Summary
עבודה זו מציגה שיטה במהירות ובמדויק לכמת את הפיגמנטציה הבטן של תסיסנית melanogaster באמצעות ניתוח תמונה דיגיטלית. שיטה זו מייעלת את ההליכים בין רכישת פנוטיפ וניתוח נתונים וכולל הדגימה הרכבה, רכישת תמונה, מיצוי ערך פיקסל, ומדידה תכונה.
Abstract
פיגמנטציה היא תכונה פשוטה מבחינה מורפולוגית אך משתנה מאוד שלעתים קרובות יש לה משמעות מסתגלת. היא שימשה באופן נרחב כמודל להבנת ההתפתחות והאבולוציה של פנוטיפים מורפולוגיים. פיגמנטציה בטן ב תסיסנית melanogaster היה שימושי במיוחד, המאפשר לחוקרים לזהות את loci כי ביסודו inter- ו intrapecific וריאציות במורפולוגיה. עם זאת, עם זאת, d. melanogaster פיגמנטציה בטן כבר assayed במידה רבה מבחינה איכותית, באמצעות ניקוד, ולא כמותי, אשר מגביל את צורות ניתוח סטטיסטי שניתן להחיל על נתונים פיגמנטציה. עבודה זו מתארת מתודולוגיה חדשה המאפשרת כימות של היבטים שונים של דפוס פיגמנטציה הבטן של המבוגר ד melanogaster . הפרוטוקול כולל הדגימה הדגימה, לכידת תמונה, מיצוי נתונים, וניתוח. כל התוכנה המשמשת לכידת תמונות וניתוח מאקרו תכונהשנכתב עבור ניתוח תמונות קוד פתוח. היתרון של גישה זו היא היכולת למדוד במדויק תכונות פיגמנטציה באמצעות מתודולוגיה כי הוא לשחזור מאוד על פני מערכות הדמיה שונות. בעוד הטכניקה שימשה למדידת וריאציה של דפוסי הפיגמנטציה טרגאל של המבוגר ד melanogaster , המתודולוגיה היא גמישה וישימה רחב על דפוסי פיגמנטציה במספר עצום של אורגניזמים.
Introduction
פיגמנטציה מראה וריאציה פנוטיפית עצומה בין מינים, אוכלוסיות, יחידים, ואפילו בתוך אנשים במהלך אונטוגני 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . למרות שיש מספר רב של מחקרים על פיגמנטציה במגוון רחב של בעלי חיים, פיגמנטציה אולי למד הכי טוב ב תסיסנית melanogaster , שבו מלוא העוצמה של גנטיקה מולקולרית שימש כדי להבהיר את המנגנונים ההתפתחותיים והפיזיולוגיים להסדיר פיגמנטציה וכיצד מנגנונים אלה מתפתחים 1 , 6 . הרבה ידוע על הגנים המסדירים את הסינתזה הביוכימית של פיגמנטים בד. מלנוגאסטר 7 , 8 והגנים השולטים בדיאטה הזמני והמרחביהפצה של ביוסינתזה זו 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . יתרה מזאת, מיפוי גנטי זיהה את הלוקים הגנטיים שעמדו ביסוד ההבדלים הבין-בין-אישיים בפיגמנטציה ב- d melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 . כמו כן נבדקו היחסים בין פיגמנטציה לבין תכונות פליאוטרופיות, כגון התנהגות 18 , 19 וחסינות 19 , 20 , כמו גם המשמעות האדפטיבית של דפוסי פיגמנטציה 15 , 21 , 22 . ככזה, פיגמנטציה ב מלנוגאסטר התפתחה כמו מ 'חזק אך פשוטOdel לפיתוח ואבולוציה של פנוטיפים מורכבים.
פיגמנטציה אצל מבוגרים ד מלנוגאסטר מאופיין על ידי דפוסים שונים של מלניזציה על פני הגוף, במיוחד על הכנפיים ועל החזה הגב והבטן. זה הפיגמנטציה של כל צלחת cuticular (tergite) על הבטן הגב, עם זאת, כי קיבל את תשומת הלב המחקרית ביותר. יש וריאציה ניכרת פיגמנטציה זו ( איור 1A- F ), בגלל הן גנטי 17 , 23 ו 24 סביבתיים , 25 גורמים. לציפורן של tergite הבטן מורכב תאים התפתחותיים הקדמי אחורי ( איור 1G ), שכל אחד מהם ניתן לחלק נוסף בהתאם בהתאם פיגמנטציה וקישוט 26 . התא הקדמי כולל שישה cuticleסוגים (a1-a6), ואת התא האחורי כולל שלושה (p1-p3) ( איור 1G ). מבין אלה, את p1, p2, ו a1 cuticle הם בדרך כלל מקופל תחת tergite ב abdomens un-stretched כך שהם מוסתרים. הציפורן הנראית לעין מאופיינת על ידי רצועה של פיגמנטציה כבדה, הנקראת כאן "רצועת פיגמנט", המורכבת מטיפוסים מסוג A4 (שעיר עם זיפים מתונים) ו- A5 (שעיר עם זיפים גדולים), עם הקצה האחורי של הלהקה פיגמנט אינטנסיבי יותר מהקצה הקדמי ( איור 1G ). קדמית להקה זו הוא אזור של פיגמנטציה קלה שעיר, אשר יש זיפים האחורי (a3), אבל לא anteriorly (a2). שינוי בפיגמנטציה בין זבובים הוא ציין הן את עוצמת הפיגמנטציה ואת רוחב של פיגמנט הלהקה. באופן כללי, וריאציה היא הגדולה ביותר במגזרים האחורי ביותר (קטעים הבטן 5, 6, ו -7) והוא נמוך יותר קטעים הקדמי יותר (הבטן se3 ו -4). יתר על כן, יש דימורפיזם מיני ב d melanogaster פיגמנטציה, עם זכרים בדרך כלל יש פיגמנטציה מלאה 5 ו tergites הבטן ( איור 4 ג ).
במרבית המחקרים של פיגמנטציה בטנית ב- d melanogaster , הפיגמנטציה טופלה כמאפיין קטגורי או סודי, כאשר הדפוס נמדד איכותית 27 , 28 , 29 או חצי כמותי בסולם 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . שיטות אלה סובלות בהכרח מחוסר דיוק, ומכיוון שהן מסתמכות על הערכה סובייקטיבית של פיגמנטציה, קשה להשוות את הנתונים בין המחקרים. מחברים אחדים כימו את הממדים המרחביים של פיגמנטציה 38 , 39 , את עוצמת הפיגמנטציה של סוג מסוים של קוטיקולה 23 , 25 , 39 , 40 , או את העוצמה הממוצעת של פיגמנטציה על פני הטרגיט הבטן כ -41 , 42 , 43 . אף על פי כן, שיטות כימות אלה אינן מודדות הן את האינטנסיביות והן את ההתפלגות המרחבית של הפיגמנטציה הבבטית בו זמנית, ולכן אינם לוכדים את הניואנסים של האופן שבו הפיגמנטציה משתנה על פני הבטןטחון. יתר על כן, כמה שיטות כימות אלה 38 , 41 , 42 , 43 דורשים את הנתיחה ואת הרכבה של cuticle הבטן. זה גם זמן רב הורס את המדגם, מה שהופך אותו זמין עבור ניתוחים מורפולוגיים נוספים. ככל שהבנת ההתפתחות והאבולוציה של הפיגמנטציה הבטן מעמיקה, כלים מתוחכמים יותר כדי למדוד במהירות ובדייקנות הן את ההתפלגות המרחבית והן את עוצמת הפיגמנטציה.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לנצל את ניתוח התמונה הדיגיטלית כדי להשיג מדידה חוזרת ומדויקת יותר של פיגמנטציה הבטן ד melanogaster . המתודולוגיה כוללת שלושה שלבים. ראשית, הזבוב הבוגר הוא רכוב ללא הרס, ואת התמונה הדיגיטלית של הבטן הגב נלקח. שנית, באמצעות מאקרו ImageJ, המשתמשמגדיר פס קדמי קדמי של פיקסלים המשתרע הקדמי של a2 לציפורן האחורי של a5 cuticle (קופסה ירוקה, איור 1G ) על שני קטעים הבטן השלישי והרביעי. ערך הפיקסל הממוצע לאורך רוחב הרצועה מחולק לאורך ציר הזמן, ומייצר פרופיל המבחין בחלוקה המרחבית ובעוצמת הפיגמנטציה כפי שהיא משתנה מהחלק הקדמי לחלק האחורי של הטרגיט. שלישית, סקריפט R משמש לתיאור פרופיל הפיגמנטציה במתמטיקה באמצעות קו מעוקב. התסריט R משתמש בשפכים ובנגזרות הראשון והשני שלו כדי לחלץ את רוחב הציפורן a2-a5, את רוחב רצועת הפיגמנט ואת רמות הפיגמנט המקסימליות והמינימליות. השיטה ולכן מכמת הן את המאפיינים המרחביים ואת עומק הפיגמנטציה בטן.
מתודולוגיה זו מכמתת את הפיגמנטציה של הטרגיטים הבטן השלישית והרביעית,אשר היו מוקד של מחקרים קודמים רבים 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , או באופן בלעדי או בשילוב עם tergites האחורי. אם כי פחות משתנה מאשר טרגיטים הבטן החמישית והשישית, tergites השלישי והרביעי אינם פיגמנטציה לחלוטין אצל גברים, כך פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על גברים ונשים כאחד. עם זאת, כפי שמוצג כאן, פרוטוקול ניתן להשתמש כדי למדוד פיגמנטציה של 5 ו tergites הבטן הנקבות אצל נקבות. יתר על כן, שינויים קלים של סקריפטים המשמשים כדי לחלץ את המאפיינים של פרופיל פיגמנטציה צריך לאפשר את השיטה לשמש לכמת וריאציה פיגמנטציה במגוון רחב של אחריםאורגניזמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הדגימה הרכבה
הערה: חנות זבובים מתים באתנול 70% במים לפני הדמיה.
- יוצקים 10 מ"ל של אגר 1.25% מומס במים רותחים ב 60 מ"מ x 15 מ"מ צלחת פטרי ולאפשר לו להגדיר.
- תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש זוג מלקחיים קנס לעשות ~ 20 מ"מ ong, 2 מ"מ רחב, 1 מ"מ חריץ עמוק על פני השטח של הג'ל. בעזרת מלקחיים בסדר, להטביע את הצד הגחון של זבוב מבוגר בחריץ, עם הצד הגבי של זבוב הקרנת מעל הג'ל.
הערה: את רופפת של ג 'ל מאפשר repositioning קל מבלי לפגוע בדגימה. אותו חריץ יכול לשמש עבור מספר רב של דגימות, אם כי הוא יהפוך מלוכלך, שבור למעלה, ו שמיש עם הזמן. לאחר מכן המשתמש יכול ליצור חריץ נוסף באותו ג'ל. כל צלחת יכולה לשמש תמונה ~ 200 זבובים. - לגמרי לכסות את הדגימה באתנול 70% במים כדי להפחית את כל השתקפויות האור מן השעווה דונגי ולמנוע נזק באגף durמניפולציה הדגימה.
2. הגדרת מיקרוסקופ
הערה: תמונות נרכשות באמצעות היקף לנתח, בסיס האור המועבר, מצלמה דיגיטלית, מקור אור קר מקורר למחשב רץ תמונה רכישת תוכנת שליטה. הוראות תוכנה ספציפיות ל- Micro-Manager v1.4.20 44 , שהיא תוכנת קוד פתוח המשלבת ImageJ 45 .
- הפעל את המיקרוסקופ, מצלמה דיגיטלית, מקור אור כפול מקורר קר, המחשב.
- הפעל את תוכנת לכידת התמונות כדי לפתוח חלון Micro-Manager וחלון ImageJ. בחלון ImageJ לחץ על "Image"> "Type"> "8-bit" כדי להגדיר את כל התמונות כ -8 סיביות. לחץ על "Live" בחלון Micro-Manager כדי לפתוח חלון "Snap / Live" המציג תצוגה מקדימה בזמן אמת מהמצלמה.
- מקסם את הגודל של "הצמד / Live" חלון אם neמזור. בחר "Grayscale" בתפריט הנפתח "מצב תצוגה" בכרטיסייה "ניגודיות" בחלון Micro-Manager.
- הפעל את מקור האור הקר לעוצמה המקסימלית שלו ומקם את הקצות של כל gooseneck על 120 מ"מ מהבמה, אחד בצד שמאל ואחד בצד ימין.
הערה: משתמשים יכולים גם להשתמש מאירה חדה, אם כי זה עשוי ליצור טבעת של האור המוחזר סביב הבטן לעוף. - באופן ידני את הגדלת המיקרוסקופ ל 60X כך שדה הראייה לוכדת שטח כ 3 מ"מ קוטר על הבמה.
- מניחים 2 מ"מ בשלב מיקרומטר על הבמה (החלפת הרקע לבן אם יש צורך). תוך כדי צפייה בתצוגה מקדימה חיה, התמקדו במיקרומטר הבמה והתאימו את החשיפה בחלון Micro-Manager על-ידי הזנת זמן החשיפה ב- ms בתיבה "חשיפה".
- כדי לכייל את המרחב באופן מרחבי, בחר את "קו ישר" כלי tהוא חלון ImageJ ו לצייר קו אורך מיקרומטר הבמה. בחלון ImageJ לחץ על "Analyse"> "Set Scale" כדי לפתוח את החלון "Set Scale", הזן את אורך המיקרומטר במיקרומטר בתיבה "מרחק ידוע" והזן "מיקרומטר" ביחידה "Unit of length" קופסא.
- ראה כי "הגדר קנה מידה" החלון ואז מציג את קנה המידה של "פיקסלים / מיקרומטר." רשום לעצמך את הסולם ולחץ על "אישור".
- בחלון "הצמד / חי", לחץ על "עצור" ולאחר מכן על "הצמד" כדי ללכוד תמונה של מיקרומטר הבמה.
- שמור את התמונה כ- TIFF בגווני אפור של 8 סיביות כדי להבטיח את היכולת לבצע כיול מרחבי של התמונות שוב, במידת הצורך. בחלון ImageJ לחץ על "File"> "שמירה בשם"> "Tiff ..." ציין היכן לשמור את הקובץ בדפדפן הקובץ, תן שם לקובץ ולחץ על "שמור".
- העבר את הבמה לשחור ומקוםצלחת פטרי מחזיק זבוב רכוב אגר (מדרגות 1.1-1.2) על הבמה.
- להסתכל דרך המיקרוסקופ ולמקם את הזבוב כדי להבטיח את קו האמצע הגבי הוא ישר על מנת להציג בצורה הטובה ביותר את דפוס פיגמנטציה. להעביר כל כנפיים ונספחים כדי להבטיח את הנוף של הבטן הוא unobstructed. אם הציפורן פיגמנט (A2-A5) אינו גלוי, לסחוט את הבטן רוחבית עד שהוא (אם כי הבטן של זבובים מאוחסן באתנול 70% במים למתוח, כך שזה לא הכרחי בדרך כלל).
הערה: בעת מיקום הזבוב, ייתכן שהמשתמש יצטרך להשתמש בהגדלה נמוכה יותר (20X). ההגדלה חייבת להיות מוחזרת ל 60X לפני שתמשיך. - מתמקדים באופן ידני בבטן הגב של הזבוב. כוונן ידנית את הקצות של מקור האור כדי למזער את הצללים ואת ההשתקפות על הבטן הגבי.
- תוך כדי צפייה בתצוגה מקדימה חיה על מסך המחשב, ושימוש היסטוגרמה ערך פיקסל בכרטיסייה "ניגודיות" של חלון Micro-Manager,כוונן את החשיפה כמתואר בשלב 2.4 כדי למקסם את טווח ערכי הפיקסלים של תמונת התצוגה המקדימה.
- הסר את לטוס צלחת פטרי ולהחליף אותם עם פלט LED (ספקטרלי של 430-660 ננומטר) מחובר מטר מתח, מרוכז בתחום התצוגה באותו מיקום כמו זבוב. השתמש מטר LED מתח כמו מד אור 46 ולהקליט את המתח שנוצר על ידי האור המכה את LED (~ 125 mV).
הערה: מד ה - LED והמתח משמשים כדי להבטיח שרמת האור תהיה קבועה במהלך הפעלות הדמיה מרובות בניסוי יחיד. - למשך הניסוי, אל תשנה עוד את המיקום או העוצמה של מקור האור, את ההגדלה של המיקרוסקופ, או את החשיפה של המצלמה.
3. הדמיה הדמיה
- מניחים צלחת פטרי מחזיק זבוב רכוב אגר (מדרגות 1.1-1.3) על הבמה מיקרוסקופ שחור. להתאים את המיקום של הזבוב, כך השלישי וארבעH קטעים הבטן גלויים קו האמצע הגבי הוא ישר, כפי שמתואר בשלב 2.9. ודא כי ההגדלה היא 60x לפני שתמשיך.
- התמקדו באופן ידני במיקרוסקופ כך שהטרגיות הבטן השלישית והרביעית נמצאות בפוקוס. השתמש בתוכנה ללכידת תמונות כדי לרכוש תמונה כ- TIFF בגווני אפור בגודל 8 סיביות, כמתואר בשלב 2.6.
הערה: התמונה יכולה להיות שנתפסו בצבע ולאחר מכן להמיר לגווני אפור לניתוח. - שמור את התמונה בשם "SESH000_sampleID.tiff", כמתואר בשלב 2.7.
הערה: כאן, [SESH] הוא קבוע, [000] הוא מספר הפגישה והוא משתנה אך חייב להיות באורך של שלוש ספרות, ו- [sampleID] הוא מה שהמשתמש מעוניין, למרות שהוא אינו חייב להכיל תווים נוספים (_) חייב להיות באורך קבוע. [Sampleid] צריך לכלול פרטים על הגורמים המשמשים בניתוח של נתוני הפיגמנטציה ( למשל, טמפרטורה או שושלת), מופרדים על ידי אלפבית ייחודי שאינו מובחןאופי, כגון מקף (-). זה מאפשר גורמים אלה ניתן לנתח בקלות מתוך [מדגם] באמצעות תוכנה סטטיסטית סטנדרטית. - הסר את צלחת פטרי מהבמה ולהחליף את הזבוב עם הדגימה הבאה. חזור על שלבים 3.1-3.3 עד שכל הדגימות צולמו, ללא כוונון נוסף של רמות התאורה, ההגדלה או החשיפה.
4. הדמיה על פני מספר מושבים
- אם יש צורך לצלם תמונות על מספר פעילויות באתר, לשמור על עוצמת האור, החשיפה וההגדלה על פני הפעלות באתר. בתחילת כל הפעלה, בדוק את הכיול המרחבי של המצלמה (שלב 2.4) ואת עוצמת האור בשלב (כפי שנמדד על ידי מד LED / מתח, שלב 2.12).
- לכוד ולשמור תמונה של מיקרומטר הבמה (צעדים 2.5-2.7) כדי להבטיח את היכולת מרחבית לכייל את התמונות שוב, במידת הצורך.
- השתמש לפחות 15 דגימות שליטה באופן אקראי לדמיין אותם בכל מפגש alloW עבור איתור וחיסול של ההשפעות הפגישה. ודא שבדוגמאות בקרה כפולות בין הפעלות יש אותו [דגימה] אך שונה [SESH000].
הערה: דגימות הבקרה הן זבובים שנאספו, מאוחסנים ומוטבעים באופן זהה לדגימות ניסיוניות, אך הם משוחזרים מחדש במהלך הפעלות. המספר המדויק של דגימות בקרה יהיה תלוי בהגדרת הניסוי של המשתמש. ראה את הדיון לפרטים נוספים.
5. ניתוח תמונה
הערה: ניתוח תמונה מתבצע ImageJ 45 ומשתמש "מדידה של Pigmentation.ijm," מאקרו המסופק כקובץ משלים.
- מניחים את כל התמונות כדי לנתח באותה תיקייה.
- הפעל את ImageJ ולהפעיל את "מדידה של Pigmentation.ijm" מאקרו על ידי לחיצה על "Plugins"> "מאקרו"> "הפעלה", בחירת "מדידה של Pigmentation.ijm" בדפדפן הקובץ, ולחיצה על "לִפְתוֹחַ."
הערה: כל השלבים הבאים נמצאים בתוך המאקרו. כל צעד הוא פקודת מאקרו אישית. - שים לב כי תיבת הדו שיח "פעולה נדרשת" נפתחת, וציין "בחר את התיקייה שבה מאוחסנות תמונות." לחץ על "אישור" ולהשתמש בדפדפן הקובץ כדי לבחור את התיקייה המכילה את התמונות ולאחר מכן לחץ על "בחר".
- שים לב כי תיבת הדו שיח "פעולה נדרשת" תיפתח, ותציין "בחר את התיקייה שבה ברצונך לשמור את הנתונים." לחץ על "אישור" והשתמש בדפדפן הקבצים כדי לבחור את התיקייה הרצויה לשמירת פרופילי הפיגמנטציה. לחץ על "בחר".
- שים לב שתיפתח תיבת דו-שיח שתשאל "כמה תווים במזהה המדגם שלך?" בתיבה נתוני קלט, הזן את מספר התווים ב- [SampleID], כמפורט בשלב 3.3, ולחץ על "אישור".
- שים לב שתיפתח תיבת דו-שיח שתשאל "עד כמה החזר ה- ROI שלך גדול?" בתיבה נתוני קלט, הזן את רוחב הפיקסלים של החלון הקדמי,רצועה אחורית שבה פרופיל הפיגמנטציה היא להיות קרא (מלבן ירוק, איור 1G , איור 2 א , ו 2 א '). לחץ על "אישור" ברירת המחדל היא 20 פיקסלים.
הערה: פרופיל הפיגמנטציה נקרא על פני רצועת לציפורן, במקום על קו, כדי להפחית את הרעש עקב שערות וזיפים. רוחב פס זה יהיה תלוי ברזולוציה של התמונה, אבל זה צריך להיות ~ 1/20 th רוחב של הבטן, בפיקסלים. - שים לב שהמאקרו יפתח את התמונה של הזבוב הראשון, ותיבת דו-שיח תשאול אם למדוד את הזבוב הנוכחי (לחץ על "כן"), כדי לעבור לטוס הבא (לחץ על "לא") או כדי לצאת מאקרו (לחץ על "ביטול").
- שים לב כי תיבת הדו שיח תפתח, הקובע "הגדר את קו האמצע של הבטן הגבי, מ - ANTERIOR ל - POSTERIOR." הכלי "קו ישר" כבר ייבחר. צייר קו מ קדמי אחוריכדי להגדיר את קו האמצע של הבטן הגבי. לחץ על "אישור" ראה איור 2 א ו -2 א ', שורה צהובה.
הערה: זה משמש כדי לארגן מחדש את התמונה כך קו האמצע הגבי שוכב אופקית על פני המסך, עם הקדמי בצד שמאל, מה שהופך את הצעדים הבאים קל יותר. - שים לב כי תיבת הדו שיח תפתח, הקובע "הגדר את הקצה האחורי של Tergite 4 ממש מאחורי רצועת הפיגמנט." הכלי "קו ישר" כבר ייבחר. צייר קו מקצה קו האמצע האחורי אל הקצה הימני-צדדי, כך שמרכז הקו (מסומן בריבוע לבן) יושב רק אחורית על הקצה האחורי של רצועת הפיגמנט (קוטיקולה A5). לחץ על "אישור". ראה איור 2 א ו -2 א ', קו מגנטה.
הערה: התסריט R יזהה באופן אוטומטי את הקצה האחורי של רצועת הפיגמנט מפרופיל הפיגמנטציה. - שים לב שיחתיבת יפתח, הקובע "הגדר את הקצה ANTERIOR של Tergite 4 בקצה הקדמי של הציפורן פיגמנט (a2)." הכלי "קו ישר" כבר ייבחר. צייר קו מקצה האמצע הקדמי הקדמי עד קצה ימין לרוחב, כך מרכז הקו (מסומן על ידי ריבוע לבן) יושב בקצה הקדמי של לציפורן פיגמנט (a2). לחץ על "אישור". ראה איור 2 א ו -2 א ' , קו ציאן.
הערה: התסריט R יגדיר נקודה זו כקצה הקדמי של הציפורן הפיגמנט של הטרגיט. על התמונה, המאקרו יראה את האזור של הריבית (ROI) שבה פרופיל פיגמנטציה נקרא (מלבן ירוק, איור 2 א ו 2 א ', מוגדל באיור 2B ו 2 ב '). המאקרו יפתח גם חלון שני המציג את פרופיל הפיגמנטציה עבור החזר ההשקעה ( איור E 2C ו- 2C '), כאשר ציר ה- x הוא המיקום, מבוטא כמספר הפיקסלים מהקצה האחורי של הפרופיל, וציר ה- y הוא ערך הפיקסלים הממוצע בכל מיקום. - הצג את החלקים של פרופיל הפיגמנטציה שייפתח על ידי המאקרו. במידת הצורך, לחץ על "Live" בחלון הפרופיל כדי להתאים את המיקום של החזר ה- ROI כך שהוא אינו כולל מבנים ( כגון זיפים) שישפיעו על פרופיל הפיגמנטציה. לאחר פרופיל משביע רצון, לחץ על "אישור".
- חזור על שלבים 5.8-5.11 עבור Tergite 3.
הערה: המאקרו מייצא את פרופילי הפיגמנטציה לשני קובצי CSV, כל אחד מהם נקרא "SESH000_samplename_TX_profile.csv", כאשר [SESH000_samplename] הוא שם התמונה ו- [TX] הוא T3 או T4 עבור tergites השלישי והרביעי, בהתאמה. - שים לב שהמאקרו פותח את התמונה הבאה. חזור על שלבים 5.7-5.13 עד שכל התמונות נותחו.
הערה: כל ניתוח הנתונים מתבצע R 47 ומשתמש "ניתוח של Pigmentation.R" סקריפט שסופק. להלן, "L ..." מציין איזה שורה (ים) של הסקריפט לרוץ עבור כל חלק של הניתוח. עיין במידע המשלים לקבלת פרטים נוספים על אופן הניתוח.
- ערוך את הסקריפט R כדי להגדיר את ספריית העבודה (L6) והגדר את filepath לתיקייה המכילה את פרופילי ה- .csv (L11).
- הפעל L13-15 כדי ליצור רשימה של פרופילי הפיגמנט המאוחסנים בתיקיית הפרופיל.
- לטעון ולהפעיל את "הקורא" ו "addPrimaryKey" פונקציות (L17-41) לקרוא את הפרופילים למסגרת נתונים אחת.
- לערוך את התסריט ב L43 כדי לציין את הכיול המרחבי של התמונות מיקרומטר / פיקסלים, כפי שנקבע בשלב 2.5.
- לטעון ולהפעיל את "adjusפונקציה "tts" (L46-58) כדי להמיר את מיקום הפרופיל (ציר x, איור 2C ו 2C ') מ-פיקסלים-מן-אחורי-קצה החזר ה- ROI ל- μm-from-anterior-edge-of-ROI (0 = שחור, 255 = לבן) לערך הפיגמנטציה (0 = ללא פיגמנט, 255 = פיגמנט מרבי).
- טען ולהפעיל את הפונקציה "spline.der.er" (L60-71) כדי ליצור את השדרה מעוקב של פרופילים פיגמנטציה נגזרות הראשון והשני שלה ( איור 2D -2F ו 2 '- 2F ').
- טען ולהפעיל את "coord" ו "assmbly.coord" פונקציות (L74-163), תחילה כדי לחלץ את המיקום של האחורי (T 3 ) ו הקדמי (T 2 ) הקצוות של הלהקה פיגמנט ( איור 2 ו 2 ד ') ואת הקצה האחורי של הציפורן A2 (T 1 , איור 2 ד ו -2 D ), ולאחר מכן לחלץ את מקסימום (P max ) מינימום (P דקות ) פיגמנטציה ערכים, נלקחה ב T 3 ו T 1 , בהתאמה.
הערה: הקצה הקדמי של הציפורן a2 כבר מוגדר בשלב 5.9. - אופציונלי: טען והפעל את הפונקציה "Chek" (L165-175) כדי לבדוק אם הפונקציה "coord" מזוהה כהלכה את המיקומים T1-3 עבור פרופיל פיגמנט שנבחר באופן אקראי.
- טען והפעל את פונקציות האינדקס והערכים (L178-193) כדי ליצור טבלת נתונים עם הכותרת "Session", "לדוגמא", "Tergite", "id" (שרשור של דוגמא וטרגייט), "P max " "P דקות ", "רוחב פס " (רוחב רצועת הפיגמנט, = T3 - T 2 ), ו- "W tergite " (רוחב פיגמנט cA utcles a2-a5, = T 3 ).
- לטעון ולהפעיל את "תיקון" הפונקציה (L196-234) כדי ליצור טבלת נתונים התיקון P max ו P דקות עבור כל הגורמים המטרדים הנובעים עקב השפעות הפגישה. השתמש עלייה ממוצעת (או ירידה) ב P max או P דקות מן הדגימות שליטה מחדש הדמיה על פני הפעלות סמוכות זמנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול שימש כדי לחקור את ההשפעה של טמפרטורת גידול על פיגמנטציה בטנית. מחקרים קודמים הראו כי עלייה בטמפרטורה התפתחותית גורמת לירידה בהתפשטות הפיגמנטציה הבטן במספר מינים של תסיסנית , כולל ד מלנוגאסטר 30 , 32 . באופן ספציפי, ב tergites בטן 3 ו 4, היקף הפיגמנטציה (רוחב של פיגמנט הלהקה) פוחתת מ 17 ° C עד 25 ° C ו נשאר זהה מ 25 ° C עד 28 ° C 24 , 36 . מחקרים אלה הבקיעו את מידת הפיגמנטציה בסולם של 1-10 (0: ללא פיגמנט הלהקה, tergite צהוב לחלוטין, 5: רצועת פיגמנט תופסת 50% של tergite, 10: tergite כהה לחלוטין). כדי לקבוע אם המתודולוגיה הכמותית יכול ללכוד את הפלסטיות פנוטיפי, פיגמנטציה נמדדה ב(3 זבובים), 25 מעלות צלזיוס (9 זבובים) ו -28 מעלות צלזיוס (9 זבובים). כדי לקבוע את האפקטיביות של הליך התיקון בהסרת גורמי המטרד שהובאו על ידי השפעות של פעילות גופנית, הפיגמנטציה של אותם זבובים הודפסה מחדש ונמדדה מחדש אחת, שתיים, ארבע ושמונה ימים לאחר מכן. תנאי תאורה וחשיפה בין המפגשים היו, עם זאת, שונה בכוונה כדי להבטיח כי היו השפעות הפעלה עבור הליך תיקון להסרה. התמונות פורסמו במאגר הדיגיטלי של Dryad.
השאלה הראשונה שהוצגה היתה האם קיימים הבדלים שיטתיים באמצעי הפיגמנטציה לאורך המפגשים. זה נבדק באמצעות חבילת lme4 ב R 48 כדי להתאים את המודלים המעורבים M ijk = S i + A j +Ε ijk ו- M ij = a j + ε ij הן ל- P max ו- P דקות , כאשר M הוא מדד הפיגמנט, S הוא הפגישה (אפקט אקראי), A הוא tergite הבטן נמדדת (אפקט אקראי), ו ε הוא את השגיאה שיורית (subscripts הם רמות בתוך משתנים). נעשה שימוש בבדיקת יחס לוג-לוגי כדי לבדוק האם הכללת הפגישה כגורם אקראי שיפרה באופן משמעותי את ההתאמה; ( טבלה 1 ). כצפוי, בחינה של מרכיבי השונות (שנוצרו באמצעות REML 48 ) הצביעה על כך ששינוי בהשפעות המושב היווה 67% ו -70% מכלל השונות ב- P max ו- P min , בהתאמה ( טבלה 1 ).
חמש עשרה טרגיות בקרה שנבחרו באופן אקראי (שליש או רביעי, מ זבובים reaאדום ב 17 ° C, 25 ° C, או 28 ° C), ושינויים הממוצע שלהם P max ו P דקות שימשו לתקן את אמצעי הפיגמנטציה של tergites הנותרים על פני הפעלות. חזרה על הניתוח על תיקון פיגמנטציה אמצעים לחסל את ההשפעות הפגישה ( טבלה 1 ) והקטין את אחוז השונות הכוללת עקב השפעות הפגישה לאפס. השגיאה השיורית היא אומדן, טעות מדידה לאחר ההשפעות הפגישה הוסרו, והיה 22% ו -27% עבור P max ו- P דקות , בהתאמה ( טבלה 1 )
לאחר מכן, הנתונים מתוקן שימש כדי לקבוע אם ההשפעה של הטמפרטורה על היבטים שונים של פיגמנטציה וגודל יכול להיות מזוהה. המודל המעורב M ijkm = T i * * D j + X k + ε ijkm היה מצויד בנתונים, כאשר T D הוא tergite (השלישי או הרביעי), ו- X הוא זבוב הפרט (גורם אקראי). מאחר שהיחסים בין פיגמנטציה לטמפרטורה אינם ליניאריים 24 , 36 , T טופל כגורם קטגורי. רמות הבדיקה המקסימלית והמינימלית ( P max ו- P min ) ורוחב רצועת הפיגמנט ושל הטרגיט ( W ו - T ) נבחנו. כמו כן נבדקה השפעת הטמפרטורה על רוחב היחסי של רצועת הפיגמנט ( R band = W band / W tergite ). הנתונים הראו שהרוחב המוחלט (רוחב פס ) ו - יחסית ( R band ) של רצועת הפיגמנט ירד מ - 17 ° C עד 25 ° C (מבחן Tukey פוסט - הוק, P <0.05 עבור כולם) ולא השתנה משמעותית מ - 25 ° C עד 28 ° C (Tukey שלאחר הבדיקה הוק,
השפעת הטמפרטורה על רוחב הטרגיט היתה מורכבת יותר. ב ד melanogaster , הגוף ואת גודל איבר ירידה לא ליניארית עם טמפרטורה 49 . מחקרים קודמים מראים כי רוחב הטרגיט הבטן החמישי פוחת ב -10% מ 16.5 ° C ל 25 ° C, ועוד 4% מ 25 ° C עד 29 ° C 50 . בעוד שלא הייתה ירידה משמעותית ברוחבהטרגיט הבטן הרביעי מ 17 ° C עד 25 ° C, הן tergites בטן השלישי והרביעי גדל רוחב מ 25 ° C עד 28 ° C ( טבלה 2 , איור 3D ). מכיוון שרוחב הטרגים הבטן מוגדר על ידי המשתמש (צעדים 5.9-5.10 בפרוטוקול), הפער בין המחקר הנוכחי לבין מחקרים קודמים אינו צפוי להיות תוצאה של הדרך R תמצית סקריפט W tergite מן הפרופיל פיגמנטציה. במקום זאת, הוא עשוי לשקף הבדלים באופן שבו נמדד קטע הבטן, בגנוטיפים של הזבובים, ובהיבטים המדויקים של tergites הבטן נמדדת.
השאלה הבאה היתה האם המתודולוגיה יכולה ליצור נתונים הדומים לנתונים שנאספו באמצעות הערכות קיימות של פיגמנטציה. שיטות אלה בדרך כלל לשאול את הצופה באופן סובייקטיבי להקצות כל זבוב לאחד סנפירIte מספר של שיעורים פנוטיפי מבוסס על מידת הפיגמנטציה 15 , 30 , 32 , 33 , 34 , ולכן להסתמך על היכולת של הצופה להעריך את רוחב של פיגמנט הלהקה. כדי לבדוק עד כמה שיטה זו אובייקטיבית משווה שיטות סובייקטיביות, חמישה משקיפים התבקשו לדרג 45 תמונות של abdomens נקבה בהתבסס על רוחב של פיגמנט הלהקה של tergite הבטן הרביעי. הדירוג הממוצע של משקיפים הושווה עם הדירוג מבוסס על W הלהקה , כפי שנמדד באמצעות מתודולוגיה זו. היה קשר חזק בין הדירוג הסובייקטיבי והאובייקטיווי ( איור משלים 1 , מידע משלים). = 0.7342 של Spearmen, P <0.0001).
נשאלת שאלה נוספתהיה איך שיטה זו כדי לחלץ W הלהקה מן השלב פיגמנטציה לעומת מדידה רוחב של הלהקה פיגמנט ביד (שיטה ויזואלית) באמצעות כלי המדידה ליניארי ב ImageJ . שוב, נמצא מתאם חזק בין הנתונים שנאספו באמצעות שתי המתודולוגיות ( איור משלים 2 , ב מידע משלים. Pdf, OLS, r 2 = 0.49 , P <0.0001). למרות ששיטת החישוב מדדה בעקביות את רצועת הפיגמנט כמצומצמת יותר מאשר בשיטה הויזואלית, מקדם הרגרסיה לא היה שונה משמעותית מ -1 ( P> 0.05).
השאלה האחרונה שהוצגה היתה האם ניתן להשתמש במתודולוגיה זו למדידת הפיגמנטציה הבטן בהקשרים אחרים. המתודולוגיה יכולה לחלץ את P מקסימום , P דקות , W הלהקה , ו W טרגיט עבור Fאנת 'ו tergites הבטן השישית ב נקבות ואת tergites בטן השלישי והרביעי בזכרים ( איור 4 ). יתר על כן, המתודולוגיה יכולה לשמש כדי לכמת את העלייה ב P max ו P דקות בזבובים מוטציה עבור הובנה ( e 1 ), אשר מראים עלייה פיגמנטציה קורטיקולרי על פני הגוף עלייה מסוימת פיגמנטציה של הקדמי לציפורן פיגמנט להקה 28 ( איור 4 ).
איור 1: פיגמנטציה בטן ב מלנוגאסטר . ( A - F ) וריאציה בפיגמנטציה בבטן אצל נקבות של שני גנוטיפים שגודלו בשלוש טמפרטורות (17 ° C, 25 ° C ו -28 ° C). A3 ו- A4 הם הטרגי הבטן השלישית והרביעית Tes, בהתאמה. ( G ) tergite הבטן הגב כולל תא קדמי ואחורי, רק חלקים מהם גלויים באופן אמין ב abdomens un-stretched. התאים מחולקים נוספת לסוגי עור שונים: a1: ללא פיגמנטציה, ללא שערות; A2: פיגמנטציה קלה שערות; A3: פיגמנט קל, שערות, זיפים מתונים; A4: פיגמנט כהה, שערות, זיפים מתונים; A5: פיגמנט כהה, שערות, זיפים גדולים; א 6: ללא פיגמנט ושערות; P3: ללא פיגמנט ושערות; P2: ללא פיגמנטציה וללא שערות; ו p1: un-pigmented ו tessellated. פיגמנט הלהקה מורכב של cuticles a4 ו a5. רק קורטיקלים פיגמנט (a2-a5, קופסה ירוקה) משמשים בניתוח. סולם ברים = 200 מיקרומטר ב (AF). הניגוד של כל התמונות כבר מותאם כדי להדגיש את דפוס הפיגמנטציה, ואת התמונות הם ממחישים. תמונות לא מותאמות המשמשות ליצירת התוצאות המייצגות מופקדים במאגר הדיגיטלי של Dryad."לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו." Target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: תמונה ניתוח נתונים לכימות פיגמנטציה בטן. ( A - F ) ו ( A - F ) הם עבור דגימות שונות ולהראות כיצד ניתוח עוסקת בתמונות באיכות שונה. ( א ) המשתמש מגדיר תחילה את קו האמצע של הבטן (הקו הצהוב), הקצה הקדמי של הטרגית (קו ציאן), וקו מעט אחורי לקצה האחורי של רצועת הפיגמנט (קו מגנטה). מאקרו ImageJ ואז מצייר קו מנקודת האמצע של הקווים הקדמיים אחוריים (קו מקווקו לבן), אשר מתרחב כדי ליצור החזר ROI (קופסה שחורה), מוגדל ב ( B ). ( ג ) ImageJ מאקרו אז לשעברמרחיב את ערך הפיקסל הממוצע לאורך הציר הקדמי-אחורי של החזר ה- ROI. שים לב כי בשלב זה, את הפרופיל הוא קרא מ האחורי כדי הקדמי. ( D - E ) מקרו ה - R ממיר את ערכי הפיקסלים הממוצעים לערך פיגמנטציה, הופך את כיוון פרופיל הפיגמנטציה, מתאים אותו בשקע מעוקב ( S (x) ) D (ומחשב את הראשון ( S (x ) ) ( E ) והשני ( S (x) ) נגזרת של spline ( F ). לאחר מכן, התסריט מזהה: T 3 , את המיקום של פיגמנטציה מקסימלית, כאשר S (x) מעברים מ <0 ל> 0, נע הקדמי מן האחורי של השדרה; T 2 , המיקום שבו הירידה בפיגמנטציה היא הגדולה ביותר ו- S (x) היא מקסימלית; ו T 1 , המיקום שבו הפיגמנטציה tergite הוא המינימום שלה S (x) מעברים מ> 0 ל <0, נע הקדמי fROM 2 ,. הקדמי של tergite גלוי אמין (הקדמי של לציפורן a2) מוגדר על ידי המשתמש. (AF) במקרים בהם לא ניתן להשתמש בנגזרת הראשונה כדי למצוא את T 1 , בדרך כלל משום ש- S (x) אינו עובר 0 ל-פסמנט, הסקריפט יגדיר את T 1 כמיקום שבו מעברי S (x) 0 עד <0 בעת מעבר קדמי מ T 2 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: השפעת הטמפרטורה על היבטים שונים של פיגמנטציה בטן ב d melanogaster נקבה. ( A ) רוחב של פיגמנט הלהקה ( W הלהקה , Fצורה 1). ( ב ) פיגמנט הלהקה כאחוז של tergite ( R הלהקה ). ( C ) מקסימום ( P מקסימום , שורות עליון) מינימום ( P דקות , שורות התחתונה) פיגמנטציה. ( D ) רוחב של tergite ( W tergite ). הנקודות הן הכי פחות מ רבוע מ מודלים ליניארי השפעה השפעה (טבלה 2). סרגלי השגיאה מייצגים את השגיאה הסטנדרטית ויכולים להיות מטושטשים על ידי הסמנים. הקו השחור הוא tergite הבטן השלישי. הקו האפור הוא הטרגיט הבטן הרביעי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: הבדלים בפיגמנטציה בין tergites הבטן השלישי והרביעי. זה מוצג ב ( א הובנה 1 נקבות, ( ב ) wildtype נקבות, ( ג ) wildtype זכרים, ואת החמישית והבטן tergites בטבע wildtype נקבות. ( D ) פיגמנט מקסימלי, P מקסימום . ( E) מינימום פיגמנטציה, P דקות . ( F ) רוחב רצועת הפיגמנט, רצועת W. ( G ) רוחב יחסי של רצועת הפיגמנט, R Band . ברים עם אותיות שונות הם שונים באופן משמעותי (Tukey HSD פוסט פוסט הוק, P <0.05). N = 6 עבור כולם למעט הובנה 1 , כאשר N = 4. סולם ברים = 200 מיקרומטר ב ( A - C ). סרגלי השגיאה מייצגים את השגיאה הרגילה. הניגוד של כל התמונות כבר מותאם כדי להדגיש את דפוס הפיגמנטציה, ואת התמונות הם ממחישים. בבקשה, בבקשהCk כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| השוואה בין מודלים | רכיבים שונים (% מסך הכל) | ||||||
| פיגמנטציה | דֶגֶם | Df | הסתברות לוגית | X² |  (%) |  (%) |  (%) |
| P מקס לא מתוקן | M ij = A i + ε ij | 3 | -678.28 | 1.94 (1)4%) | 11.86 (86%) | ||
| M ijk = S i + A j + ε ijk | 4 | -457.95 | 440.66 *** | 4.08 (26%) | 10.71 (67%) | 1.14 (7%) | |
| דקות לא מתוקנות | M ij = A i + ε ij | 3 | -875.03 | 6.05 (9%) | 59.39 (91%) | ||
| M ijk = S i + A j + ε ijk | 4 | -664.58 | 420.91 *** | 16.67 (22%) | 53.08 (70%) | 6.31 (8%) | |
| P מקסימום תיקון | M ij = A i + ε ij | 3 | -445.05 | <Td> 4.08 (78%) | 1.15 (22%) | ||
| M ijk = S i + A j + ε ijk | 4 | -444.88 | 0.3378 | 4.08 (78%) | 0.01 (<1%) | 1.14 (22%) | |
| P דקות תיקון | M ij = A i + ε ij | 3 | -649.9 | 16.67 (73%) | 6.24 (27%) | ||
| M ijk = S i + A j + ε ijk | 4 | -649.9 | 0 | 16.67 (73%) | 0 | 6.31 (27%) | |
טבלה 1: מודלים ליניאריים של השפעה משולבת של השפעת הטרגיט והפעלות. מודלים ליניאריים של השפעה משולבת של השפעת הטרגיט והפעלות עלפיגמנטציה של הבטן ( P max ו- P דקות ) של 50 tergites שנמדדו מחדש בחמש פגישות, עם רכיבי שונות שנאמדו באמצעות REML. המודלים היו מודלים ליניאריים מעורבים. M : מדידת פיגמנטציה; ת : טרגיט אישי נמדד; S : מושב; Ε : שגיאה שיורית. X2 משמעותיים מוצגים בגופן מודגש. * P <0.05. ** p <0.01. *** p <0.001.
| תְכוּנָה | טֶמפֶּרָטוּרָה | טרגיטה | טֶמפֶּרָטוּרָה X טרגיט | |
| P מקסימום | ללא שם: F | 8.14 | 55.59 | 6.6 |
| עמ ' | 0.002 | <0.001 | ||
| P דקות | ללא שם: F | 4.41 | 66.11 | 6.36 |
| עמ ' | 0.026 | <0.001 | 0.002 | |
| W הלהקה | ללא שם: F | 113.93 | 0.01 | 0.64 |
| עמ ' | <0.001 | 0.931 | 0.531 | |
| W טרגיטה | ללא שם: F | 1.79 | 0.92 | 5.11 |
| עמ ' | 0.191 | 0.338 | 0.007 | |
| R הלהקה | ללא שם: F Td> | 27.66 | 0.08 | 1.46 |
| עמ ' | <0.001 | 0.782 | 0.23 |
טבלה 2: השפעת הטמפרטורה והזהות הטרגית. השפעת הטמפרטורה והזהות הטרגית על היבטים שונים של פיגמנטציה בטן ב 50 tergites מחדש נמדד על פני חמישה מפגשים. המודלים היו מודלים ליניאריים בעלי השפעה מעורבת, כאשר זבוב יחיד נכלל כגורם אקראי. P מקסימום : פיגמנט מרבי (מתוקן); P דקות : פיגמנט מינימלי (מתוקן); רוחב פס : רוחב רצועת פיגמנט; W tergite : רוחב של tergite; R Band : רוחב יחסי של רצועת פיגמנט. גורמים קבועים משמעותיים מוצגים מודגש ( P < 0.05).
| לעכב | W הלהקה | טֶמפֶּרָטוּרָה | טרגיטה | |||
| 17 ג | 25˚C | שְׁלִישִׁי | ||||
| P מקסימום | Β | 234.35 | 0.069 | 0.063 | -1.178 | -0.588 |
| F | 29.93 | 5.97 | 54.82 | |||
| עמ ' | <0.001 | 0.008 | <0.001 | |||
| P דקות | Β | 223.96 | -0.137 | 3.931 | -3.024 | -4.25 |
| F | 19.33 | Span = "2"> 9.66 | 62.02 | |||
| עמ ' | <0.001 | 0.001 | <0.001 | |||
טבלה 3: ההשפעה של רוחב פס פיגמנט, טמפרטורה, זהות טרגית על רמת הפיגמנטציה. ההשפעה של רוחב הלהקה פיגמנט, טמפרטורה, זהות tergite על רמת הפיגמנטציה ב 50 tergites מחדש נמדד על פני 5 מפגשים. המודלים היו מודלים ליניאריים בעלי השפעה מעורבת, כאשר זבוב יחיד נכלל כגורם אקראי. P מקסימום : פיגמנט מרבי (מתוקן); P דקות : פיגמנט מינימלי (מתוקן); רוחב פס : רוחב רצועת פיגמנט; R Band : רוחב יחסי של רצועת פיגמנט.
קובץ משלים 1. מידע נוסף.Y_Information.pdf "target =" _ blank "> לחץ כאן להורדת הקובץ.
קובץ משלים 2. ניתוח סקריפט Pigmentation.R. לחץ כאן להורדת הקובץ.
קובץ משלים 3. מדידה של Pigmentation.ijm אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
סימולציה R סקריפט. לחץ כאן להורדת הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מתודולוגיה זו מאפשרת את הרכישה המדויקת, המהירה והדירנטית של נתוני הפיגמנטציה בצורה כמותית המתאימה למספר ניתוחים במורד הזרם. השיטה שימשה כדי לרכוש נתונים על השפעת הטמפרטורה על פיגמנטציה בטן בקו איזוגני של זבובים. עם זאת, ניתן להשתמש במתודולוגיה במחקרים עתידיים על גנטיקה כדי לזהות גנים המונחים ביסוד הבדלי הפיגמנטציה בין פרטים, אוכלוסיות או מינים, או מחקרים גנטיים-לאחור כדי לחקור את ההשפעות של גנים ספציפיים על דפוסי פיגמנטציה. אמנם, כפי שצוין לעיל, היו מחקרים רבים אשר בחנו את התפתחות ואבולוציה של פיגמנטציה ד melanogaster, הדיוק שבו מתודולוגיה זו לוכדת נתונים פיגמנטציה בצורה כמותית מאפשר גישות סטטיסטיות יותר חזקים. זה בתורו מאפשר לחוקרים להשתמש בדגימות פחות בעת ניתוח דפוסי פיגמנטציה, או מאפשר להם להבהיר יותר מתוחכםהיבטים של פיגמנטציה. יתר על כן, שיטה זו אינה דורשת את דיסקציה של זבוב, המאפשר המדגם לשמש לאחר מכן לניתוחים נוספים, כגון מדידות מורפולוגיות או genotyping. ואכן, המתודולוגיה יכולה להיות בשימוש על זבובים מורדמים, אשר לאחר מכן ניתן לגדל באופן סלקטיבי על בסיס המאפיינים הפיגמנטציה שלהם.
בעיה אפשרית אחת במדידת הפיגמנטציה באמצעות ניתוח תמונה היא שערכי הפיגמנטציה עשויים לשקף את תנאי החשיפה והתאורה, שבהם התמונה נלקחה, ולא את רמת הפיגמנטציה עצמה. תוך שימוש ברמות תאורה קבועות, מיקומי אור, הגדלה וחשיפה מסייעים להקל על בעיות אלה, סביר להניח כי עדיין יהיה צורך לקחת מספר תמונות בקרה חוזרות בכל הפעלה כדי לשלוט באופן מלא על השפעות ההפעלה. שיטה זו כוללת מחדש הדמיה חמש עשרה דגימות בקרה כל מפגש ושימוש בין הפגישה השינויים ב- MAX ו- P דקות כדי לזהות ולחסל אפקטים הפעלה. עם זאת, המספר המדויק של הדגימות שליטה כי צריך להיות צילמו מחדש יהיה תלוי בחומרה הדמיה ותוכנה בשימוש, ההיבט של פיגמנטציה של עניין למשתמש וכיצד הוא משתנה בין טיפולים, וכמה תמונות נלקחים בכל מוֹשָׁב. ביצוע ניסוי ראשוני שבו אותם הדגימות מחדש הדמיה מעל חמש פגישות יאפשר למשתמש לחשב את השונות עקב השפעות הפגישה, השונות עקב זהות הדגימה, ואת השונות שיורית (שהוא אומדן שגיאת המדידה לאחר תיקון עבור השפעות מושב) ( טבלה 1 ). ערכים אלה יכולים לשמש כדי להעריך כמה תמונות שליטה צריך להילקח בכל הפעלה כדי לזהות ולשלוט על ההשפעות הפגישה. סקריפט פשוט R נכתב והשתמש בנתונים מניסוי ראשוני זה כדי לדמות אמצעי פיגמנטציה בין הפעלות. זה יכול לשמשכדי לבדוק את מספר התמונות שליטה לכל הפעלה מספיק כדי להסיר את ההשפעות ההפעלה. סקריפט זה מסופק כקובץ משלים.
אם משתמשים מודאגים כי ישנם גורמים מטרד בתוך הפעלות, הם יכולים גם reimage אותו דגימה מספר פעמים במהלך הפגישה, כמתואר ג ' ון ואח', 2016 41 . במקרה זה, [דגימה] עבור הדגימה שליטה אחת יש לשנות בכל פעם מחדש הדמיה בתוך הפגישה ( למשל , control1, control2, control3, וכו ' ); אחרת, תוכנת הדמיה תחליף את התמונה הקודמת עם התמונה החדשה של אותו שם. פונקציית התיקון מבססת את התיקון שלה על תמונות כפולות עם אותו [דוגמא] בין הפעלות סמוכות באופן זמני, ותתקן, אם הדגימה זהה מחדש מספר פעמים בתוך ובין הפעלות או אם אותה קבוצה של דגימות בקרה הם צילמו בין הפגישות. לא משנה איך thתמונות e שליטה נלקחים, הפעלות צריך להיות מטופל כמו בלוקים, ובמידת האפשר, משתמשים צריכים להעסיק עיצוב בלוק אקראי, כך שכל השפעות הפגישה שנותרו לאחר תיקון ניתן לשלוט סטטיסטית עבור. כשלון זה, דגימות יש להקצות באופן אקראי לפגישות, כך השפעות הפגישה אינם מבולבלים עם גורמים ניסיוניים.
הפרוטוקול מסתמך על הדור של פרופיל פיגמנטציה המייצג את השינוי בפיגמנטציה על פני כל tergite. נושא אחד עם הפקת פרופיל זה הוא שיער כהה המכסים את לציפורן הבטן, אשר הם bisected תמיד על ידי כל קו הקדמי-אחורי שחוצה את tergite. הפרוטוקול מפחית את הרעש שנוצר על ידי שערות אלה על ידי לקיחת הפרופיל פיגמנטציה בממוצע על פני רצועת של לציפורן. עם זאת, משתמשים יכולים להגדיר את רוחב ההחזר על ההשקעה ל 1 פיקסל בשלב 5.6 אם הם רוצים ליצור פרופילים המבוססים על קו דק של לציפורן. יתר על כן, משתמשים יכולים לנתח tהוא אותו תמונה מספר פעמים, לשנות את המיקום לרוחב של פרופיל פיגמנטציה ללכוד שינויים ברוחב של פיגמנט הלהקה בתוך קטע. במקרה זה, עם זאת, משתמשים יצטרכו להעתיק את אותה תמונה מספר פעמים ולתת כל עותק שם ייחודי לפני ביצוע שלב 5.1, מאז מאקרו ImageJ יהיה להחליף פרופילים של אותו שם.
שיקול חשוב נוסף בעת יצירת פרופיל הפיגמנטציה הוא פרמטר החלקה של הספין המעוקב, המוגדר בתוך הפונקציה spline.der.er (L63) בניתוח סקריפט פיגמנטציה R. פרמטר החלקה המתאים תלוי בהגדרת ההדמיה וברזולוציה. החלקת יתר של פרופיל עלולה לגרום לאובדן המאפיינים של פרופיל הספין המשמש לחישוב הקואורדינטות של T 1 , T 2 ו- T 3 ( איור 2 ו -2 D ). לעומת זאת, מתחת להחלקה מגדילהרעש של הפרופיל וכתוצאה מכך את הדיוק של תמציות קואורדינטות. הפונקציה chk מייצרת סיכום גרפי של spline ונגזרות שלה והוא יכול לשמש רמז חזותי לבחור פרמטר החלקה המתאים.
המתודולוגיה המתוארת כאן מתמקדת בלכידת נתונים על הפיגמנטציה של הטרגיטים הבטן השלישית והרביעית אצל דאלנו מלנוגאסטר . עם זאת, התוצאות נציג עולה כי ניתן גם להשתמש בו כדי למדוד את הפיגמנטציה של מקטעי הבטן החמישית והשישית של נקבות. יתר על כן, המתודולוגיה יכולה לזהות הבדלים פנוטיפ הנגרמת על ידי מוטציות של גנים המשפיעים על פיגמנטציה. ניתן לשנות בקלות את התסריטים של מאקרו ו - R של ImageJ כדי למדוד פיגמנטציה בבטן של מינים שונים של מלנוגאסטרים , או אפילו פיגמנטציה של חלקי גוף אחרים במסה אחרת, בתנאי שתבנית הפיגמנטציה היא סטריאוטיפית. לבסוף, המתודולוגיהיכול גם להיות מותאם כדי למדוד היבטים של צבע פיגמנטציה על ידי לכידת תמונות RGB וניתוח כל ערוץ בנפרד.
באופן כללי, מתודולוגיה זו היא חלק מהשדה המתעוררים של phenomics 51 , 52 . מטרת הפנומיקה היא ליצור ולנתח נתונים מערכים פנוטיפיים רב-ממדיים גדולים כדי להבין טוב יותר את האינטראקציות הגנטיות והסביבתיות המשפיעות על פנוטיפ, כולל מחלות, וכיצד האינטראקציות הללו מתפתחות כדי ליצור מגוון ביולוגי. כדי שהפנמיות יממשו את הפוטנציאל שלה, מתודולוגיות לרכישת נתונים פנוטיפיים חייבות להיות פשוטות ומותאמות בקלות לפנוטיפים שונים, כמו גם באופן חופשי. באמצעות תוכנת קוד פתוח כדי לנתח תמונות שנתפסו באמצעות ציוד סטנדרטי, מתודולוגיה זו מסייעת להשיג מטרה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע מענקים IOS-1256565 ו- IOS-1557638 ל- AWS. אנו מודים לפטרישיה ויטקופ ולשלושה מבקרים אנונימיים על הערותיהם המועילות על גרסה קודמת של מאמר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Biology Forceps | FST | 11252-30 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Dissecting Scope | Leica | MZ16FA | |
| Base | Leica | MDG41 | |
| Camera | Leica | DFC280 | |
| Gooseneck Cold Light Source | Schott | ACE 1 | |
| Image Acquisition Control Software | Micro-Manager v1.3.20 | https://micro-manager.org/ | |
| Image Analysis Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Data Analysis Software | R 3.3.2 | https://www.r-project.org/ | |
| LED | Thor Labs | LEDWE-15 | |
| Multimeter | Fluke | Fluke 75 Series II | |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Celltreat Scientific Products | 229663 | |
| Stage micrometer | Klarman Rulings, Inc. | KR-867 |
References
- Wittkopp, P. J., Beldade, P. Development and evolution of insect pigmentation: Genetic mechanisms and the potential consequences of pleiotropy. Semin. Cell Dev. Biol. 20 (1), 65-71 (2009).
- Lindgren, J. Interpreting melanin-based coloration through deep time: a critical review. Proc Roy Soc B-Biol Sci. 282 (1813), (2015).
- Kronforst, M. R., Papa, R. The Functional Basis of Wing Patterning in Heliconius Butterflies: The Molecules Behind Mimicry. Genetics. 200 (1), 1-19 (2015).
- Albert, N. W., Davies, K. M., Schwinn, K. E. Gene regulation networks generate diverse pigmentation patterns in plants. Plant Signal Behav. 9, e29526 (2014).
- Monteiro, A. Origin, development, and evolution of butterfly eyespots. Annu Rev Entomol. 60, 253-271 (2015).
- Kronforst, M. R. Unraveling the thread of nature's tapestry: the genetics of diversity and convergence in animal pigmentation. Pigm Cell Melanoma Res. 25 (4), 411-433 (2012).
- Wright, T. R. The genetics of biogenic amine metabolism, sclerotization, and melanization in Drosophila melanogaster. Adv Genet. 24, 127-222 (1987).
- True, J. R. Insect melanism: the molecules matter. TREE. 18 (12), 640-647 (2003).
- Kopp, A., Duncan, I. Control of cell fate and polarity in the adult abdominal segments of Drosophila by optomotor-blind. Development. 124 (19), 3715-3726 (1997).
- Kopp, A., Muskavitch, M. A., Duncan, I. The roles of hedgehog and engrailed in patterning adult abdominal segments of Drosophila. Development. 124 (19), 3703-3714 (1997).
- Kopp, A., Blackman, R. K., Duncan, I. Wingless, decapentaplegic and EGF receptor signaling pathways interact to specify dorso-ventral pattern in the adult abdomen of Drosophila. Development. 126 (16), 3495-3507 (1999).
- Kopp, A., Duncan, I., Godt, D., Carroll, S. B. Genetic control and evolution of sexually dimorphic characters in Drosophila. Nature. 408 (6812), 553-559 (2000).
- Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134 (4), 610-623 (2008).
- Wittkopp, P. J., Williams, B. L., Selegue, J. E., Carroll, S. B. Drosophila pigmentation evolution: divergent genotypes underlying convergent phenotypes. Proc Natl Acad Sci Usa. 100 (4), 1808-1813 (2003).
- Brisson, J. A., De Toni, D. C., Duncan, I., Templeton, A. R. Abdominal pigmentation variation in drosophila polymorpha: geographic variation in the trait, and underlying phylogeography. Evolution. 59 (5), 1046-1059 (2005).
- Brisson, J. A., Templeton, A. R., Duncan, I. Population genetics of the developmental gene optomotor-blind (omb) in Drosophila polymorpha: evidence for a role in abdominal pigmentation variation. Genetics. 168 (4), 1999-2010 (2004).
- Dembeck, L. M. Genetic Architecture of Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 11 (5), e1005163 (2015).
- Drapeau, M. D., Radovic, A., Wittkopp, P. J., Long, A. D. A gene necessary for normal male courtship, yellow, acts downstream of fruitless in the Drosophila melanogaster larval brain. J Neurobiol. 55 (1), 53-72 (2003).
- Hodgetts, R. B., O'Keefe, S. L. Dopa decarboxylase: a model gene-enzyme system for studying development, behavior, and systematics. Annu Rev Entomol. 51, 259-284 (2006).
- Marmaras, V. J., Charalambidis, N. D., Zervas, C. G. Immune response in insects: the role of phenoloxidase in defense reactions in relation to melanization and sclerotization. Arch Insect Biochem Physiol. 31 (2), 119-133 (1996).
- Kalmus, H. The Resistance to Desiccation of Drosophila Mutants Affecting Body Colour. Proc Roy Soc London B. 130 (859), 185-201 (1941).
- Rajpurohit, S., Gibbs, A. G. Selection for abdominal tergite pigmentation and correlated responses in the trident: a case study in Drosophila melanogaster. Biol J Linn Soc. 106 (2), 287-294 (2012).
- Pool, J. E., Aquadro, C. F. The genetic basis of adaptive pigmentation variation in Drosophila melanogaster. Mol Ecol. 16 (14), 2844-2851 (2007).
- Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Developmental constraints on an adaptive plasticity: reaction norms of pigmentation in adult segments of Drosophila melanogaster. Evol Dev. 2 (5), 249-260 (2000).
- Shakhmantsir, I., Massad, N. L., Kennell, J. A. Regulation of cuticle pigmentation in drosophila by the nutrient sensing insulin and TOR signaling pathways. Dev Dyn. 243 (3), 393-401 (2014).
- Struhl, G., Barbash, D. A., Lawrence, P. A. Hedgehog organises the pattern and polarity of epidermal cells in the Drosophila abdomen. Development. 124 (11), 2143-2154 (1997).
- Jeong, S., Rokas, A., Carroll, S. B. Regulation of body pigmentation by the Abdominal-B Hox protein and its gain and loss in Drosophila evolution. Cell. 125 (7), 1387-1399 (2006).
- Wittkopp, P. J., True, J. R., Carroll, S. B. Reciprocal functions of the Drosophila yellow and ebony proteins in the development and evolution of pigment patterns. Development. 129 (8), 1849-1858 (2002).
- True, J. R. Drosophila tan encodes a novel hydrolase required in pigmentation and vision. PLoS Genet. 1 (5), e63 (2005).
- David, J. R., Capy, P., Gauthier, J. P. Abdominal pigmentation and growth temperature in Drosophila melanogaster: Similarities and differences in the norms of reaction of successive segments. J Evol Biol. 3 (5-6), (1990).
- Gibert, J. M., Peronnet, F., Schlotterer, C. Phenotypic plasticity in Drosophila pigmentation caused by temperature sensitivity of a chromatin regulator network . PLoS Genet. 3 (2), e30 (2007).
- Gibert, P., Moreteau, B., Scheiner, S. M. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila: correlated variations between segments. Genet Sel Evol. 30 (2), 181 (1998).
- Matute, D. R., Harris, A. The influence of abdominal pigmentation on desiccation and ultraviolet resistance in two species of Drosophila. Evolution. 67 (8), 2451-2460 (2013).
- Das, A., Mohanty, S., Parida, B. Abdominal pigmentation and growth temperature in Indian Drosophila melanogaster: Evidence for genotype-environment interaction. J Biosci. 19 (2), 267-275 (1994).
- Hollocher, H., Hatcher, J. L., Dyreson, E. G. Evolution of abdominal pigmentation differences across species in the Drosophila dunni subgroup. Evolution. 54 (6), 2046-2056 (2000).
- Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila melanogaster: genetic repeatability of quantitative parameters in two successive generations. Heredity. 92 (6), 499-507 (2004).
- Carbone, M. A., Llopart, A., deAngelis, M., Coyne, J. A., Mackay, T. F. Quantitative trait loci affecting the difference in pigmentation between Drosophila yakuba and D. santomea. Genetics. 171, 211-225 (2005).
- Kopp, A., Graze, R. M., Xu, S., Carroll, S. B., Nuzhdin, S. V. Quantitative trait loci responsible for variation in sexually dimorphic traits in Drosophila melanogaster. Genetics. 163 (2), 771-787 (2003).
- Bastide, H., Yassin, A., Johanning, E. J., Pool, J. E. Pigmentation in Drosophila melanogaster reaches its maximum in Ethiopia and correlates most strongly with ultra-violet radiation in sub-Saharan Africa. BMC Evol Biol. 14, 179 (2014).
- Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326 (5960), 1663-1667 (2009).
- John, A. V., Sramkoski, L. L., Walker, E. A., Cooley, A. M., Wittkopp, P. J. Sensitivity of Allelic Divergence to Genomic Position: Lessons from the Drosophila tan Gene. G3. 6 (9), 2955-2962 (2016).
- Wittkopp, P. J. Local adaptation for body color in Drosophila americana. Heredity. 106 (4), 592-602 (2011).
- Wittkopp, P. J. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
- Edelstein, A. D. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), e10 (2014).
- U. S. National Institutes of Health. ImageJ v.1.50i. , Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2016).
- Mims, F. M. How to Use LEDs to Detect Light. Make:. 36, 136-138 (2013).
- R: Language and Environment for Statistical Computing v.3.3.2. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: https://www.r-project.org/ (2016).
- Bates, D., Machler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting Linear Mixed-Effects Models Using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
- Shingleton, A. W., Estep, C. M., Driscoll, M. V., Dworkin, I. Many ways to be small: different environmental regulators of size generate distinct scaling relationships in Drosophila melanogaster. Proc Roy Soc Lond B Biol Sci. 276 (1667), 2625-2633 (2009).
- French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
- Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nat Rev Genet. 11 (12), 855-866 (2010).
- Kültz, D. New frontiers for organismal biology. BioSci. 63 (6), 464-471 (2013).
