Summary
Vi beskriver en eksperimentell teknikken som vi kaller minimalt invasiv muskel innebygging (MIME), som er basert på bevis at skjelettlidelser muskelvev inneholder levedyktig myogenic celler som kan lette donor-celle-mediert myogenesis når implantert i en vert muskel.
Abstract
Skjelettmuskel besitter regenerativ kapasitet fordi vev-resident, muskel fiber-genererer (myogenic) satellitt celler (SCs), som kan danne nye muskelfibre under de rette forholdene. Selv om SCs kan høstes fra muskelvev og kultivert i vitro, er resulterende myoblast cellene ikke veldig effektivt for å fremme myogenesis når transplantert inn i vert muskel. Kirurgisk utsette vert muskelen og pode segmenter av donor muskelvev eller isolert muskelfibre med deres SCs på verten muskler, fremmer bedre myogenesis sammenlignet med myoblast transplantasjon. Vi har utviklet en ny teknikk som vi kaller minimalt invasiv muskel innebygging (MIME). MIME innebærer passerer en kirurgisk nål gjennom vert muskelen, tegne et stykke donor muskelvev gjennom nål sporet og la donor vevet innebygd i vert muskler slik at den kan fungere som en kilde til SCs for verten muskelen. Her beskrive vi i detalj trinnene involvert i å utføre MIME i en immunodeficient musemodell som uttrykker en grønn fluorescerende protein (GFP) i alle cellene. Immunsvikt vert musen reduserer risikoen for uimottakelig avvisning av donor vev, og GFP kan lett identifikasjon av verten muskel fiber (GFP +) og donor-cell-derived muskel fiber (GFP-). Våre forsøksdata foreslår at MIME kan brukes å implantatet en extensor digitorum longus (EDL) muskel fra en donor mus inn i tibialis fremre (TA) muskelen vert museklikk. Våre data foreslår også at når en myotoxin (barium klorid, BaCl2) injiseres inn i vert muskelen etter MIME, det er bevis på donor-cell-derived myogenesis i vert muskler, med ca 5%, 26%, 26% og 43% av fibrene i en enkelt vert TA muskel viser ingen vert bidrag, minimal vert bidrag, moderat vert bidrag og maksimal vert bidrag, henholdsvis.
Introduction
Sunn skjelettmuskulatur, selv etter mitotisk, har utmerket regenerativ kapasitet av vev-resident myogenic celler kjent som satellitt celler (SCs)1,2; og vurdert i3,4. Men under patologiske tilstander forårsaket av muscular dystrophies, traumer eller akselerert aldring, muskel fornyelse kan ikke holde tritt med muskel sammenbrudd, og dermed progressiv muskel fiber brutt5. Selv om effektive metoder har blitt utviklet for å isolere SCs fra muskel og utvide dem i kultur generere store antall myoblasts (og senere myotubes), har forsøk på å generere fysiologisk relevante antall muskelfibre i vert muskel gitt bare minimal suksess6. Som med mange andre celletyper, når myoblasts blir injisert alene i vert vev, de fleste av cellene ikke engraft7,8. Vi har vist at nevromuskulær elektrisk stimulering (NMES) muliggjør donor-cell-derived myogenesis i gjenfødelse dårlig vert musen muskler som ble injisert med menneskelig myoblasts8. Andre har vist at kirurgisk pode biopsied muskel eller enkelt muskelfibre med vedlagte SCs, lette moderat myogenesis selv uten NMES, antyder at implanting hele muskelfibre med SCs kan være mer fordelaktig enn implanting myogenic celler alene9,10. Siden donor eller utviklet muskelvev podet vert muskel gir bedre resultater enn transplanting celler alene, er det mulig at vev eller vev-lignende strukturer kan gi avgjørende signaler for giver-cellers engraftment; et konsept som blir stadig tydeligere i celle-terapi studier som involverer ulike cellen typer10,11,12.
Siste data tyder på at SCs fra mennesker mer enn 2 uker post mortem generere myotubes i kultur13. Derfor ønsker vi å vurdere om implantering av muskel vev høstet evaluering i et levende vert vil reversere tap av muskel fiber. Vi har utviklet en ny teknikk som kalles MIME å implantatet donor muskelvev i skjelettlidelser muskelvev til en levende vert for å fremme donor-cell-derived myogenesis. MIME innebærer passerer en kirurgisk nål gjennom vert muskler til å opprette en nål spor; tegne en liten del av donor muskelvev gjennom nål banen; forlate donor vevet innebygd i vert muskelen; og lukking pinnen hullene med vev lim. Når praktiserende teknikken i euthanized mus studerte andre eksperimenter, vi har nå utført MIME i levende mus som er immunodeficient og overalt express en grønn fluorescerende protein (GFP) og oppfølging på 3 til 14 dager etter MIME. På 3 dager etter MIME bekrefte vi at donor musen (GFP-) EDL muskler implantert i vert mus (GFP +) TA muskler, forblir i vert muskelen. På 14 dager etter MIME, bekrefte etter BaCl2 myotoxin skade å indusere skade og myogenesis, vi at ca 5%, 26%, 26% og 43% av fibrene i en enkelt vert TA muskel viser ingen vert bidrag, minimal vert bidrag, moderat vert bidrag, og maksimal vert bidrag, henholdsvis. Sentrale nucleation (en markør av degenerasjon og påfølgende gjenfødelse) er sett i omtrent 95% av TA muskelfibre etter MIME og myotoxin injeksjon.
Vi studerer TA muskler 14 dager etter MIME + BaCl2 fordi dette tidspunkt fanger det mellomliggende stadiet av gjenfødelse, når et flertall av gjenfødte fibrene er en sentral nucleated. Vi studerer GFP + mus som vertskap for MIME, slik at når vi til slutt transplantasjon menneskelige cadaveric muskel i vert mus, vi vil kunne enkelt skille muskelfibre vert og donor opprinnelse. Vi bruker musen EDL muskel som eksperimentelle donor vevet, siden enkelt fibre fra denne muskelen har vist større myogenic potensial enn TA muskler9. EDL muskelen er også synergistisk til TA muskel og har lignende fiber-type sammensetning. Våre foreløpige data tyder på at MIME er i stand til å tilrettelegge donor-cell-derived myogenesis i vert muskelen.
Protocol
alle studier med levende dyr godkjent av institusjonen Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Wayne State University, Detroit, Michigan, USA, og er i samsvar med veiledningen for omsorg og bruk av forsøksdyr ( 8nde edition, 2011, utgitt av National Academies Press, 500 femte Street, NW, Lockbox 285, Washington, DC 20055, USA). Etter de godkjente IACUC protokollene, ble prosedyrer som involverer smerte og/eller nød utført under narkose, som er indusert og vedlikeholdt av isoflurane innånding (1.5-5% med effekt). Anestesi ble bekreftet av mangel på uttak til tå knipe, og mangel på palpebral eller vibrissae svar (prosentandelen av isoflurane ble økt som nødvendig for å opprettholde effekten). På grunn av minimal invasiv natur av protokoller, en " sterilt tips " teknikken ble fulgt. Mens dyr var under narkose, ble petroleum gelé brukt til øynene for å hindre tørrhet. Ingen spesiell behandling var nødvendig; Imidlertid ble kosthold gel levert til dyrene for 24 timer etter prosedyrer som involverte generell anestesi. etterforskeren er godkjent av IACUC til å tilbakeholde analgesi etter MIME, siden prosedyren ikke innebærer utsette kirurgisk verten muskler, fordi det er begrenset til én hindlimb, og påvirker ikke normal funksjon, og fordi mange vanlige smertestillende medisiner er kjent for å påvirke normal muskel gjenfødelse.
1. Dyremodeller
- Host mus for MIME-
- Bruk NSG-GFP mus (8-10 uke, mann) som vertskap for muskel graft studier.
Merk: Disse musene er ideelle verter for allogene muskel graft fordi de mangler modne T- og B-lymfocytter og funksjonelle naturlige drepe celler, er mangelfull i cytokin signalering, og har blitt brukt av andre for allografting eller xenografting ikke-muskel celler < sup class = "xref" > 14. Allestedsnærværende GFP uttrykk gir enkel identifisering av verten (GFP +) og donor-cell-derived (GFP-)-muskelfibre.
- Bruk NSG-GFP mus (8-10 uke, mann) som vertskap for muskel graft studier.
- Donor mus for MIME-
- Bruk C57BL/6J mus (12-16 uke) som donor mus.
Merk: Disse musene er passende donor mus fordi de har et fullt tilordnet Genova, ikke kjent for å ha noen Skjelettmuskel patologi, er lett tilgjengelige og økonomisk og ikke uttrykke GFP.
- Bruk C57BL/6J mus (12-16 uke) som donor mus.
2. Forbereder Donor muskelvev
- binde Guiding suturer og høsting donor EDL muskler
- Euthanize donor musene av cervical forvridning og thoracotomy utført under narkose administreres av en tabletop isoflurane vaporizer drevet av medisinsk oksygen (inhalert isoflurane, 2-5% til effekten).
- Til EDL musklene, bruk et par kirurgisk saks for å åpne huden over fremre overflaten av benet. Finn TA muskelen i fremre benet og fjerne det å visualisere EDL muskler som ligger bak TA muskelen. Skyv tuppen av et par pinsett bak EDL muskelen og bruk mild trekkraft for å se hvis tærne utvide (dette bekrefter at muskelen er EDL).
Merk: Donor vevet området skal kirurgisk, tas aseptisk prepped før høste. - Bruk ~ 10 cm segmenter av 4-0 silke, flettet, ikke-absorberbare, sterile Sutur og gjøre to doble knop bruke veiledende bildet proksimale og distale sener av EDL muskel. ( figur 1A).
- Kutte distale EDL senen, gjenspeiler EDL muskelen og kutte proksimale senen.
- Sted moderkroppen EDL muskler i en Petriskål fylt med musen Ringer løsning.
3. Forbereder vert mus for MIME-
- anestesi
- plasserer vert musen under generell anesthesia (inhalert isoflurane, 1.5-5% med virkning) administreres av en tabletop isoflurane vaporizer drevet av medisinsk oksygen.
- Induserer anestesi i en induksjon kammer og deretter overføre musen til en forpart å opprettholde av bedøvelsen mens du utfører andre prosedyrer på dyret. Gi termisk støtte en isotermiske gel varmeputen mens dyret er under anestesi.
- Preparering av huden
- fjerne dyret ' s pels, bruk en depilatory fløte over den fremre del av den venstre bakben ben. Høyre benet fungerer som en kontroll ben for senere prosedyrer.
- La depilatory krem på for 2 min. Clean av depilatory kremen sammen med den frittstående pels med våtservietter dynket i fosfat bufret saltvann (PBS). Etter pels fjerning, skrubbe huden med tre vekslende kluter av povidon-jod skrubbe løsning og 70% etanol.
- Skaper en nål spor i vert TA muskelen
- passere en 18-gauge (1 i lang) kirurgisk nålen gjennom midten av verten TA muskel langs muskelen ' s lang akse ( figur 1B). Passerer nålen i en cephalo-caudal retning, langs lengden av TA muskel, og gjennom midten av magemusklene ( figur 1B).
Merk: Hensikten med dette trinnet er å opprette en nål spor, som en del av donor muskel kan bygges. Innebygging donor vevet i midten av TA muskelen ville tillate SCs fra donor vevet å migrere og lette myogenesis over hele hærskaren TA muskel.
- passere en 18-gauge (1 i lang) kirurgisk nålen gjennom midten av verten TA muskel langs muskelen ' s lang akse ( figur 1B). Passerer nålen i en cephalo-caudal retning, langs lengden av TA muskel, og gjennom midten av magemusklene ( figur 1B).
- Embedding donor vev i p spor av vert TA muskel
- når kirurgisk nålen er i verten TA muskel, passerer styrende bildet i den ene enden av donor vev gjennom lumen av kirurgiske nål i en caudo-cephalic retning ( figur 1 c).
- Trekke donor vevet gjennom nål sporet som nålen er trukket fra verten TA muskelen caudo-cephalic retning.
- Bruk styrende bildet i caudal og cephalic endene av donor vev for å justere plasseringen av donor vev. Sikre at donor vevet er forskanset i verten TA muskel ( figur 1 d).
- Når donor vev plasseringen er optimalisert, kuttet av styrende bildet, foreta endelige justeringer donor vev plasseringen med tynn tang.
- Seal kutan p sår ( figur 1E -F) ved å tilnærme såret kanten med tang og bruke veterinær vev lim med spissen av en 27-gauge kirurgisk nål.
4. Intramuskulær injeksjon for Myotoxin å indusere felles muskel degenerasjon og Regeneration
- etter MIME, injisere 50-60 µL av 1,2% BaCl 2 (myotoxin) i verten TA muskel å indusere omfattende muskel fiber skade i vert muskelen og donor vev som er innebygd i det 15.
- Injisere BaCl 2 til 3 steder langs verten TA muskel (proksimale, midtre og distale en tredjedel av magemusklene).
Merk: Injisere myotoxins som BaCl 2, cardiotoxins og notexin i skjelettmuskulatur induserer felles muskel fiber skade etterfulgt av gjenfødelse 16.
- Injisere BaCl 2 til 3 steder langs verten TA muskel (proksimale, midtre og distale en tredjedel av magemusklene).
5. Etter fremgangsmåter for Animal Care
- etter MIME og BaCl 2 injeksjon, ren vert musen ' s venstre bakben ben med etanol og Påfør et tynt lag av å beskytte huden.
- Etter etter fremgangsmåter for hudpleie, Fjern vert musen fra nesen kjegle.
- Plasserer musen i ensom utvinning bur uten sengetøy. Gi termisk støtte å utvinne dyret gjennom en isotermiske gel varmeputen plassert under halvparten av utvinning buret.
Merk: En halvparten ikke er oppvarmet slik at dyr kan bevege seg bort fra oppvarming pad hvis nødvendig. - Etter vert musen har helt utvinnes fra anestesi, tilbake dyret til buret sitt opprinnelige. Plasser dyr baksiden i dyr anlegget til oppfølgingseksperimenter utføres. Overvåke vert musen daglig før den er klar for oppfølging – eksempel: på 3 eller 14 dager etter MIME. Følgende MIME, dyr overvåkes av laboratoriepersonell også av veterinary stab – dette hovedsakelig innebærer vurdere om dyr er lyse, varsling og forståelsesfull; og også vurdere om dyr viser åpenbare tegn på smerte eller har problemer med å flytte, fôring, drikking og grooming.
6. Vev samling
- høsting vert muskel
- Euthanize vert musene av cervical forvridning og thoracotomy utført under narkose administreres av en tabletop isoflurane vaporizer drevet av medisinsk oksygen ( inhalert isoflurane; 2-5% til effekten). etterforskeren har også IACUC godkjennelse til å høste TA musklene under narkose før euthanasia.
- for å adgang vert TA musklene, bruke et par kirurgisk saks for å åpne huden over fremre overflaten av benet. Finn TA muskelen i fremre benet, kuttet distale senen, gjenspeiler muskelen og kutte proksimale muskel vedlegg (se § 2.1).
- Samle både venstre (eksperimentell) og høyre (kontroll) TA musklene.
- Fest fryse, høstes musklene
- veie høstet musklene ved å plassere veie papir og vekt.
- Dukkert kort musklene i mineral olje for cryoprotection. Blot av overflødig olje.
- Sted musklene i aluminiumsfolie og fest fryse musklene ved raskt fordyper seg i flytende nitrogen fylt ut en Dewar. Overføre prøvene til merket cryovials og lagre prøvene i-80 ° C fryser for senere undersøkelser.
7. Histologiske studier
- og kryosnitt muskelvev samle føljetong tverrsnitt
- overføre prøvene fra-80 ° C fryseren til en kryostaten ved å plassere dem i en Dewar med flytende nitrogen.
- i kryostaten, håndtere ett utvalg om gangen. Med en kald razor blad (blad lagret i kryostaten), kutt prøven dobbelt på midten av magen av TA muskler til å produsere et segment av muskel som er ca 1-2 mm tykk. Holde dette segmentet for å lage delene kryostaten og returnere de gjenværende delene av muskel til dens cryovial.
- Med optimal kutte temperatur (OCT) iskaldt compound, sikre den tykke delen av vev på en kryostaten prøveskiven. Plasser prøveplaten på prøveholderen.
- Grove-ansikt prøven ved klipping 20 µm deler. Samle noen 20 µm deler på glass lysbilder for delene kryostaten.
- Om kvaliteten på delene for 20 µm er tilfredsstillende, endre kutte tykkelsen til 5 µm og samle noen deler for å vurdere kvaliteten. Hvis avsnittene 5 µm tilfredsstillende kvalitet, samle føljetong deler. Samle 2-3 deler per lysbilde og samle nok seksjoner for 3 lysbilder.
- Samle deler både fra experimental (venstre) og kontroll (høyre) TA musklene i hvert dyr.
- Studerer GFP uttrykk
Merk: angi ett sett forberedt lysbildene (punkt 7.1) å studere GFP uttrykk i muskelfibre.- Bruke ~ 50 µL av anti-fade medium på delene og bruke et glass dekkglassvæske. Forsegle dekkglassvæske kantene med klart neglelakk.
- Bruk av lys og fluorescerende mikroskopet (se Tabell for materiale), studere delene med en 10 X mål og en riktig filter for å visualisere GFP.
- Hente digitale bilder (~ 15) av overlappende visuelle felt for å dekke hele tverrsnitt av TA muskelen. Samle fase kontrast bilder for hvert av feltene visual ved å bytte fra fluorescens til fase kontrast-modus på mikroskopet.
- Åpne bilder med en egnet tenkelig programvare som skrive personlige bilder for å produsere ett sammensatt bilde; eksempel bruk av " photomerge " under fil-menyen i tenkelig programvare er oppført i Tabellen for materiale.
- Åpne GFP fluorescens bildene med et passende bilde analyseprogramvare (f.eks ImageJ). Sirkel enkele muskelfibrer bruker den " ROI-verktøyet " og registrere mener fluorescens intensiteten for hver fiber.
- Beregn maksimale GFP (fluorescens) intensitet ved å ta gjennomsnittet av mener fluorescens intensiteten av 10 fibre som viser høy GFP uttrykk og har normal morfologi. Beregne % maksimum GFP intensitet for hver fiber ved å dele mener Florescence intensiteten for hver fiber den maksimale GFP intensitet og å multiplisere med 100. Tabulere resultatene av GFP analyse for hver TA muskel som vist i figur 3E.
- Studere muskel fiber integritet og myonuclear plasseringen av Immunofluorescent merking av desmin og 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), henholdsvis.
Merk: Angi ett sett med lysbilder forberedt, som ovenfor å studere desmin merkingen i muskelfibre.- Fastsette seksjoner med 2% paraformaldehyde i PBS for 10 min. vaske avsnittene tre ganger med PBS.
FORSIKTIG: Bruke riktig personlig verneutstyr (PVU) ved håndtering ved håndtering paraformaldehyde. - Blokk seksjoner med 3% bovin serum albumin fortynnet i PBS 0,01 prosent Triton-X100 i 30 min. Dette blokkerer løsning er referert til heretter som den primære fortynningsmiddel.
- Fortynne kanin anti-desmin immunglobulin G (IgG) i den primære fortynningsmiddel (1:200).
- Etter blokkering er fullført, bruke utvannet primære antistoffer på deler og ruge over natten i et kjøleskap på ~ 4 ° C. vask delene når (5 min) med PBS 0,1 prosent Triton X-100. Denne løsningen er referert til heretter som den første vaskebuffer.
- Vask delene 3 ganger (5 min per vask) med PBS.
- Forberede sekundære antistoffer fortynne geit anti kanin IgG (konjugert til rød fluorescerende farge) i PBS 0,01 prosent Triton X-100.
- Bruke utvannet sekundære antistoffer på delene og ruge ved romtemperatur (~ 23 ° C) for 60 min.
- Vask delene når (5 min) med den første vaskebuffer. Vask delene 3 ganger (5 min per vask) med PBS.
- Bruk DAPI for 3 min. vask delene 3 ganger (1 min per vask) med PBS. Bruke ~ 50 µL av anti-fade mediet på delene og bruke glass dekkglassvæske. Forsegle dekkglassvæske kantene med klart neglelakk.
- Bruk av lys og fluorescerende mikroskopet (se Tabell for materiale), studie føljetong seksjoner med en 10 X mål og en riktig filter for å visualisere røde fluorescerende fargestoff.
- Samle de digitale bildene (~ 15) i feltene for overlappende visual å dekke hele tverrsnitt av TA muskelen. Samle fluorescens bilder av DAPI merking for hvert av feltene visual ved å bytte til riktig filterinnstillingen.
- Åpen og analysere bildene benytter en egnet programvare som beskrevet i trinnene 7.2.3 - 7.2.4.
Merk: Studere bilder å identifisere, hvilke muskelfibre er skadet (desmin negativ), hvilke muskelfibre har sentral nucleation (desmin positiv fibre som har DAPI-merket kjerner ligger internt i stedet for perifert) og, hvilke områder av delen har betennelse og/eller fibrose (områder som har mange DAPI-merket kjerner gruppert sammen, men er blottet for muskel fiber).
- Fastsette seksjoner med 2% paraformaldehyde i PBS for 10 min. vaske avsnittene tre ganger med PBS.
Representative Results
På 3 dager etter MIME finnes donor EDL som er implantert av MIME i verten TA muskel batterirommet (figur 2A-C). Som forventet, tverrsnitt av TA muskel fra donor mus, studerte under fluorescens optikk, viser ikke grønne fluorescens fordi de ikke uttrykke GFP (figur 2D). Derimot viser tverrsnitt av TA muskel fra verten mus som ikke er implantert med donor vev, uniform grønne fluorescens i TA muskel fiber, som fiber express GFP (figur 2E). I tverrsnitt av muskler implantert av MIME med donor muskelvev, finnes det en linje med avgrensning mellom verten muskel fiber (GFP +) og donor muskel fiber (GFP-). Fase kontrast bilder av visual feltene som vises i figur 2D-F presenteres i figur 2E'-F' og foreslå at det er faktisk muskel fiber til stede i områder der det er ingen GFP signal.
På 14 dager etter MIME og BaCl2 injeksjon, ved å studere føljetong tvers deler av TA muskel som gjenstår umerkede eller er merket med antistoffer mot desmin (Figur 3), vi lærer at GFP signalet er uttrykt ved alle muskelfibre i den ubehandlet muskel fra verten mus, men ikke i MIME-behandlet muskelen (rød desmin merking oppdager levedyktig muskelfibre). I host TA muskelen behandlet med MIME og BaCl2 injeksjon, giver-cell-derived myogenesis er tydelig fra tilstedeværelsen av mange desmin(+) muskel fiber som viser ingen synlig GFP signal (Figur 3 c-D, 3 C' -D'). Chimeric muskelfibrer som oppstår fra sannsynlig fusjon av verten og donor myogenic cellene kan oppdages ved lav til moderat nivåer av GFP fluorescens utstilt av disse fiber. Mange chimeric fiber vises over hele diameteren på TA muskel antyder at giveren SCs er dugelig av overfører flere hundre mikron i epimysium av verten muskel. Kvantifisering av GFP + fiber er vist i figur 3E. Figur 4 viser forstørring bilder av føljetong tverrsnitt av en hel MIME + BaCl2 behandlet TA muskel.
Figur 1 . Trinnene involvert i minimal invasiv muskel innebygging (MIME).
MIME er utført under narkose. Det innebærer å plassere ~ 10 mg av donor muskel (donor mus EDL) i Ringer løsning og knytte styrende bildet på endene (A). En 18-gauge nålen går gjennom den lange aksen av verten muskel (B) og donor vevet trekkes gjennom nål sporet (C). Donor vevet er venstre innebygd i vert muskelen (D), guiding bildet er kuttet og nål hullene er forseglet med vev lim (E). Forseglet p sår angis med piler (F). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 . Studier av TA muskel 3 dager etter MIME.
Verten muskel samlet 3 dager etter MIME; Merk p merkene på verten TA (piler; A-B). Dataene videre bekrefte at innebygde donor musen EDL er forskanset i TA muskel batterirommet (ABC). Fluorescens bilder TA muskler tverrsnitt viser ingen grønne fluorescens i vill-type TA muskel (D), lys grønn fluorescens i NSG-GFP TA muskel (E)og et skille mellom vert og donor muskel i NSG-GFP TA muskel etter 3 dager etter MIME (F). Fase kontrast bilder av de visuelle feltene i D-F vises i D'-F "henholdsvis. Den røde linjen i paneler F og F' viser linje avgrensning mellom vert og donor vevet. Skala bar = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Studier av TA muskel 14 dager etter MIME.
Data samlet inn 14 dager etter MIME presenteres. Røde signalet er fra immunofluorescent merking av desmin (et positivt signal for desmin angir at myofibers er levedyktig), blå signalet er fra DAPI (flekker kjerner), og grønne signalet er fra GFP. I kontroll TA muskler (høyre hindlimb) høstet fra verten musen, som forventet, er nesten alle myofibers positivt for desmin, antyder at disse myofibers er levedyktig (A; røde signalet). I tillegg basert på DAPI flekker, er det tydelig at myonuclei av nesten alle myofibers er perifert plassert, forventet i sunn muskel (A; blå signal). Seriell deler av kontroll TA muskelen viser at nesten alle muskelfibre er lys grønn, noe som tyder på at de er positivt for GFP. I MIME-+ BaCl2 -behandlet TA muskel (venstre hindlimb), giver-celle-mediert myogenesis er tydelig fra tilstedeværelsen av mange desmin(+) muskel fiber som viser ingen synlig GFP fluorescens (C-D, C'-D'). Desmin(+) muskel fiber med lav til moderat GFP fluorescens (chimeric muskelfibre) finnes over diameter av hele TA muskler, antyder at MIME gir donor SCs som kan overføre i epimysium av TA muskel og fremme donor-cell-derived myogenesis. A'-D' høy forstørrelse bilder av områdene i blå boksene i A-D. Kvantifisering av GFP(+) fiber og sentralt kjerne fibre vises i E. Skalere barer = 100 µm (A-D) og 50 µm (A'-D'). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
RC="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55731/55731fig4.jpg" / >
Figur 4 . Bevis på omfattende skader og Regeneration 14 dager etter MIME og BaCl2 injeksjon.
Forstørring, seriell tverrsnitt av en hel MIME + BaCl2 behandlet TA muskel presenteres. Dataene viser at mange muskel fiber, som er moderat eller sterkt GFP + har en sentral beliggenhet kjerner (A-B, rød i A er fra desmin blå signalet i A er fra DAPI og grønt signal i B er fra GFP). Disse data tyder på at degenerasjon og regeneration etter BaCl2 injeksjon ikke påvirker GFP uttrykk. I denne sammenheng antyder tilstedeværelsen av en sentral kjerne muskelfibre i MIME-+ BaCl2 behandlet TA muskler, med lite til ingen GFP uttrykk, at disse fibrene er det sannsynlige resultatet av myogenesis (eller gjenfødelse) med betydelige bidrag fra GFP - myogenic celler. Disse observasjonene kan verifiseres videre i forstørring bilder av utvalgte felt (C-F; C og D, E og F, henholdsvis, er overlappende områder fra føljetong tverrsnitt; fargekoding av biletkantane betegne plasseringen av disse regionene i A og B). Skalere barer = 100 µm (A-B) og 50 µm (C-F). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Her presenterer vi en detaljert protokoll for den eksperimentelle teknikken kalles MIME, utviklet i vårt laboratorium, til implantatet donor muskelvev inn vert muskelvev. Dette er en tilpasning av en åpen muskel pode teknikk som allerede har vist seg for å være effektive i å fremme donor-celle-mediert myogenesis i en vert muskel9,10,17.
Målet med MIME er ikke å aktivere engraftment av donor muskelvev seg inn i vert muskelen (nå ikke vet vi om dette skjer), men heller å gi en kilde av donor SCs som kan bidra til myogenesis i vert muskelen under forhold som stimulerer m uscle regenerering. Vårt håp er at etter MIME er optimalisert og testet i grunnleggende og prekliniske studier, det kan gi verdifull innsikt for å veilede klinisk behandling å øke muskel fornyelse i skjelettmuskulatur som har gjennomgått myogenic muskel tap.
Det er mange spørsmål som har ennå å bli besvart om hvordan MIME kan oversettes til en klinisk terapi, for eksempel: hvordan ville vi kontrollere kvaliteten på donor vev? Hvordan ville vi styrer uimottakelig avvisning av donor vev og celler? Tømmes donor vevet etter gir celler for myogenesis eller det etterlate en fibrotiske arr? Påvirker giver og/eller -muskel fiber type donor-celle-mediert myogenesis? Der musklene kan praktisk nytte MIME? Vi utvide nå våre studier for å vurdere om MIME er trygg og effektiv, identifisere Tilleggsbehandling behandlinger som kan øke donor-avledet myogenesis, og svare på mange av spørsmålene, ovenfor.
Etter endt våre tester av musen til mus allogene transplantasjon med MIME, er vår neste skritt å utføre menneske-til-mus MIME med cadaveric menneskelig vev for å evaluere myogenic potensialet i cadaveric muskelvev. Vi forventer at disse eksperimentene vil føre til en ny linje av grunnleggende og translasjonsforskning forskning, som involverer muskelvev fra givere, som er registrert i tiltak som kroppen arv programmet for utdanning og livets gave programmet for organdonasjon .
Representant dataene presenteres i dette manuskriptet foreslår at på 14 dager etter MIME, det er flere levedyktig myofibers som mangler GFP eller har lave nivåer av GFP. Vår tolkning av disse dataene er at GFP-giver satellitt celler bidratt til myogenesis i vert muskelen. Vi utførte dette eksperimentet i forberedelse til implantering av menneskelig cadaveric vev til en vert musen muskler. For å demonstrere utvetydig at donor satellitt cellene bidra til myogenesis i vert muskelen følgende MIME, ville det være nyttig å implantatet donor vev som uttrykker fluorescerende reporter, som kan være lett skilles fra GFP (f.eks, rød fluorescerende protein uttrykke donor vev implantert i GFP + vert muskel).
Denne teknikken er hovedsakelig begrenset natur SCs i donor vevet. Hvis SCs i donor vevet er levedyktig, teknikken er sannsynlig å lette donor-celle-mediert myogenesis, mens hvis de ikke er levedyktig, myogenesis kan ikke forekomme. Men siden SCs er svært fleksibel og er levedyktig for evaluering av ca 2 uker, er det svært sannsynlig at for eksperimentelle formål, donor vev som er implantert innen få minutter etter innhøsting vil lette donor-celle-mediert myogenesis13 . I tillegg som antydet ovenfor, er det mulig at siden hele muskelvev (som inneholder SCs, modne muskel fiber, samt muskel-resident fibroblaster) er innebygd i vert muskler, fibrose kan oppstå. Men må forutsetningen undersøkes empirisk. Litteratur om muskel skader fra skadelig sammentrekninger, cryoinjury og eksperimentell myotoxins, antyder at immunceller (hovedsakelig makrofager) er i stand til å effektivt fjerne mobilnettet rusk fra skadede fiber og ombygging av ekstracellulær matrix18. Derfor er det mulig at etter MIME og BaCl2 injeksjon, som immunceller som vert har tilgang til degenereres donor muskel fiber, de kan fjerne rusk, etterlot bare donor SCs. Endelig, omfanget av donor-avledet myogenesis er avhengig av mengden av donor muskelvev som er innebygd i vert muskelen. For at verten muskel rommet å være helt nytt av donor-cell-derived myofibers, ville det kreve en metode som X - eller gamma-bestråling å ablate vert muskel SCs og også krever gjentatte MIME-prosedyrer.
Det har blitt demonstrert at kirurgisk utsette en vert muskel og suturing en del av donor på verten muskelen kan rette donor-celle-mediert myogenesis9,10,17. Denne åpne kirurgisk tilnærming er brukt i siste til å spore fremdriften for myogenesis og generere musen modeller av menneskelig muskel sykdommer. Det nyskapende aspektet av MIME-teknikken er at det er minimal invasiv og ikke involverer kirurgisk utsette vert muskelen. Dette reduserer risikoen for iatrogenic infeksjon og graden av ubehag i vert dyr, derfor gjør det mer praktisk å utføre MIME gjentatte ganger på samme vert muskelen hvis nødvendig.
Vi forventer at MIME-teknikken kan være et egnet raffinement til den åpne kirurgisk tilnærmingen som for øyeblikket følges for å implantatet donor muskelvev i en host-mus. Dette kan fremskynde generering av humanized musen modeller, ved å bygge biopsied menneskelige muskel i vert musen muskler. I tillegg forventer basert på våre foreløpige data fra mus til mus pode, vi at MIME vil være effektiv for å oppnå donor-celle-mediert myogenesis fra menneskelige cadaveric donor vev som donor SCs er levedyktig. Til slutt, med ytterligere testing og validering, vi håper at MIME-teknikken vil bidra til å utvikle nye behandlinger for å lette donor-celle-mediert myogenesis hos mennesker med muskel sykdommer.
Suksessen til MIME-teknikken er kritisk avhengig nettopp innebygging donor vevet fascial batterirommet (epimysium) av verten muskel. Hvis giveren vevet er plassert i vert muskel rommet, vil det kunne gi SCs til verten muskel på en presis måte. Hvis giveren vevet er plassert utenfor vert muskelen, er det uklart hva ville være sin skjebne. I vår eksperimentell modell for MIME bruker vi TA muskelen som vert muskler, siden det er fremtredende og overfladisk plassert i det anterolaterale aspektet i beinet. Størrelsen, retningen og anatomisk posisjon av TA muskler, gjør det enkelt å bekrefte at donor vevet er plassert riktig i vert TA muskelen etter MIME. I dette papiret, vi tilbyr eksperimentelle bevis som donor vevet restrømnettet innebygd i verten TA muskel på tre dager etter MIME, og at det er giver-celle-mediert myogenesis i vert muskelen på 14 dager etter MIME.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble gjort mulig av en Pilot bevilgning fra Alliansen for regenerativ rehabilitering forskning og opplæring (AR3T) og en fakultetet oppstart pakke fra Wayne State University til JAR. AR3T støttes av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health Human Development (NICHD), National Institute av nevrologiske lidelser og strek (NINDS), og National Institute for biomedisinsk bildebehandling og bioteknologi (NIBIB ) av de nasjonale instituttene for helse under prisen nummer P2CHD086843. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NSG-GFP mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #021937 | Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #000664 | Control donor mice |
| Tabletop isoflurane vaporizer | VetEquip (Livermore, CA) | Item #901801 | Inhaled anesthesia system |
| Magic depilatory crea | Softsheen Carson (New York, NY) | N/A | Razorless hair removal cream |
| 4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures | Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD) | SUT106631 | Guiding sutures for donor tissue |
| VetBond veterinary tissue adhesive | 3M (Maplewood, MN) | Catalog #1469Sb | Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure |
| Barium chloride | Ricca Chemical Company (Arlington, TX) | Product #R0854000-500A 854-16 | Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration |
| Deltaphase isothermal gel heating pad | Braintree Scientific (Braintree, MA) | Item #39DP | Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia |
| HM525NX cryostat | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog #HM525NX | Cryostat to make frozen sections of muscle |
| Vectashield Antifade Medium | Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) | Catalog Number: H-1000 | Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples |
| Rabbit anti Desmin Antibody | Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA) | RB9014P | Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling |
| Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog#: A-21069 | Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Seracare (Milford, MA) | Catalog #5930-0006 or 71-03-01 | Reagent for fluorescent labeling of nuclei |
| Axio Scope.A1 microscope | Carl Zeiss (Peabody, MA) | Product #Axio Scope.A1 | Light and fluorescence microscope |
| Photoshop CS4 | Adobe Systems (San Jose, CA) | Photoshop CS4 | Imaging Software for perform image tiling |
| Image J | National Institutes of Health (Bethesda, MD) | Image J for Windows 64-bit Operating System | Imaging Software for quantitative fluorescence analysis |
References
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9, 493-495 (1961).
- Robertson, T. A., Grounds, M. D., Papadimitriou, J. M. Elucidation of aspects of murine skeletal muscle regeneration using local and whole body irradiation. J Anat. 181 (Pt 2), 265-276 (1992).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).
- Brack, A. S., Rando, T. A. Tissue-specific stem cells: lessons from the skeletal muscle satellite cell. Cell Stem Cell. 10 (5), 504-514 (2012).
- Krag, T. O., Hauerslev, S., Sveen, M. L., Schwartz, M., Vissing, J. Level of muscle regeneration in limb-girdle muscular dystrophy type 2I relates to genotype and clinical severity. Skelet Muscle. 1 (1), 31 (2011).
- Skuk, D., et al. Dystrophin expression in myofibers of Duchenne muscular dystrophy patients following intramuscular injections of normal myogenic cells. Mol Ther. 9 (3), 475-482 (2004).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Sakellariou, P., et al. Neuromuscular electrical stimulation promotes development in mice of mature human muscle from immortalized human myoblasts. Skelet Muscle. 6 (1), 4 (2015).
- Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Zhang, Y., et al. Human skeletal muscle xenograft as a new preclinical model for muscle disorders. Hum Mol Genet. 23 (12), 3180-3188 (2014).
- Juhas, M., Engelmayr, G. C. Jr, Fontanella, A. N., Palmer, G. M., Bursac, N. Biomimetic engineered muscle with capacity for vascular integration and functional maturation in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5508-5513 (2014).
- Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution. Tissue Eng Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).
- Latil, M., et al. Skeletal muscle stem cells adopt a dormant cell state post mortem and retain regenerative capacity. Nat Commun. 3, 903 (2012).
- Maykel, J., et al. NOD-scidIl2rg (tm1Wjl) and NOD-Rag1 (null) Il2rg (tm1Wjl) : a model for stromal cell-tumor cell interaction for human colon cancer. Dig Dis Sci. 59 (6), 1169-1179 (2014).
- Casar, J. C., et al. Heparan sulfate proteoglycans are increased during skeletal muscle regeneration: requirement of syndecan-3 for successful fiber formation. J Cell Sci. 117 (Pt 1), 73-84 (2004).
- Hardy, D., et al. Comparative Study of Injury Models for Studying Muscle Regeneration in Mice. PLoS One. 11 (1), e0147198 (2016).
- Roberts, P., McGeachie, J. K., Grounds, M. D., Smith, E. R. Initiation and duration of myogenic precursor cell replication in transplants of intact skeletal muscles: an autoradiographic study in mice. Anat Rec. 224 (1), 1-6 (1989).
- Tidball, J. G. Mechanisms of muscle injury, repair, and regeneration. Compr Physiol. 1 (4), 2029-2062 (2011).
