na MIME. 3 dagen na MIME bevestigen wij dat de donor muis (GFP-) EDL spier host muis (GFP +) TA spier, blijft ingebed in de spieren van de host ingeplant. Bij 14 dagen na MIME, bevestigen na BaCl2 myotoxin schade aan het veroorzaken van schade en myogenesis, wij dat ongeveer 5%, 26%, 26% en 43% van de vezels in één host TA spier geen host bijdrage, minimale host bijdrage, matige ontvangst bijdrage en maximale host bijdrage, respectievelijk. Centrale nucleatie (een marker van degeneratie en regeneratie van de latere) is te zien in ongeveer 95% van de spiervezels TA na injectie van MIME en myotoxin.
We bestuderen TA spieren 14 dagen na MIME + BaCl2 omdat dit punt van tijd de tussenfase van de regeneratie, vangt wanneer een meerderheid van de geregenereerde vezels zijn centraal nucleated. We bestuderen GFP + muizen als gastheer voor MIME, zodat wanneer we uiteindelijk transplantatie van menselijke dode foetussen spier in host muizen, zullen we kunnen gemakkelijk onderscheiden spiervezels van host- en donor oorsprong. We gebruiken de muis EDL spier als de experimentele donorweefsel, aangezien enkele vezels van deze spier is groter myogenic potentieel dan TA spieren9gebleken. De EDL spier is ook synergetische naar de TA-spier en heeft dezelfde type vezel samenstelling. Onze voorlopige gegevens suggereren dat MIME kunnen vergemakkelijken van donor-cell-derived myogenesis in de spier van de gastheer.
Protocol
alle studies met betrekking tot levende dieren zijn goedgekeurd door de instelling Animal Care en gebruik Comité (IACUC) aan de Wayne State University, Detroit, Michigan, USA, en zijn in overeenstemming met de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren ( 8ste editie, 2011, gepubliceerd door de National Academies Press, 500 vijfde Street NW, Lockbox 285, Washington, DC 20055, USA). Volgens de goedgekeurde IACUC-protocollen, werden procedures waarbij pijn en/of nood uitgevoerd onder narcose, die wordt geïnduceerd en onderhouden door Isofluraan inademing (1.5-5% daartoe). Anesthesie werd gecontroleerd door gebrek terugtrekking tot teen snuifje, en van ooglidreflex of snorharen Reacties (het percentage van Isofluraan werd verhoogd als nodig om effect). De minimaal invasieve karakter van de protocollen, een " steriel tips " techniek werd gevolgd. Terwijl dieren onder verdoving waren, werd vaseline toegepast op de ogen om te voorkomen dat droogte. Geen speciale behandelingen waren noodzakelijk zijn; dieet gel was evenwel tot aan de dieren gedurende 24 uur volgens procedures die algemene anesthesie. de onderzoeker is goedgekeurd door de IACUC te weigeren analgesie na MIME, aangezien de procedure houdt niet operatief bloot de host spier, omdat het is beperkt tot één stuk en heeft geen invloed op de normale functie, en omdat veel gemeenschappelijk pijnstillende geneesmiddelen zijn gekend om te beïnvloeden van normale spier regeneratie.
1. Diermodellen
- Host muizen voor MIME-
- gebruik NSG-GFP muizen (8-10 week, mannelijke) als gastheer voor de spier explantaten studies.
Opmerking: Deze muizen zijn ideale hosts voor allogene spier explantaten omdat ze gebrek aan volwassen T en B-lymfocyten en functionele natural killer cellen tekort aan cytokine signalering zijn en door anderen werden gebruikt voor allografting of xenografting niet-spiercellen < sup Class = "xref" > 14. Alomtegenwoordige GFP expressie zorgt voor gemakkelijke identificatie van de host (GFP +) en (GFP-)-spiervezels's donor-cell-derived.
- gebruik NSG-GFP muizen (8-10 week, mannelijke) als gastheer voor de spier explantaten studies.
- Donor muizen voor MIME-
- gebruik C57BL/6J muizen (12-16 week) als donor muizen.
Opmerking: Deze muizen zijn geschikte donor muizen omdat ze een volledig toegewezen genoom hebben, is niet bekend dat er eventuele pathologie van de skeletspieren, gemakkelijk beschikbaar en zuinig zijn en doen niet express GFP.
- gebruik C57BL/6J muizen (12-16 week) als donor muizen.
2. Voorbereiding van Donor spierweefsel
- koppelverkoop leidende hechtingen en opruiming donor EDL spieren
- euthanaseren de donor muizen door cervicale dislocatie en Thoracotomie uitgevoerd onder algehele narcose toegediend door een tafelblad Isofluraan vaporisator gedreven door medische zuurstof (geïnhaleerde Isofluraan; 2-5% daartoe).
- Tot de spieren EDL, gebruiken een paar chirurgische schaar te openen van de huid over het voorste oppervlak van het been. Zoek het TA-spier in het voorste been en verwijder deze om te visualiseren de EDL spier die achter de spier TA ligt. Schuif het uiteinde van een paar pincet achter de spier EDL en zachte tractie om te zien als de tenen uitbreiden van toepassing (dit bevestigt dat de spier de EDL is).
Opmerking: donorgebied weefsel moet operatief, aseptisch klaargestoomd voorafgaand aan de oogst. - Gebruik ~ 10 cm segmenten van de zijde van de 4-0, gevlochten, niet-absorbeerbare, steriel hechtdraad en maak twee dubbele knopen toe te passen van de leidende hechtingen op de proximale en distale pezen van de EDL spier. ( figuur 1A).
- Knippen van de distale pees EDL, weerspiegelen de EDL spier en knippen van de proximale pees.
- Plaats de donor EDL in een petrischaal spieren gevuld met muis Ringer oplossing.
3. Voorbereiding van Host muizen voor MIME-
- verdoving
- plaats van de muis van de host onder algemene verdoving (geïnhaleerde Isofluraan; 1.5-5% daartoe) wordt beheerd door een tafelblad Isofluraan vaporizer gedreven door medische zuurstof.
- Veroorzaken van verdoving in de zaal van een inductie en breng de muis naar een neus-kegel te handhaven van de narcose tijdens het uitvoeren van andere procedures op het dier. Thermische ondersteunen met een isothermische gel verwarming pad terwijl het dier onder verdoving is.
- Huid voorbereiding
- te verwijderen van het dier ' s bont, breng een ontharende room over de voorste aspect van de linker achterpoot. Het rechterbeen dient als een controle-been voor latere procedures.
- Laat de ontharende room op 2 min. schone uit de ontharende room samen met de vrijstaande bont met doekjes gedrenkt in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Na verwijdering van de bont, scrub de huid met drie afwisselende doekjes van Povidon-jodium schrobben oplossing en 70% ethanol.
- Maken van een track van de naald in de spier host TA
- Pass een 18-gauge (1 in lang) chirurgische naald door het midden van de host TA spier langs de spier ' s lange as ( figuur 1B). Passeren van de naald in wezen-caudal richting, langs de lengte van de spier TA, en door het midden van de buik van de spier ( figuur 1B).
Opmerking: Het doel van deze stap is om te maken een naald track, waarin een stuk van de spier van de donor kan worden ingesloten. Insluiten van het donorweefsel in het midden van de TA spier zou mogelijk maakt het SCS systeem van het donorweefsel migreren en vergemakkelijken van myogenesis over de gehele Heerscharen TA spier.
- Pass een 18-gauge (1 in lang) chirurgische naald door het midden van de host TA spier langs de spier ' s lange as ( figuur 1B). Passeren van de naald in wezen-caudal richting, langs de lengte van de spier TA, en door het midden van de buik van de spier ( figuur 1B).
- Embedding donorweefsel in het spoor van de naald van host TA spier
- zodra de chirurgische naald binnen de host TA spier is, passeren de leidende hechtingen aan het ene uiteinde van het donorweefsel via de lumen van chirurgische naald in een caudo-cephalic richting ( Figuur 1 c).
- Tekenen van het donorweefsel via de naald weg als de naald is onttrokken aan de host TA spier in een caudo-cephalic richting.
- Met de leidende hechtingen aan de caudal en cephalic uiteinden van het donorweefsel kunt u de plaatsing van het donorweefsel. Zorgen dat de donorweefsel is genesteld binnen de host TA spier ( Figuur 1 d).
- Zodra de donor weefsel plaatsing is geoptimaliseerd, afgesneden van de leidende hechtingen, het maken van eventuele definitieve aanpassingen van de donor weefsel plaatsing met een boete-tipped Tang.
- Zegel cutane naald wonden ( figuur 1E -F) door de onderlinge aanpassing van de rand van de wond met een tang en toepassing van de veterinaire weefsel lijm met het puntje van een 27-gauge chirurgische naald.
4. Intramusculaire injectie van de Myotoxin induceren gezamenlijk spier degeneratie en regeneratie
- na MIME, injecteren de host TA spier voor het opwekken van uitgebreide spiervezel schade in de spier host 50-60 µL van 1,2% BaCl 2 (myotoxin) en de donorweefsel ingebed in het 15.
- Injecteren BaCl 2 op 3 locaties langs de lengte van de host TA spier (proximale, distale en middelste eenderde van de spier buik).
Opmerking: Injecteren van myotoxins zoals BaCl 2, cardiotoxins en notexin in skeletspieren induceert gezamenlijke spiervezel schade gevolgd door regeneratie 16.
- Injecteren BaCl 2 op 3 locaties langs de lengte van de host TA spier (proximale, distale en middelste eenderde van de spier buik).
5. Post procedurele Animal Care
- na MIME en BaCl 2 injectie, schoon de host muis ' s links hind been met ethanol en breng een dunne laag van vaseline ter bescherming van de huid.
- Na post procedurele huidverzorging, de gastheer-muis te verwijderen uit de neus kegel.
- Plaatst u de muisaanwijzer in een kooi van de eenzame herstel zonder strooisel. Bieden thermische ondersteuning aan het herstellende dier door middel van een isothermische gel verwarming pad geplaatst onder de helft van de kooi herstel.
Opmerking: Een helft is niet verwarmd dus dat dier kan bewegen uit de buurt van de verwarming pad desgewenst.
Het dier terug - nadat de host muis is volledig hersteld van anesthesie, naar zijn oorspronkelijke kooi. Plaats het dier terug in het dier faciliteit tot follow-up experimenten worden uitgevoerd. De host-muis dagelijks volgen totdat het klaar voor de follow-up is – voorbeeld: op 3 of 14 dagen na MIME. Naar aanleiding van MIME, dieren worden gecontroleerd door laboratoriumpersoneel evenals door veterinaire personeel – hierbij vooral beoordelen als dieren licht, alert en ontvankelijk zijn; en ook beoordelen als dieren openlijke van pijn tekenen zijn of verplaatsen moeite, voeding, drinken en grooming.
6. Weefsel collectie
- opruiming host spier
- euthanaseren de host muizen door cervicale dislocatie en Thoracotomie uitgevoerd onder algehele narcose toegediend door een tafelblad Isofluraan vaporizer gedreven door medische zuurstof ( geïnhaleerde Isofluraan; 2-5% daartoe). de onderzoeker heeft ook IACUC goedkeuring aan oogst TA spieren onder algemene anesthesie voordat euthanasie.
- gebruiken voor toegang tot de host TA spieren, een paar chirurgische schaar te openen van de huid over het voorste oppervlak van het been. Zoek het TA-spier in het voorste been, gesneden van de distale pees, weerspiegelen de spier en knippen van de bijlagen van de proximale spieren (zie punt 2.1).
- Verzamelen zowel links (experimenteel) en rechts (control) TA spieren.
- Snap bevriezing geoogste spieren
- wegen de geoogste spieren door te plaatsen op papier wegen en wegen schaal.
- Kort Dompel de spieren in minerale olie voor cryoprotection. Uit de overtollige olie vlek.
- Plaats spieren op aluminiumfolie, en snap bevriezen de spieren door hen snel onder te dompelen in vloeibare stikstof gevuld in een Dewar. De monsters overbrengen in gelabelde cryovials en opslaan van de monsters in een vriezer-80 ° C voor latere studies.
7. Histologische Studies
- Cryosectioning spierweefsel te verzamelen van seriële kruissecties
- overbrengen in de monsters uit de diepvries-80 ° C een cryostaat door ze te plaatsen in een Dewar met vloeibare stikstof.
- In de cryostaat, één monster te behandelen op een moment. Snijd met een koude scheermesje (mes opgeslagen in cryostaat), het monster twee keer bij de halverwege buik van de spier TA voor de productie van een segment van de spier die is ongeveer 1-2 mm dik. Houd dit segment voor het maken van de cryostaat secties en de resterende gedeelten van spier terug te keren naar zijn cryovial.
- Met de optimale snijden temperatuur (OCT) bevriezing samengestelde, secure het dikke segment van weefsel op een cryostaat specimen schijf. Plaats de disc van het specimen op de monsterhouder.
- Ruw-gezicht het monster door 20 µm-secties snijden. Verzamelen van een paar 20 µm secties op glas dia's voor de secties van de cryostaat.
- Als de kwaliteit van de 20 µm secties bevredigend is, de snijdikte omzetten in 5 µm en verzamelen van een paar secties om te beoordelen van de kwaliteit. Als de 5 µm secties bevredigend in kwaliteit zijn, verzamelen seriële secties. 2-3 secties per dia verzamelen en het verzamelen van genoeg secties voor 3 dia.
- Verzamelen secties van zowel de experimentele (links) en de controle (rechts) TA spieren van elk dier.
- Studeren GFP expressie
Opmerking: een verzameling van de voorbereide dia's (sectie 7.1) studeren GFP expressie in de spiervezels.- ~ 50 µL van anti-fade medium van toepassing op de secties en breng een dekglaasje glas aan. Zegel van het dekglaasje aan randen met duidelijke nagellak.
- Met behulp van de lichte en fluorescente microscoop (Zie Tabel of Materials), studie van de secties met een 10 X doelstelling en een geschikte filter voor het visualiseren van GFP.
- Collect digitale beelden (~ 15) van overlappende visual velden ter dekking van de gehele dwarsdoorsnede van de spier TA. De fase contrast beelden voor elk van de velden van visual verzamelen door het overschakelen van fluorescentie fase contrast modus op de Microscoop.
- Open afbeeldingen met een geschikte imaging software die kan tegel afzonderlijke beelden te produceren van één samengestelde afbeelding; bijvoorbeeld, gebruik de " photomerge " optie onder het Menu bestand in de beeldbewerkingssoftware vermeld in de Tabel of Materials.
- Open de GFP fluorescentie afbeeldingen met de software van de analyse van een geschikte afbeelding (bijvoorbeeld ImageJ). Het afzonderlijke spiervezels cirkel met behulp van de " ROI tool " en opnemen van de intensiteit van de fluorescentie betekenen voor elke vezel.
- Berekenen de maximale GFP (fluorescentie) intensiteit door het nemen van het gemiddelde van de intensiteit van de fluorescentie betekenen van 10 vezels die hoge GFP expressie weergeven en normale morfologie. Bereken het % GFP maximumlichtsterkte van elke vezel door de intensiteit van de bloeien betekenen voor elke vezel te delen door de maximumlichtsterkte van GFP en te vermenigvuldigen met 100. De resultaten van de analyse van de GFP voor elke spier TA tabulate, zoals weergegeven in figuur 3E.
- Analyse van spiervezel integriteit en myonuclear locatie door middel van immunefluorescentie etikettering van desmin en 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), respectievelijk.
Opmerking: Voorgedragen één van de dia's opgesteld, zoals hierboven, om te studeren het labelen van de desmin in de spiervezels.- Fix secties met 2% paraformaldehyde in PBS voor 10 min. wassen de secties driemaal met PBS.
Let op: Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) bij hantering bij het verwerken van paraformaldehyde. - Blok secties met 3% bovien serumalbumine verdund in PBS met 0,01% Triton-X100 voor 30 min. Deze blokkering oplossing is hierna de primaire verdunningsmiddel.
- Verdund het konijn anti-desmin immunoglobuline G (IgG) in de primaire verdunningsmiddel (1:200).
- Als de blokkering is voltooid, de verdunde primaire antilichamen van toepassing op secties en na een nacht bebroeden in een koelkast op ~ 4 ° C. Wash de secties eenmaal (5 min) met PBS met 0,1% Triton X-100. Deze oplossing is hierna de eerste was buffer.
- Wassen van de secties 3 keer (5 min per wasbeurt) met PBS.
- Voorbereiden het secundaire antilichaam door verder verdunnen van geit anti konijn IgG (geconjugeerd met rode fluorescerende kleurstof) in PBS met 0,01% Triton X-100.
- Toepassing van de verdunde secundair antilichaam op de secties en Incubeer bij kamertemperatuur (~ 23 ° C) voor 60 min.
- Wassen de secties eenmaal (5 min) met de eerste was buffer. Wassen van de secties 3 keer (5 min per wasbeurt) met PBS.
- Toepassen DAPI voor 3 min. wassen de secties 3 keer (1 min per wasbeurt) met PBS. Toepassing ~ 50 µL van het anti-vervagen-medium op de secties en breng glas dekglaasje aan. Zegel van het dekglaasje aan randen met duidelijke nagellak.
- Met behulp van de lichte en fluorescente microscoop (Zie Tabel of Materials), studie de seriële secties met een 10 X doelstelling en een geschikte filter voor het visualiseren van rode fluorescerende kleurstof.
- Verzamelen de digitale beelden (~ 15) van de overlappende visual velden ter dekking van de gehele dwarsdoorsnede van de spier TA. Verzamelen van de beelden van de fluorescentie van de DAPI labeling voor elk van de velden van visual door over te schakelen naar de instelling van de gewenste filteractie.
- Open en analyseren van de beelden met behulp van een geschikte imaging software zoals beschreven in stappen 7.2.3 - 7.2.4.
Opmerking: Studeren beelden te identificeren, welke spiervezels zijn beschadigde (desmin negatieve), welke spiervezels hebt Centraal nucleatie (desmin positieve vezels die DAPI-geëtiketteerden kernen gelegen intern in plaats van ook hebben) en, welke gebieden van de sectie ontsteking en/of fibrose (gebieden die veel DAPI-geëtiketteerden kernen samen een cluster vormen, maar zijn verstoken van spiervezels).
- Fix secties met 2% paraformaldehyde in PBS voor 10 min. wassen de secties driemaal met PBS.
Representative Results
Op 3 dagen na MIME, is de donor EDL die is geïmplanteerd door MIME vervat in de host TA spier compartiment (figuur 2A-C). Zoals verwacht, de cross-secties van de spier TA van donor muizen, studeerde onder fluorescentie optica, vertonen geen groene fluorescentie omdat ze doen niet uiten GFP (figuur 2D). De cross-secties van de spier TA van host muizen die niet zijn geïmplanteerd met donorweefsel, Toon daarentegen uniforme groene fluorescentie in de TA spiervezels, zoals de vezels express GFP (figuur 2E). In de cross-secties van spieren ingeplant door MIME met donor spierweefsel, is er een lijn van de afbakening tussen de host spiervezels (GFP +) en de donor spiervezels (GFP-). De fase contrast beelden van de visual velden weergegeven in figuur 2D--F worden gepresenteerd in figuur 2E'-F' en suggereren dat er inderdaad sprake zijn van spiervezels die aanwezig zijn in de regio's waar er geen GFP signaal.
14 dagen na MIME en BaCl2 injectie, door het bestuderen van seriële Kruis secties van de TA spier die worden achtergelaten ongelabelde of zijn gelabeld met antilichamen tegen desmin (Figuur 3), leren we dat het GFP-signaal wordt uitgedrukt door de spiervezels in de onbehandelde spier van host muizen, maar niet in de MIME-behandelde spier (rode desmin labeling detecteert levensvatbare spiervezels). In de host TA spier behandeld met MIME en BaCl2 injectie, de donor-cell-derived myogenesis blijkt uit de aanwezigheid van vele desmin(+) spiervezels die geen detecteerbare GFP-signaal tonen (Figuur 3 c-D, 3 C' -D'). Chimeer spiervezels die voortvloeien uit de waarschijnlijke versmelting van de host en donor myogenic cellen kan worden gedetecteerd door de lage tot gematigde niveaus van GFP fluorescentie tentoongesteld door deze vezels. Talrijke chimeer vezels staan langs de gehele diameter van de TA spier suggereren dat de donor SCs geschikt zijn voor het migreren van honderden micron binnen het epimysium van de spier van de gastheer. Kwantificatie van GFP + vezels wordt weergegeven in figuur 3E. Figuur 4 toont beelden van de hoge vergroting van seriële doorsneden van een volledige MIME + BaCl2 behandeld TA spier.
Figuur 1 . Stappen in minimaal invasieve spier insluiten (MIME).
MIME is onder algemene verdoving uitgevoerd. Het gaat om het plaatsen van ~ 10 mg van donor spier (donor muis EDL) in Ringer-oplossing en koppelverkoop de leidende hechtingen aan de uiteinden (A). Een 18-gauge-naald wordt doorgegeven door de lange as van de spier van de host (B) en de donorweefsel wordt getekend door de naald track (C). De donorweefsel is links ingebed in de spieren van de host (D), de leidende hechtingen worden gesneden en de naald gaatjes worden afgedicht met weefsel lijm (E). De verzegelde naald wonden worden aangegeven met pijlen (F). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Studies van de spier TA 3 dagen na MIME.
Host spier verzameld 3 dagen na MIME; Opmerking naald merken op host TA (pijlen; A-B). Verdere gegevens bevestigen dat de ingesloten donor muis EDL is genesteld binnen de TA spier compartiment (B-C). Fluorescentie beelden van TA spier doorsneden tonen geen groene fluorescentie in wild-type TA spier (D), helder groen fluorescentie in NSG-GFP TA spier (E)en een onderscheid tussen host en donor spier in NSG-GFP TA spier op 3 dagen post MIME (F). De fase contrast beelden van de visual velden in D-F staan in D'-F', respectievelijk. De rode lijn in deelvensters, F en F' toont de lijn van de afbakening tussen de host en donor weefsel. Schaal bar = 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Studies van TA spier 14 dagen na MIME.
Gegevens verzameld 14 dagen na MIME worden gepresenteerd. Het rood signaal is van immunefluorescentie etikettering van desmin (een positief signaal voor desmin betekent dat myofibers levensvatbaar zijn), het blauwe signaal is van de DAPI (vlekken kernen) en het groene signaal is van GFP. In de spier in (juiste stuk) van het besturingselement TA geoogst uit de host-muis, zoals verwacht, zijn bijna alle myofibers positief voor desmin, suggereren dat deze myofibers levensvatbare (A; rood signaal). Bovendien, op basis van de DAPI kleuring, het is duidelijk dat myonuclei van bijna alle myofibers zich ook bevinden, zoals zou worden verwacht in gezonde spier (A; blauw signaal). Seriële secties van de spier controle TA laten zien dat bijna alle spiervezels helder groen zijn, wat inhoudt dat ze positief voor GFP zijn. In MIME + BaCl2 -behandeld TA spier (linker stuk), donor-cel-gemedieerde myogenesis blijkt uit de aanwezigheid van vele desmin(+) spiervezels die geen detecteerbare GFP-fluorescentie tonen (C-D, C'-D'). De spiervezels Desmin(+) met lage tot matige GFP fluorescentie (chimeer spiervezels) zijn aanwezig in de diameter van de gehele TA spier, suggereren dat MIME biedt donor SCs die kunnen migreren binnen het epimysium van de TA-spier en bevorderen donor-cell-derived myogenesis. A'-D' zijn high-vergroting beelden van de regio's binnen de blauwe dozen in A-D. Kwantificatie van GFP(+) vezels en Centraal genucleëerde vezels staan in E. Schaal bars = 100 µm (A-D) en 50 µm (A'-D'). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
RC="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55731/55731fig4.jpg" / >
Figuur 4 . Bewijs van wijdverspreide schade en regeneratie 14 dagen na MIME en BaCl2 injectie.
Hoge vergroting, seriële doorsneden van een volledige MIME + BaCl2 behandeld TA spier worden gepresenteerd. Uit de gegevens blijkt dat vele spiervezels, die matig of sterk GFP + centraal kernen hebben gelegen (A-B; rood signaal in A is van desmin, blauwe signaal in A is van DAPI en groene signaal in B is van GFP). Deze gegevens duiden erop dat degeneratie en regeneratie na BaCl2 injectie heeft geen invloed op het GFP-expressie. In deze context, de aanwezigheid van centraal genucleëerde spiervezels in MIME + BaCl2 behandeld TA spier, met weinig tot geen GFP expressie, suggereert dat deze vezels waarschijnlijk of het resultaat van myogenesis (regeneratie zijn) met grote bijdrage van de GFP - myogenic cellen. Deze opmerkingen kunnen verder worden geverifieerd in hoge vergroting beelden van geselecteerde velden (C-F; C en D, en E en F, respectievelijk, zijn overlappende gebieden van seriële doorsneden; kleurcodering van afbeelding randen geven de locatie van deze regio's in A en B). Schaal bars = 100 µm (A-B) en 50 µm (C-F). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de nieuwe experimentele techniek die bekend staat als MIME, ontwikkeld in ons laboratorium, implantaat donor spierweefsel in host spierweefsel. Dit is een aanpassing van een open spier enten techniek die heeft bewezen effectief te zijn in het bevorderen van donor-cel-gemedieerde myogenesis in een host spier9,10,17.
Het doel van MIME is niet in te schakelen van de engraftment van de donor spierweefsel zelf in de spier van de host (op dit moment weten we niet als dit gebeurt), maar eerder om een bron van donor SCs die kunnen bijdragen aan de myogenesis in de spier van de host onder voorwaarden die m stimuleren uscle de regeneratie. Onze hoop is dat nadat MIME is geoptimaliseerd en getest in basis- en preklinisch onderzoek, het zou kunnen waardevolle inzichten om te begeleiden van klinische therapieën gericht bieden op het verhogen van de regeneratie van de spier in skeletspieren die myogenic spier verlies hebben ondergaan.
Er zijn tal van vragen die nog moeten worden beantwoord met betrekking tot hoe MIME kon worden vertaald in een klinische therapie, bijvoorbeeld: hoe zouden we de controle van de kwaliteit van het donorweefsel? Hoe zouden we immuun afwijzing van donor weefsels en cellen controleren? Is de donorweefsel uitgeschakeld na het verstrekken van cellen voor myogenesis of laat het achter een fibrotische litteken? Beïnvloedt de type vezel van donor en/of host spier de donor-cel-gemedieerde myogenesis? Welke spieren kunnen praktisch profiteren van MIME? We zijn momenteel onze studies om te beoordelen of MIME is veilig en effectief, het identificeren van adjuvante behandelingen die kunnen vergroten donor afkomstige myogenesis, en antwoord op veel van de vragen, bovengenoemde uitbreiden.
Na het voltooien van onze tests van muis-tot-muis allogene transplantatie met MIME, is onze volgende stap het uitvoeren van mens-tot-muis MIME met menselijk weefsel van dode foetussen om te evalueren van het myogenic potentieel van dode foetussen spierweefsel. Wij verwachten dat deze experimenten zal leiden tot een nieuwe lijn van fundamenteel en translationeel onderzoek, waarbij spierweefsel van donoren, die zijn ingeschreven in initiatieven zoals de Body legaat programma voor onderwijs en het programma van de Gift van het leven voor orgaandonatie .
De representatieve gegevens gepresenteerd in dit manuscript suggereren dat na 14 dagen na MIME, er zijn verschillende levensvatbare myofibers die gebrek aan GFP hetzij hebben lage niveaus van GFP. Onze interpretatie van deze gegevens is dat GFP-donor satelliet cellen aan de myogenesis in de spier van de gastheer bijgedragen. We dit experiment uitgevoerd ter voorbereiding van het implanteren van menselijk weefsel van dode foetussen in een host muis spier. Om aan te tonen ondubbelzinnig dat de donor satelliet cellen bijdragen aan myogenesis in de host-spier na MIME, zou het nuttig zijn om te inplanteren donorweefsel die een fluorescerende verslaggever, die kan gemakkelijk worden onderscheiden van GFP (b.v.uitdrukt, rood fluorescerend eiwit donorweefsel GFP + host spier ingeplant uitdrukken).
Deze techniek wordt vooral beperkt door de aard van de SCs aanwezig in de donorweefsel. Als de SCs in het donorweefsel levensvatbare, dat de techniek is waarschijnlijk ter vergemakkelijking van de donor-cel-gemedieerde myogenesis, terwijl als zijn ze niet rendabel, myogenesis zich niet voordoen. Aangezien echter SCs zijn zeer veerkrachtig en levensvatbaar is voor ongeveer 2 weken na het slachten, het is zeer waarschijnlijk dat voor experimentele doeleinden, het donorweefsel die is geïmplanteerd binnen een paar minuten na de oogst donor-cel-gemedieerde myogenesis13 vergemakkelijken zal . Bovendien, zoals zinspeelde op bovenstaande, is het mogelijk dat sinds het hele spierweefsel (dat bevat SCs, volwassen spiervezels, evenals spier-ingezeten fibroblasten) is ingebed in de host-spier, fibrose kan optreden. Deze veronderstelling moet echter worden empirisch onderzocht. De literatuur over spier schade ten gevolge van schadelijke contracties, cryoinjury en experimentele myotoxins, suggereert dat immuuncellen (voornamelijk macrofagen) kunnen effectief clearing cellulaire puin van de beschadigde vezels en het remodelleren van de extracellulaire matrix18. Het is daarom mogelijk dat na MIME en BaCl2 injectie, zolang de immuun cellen van de gastheer toegang tot degenererende donor spiervezels hebben, ze kon duidelijk puin, gewoon de donor SCs achterlatend. Ten slotte, de omvang van de donor-afgeleide myogenesis is afhankelijk van de hoeveelheid donor spierweefsel dat is ingebed in de spieren van de host. Om de host spier compartiment volledig tekstindex door donor-cell-derived myofibers, zou het een methode zoals X - of gamma-bestraling lasertherapie host spier SCs en ook vereisen herhaalde MIME procedures vereisen.
Het is aangetoond dat operatief bloot een host spier en wordt een stukje donorweefsel op de host-spier donor-cel-gemedieerde myogenesis9,10,17kunnen vergemakkelijken. Deze open chirurgische benadering heeft in het verleden is gebruikt voor het bijhouden van de voortgang van myogenesis en voor het genereren van Muismodellen van menselijke spier ziekten. Het innovatieve aspect van de MIME-techniek is dat het minimaal invasieve en houdt niet operatief bloot de host spier. Dit vermindert het risico van iatrogene infecties en de mate van ongemak in de host-dier, dus waardoor het meer haalbaar MIME herhaaldelijk op de dezelfde host spier uitvoeren indien nodig.
Wij verwachten dat de MIME-techniek een geschikte verfijning van de open chirurgische aanpak die momenteel wordt gevolgd wellicht om het implantaat donor spierweefsel in de muis van een host. Dit kan de generatie van gehumaniseerd muismodellen, versnellen door inbedding biopsied menselijke spier in de host muis spier. Bovendien, verwachten gebaseerd op onze voorlopige gegevens uit het muis-tot-muis enten, we dat MIME doeltreffend zullen voor het bereiken van donor-cel-gemedieerde myogenesis van menselijk donorweefsel voor dode foetussen, zo lang als donor SCs levensvatbaar zijn. Tot slot, met extra testen en valideren hopen we dat de MIME-techniek ontwikkelen van nieuwe therapieën helpen zal om donor-cel-gemedieerde myogenesis bij mensen met ziekten van de spier.
Het succes van de MIME-techniek is kritisch afhankelijk van het donorweefsel binnen de fasciaal compartiment (epimysium) van de host-spier juist te embedding. Alleen als de donorweefsel wordt geplaatst binnen de gastheer spier compartiment, zullen het kunnen bieden van SCs aan de host spier op een nauwkeurige wijze. Als de donorweefsel wordt geplaatst buiten de gastheer spier, is het onduidelijk wat haar lot zou zijn. In onze experimenteel model voor MIME-gebruiken we de TA spier als de host-spier, aangezien het prominente en oppervlakkig geplaatst in het anterolateral aspect van het been. De grootte, de afdrukstand en de anatomische positie van de TA spier, maakt het gemakkelijk om te bevestigen dat de donorweefsel correct wordt geplaatst binnen de gastheer TA spier na MIME. In dit document, hebben wij experimenteel bewijs verstrekt dat de donorweefsel relichtnet ingebed binnen de host TA spier op 3 dagen na MIME-, en dat er is donor-cel-gemedieerde myogenesis in de spier van de gastheer op 14 dagen na MIME.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd mogelijk gemaakt door een subsidie van de piloot van het Bondgenootschap voor regeneratieve revalidatie onderzoek en opleiding (AR3van T) en een faculteit Startup-pakket van de Wayne State University aan JAR. AR3T wordt ondersteund door de Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health en menselijke ontwikkeling (NICHD), National Institute of Neurological Disorders en Stroke (NINDS), en nationale Instituut van biomedische beeldvormings- en Bioengineering (NIBIB ) van het National Institutes of Health onder nummer P2CHD086843 Award. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NSG-GFP mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #021937 | Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #000664 | Control donor mice |
| Tabletop isoflurane vaporizer | VetEquip (Livermore, CA) | Item #901801 | Inhaled anesthesia system |
| Magic depilatory crea | Softsheen Carson (New York, NY) | N/A | Razorless hair removal cream |
| 4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures | Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD) | SUT106631 | Guiding sutures for donor tissue |
| VetBond veterinary tissue adhesive | 3M (Maplewood, MN) | Catalog #1469Sb | Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure |
| Barium chloride | Ricca Chemical Company (Arlington, TX) | Product #R0854000-500A 854-16 | Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration |
| Deltaphase isothermal gel heating pad | Braintree Scientific (Braintree, MA) | Item #39DP | Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia |
| HM525NX cryostat | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog #HM525NX | Cryostat to make frozen sections of muscle |
| Vectashield Antifade Medium | Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) | Catalog Number: H-1000 | Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples |
| Rabbit anti Desmin Antibody | Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA) | RB9014P | Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling |
| Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog#: A-21069 | Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Seracare (Milford, MA) | Catalog #5930-0006 or 71-03-01 | Reagent for fluorescent labeling of nuclei |
| Axio Scope.A1 microscope | Carl Zeiss (Peabody, MA) | Product #Axio Scope.A1 | Light and fluorescence microscope |
| Photoshop CS4 | Adobe Systems (San Jose, CA) | Photoshop CS4 | Imaging Software for perform image tiling |
| Image J | National Institutes of Health (Bethesda, MD) | Image J for Windows 64-bit Operating System | Imaging Software for quantitative fluorescence analysis |
References
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
- Robertson, T. A., Grounds, M. D., Papadimitriou, J. M. Elucidation of aspects of murine skeletal muscle regeneration using local and whole body irradiation. J Anat. 181 (Pt 2), 265-276 (1992).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).
- Brack, A. S., Rando, T. A. Tissue-specific stem cells: lessons from the skeletal muscle satellite cell. Cell Stem Cell. 10 (5), 504-514 (2012).
- Krag, T. O., Hauerslev, S., Sveen, M. L., Schwartz, M., Vissing, J. Level of muscle regeneration in limb-girdle muscular dystrophy type 2I relates to genotype and clinical severity. Skelet Muscle. 1 (1), 31 (2011).
- Skuk, D., et al. Dystrophin expression in myofibers of Duchenne muscular dystrophy patients following intramuscular injections of normal myogenic cells. Mol Ther. 9 (3), 475-482 (2004).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Sakellariou, P., et al. Neuromuscular electrical stimulation promotes development in mice of mature human muscle from immortalized human myoblasts. Skelet Muscle. 6 (1), 4 (2015).
- Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Zhang, Y., et al. Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders. Hum Mol Genet. 23 (12), 3180-3188 (2014).
- Juhas, M., Engelmayr, G. C. Jr, Fontanella, A. N., Palmer, G. M., Bursac, N. Biomimetic engineered muscle with capacity for vascular integration and functional maturation in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5508-5513 (2014).
- Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution. Tissue Eng Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).
- Latil, M., et al. Skeletal muscle stem cells adopt a dormant cell state post mortem and retain regenerative capacity. Nat Commun. 3, 903 (2012).
- Maykel, J., et al. NOD-scidIl2rg (tm1Wjl) and NOD-Rag1 (null) Il2rg (tm1Wjl) : a model for stromal cell-tumor cell interaction for human colon cancer. Dig Dis Sci. 59 (6), 1169-1179 (2014).
- Casar, J. C., et al. Heparan sulfate proteoglycans are increased during skeletal muscle regeneration: requirement of syndecan-3 for successful fiber formation. J Cell Sci. 117 (Pt 1), 73-84 (2004).
- Hardy, D., et al. Comparative Study of Injury Models for Studying Muscle Regeneration in Mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
- Roberts, P., McGeachie, J. K., Grounds, M. D., Smith, E. R. Initiation and duration of myogenic precursor cell replication in transplants of intact skeletal muscles: an autoradiographic study in mice. Anat Rec. 224 (1), 1-6 (1989).
- Tidball, J. G. Mechanisms of muscle injury, repair, and regeneration. Compr Physiol. 1 (4), 2029-2062 (2011).
