Summary
이 작품은 디지털 이미지 분석을 사용하여 Drosophila melanogaster의 복부 색소 침착 을 빠르고 정확하게 정량화하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 표현형 획득과 데이터 분석 사이의 절차를 합리화하고 표본 장착, 이미지 수집, 픽셀 값 추출 및 특성 측정을 포함합니다.
Abstract
색소 침착은 형태 적으로 간단하지만 매우 가변적 인 특성으로 종종 적응의 중요성이 있습니다. 그것은 형태 학적 표현형의 발달과 진화를 이해하기위한 모델로서 광범위하게 사용되어왔다. Drosophila melanogaster의 복부 색소 침착 은 특히 유용하여 연구원은 형태학의 내부 및 내부 특이성 변이의 기초가되는 좌위를 확인할 수있었습니다. 그러나, D. melanogaster 복부 색소 침착은 색소 침착 데이터에 적용 할 수있는 통계 분석의 형태를 제한하는 정량적 인 것이 아니라 정량적으로 정량적으로 분석되어왔다. 이 작품은 성인 D. melanogaster 의 복부 색소 침착 패턴의 다양한 측면을 정량화 할 수있는 새로운 방법론을 설명 합니다. 이 프로토콜에는 표본 장착, 이미지 캡처, 데이터 추출 및 분석이 포함됩니다. 이미지 캡처 및 분석 기능 매크로에 사용되는 모든 소프트웨어오픈 소스 이미지 분석을 위해 작성되었습니다. 이 방법의 장점은 다른 이미징 시스템에서 재현성이 높은 방법론을 사용하여 색소 특성을 정확하게 측정 할 수 있다는 것입니다. 이 기법은 성인 D. melanogaster 의 tergal pigmentation 패턴의 변이를 측정하는 데 사용 되었지만 ,이 방법은 무수히 많은 유기체에서 색소 침착 패턴에 유연하고 광범위하게 적용될 수 있습니다.
Introduction
색소 침착은 종, 개체군, 개개인간에, 심지어 개체 발생 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 동안 개인 내에서도 거대한 표현형의 변화를 보여줍니다. 다양한 동물에서 색소 침착에 대한 수많은 연구가 있지만 염색은 Drosophila melanogaster에서 가장 잘 연구되었을 것입니다. 분자 유전학의 모든 힘이 색소 침착을 조절하는 발달 및 생리적 메커니즘을 밝혀 내고 이러한 메커니즘이 어떻게 발전하는지 1 , 6 . D. melanogaster 7 과 8 에서 색소의 생화학 적 합성을 조절하는 유전자와 시간 및 공간적 di를 조절하는 유전자에 대해 많이 알려져있다 .이 생합성에 대한 스트라이핑 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . 또한, 유전지도 작성은 D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 에서 착색의 내부 및 내부 특이적인 차이점을 나타내는 유전자 좌의 위치를 확인했다. 행동 18 , 19 , 면역 19 , 20 과 같은 착색과 pleiotropic 특성 사이의 관계도 착색 패턴 15 , 21 , 22 의 적응 의미를 가지고 탐험되었습니다. 이와 같이, D. melanogaster의 색소 침착 은 강력하면서도 단순한 m복잡한 표현형의 개발과 진화를위한 odel.
성인에서 색소 침착 D. melanogaster 는 특히 날개와 지느러미 흉부와 복부에서 몸 전체에 뚜렷한 무늬가 특징입니다. 그러나 대부분의 연구 관심을받은 것은 배 쪽 복부에있는 각 큐티 큘라 플레이트 (tergite)의 착색입니다. 유전 적 17 , 23 및 환경 24 , 25 요인 때문에이 색소 침착 ( 그림 1A- F )에 상당한 차이가 있습니다. 복강 각질의 큐티클은 전방 및 후방 발달 구획으로 구성되며 ( 그림 1G ), 각 구별은 색소 침착 및 장식에 따라 더 세분화 될 수 있습니다. 전방 구획에는 6 개의 큐티클유형 (a1-a6)을 포함하고 후방 구획은 세 가지 (p1-p3)를 포함한다 ( 그림 1G ). 이 중 p1, p2 및 a1 표피는 일반적으로 미연 신 (un-stretched abdomens)의 표층 아래에 접혀있어 숨겨져 있습니다. 확실하게 눈에 보이는 표피는 큐티클 유형 a4 (중간 정도의 털이있는 털이)와 a5 (털이 큰 털이있는)로 구성되어 있고 밴드의 뒷부분 가장자리로 구성된 무거운 색소의 밴드를 특징으로합니다. ( 그림 1G )보다 강하게 색소 침착되었다. 이 밴드의 앞부분은 가볍게 착색 된 털이 많은 큐티클의 영역으로, 뒤쪽으로 (a3) 딱딱하고 앞쪽으로는 (a2)가 없습니다. 파리 사이의 색소 침착의 변이는 색소의 강도와 색소의 폭 모두에서 관찰된다. 일반적으로, 변이는 대부분의 후부 분절 (복부 분절 5, 6 및 7)에서 가장 크며, 더 많은 전 안부 분절에서 더 낮다 (복부3과 4 장) 24 . 또한, D. melanogaster 색소 침착에 성적 이형성이 있으며, 남성은 일반적으로 5 번째 및 6 번째 복부 tergites를 완전히 색칠합니다 ( 그림 4C ).
D. melanogaster 의 복부 색소 침착에 대한 대부분의 연구에서, 색소 침착은 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 의 척도에서 정 성적으로 27 , 28 , 29 또는 semi-quantitatively로 측정 된 패턴을 가진 범주 형 또는 서수 형으로 처리되었습니다. , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . 이러한 방법은 필연적으로 정밀도 부족으로 고통 받고 있으며 색소 침착의 주관적인 평가에 의존하기 때문에 여러 연구에서 데이터를 비교하기가 어렵습니다. 몇몇 저자들은 착색 38,39의 공간적 차원, 특정 큐티클 유형 23 , 25 , 39 , 40 의 착색 강도 또는 복부 용제 전체의 착색 강도 평균을 41 , 42 , 43 로 계량화했습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 정량화 방법은 복부 색소 침착의 강도와 공간 분포를 동시에 측정하지 않으므로 색소 침착이 abd에서 어떻게 변하는 지에 대한 뉘앙스를 포착하지 않습니다ominal tergite. 또한, 이러한 정량화 방법들 (38 , 41 , 42 , 43) 중 몇 가지는 복부 표피의 해부 및 장착을 필요로한다. 이것은 시간이 많이 걸리고 샘플을 파괴하므로 추가적인 형태 학적 분석에 사용할 수 없습니다. 복부 색소 침착의 발달과 진화에 대한 이해가 심화됨에 따라 공간 분포와 색소 침착을 신속하고 정확하게 측정 할 수있는보다 정교한 도구가 필요합니다.
이 방법의 전반적인 목표는 D. melanogaster 에서 복부 색소 침착에 대한 복제 가능하고 정확한 측정을 얻기 위해 디지털 이미지 분석을 이용하는 것 입니다. 이 방법론은 세 단계로 구성됩니다. 첫째, 성충은 비파괴 적으로 장착되고 등 쪽 복부의 디지털 이미지가 촬영됩니다. 둘째, ImageJ 매크로를 사용하여 사용자는 a2 큐티클의 앞쪽에서 세 번째 및 네 번째 복부 세그먼트의 a5 큐티클 (녹색 상자, 그림 1G )의 후방까지 연장되는 픽셀의 앞 / 뒤쪽 스트립을 정의합니다. 이 스트립의 너비에 걸친 평균 픽셀 값은 장축을 따라 추출되어 테르가 트의 전방에서 후방으로 변화함에 따라 색소의 공간 분포와 강도를 포착하는 프로파일을 생성합니다. 셋째, R 스크립트는 큐빅 스플라인을 사용하여 수학적으로 착색 프로파일을 설명하는 데 사용됩니다. 그런 다음 R 스크립트는 스플라인과 첫 번째 및 두 번째 미분을 사용하여 a2-a5 표피의 너비, 안료 밴드의 너비 및 염색의 최대 및 최소 레벨을 추출합니다. 따라서이 방법은 복부 색소 침착의 깊이와 공간 특성을 정량화합니다.
이 방법론은 세 번째 및 네 번째 복부 tergites의 착색을 정량화,이들은 이전의 많은 연구 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42의 초점이었으며, 오직 더 많은 후부 표적과 배타적으로 또는 조합으로 사용되었다. 다섯 번째 및 여섯 번째 복부 tergites보다 덜 변하지 만, 세 번째 및 네 번째 tergites은 남성에서 완전히 색칠되지 않습니다, 그래서이 프로토콜은 남성과 여성 모두에 적용 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 여기에 표시된대로, 프로토콜은 여성의 다섯 번째와 여섯 번째 복부 tergites의 색소를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 염색 프로파일의 특성을 추출하는 데 사용되는 스크립트의 사소한 수정을 통해 다양한 방법으로 색소 침착의 변이를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다유기체.
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Protocol
1. 시편 설치
참고 : 이미징하기 전에 죽은 파리를 물에 70 % 에탄올에 보관하십시오.
- 60 mm x 15 mm 페트리 접시에 끓는 물에 용해 된 1.25 % 한천 10 ML을 부어 그것을 설정할 수 있습니다.
- 해부 현미경, 젤의 표면에 ~ 20mm 옹이, 2mm 폭, 1mm 깊이 홈을 만들기 위해 미세 포인트 포셉 한 켤레를 사용합니다. 미세 포셉을 사용하여 성인 파리의 복부 측면을 그루브에 삽입하고 파리의 등쪽면을 젤 위에 돌출시킵니다.
참고 : 젤이 느슨하면 시편을 손상시키지 않고 쉽게 위치를 변경할 수 있습니다. 더럽고 부서지며 시간이 지나면 사용할 수 없지만 동일한 홈을 여러 표본에 사용할 수 있습니다. 그런 다음 사용자는 동일한 젤에 다른 홈을 만들 수 있습니다. 각 접시는 200 파리를 이미지하는 데 사용할 수 있습니다. - 물에서 70 % 에탄올로 표본을 완전히 덮어 왁스 같은 큐티클의 빛 반사를 줄이고 날개 손상을 방지하십시오.시험편 조작.
2. 현미경 설정
참고 : 이미지 수집 컨트롤 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터에 연결된 해부 범위, 전송 된 광원, 디지털 카메라 및 거위 목처럼 찬 광원을 사용하여 이미지를 수집합니다. 소프트웨어 지침은 ImageJ 45 를 통합 한 오픈 소스 소프트웨어 인 Micro-Manager v1.4.20 44 에만 해당됩니다.
- 현미경, 디지털 카메라, 이중 구즈넥 차가운 광원 및 컴퓨터를 켭니다.
- 이미지 캡처 소프트웨어를 실행하여 Micro-Manager 창과 ImageJ 창을 엽니 다. ImageJ 창에서 "이미지"> "유형"> "8 비트"를 클릭하여 모든 이미지를 8 비트로 설정하십시오. Micro-Manager 창에서 "라이브"를 클릭하면 카메라에서 실시간 미리보기를 보여주는 "스냅 / 라이브"창이 열립니다.
- "스냅 / 라이브"창의 크기를 최대화하십시오세서리. Micro-Manager 창의 "Contrast"탭에서 풀다운 "Display mode"메뉴에서 "Grayscale"을 선택하십시오.
- 차가운 광원을 최대 강도로 켜고 각 거위 목의 끝을 스테이지에서 약 120mm (왼쪽과 오른쪽에 각각 하나씩) 위치시킵니다.
참고 : 파리 복부 주위에 반사광이 울릴 수도 있지만 사용자는 환형 조명기를 사용할 수도 있습니다. - 수동으로 현미경 배율을 60X로 설정하여 시야에서 스테이지의 지름이 약 3mm 인 영역을 캡처합니다.
- 스테이지에 2mm 무대 마이크로 미터를 놓습니다 (필요한 경우 배경을 흰색으로 전환). 실시간 미리보기를 보면서 무대 마이크로 미터에 초점을 맞추고 "노출"상자에 노출 시간을 ms 단위로 입력하여 마이크로 관리자 창에서 노출을 조정하십시오.
- 공간적으로 카메라를 교정하려면 t에서 "직선"도구를 선택하십시오.그는 ImageJ 창을 열고 스테이지 마이크로 미터의 길이를 그립니다. ImageJ 윈도우에서 "Analyze"> "Set Scale"을 클릭하여 "Set Scale"창을 열고 "Known distance"상자에 μm로 마이크로 미터의 길이를 입력 한 다음 "Unit of length" 상자.
- "Set Scale"창이 "pixels / μm"단위로 스케일을 표시하는지 확인하십시오. 눈금을 적어두고 "확인"을 클릭하십시오.
- "Snap / Live"창에서 "Stop"을 클릭 한 다음 "Snap"을 클릭하여 스테이지 마이크로 미터의 이미지를 캡처하십시오.
- 필요한 경우 이미지를 다시 공간적으로 조정할 수 있도록 이미지를 8 비트 회색조 TIFF로 저장하십시오. ImageJ 윈도우에서 "파일"> "다른 이름으로 저장"> "Tiff ..."를 클릭하십시오. 파일 브라우저에서 파일을 저장할 위치를 지정하고 파일 이름을 지정하고 "저장"을 클릭하십시오.
- 무대를 검은 색과 장소로 전환하십시오.무대에서 한천 (단계 1.1-1.2)에 탑재 비행을 들고 페 트리 접시.
- 현미경을 통해보고 염소 패턴을 가장 잘 볼 수 있도록 등쪽 중간 선이 곧게 펴지도록 파리를 배치하십시오. 날개와 부속 장치를 움직여 복부의 시야가 방해받지 않도록하십시오. 색소 표피 (a2-a5)가 보이지 않으면 복부를 옆으로 꽉 짜내십시오 (물의 70 % 에탄올에 저장된 파리의 복부가 팽창하기 때문에 일반적으로 필요하지 않습니다).
참고 : 플라이를 배치 할 때 사용자는 더 낮은 배율 (20X)을 사용해야 할 수도 있습니다. 진행하기 전에 배율을 60X로 돌려 주어야합니다. - 파리의 등 복부에 수동으로 초점을 맞 춥니 다. 수동으로 광원의 팁을 조정하여 등 복부의 그림자와 반사를 최소화합니다.
- 컴퓨터 화면에서 실시간 미리보기를보고 Micro-Manager 창의 "대비"탭에서 픽셀 값 막대 그래프를 사용하는 동안,단계 2.4에서 설명한대로 노출을 조정하여 미리보기 이미지의 픽셀 값 범위를 최대화하십시오.
- 파리와 페트리 접시를 제거하고 플라이와 같은 위치에서 시야를 중심으로 전압계에 연결된 LED (430-660 nm의 스펙트럼 출력)로 교체하십시오. LED와 전압계를 광도계로 사용하고 LED에 닿는 빛에 의해 생성 된 전압을 기록하십시오 (~ 125 mV).
참고 : LED 및 전압계는 단일 실험 내에서 여러 이미징 세션에서 조명 수준이 일정하도록 보장하는 데 사용됩니다. - 실험 기간 동안 광원의 위치 나 강도, 현미경의 배율 또는 카메라의 노출을 더 이상 변경하지 마십시오.
3. 시편 이미징
- 한천 (단계 1.1-1.3)에 검은 색 현미경 stage.Ajust에 장착 된 비행 자세를 유지 페트리 접시를 놓으십시오 제 3과 fourt복부 세그먼트가 보이고 지느러미 정중선은 단계 2.9에서 설명한대로 곧게 펴집니다. 진행하기 전에 배율이 60 배인지 확인하십시오.
- 수동으로 세 번째와 네 번째 등 쪽 복부 tergites 초점에 현미경 초점을 맞 춥니 다. 단계 2.6에서 설명한대로 이미지 캡처 소프트웨어를 사용하여 이미지를 8 비트 회색조 TIFF로 얻습니다.
참고 : 이미지를 컬러로 캡처 한 다음 분석을 위해 그레이 스케일로 변환 할 수 있습니다. - 단계 2.7에서 설명한대로 이미지를 "SESH000_sampleID.tiff"로 저장하십시오.
참고 : [SESH]는 상수이고, [000]은 세션 번호이며 변수이지만 3 자릿수 여야하며 [sampleID]는 사용자가 원하는 모든 것이지만 추가 밑줄 (_) 문자를 포함 할 수는 없으며 일정한 길이 여야합니다. [표본 ID]는 색소 침착 데이터 ( 예 : 온도 또는 혈통) 분석에 사용 된 요소에 대한 세부 정보를 포함해야하며 특유한 비 알파벳하이픈 (-)과 같은 대문자. 이렇게하면 표준 통계 소프트웨어를 사용하여 [sampleID]에서 이러한 요소를 쉽게 파싱 할 수 있습니다. - 무대에서 페트리 접시를 제거하고 다음 표본과 파리를 교체하십시오. 조명 수준, 배율 또는 노출을 추가 조정하지 않고 모든 표본이 이미 찍힐 때까지 3.1-3.3 단계를 반복합니다.
4. 여러 세션에서 이미징
- 이미지를 여러 세션으로 가져와야하는 경우 세션 전반에 걸쳐 광도, 노출 및 배율을 유지하십시오. 각 세션이 시작될 때 카메라의 공간 보정 (2.4 단계)과 스테이지의 광도 (LED / 전압계로 측정, 단계 2.12)를 확인하십시오.
- 필요한 경우, 이미지를 공간적으로 다시 보정하는 기능을 보장하기 위해 스테이지 마이크로 미터의 이미지를 캡처하고 저장합니다 (2.5-2.7 단계).
- 적어도 15 개의 대조 표본을 사용하고 각 세션에서 무작위로 이미지를 재사용하십시오w를 사용하여 세션 효과를 감지하고 제거합니다. 세션 사이의 중복 대조 표본이 동일한 [표본 ID]이지만 [SESH000]이 서로 다른지 확인하십시오.
참고 : 대조 표본은 수집되어 저장되며 실험 시료와 동일하게 장착되지만 반복적으로 촬영됩니다. 정확한 대조 표본 수는 사용자의 실험 설정에 따라 달라집니다. 자세한 내용은 토론을 참조하십시오.
5. 이미지 분석
참고 : 이미지 분석은 ImageJ 45 에서 수행되며 "Pigmentation.ijm 측정"보조 매크로를 보조 파일로 사용합니다.
- 분석 할 모든 이미지를 같은 폴더에 놓습니다.
- ImageJ를 시작하고 "Plugins"> "Macro"> "Run"을 클릭하고 파일 브라우저에서 "Pigmentation.ijm 측정"을 선택한 다음 "열다."
참고 : 모든 후속 단계는 매크로 내에 있습니다. 각 단계는 개별 매크로 명령입니다. - "필요한 이미지를 저장할 폴더 선택"이라는 "작업 필요"대화 상자가 열립니다. "확인"을 클릭하고 파일 브라우저를 사용하여 이미지가 들어있는 폴더를 선택한 다음 "선택"을 클릭하십시오.
- "필요한 작업을 저장할 폴더를 선택하십시오."라는 "작업 필요"대화 상자가 열립니다. "OK"를 클릭하고 파일 브라우저를 사용하여 염색 프로파일을 저장할 폴더를 선택하십시오. "선택"을 클릭하십시오.
- 대화 상자가 열리면서 "샘플 ID에 몇 개의 문자가 있습니까?"라고 묻습니다. 데이터 입력 상자에 3.3에서 지정한대로 [SampleID]의 문자 수를 입력하고 "확인"을 클릭하십시오.
- "ROI는 얼마나 넓습니까?"라는 질문을하는 대화 상자가 열립니다. 데이터 입력 상자에 전방 십자형 커서의 픽셀 너비를 입력합니다.( 그림 1G , 그림 2A 및 2A '의 녹색 직사각형)을 읽어야합니다. "확인"을 클릭하십시오. 기본값은 20 픽셀입니다.
참고 : 염색 프로파일은 머리카락과 털로 인한 노이즈를 줄이기 위해 줄보다는 큐티클 스트립을 통해 읽습니다. 이 스트립의 너비는 이미지의 해상도에 따라 다르지만 복부 폭의 1 / 20 ~ 1 픽셀이어야합니다. - 매크로가 첫 번째 파리의 이미지를 열고 대화 상자에 현재 파리를 측정할지 ( "예"클릭), 다음 파리로 이동 ( "아니오"클릭) 또는 매크로 ( "취소"를 클릭하십시오).
- "ANTERIOR에서 POSTERIOR로 지느러미 복부의 정중선을 정의하십시오."라는 대화 상자가 열립니다. "직선"도구가 이미 선택됩니다. 앞쪽에서 뒤쪽까지 선 그리기등 쪽 복부의 정중선을 정의한다. "확인"을 클릭하십시오. 그림 2A 및 2A ', 황색 선을 참조하십시오.
참고 : 이것은 이미지의 방향을 변경하여 등 쪽 정중선이 화면에서 가로로 놓이고 왼쪽이 앞쪽에 오도록하여 후속 단계를 더 쉽게 만듭니다. - "Tergite 4의 POSTERIOR 가장자리를 안료 밴드 바로 뒤에 정의하십시오."라는 대화 상자가 열립니다. "직선"도구가 이미 선택됩니다. 구형 중간 선 가장자리에서 오른쪽 가장자리로 선을 그어 선의 중심 (흰색 사각형으로 표시)이 안료 밴드 (표피 a5)의 후부 가장자리 바로 뒤쪽에 위치하도록합니다. "확인"을 클릭하십시오. 그림 2A 및 2A ', 마젠타 색 선을 참조하십시오.
참고 : R 스크립트는 색소 프로파일에서 안료 밴드의 후방 가장자리를 자동으로 감지합니다. - 대화 상자상자가 열리 며 "착색 된 큐티클 (a2)의 앞쪽 가장자리에 Tergite 4의 원형 가장자리를 정의하십시오." "직선"도구가 이미 선택됩니다. 앞쪽 중간 선 가장자리에서 오른쪽 가장자리로 선을 그어 선의 중심 (흰색 사각형으로 표시)이 색소 표피 (표피 a2)의 앞쪽 가장자리에 놓 이도록합니다. "확인"을 클릭하십시오. 그림 2A 및 2A ' , 시안 색 선을 참조하십시오.
참고 : R 스크립트는이 점을 표백제의 색소 표피의 앞쪽 가장자리로 정의합니다. 이미지에서 색소 침착 프로파일을 읽는 관심 영역 (ROI)이 매크로에 표시됩니다 (녹색 장방형, 그림 2A 및 2A ', 그림 2B 및 2B '에서 확대). 또한 매크로는 ROI에 대한 색소 침착 프로파일을 보여주는 두 번째 창을 엽니 다 ( Figur e 2C 및 2C '), 여기에서 x 축은 프로파일의 후방 모서리로부터의 픽셀 수로 표현되는 위치이고, y 축은 각 위치의 평균 픽셀 값입니다. - 매크로에 의해 열리는 착색 프로파일의 플롯을 봅니다. 필요한 경우 프로필 창에서 "라이브"를 클릭하여 색소 침착 프로파일에 영향을 줄 수있는 구조 ( 예 : 털)가 없도록 ROI 위치를 조정합니다. 프로필이 만족 스러우면 "확인"을 클릭하십시오.
- Tergite 3에 대해 5.8-5.11 단계를 반복하십시오.
참고 : 매크로는 색소 프로파일을 두 개의 CSV 파일 (각각 "SESH000_samplename_TX_profile.csv")로 내 보냅니다. 여기서 [SESH000_samplename]은 이미지 이름이고 [TX]는 세 번째 및 네 번째 표준의 경우 T3 또는 T4입니다. - 매크로는 다음 이미지를 엽니 다. 모든 이미지가 분석 될 때까지 5.7-5.13 단계를 반복하십시오.
참고 : 모든 데이터 분석은 R 47 에서 수행되며 제공된 "Pigmentation.R"분석 스크립트를 사용합니다. 아래에서 "L ..."은 분석의 각 부분에 대해 실행할 스크립트의 줄을 나타냅니다. 분석 수행 방법에 대한 추가 정보는 보충 정보를 참조하십시오.
- R 스크립트를 편집하여 작업 디렉토리 (L6)를 설정하고 .csv 프로파일이 들어있는 폴더 (L11)에 대한 파일 경로를 정의하십시오.
- L13-15를 실행하여 프로필 폴더에 저장된 착색 프로필 목록을 생성하십시오.
- 프로파일을 단일 데이터 프레임으로 읽으려면 "reader"및 "addPrimaryKey"기능 (L17-41)을로드하고 실행하십시오.
- L43에서 스크립트를 편집하여 2.5 단계에서 결정한대로 μm / 픽셀 단위로 이미지의 공간 보정을 지정합니다.
- "adjus"를로드하고 실행하십시오.그림 2C 와 2C '의 프로파일 위치를 ROI의 픽셀 - 투 - 후 - 에지 (ROI)에서 ROI의 μm 전치로 변환하는 "tments"기능 (L46-58)과 (0 = 검정, 255 = 흰색)에서 색소 값 (0 = 색소 없음, 255 = 최대 색소)까지의 프로파일 값 (y 축, 그림 2C 및 2C '
- "spline.der.er"함수 (L60-71)를로드하고 실행하여 착색 프로파일과 그 첫 번째 및 두 번째 미분 ( 그림 2D -2F 및 2D '- 2F ')의 3 차 스플라인을 생성합니다.
- 먼저 "coord"와 "assmbly.coord"함수 (L74-163)를 실행하여 안료 밴드의 후방 (T 3 )과 전방 (T 2 ) 모서리의 위치를 추출합니다 ( 그림 2D 및 2D ')와 a2 큐티클의 후단 모서리 (T1, 도 2D 및 2D ')를 추출한 다음 T 3 및 T 1 에서 각각 취한 최대 (P max ) 및 최소 (P min ) 색소 값을 추출한다.
참고 : a2 큐티클의 앞쪽 가장자리는 이미 5.9 단계에서 정의되었습니다. - 옵션 : "chek"기능 (L165-175)을로드하고 실행하여 "coord"기능이 무작위로 선택된 착색 프로파일에 대해 T 1-3 위치 를 정확히 식별하는지 확인하십시오.
- "Session", "Sample", "Tergite", "id"(Sample 및 Tergite의 연결), "P max "라는 제목의 데이터 테이블을 생성하려면 인덱스 및 메트릭 함수 (L178-193) "P min ", "W band "(안료 밴드 폭 = T3 - T2) 및 "W tergite "(색소 c의 폭uticles a2-a5, = T3).
- "수정"기능 (L196-234)을로드하고 실행하여 세션 효과로 인해 발생하는 불필요한 요소에 대해 P max 와 P min 을 수정하는 데이터 테이블을 생성하십시오. 일시적으로 인접한 세션에서 다시 촬영 한 대조군 표본의 P max 또는 P min 의 평균 증가 (또는 감소)를 사용합니다.
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Representative Results
프로토콜은 복부 색소 침착에 온도를 키우는 효과를 탐색하는 데 사용되었습니다. 이전 연구에 의하면 발달 온도의 증가는 D. melanogaster 30 , 32를 포함 하여 여러 종의 초파리 에서 복부 색소 침착의 확산을 감소시키는 것으로 나타났습니다. 특히, 복부 tergites 3과 4, 착색의 범위 (안료 밴드의 폭) 17 ° C에서 25 ° C로 감소하고 25 ° C에서 28 ° C 24,36 동일하게 유지됩니다. 이 연구는 1-10 등급 (0 : 안료 밴드 없음, tergite 완전 황색, 5 : 색소 밴드는 tergite의 50 %, 10 : tergite는 완전히 어둡다)의 색소 침착 정도를 기록했다. 정량적 방법론이 이러한 표현형 소성을 포착 할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 착색은 th17 번 (일곱 개의 파리), 25 ° C (아홉 개의 파리), 그리고 28 ° C (아홉 개의 파리)에서 알에서 성충으로 자란 표정 상 야생형 여성 파리의 등화선의 세 번째 및 네 번째 복부 tergites. 세션 효과에 의해 도입 된 불필요한 요인을 제거 할 때 보정 절차의 효과를 확인하기 위해 동일한 파리의 색소 침착을 다시 촬영하고 1, 2, 4 및 8 일 후에 다시 측정했습니다. 그러나 조명 조건과 세션 간 노출은 수정 절차에 대한 세션 효과가 제거되도록 의도적으로 변경되었습니다. 이미지는 Dryad 디지털 저장소에 게시되었습니다.
첫 번째 질문은 세션에서 색소 침착 측정법의 체계적인 차이가 있는지 여부입니다. 이것은 R48 의 lme4 패키지를 사용하여 혼합 모델에 적합하게 조사되었다. M ijk = S i + A j +S 는 세션 (무작위 효과), A 는 측정되는 복부 tergite (무작위 효과), ε 은 다음과 같이 나타낼 수 있습니다. ε ijk 및 M ij = A j + ε ij = P max 및 P min 잔여 오류 (아래 첨자는 변수 내의 레벨 임). 로그 우도 비 (log-likelihood ratio) 테스트를 사용하여 세션을 임의의 요소로 포함하는 것이 적합성을 크게 개선했는지 여부를 테스트했습니다. 그랬다 ( 표 1 ). 예상대로 REML 48 을 통해 생성 된 분산 구성 요소를 조사한 결과 세션 효과로 인한 변동은 P max 와 P min 의 총 분산의 67 %와 70 %를 차지하는 것으로 나타났습니다 ( 표 1 ).
15 개의 무작위로 선발 된 대조 표적 (세 번째 또는 네 번째, 파리에서17 ° C, 25 ° C 또는 28 ° C에서 적색)을 선택하고 평균 P max 및 P min의 변화를 사용하여 세션을 통해 나머지 표적의 색소 침착을 교정했습니다. 보정 된 색소 침착도 측정에 대한 분석을 반복하면 세션 효과가 제거되고 ( 표 1 ) 세션 효과로 인한 전체 분산의 비율이 0으로 줄어 듭니다. 잔여 오차는 추정치이며 세션 효과가 제거 된 후의 측정 오차이며 P max 와 P min 각각 22 %와 27 %이다 ( 표 1 )
다음으로, 보정 된 데이터를 사용하여 착색 및 크기의 상이한 측면에 대한 온도의 영향을 검출 할 수 있는지를 결정 하였다. 혼합 모델 M ijkm = T i * D j + X k + ε ijkm 가 데이터에 맞추어졌다. 여기서 T D 는 tergite (세 번째 또는 네 번째), X 는 개별 파리 (random factor)입니다. 색소 침착과 온도 사이의 관계가 선형 24 , 36 이 아니기 때문에 T 는 범주 적 요인으로 취급되었습니다. 착색의 최대 및 최소 수준 ( Pmax 및 Pmin) 및 색소 밴드 및 표석 ( W 밴드 및 Wtergite )의 폭 을 테스트 하였다. 안료 밴드 ( R band = W band / W tergite )의 상대 폭에 대한 온도의 영향도 시험 하였다. 데이터는 안료 밴드의 절대 (W 밴드 ) 및 상대 ( R 밴드 ) 폭이 17 ° C에서 25 ° C로 감소한 것을 보여 주었으며 (Tukey 사후 테스트, 모두 P <0.05), 25 ° C ~ 28 ° C (Tukey 사후 테스트,
tergite의 폭에 대한 온도의 영향은 더 복잡했다. D. melanogaster 에서 몸과 기관의 크기는 온도 49 에서 비선형 적으로 감소합니다. 이전의 연구에 따르면 제 5 복부 태거의 폭은 16.5 ° C에서 25 ° C로 10 % 감소하고 25 ° C에서 29 ° C 50 °까지 4 % 감소합니다. 폭의 유의하지 않은 감소가 있었지만제 4 복부 tergite는 17 ° C에서 25 ° C까지, 제 3 및 제 4 복부 tergites 모두 폭이 25 ° C에서 28 ° C로 증가했습니다 ( 표 2 , 그림 3D ). 복부 tergites의 너비가 본질적으로 사용자 (프로토콜의 단계 5.9-5.10)에 의해 정의되기 때문에, 현재 연구와 이전 연구 사이의 불일치는 R 스크립트가 색소 프로파일에서 Werger 를 추출하는 방식 때문이 아닐 수 있습니다. 오히려 그것은 복부 부분이 측정되는 방식, 파리의 유전형 및 측정되는 복부 tergite의 정확한 양상의 차이를 반영 할 수 있습니다.
다음 질문은 방법론이 기존의 색소 평가를 사용하여 수집 된 데이터와 비교 가능한 데이터를 생성 할 수 있는지 여부입니다. 이 방법들은 일반적으로 관찰자에게 각 플라이를 주관적으로 지느러미 중 하나에 할당하도록 요청합니다pigmentation 15 , 30 , 32 , 33 , 34 의 정도에 따라 phenotypic 클래스의 숫자 따라서 따라서 안료 밴드의 너비를 평가하는 관찰자의 능력에 의존합니다. 이 객관적 방법이 주관적 방법과 얼마나 잘 비교해보기 위해 다섯 명의 관찰자에게 네 번째 복강암의 색소 폭의 폭을 기준으로 45 개의 여성 복부 이미지를 순위 지정하도록 요청 받았다. 이 방법론을 사용하여 측정 한 관찰자의 평균 순위와 W 밴드를 기준으로 한 순위를 비교했습니다. 주관적 및 객관적 순위 ( Supplementary Information.pdf의 보충 자료 1 , Spearmen 's = 0.7342, P <0.0001) 간에는 강한 상관 관계가있었습니다.
또 다른 질문 제기ImageJ 의 선형 측정 도구를 사용하여 안료 밴드의 너비를 손으로 (시각적 인 방법으로) 측정하는 것과 비교하여 색소 침착 스플라인에서 W 밴드 를 추출하는 방법이 무엇이었습니다. 다시, 두 가지 방법론을 사용하여 수집 된 데이터 간에는 강한 상관 관계가 발견되었다 ( 보충 그림 2 , 보충 정보 .pdf, OLS, r 2 = 0.49 , P <0.0001). 계산 방법이 안료 밴드를 일관되게 "시각적"방법보다 좁은 것으로 측정했지만, 회귀 계수는 1과 크게 다르지 않았습니다 ( P> 0.05).
마지막으로 제기 된 질문은이 방법이 다른 상황에서 복부 색소 침착을 측정하는 데 사용될 수 있는지 여부입니다. 이 방법론은 f max , P min , W band 및 W tergite 를 추출 할 수있다.여성에서 제 5 및 제 6 복부 tergites 및 남성에서 세 번째 및 네 번째 복부 tergites ( 그림 4 ). 또한, 방법론은 흑체 ( e 1 )에 대한 파리 돌연변이 체에서 P max 및 P min 의 증가를 정량화하는데 사용될 수 있는데, 이는 체내의 큐티클 색소 침착 증가 및 안료 앞 큐티클의 특이한 증가를 나타낸다 밴드 (28) ( 도 4 ).
그림 1 : D. melanogaster의 복부 색소 침착 ( A - F ) 세 가지 온도 (17 ° C, 25 ° C 및 28 ° C)에서 양육 된 두 가지 유전자형의 암컷 복부 색소 침착의 변이. A3과 A4는 3 번째와 4 번째 복부 전이 테스. ( G ) 지느러미 복부 용적 (torsite)은 전방 및 후방 구획을 포함하며, 이들 중 일부는 신장되지 않은 복부에서 확실하게 볼 수있다. 구획은 구별 된 큐티클 유형으로 더 세분됩니다 : a1 : 착색되지 않고 털이 없습니다. a2 : 엷은 색소와 털이있다. a3 : 옅은 색소, 털 및 보통 털; a4 : 짙은 색소, 털 및 보통 털; a5 : 짙은 색소, 털 및 큰 털; a6 : 착색되지 않은 털과 모발. p3 : 착색되지 않은 털과 모발. p2 : 착색되지 않고 털이 없다. 및 p1 : 유색 안료 및 모자이크 처리. 안료 밴드는 큐티클 a4와 a5로 구성됩니다. 색소 큐티클 (a2-a5, 녹색 상자) 만 분석에 사용됩니다. 스케일 바 = 200 μm (AF). 모든 이미지의 대비가 색소 침착 패턴을 강조하기 위해 조정되었으며 이미지는 실례입니다. 대표 결과를 생성하는 데 사용되는 조정되지 않은 이미지는 Dryad 디지털 저장소에 보관됩니다..com / files / ftp_upload / 55732 / 55732fig1large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 복부 색소 침착을 정량화하기위한 이미지 및 데이터 분석. ( A - F )와 ( A - F )는 서로 다른 표본에 대한 것이며 분석이 다른 품질의 이미지를 다루는 방법을 보여줍니다. ( A ) 사용자는 먼저 복부의 중앙선 (황색 선), 표석의 앞쪽 가장자리 (시안 선) 및 안료 밴드 (마젠타 선)의 후부 가장자리 약간 뒤에있는 선을 정의합니다. ImageJ 매크로는 전방 및 후방 선의 중간 점 (흰색 파선)에서 선을 그어 그 선을 확대하여 ROI (검은 색 상자)를 확대하고 ( B )로 확대합니다. ( C ) ImageJ 매크로 다음 ex는 ROI의 전후 축을 따라 평균 픽셀 값을 추적합니다. 이 단계에서 프로파일은 후방에서 전방으로 읽혀집니다. ( D - E ) R 매크로는 평균 픽셀 값을 색소 값으로 변환하고, 착색 프로파일의 방향을 반전시키고, 입체 스플라인 ( S (x) ) ( D )으로 맞추고, 첫 번째 ) ) ( E )와 두 번째 ( S (x) ) 미분 값을 구합니다. 스크립트는 다음을 식별합니다. T 3 , 최대 색소 침착의 위치, 여기서 S (x) 는 0에서> 0으로 전환하고 스플라인의 후방에서 전방으로 이동합니다. T 2 , 착색의 감소가 가장 크고 S (x) 가 최대 인 위치; 및 t 1 , tergite 착색이 최소이고 S (x) 가> 0에서 <0으로 전이하는 위치, 전방으로 이동하는 fROM T 2 ,. 확실하게 보이는 tergite의 전방 (큐티클 a2의 전방)은 사용자에 의해 정의됩니다. (AF) S (x) 가 색소 밴드 앞쪽을 0으로 교차하지 않기 때문에 일차 미분 계수를 사용하여 T 1 을 찾을 수없는 경우, 스크립트는 T 1 을 S (x) 가> T 2 에서 앞쪽으로 움직일 때 0에서 <0. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 여성의 복부 색소 침착의 여러 측면에 대한 온도의 영향 D. melanogaster . ( A ) 안료 밴드 폭 ( W 밴드 , F그림 1). ( B ) 표백석의 비율로서의 안료 밴드 ( R 밴드 ). ( C ) 최대 ( P 최대 , 상단 라인) 및 최소 ( P 최소 , 낮은 라인) 착색. ( D ) tergite의 폭 ( tergite ). 포인트는 선형 혼합 효과 모델에서 최소 제곱 평균입니다 (표 2). 오차 막대는 표준 오차를 나타내며 마커에 의해 가려 질 수 있습니다. 검은 선은 세 번째 복부 테르 타이 트입니다. 회색 선은 네 번째 복부 용암입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 세 번째와 네 번째 복부 tergites 사이의 착색의 차이. 이것은 ( A 에보니 1 명의 암컷, ( B ) 야생형 암컷, ( C ) 야생형 남성, 야생형 암컷의 다섯 번째 및 여섯 번째 복부 tergites. ( D ) 최대 착색, P max . ( E) 최소 착색, P min . ( F ) 안료 밴드의 너비, W 밴드 . ( G ) 안료 밴드의 상대 너비, R 밴드 . 다른 문자가있는 막대는 크게 다릅니다 (Tukey HSD post-hoc 검정, P <0.05). 흑단 1을 제외하고 N = 6, N = 4 인 경우 N = 6. 스케일 막대 = ( A - C )의 경우 200 μm. 오차 막대는 표준 오차를 나타냅니다. 모든 이미지의 대비가 색소 침착 패턴을 강조하기 위해 조정되었으며 이미지는 실례입니다. 제발 cli이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 모델 비교 | 분산 구성 요소 (총 대비 %) | ||||||
| 색소 형성 특성 | 모델 | df | 로그 가능성 | X² |  (%) |  (%) |  (%) |
| P 최대 보정되지 않음 | M ij = A i + ε ij | 삼 | -678.28 | 1.94 (14 %) | 11.86 (86 %) | ||
| Mijk = Si + Aj + εijk | 4 | -457.95 | 440.66 *** | 4.08 (26 %) | 10.71 (67 %) | 1.14 (7 %) | |
| P 분 보정되지 않음 | M ij = A i + ε ij | 삼 | -875.03 | 6.05 (9 %) | 59.39 (91 %) | ||
| Mijk = Si + Aj + εijk | 4 | -664.58 | 420.91 *** | 16.67 (22 %) | 53.08 (70 %) | 6.31 (8 %) | |
| P 최대 보정 됨 | M ij = A i + ε ij | 삼 | -445.05 | <td> 4.08 (78 %) | 1.15 (22 %) | ||
| Mijk = Si + Aj + εijk | 4 | -444.88 | 0.3378 | 4.08 (78 %) | 0.01 (<1 %) | 1.14 (22 %) | |
| P 분 보정 됨 | M ij = A i + ε ij | 삼 | -649.9 | 16.67 (73 %) | 6.24 (27 %) | ||
| Mijk = Si + Aj + εijk | 4 | -649.9 | 0 | 16.67 (73 %) | 0 | 6.31 (27 %) | |
표 1 : tergite 및 세션 효과의 선형 혼합 효과 모델. tergite 및 세션의 효과에 대한 선형 혼합 효과 모델REML을 통해 추정 된 분산 성분을 사용하여 5 회의 세션에서 재현 된 50 개의 표적의 복부 색소 침착 ( P max 및 P min ). 모델은 선형 혼합 효과 모델이었습니다. M : 안료 측정; A : 개별 tergite 측정; S : 세션; ε : 잔여 오류. 중요한 X²는 굵게 표시됩니다. * p <0.05. ** p <0.01. *** p <0.001.
| 특성 | 온도 | Tergite | 온도 x Tergite | |
| P max | F- 비율 | 8.14 | 55.59 | 6.6 |
| 피 | 0.002 | <0.001 | ||
| P 분 | F- 비율 | 4.41 | 66.11 | 6.36 |
| 피 | 0.026 | <0.001 | 0.002 | |
| W 밴드 | F- 비율 | 113.93 | 0.01 | 0.64 |
| 피 | <0.001 | 0.931 | 0.531 | |
| 목표 | F- 비율 | 1.79 | 0.92 | 5.11 |
| 피 | 0.191 | 0.338 | 0.007 | |
| R 밴드 | F- 비율 27.66 | 0.08 | 1.46 | |
| 피 | <0.001 | 0.782 | 0.23 |
표 2 : 온도 및 tergite 정체성의 영향. 온도와 tergite 정체성의 효과 50 세 tergites의 복부 색소 침착의 다른 측면에 대해 5 회의 세션에서 재 측정했다. 모델은 선형 혼합 효과 모델이었으며, 개별 플라이는 무작위 요인으로 포함되었습니다. P max : 최대 착색 (보정); P 분 : 최소 착색 (보정); W 밴드 : 안료 밴드의 너비; W tergite : tergite의 너비; R 밴드 : 안료 밴드의 상대 너비. 유의 한 고정 인자는 굵게 표시 하였다 ( P < 0.05).
| 요격 | W 밴드 | 온도 | Tergite | |||
| 17˚C | 25˚C | 제삼 | ||||
| P max | β | 234.35 | 0.069 | 0.063 | -1.178 | -0.588 |
| 에프 | 29.93 | 5. 97 | 54.82 | |||
| 피 | <0.001 | 0.008 | <0.001 | |||
| P 분 | β | 223.96 | -0.137 | 3.931 | -3.024 | -1.54 |
| 에프 | 19.33 | span = "2"> 9.66 | 62.02 | |||
| 피 | <0.001 | 0.001 | <0.001 | |||
표 3 : 색소 수준에 안료 밴드 폭, 온도 및 tergite 정체도의 효과. 안료 밴드 폭, 온도 및 tergite 정체도가 50 개 tergites의 색소 수준에 미치는 영향은 5 회의 세션에서 재 측정되었습니다. 모델은 선형 혼합 효과 모델이었으며, 개별 플라이는 무작위 요인으로 포함되었습니다. P max : 최대 착색 (보정); P 분 : 최소 착색 (보정); W 밴드 : 안료 밴드의 너비; R 밴드 : 안료 밴드의 상대 너비.
보충 파일 1. Supplementaly 정보.y_Information.pdf "target ="_ blank ">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2. Pigmentation.R 스크립트의 분석. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Supplemental File 3. Pigmentation.ijm의 측정 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
시뮬레이션 R 스크립트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 방법론은 다중 하류 분석에 적합한 양적 형태로 색소 침착 데이터를 정확하고 신속하며 반복적으로 수집 할 수있게합니다. 이 방법은 파리의 등선에서 복부 색소 침착에 대한 온도 효과에 대한 자료를 수집하는 데 사용되었습니다. 그러나 전향 적 유전학 연구에서 개인, 개체군 또는 종 사이의 색소의 차이를 결정하는 유전자를 식별하거나 특정 유전자의 색소 침착 패턴에 미치는 영향을 조사하기위한 역 유전 연구에 사용할 수 있습니다. 상기 한 바와 같이, D. melanogaster 색소 침착의 개발 및 진화를 연구 한 수많은 연구가 있었지만,이 방법론이 색소 침착 데이터를 정량적 형태로 포착하는 정밀도는보다 강력한 통계적 접근법을 가능하게한다. 이것은 차례로 연구원이 착색 패턴을 분석 할 때 샘플을 적게 사용하거나 더 미세하게 해명 할 수있게 해줍니다.착색의 양상. 또한이 방법은 파리의 절개를 필요로하지 않으므로 형태 학적 측정이나 유전자형 분석과 같은 추가 분석을 위해 샘플을 연속적으로 사용할 수 있습니다. 실제로,이 방법은 마취 된 파리에 사용될 수 있으며, 그 후 선택적으로 그들의 착색 특성에 기초하여 사육 될 수있다.
이미지 분석을 통해 색소 침착을 측정 할 때 발생할 수있는 한 가지 문제점은 색소 값이 색소 침착 수준보다는 이미지를 촬영 한 노출 및 조명 조건을 반영한다는 점입니다. 고정 된 조명 레벨, 조명 위치, 배율 및 노출을 사용하면 이러한 문제를 완화하는 데 도움이되지만 세션 효과를 완벽하게 제어하려면 각 세션에서 몇 가지 반복 제어 이미지를 사용해야 할 수 있습니다. 이 방법은 각 세션마다 15 개의 대조 표본을 재 이미징하고 P max와 P min 을 사용하여 세션 효과를 감지하고 제거합니다. 그러나 재 이미징해야하는 정확한 대조 표본의 수는 사용되는 이미징 하드웨어 및 소프트웨어, 사용자가 관심을 갖는 색소의 양상 및 처리 사이의 가변성 및 각 이미지에서 얼마나 많은 이미지가 사용되는지에 따라 달라집니다 세션. 동일한 표본을 5 회의 세션에 걸쳐 다시 묘사하는 예비 실험을 실시하면 세션 효과, 표본 동일성에 따른 분산 및 잔류 분산 (정정 후 측정 오차 추정치)으로 인해 사용자가 분산을 계산할 수 있습니다 세션 효과) ( 표 1 ). 그런 다음이 값을 사용하여 세션 효과를 탐지하고 제어하기 위해 각 세션에서 필요한 제어 이미지 수를 추정 할 수 있습니다. 간단한 R 스크립트가 작성되었으며 세션을 통한 색소 침착을 시뮬레이트하기 위해 예비 실험의 데이터를 사용합니다. 사용할 수 있습니다.세션 당 제어 이미지의 수가 세션 효과를 제거하기에 충분한 지 확인하십시오. 이 스크립트는 보충 파일로 제공됩니다.
사용자가 세션 내에서 불쾌한 요인이 염려되는 경우 John et al., 2016 41 에서 설명한 것처럼 세션을 통해 동일한 표본을 여러 번 다시 이미지 할 수 있습니다. 이 경우 단일 제어 견본에 대한 [sampleID]는 세션 ( 예 : control1, control2, control3 등 )에서 다시 이미지화 할 때마다 변경해야합니다. 그렇지 않으면 이미징 소프트웨어가 이전 이미지를 동일한 이름의 새 이미지로 바꿉니다. 보정 기능은 동일한 시편이 세션 내에서 세션간에 여러 번 다시 촬영되는지 또는 동일한 대조군 세트가 세션간에 이미지화되는지 여부와 상관없이 시간적으로 인접한 세션간에 동일한 [sampleID]가있는 중복 이미지에 보정을 적용하고 보정합니다. 에 관계없이 th제어 이미지가 찍히고, 세션은 블록으로 취급되어야하며 가능한 경우 수정 후 남은 세션 효과를 통계적으로 제어 할 수 있도록 무작위 블록 디자인을 사용해야합니다. 이것이 실패하면, 표본을 세션에 임의로 할당하여 세션 효과가 실험적 요인과 혼동되지 않도록해야합니다.
이 프로토콜은 각 표백제에 대한 색소 침착의 변화를 나타내는 색소 분포의 생성에 의존합니다. 이 프로필을 생성하는 한 가지 문제는 복부 큐티클을 덮는 검은 머리카락입니다.이 검은 머리카락은 바지 타이트를 가로 지르는 임의의 전후방 선에 의해 항상 양분됩니다. 이 프로토콜은 큐티클 밴드를 통해 평균 색소 분포를 취함으로써 이러한 모발에서 발생하는 소음을 줄입니다. 그럼에도 불구하고 큐티클의 얇은 선을 기반으로하는 프로파일을 생성하려는 경우 사용자는 단계 5.6에서 ROI의 너비를 1 픽셀로 설정할 수 있습니다. 또한 사용자는동일한 이미지를 여러 번 반복하여 색소 프로필의 횡 방향 위치를 변경하여 세그먼트 내의 안료 밴드 폭의 변화를 캡처합니다. 그러나이 경우 ImageJ 매크로가 같은 이름의 프로필을 덮어 쓰므로 사용자는 동일한 이미지를 여러 번 복사하고 5.1 단계를 수행하기 전에 각 복사본에 고유 한 이름을 지정해야합니다.
착색 프로파일을 생성 할 때 두 번째 중요한 고려 사항은 Pigmentation R 스크립트 분석에서 스플라인 .der.er 함수 (L63) 내에 정의 된 3 차 스플라인의 평활화 매개 변수입니다. 적절한 스무딩 매개 변수는 이미징 설정 및 해상도에 따라 다릅니다. 프로필을 과도하게 평탄화하면 T 1 , T 2 및 T 3 좌표를 계산하는 데 사용되는 스플라인 프로파일의 특성이 손실 될 수 있습니다 ( 그림 2D 및 2D '). 반대로 언더 스무딩은프로파일 소음과 결과적으로 좌표 추출 정확도. Chek 함수는 스플라인과 그 미분의 그래픽 요약을 생성하며 적절한 평활화 매개 변수를 선택하는 시각적 큐로 사용할 수 있습니다.
여기에 설명 된 방법은 암컷과 수컷 D. melanogaster 에서 제 3 및 제 4 복부 tergites의 착색에 대한 데이터를 포착하는 데 초점을 맞추고 있습니다. 그러나 대표 결과는 여성의 다섯 번째 및 여섯 번째 복부 부분의 색소 침착을 측정하는 데에도 사용될 수 있음을 나타냅니다. 또한이 방법은 색소 침착에 영향을 미치는 유전자 돌연변이 체에 의한 표현형의 차이를 발견 할 수 있습니다. ImageJ 매크로와 R 스크립트는 다른 D. melanogaster 종의 복부에서 색소 침착을 측정하거나 색소 패턴이 고정 관념 인 경우 다른 분류군의 다른 신체 부위의 색소 침착을 쉽게 측정하도록 수정할 수 있습니다. 마지막으로, 방법론RGB로 이미지를 캡처하고 각 채널을 개별적으로 분석하여 색소 색의 양상을 측정 할 수 있습니다.
일반적으로,이 방법론은 신기원 인 phenomics 51 , 52 의 일부이다. phenomics의 목표는 질병을 포함하여 표현형에 영향을 미치는 유전 적 및 환경 적 상호 작용을보다 잘 이해하고 이러한 상호 작용이 어떻게 생물 다양성을 발생시키는지를 이해하기 위해 대규모의 다차원 표현형 데이터 세트를 생성 및 분석하는 것입니다. 그러나 phenomics가 그 잠재 성을 발휘하기 위해서는 표현형 데이터를 얻기위한 방법론이 간단해야하며 자유로이 사용할 수있을뿐만 아니라 다른 표현형에도 쉽게 적용 할 수 있어야합니다. 표준 장비를 사용하여 캡처 한 이미지를 분석하기 위해 오픈 소스 소프트웨어를 사용함으로써이 방법론은 이러한 목표를 달성하는 데 도움이됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 National Science Foundation에서 IOS-1256565 및 IOS-1557638을 AWS에 기부하여 지원되었습니다. 우리는 Patricia Wittkopp과 3 명의 익명의 평론가들에게이 백서의 이전 버전에 대한 도움이되는 의견에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Biology Forceps | FST | 11252-30 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Dissecting Scope | Leica | MZ16FA | |
| Base | Leica | MDG41 | |
| Camera | Leica | DFC280 | |
| Gooseneck Cold Light Source | Schott | ACE 1 | |
| Image Acquisition Control Software | Micro-Manager v1.3.20 | https://micro-manager.org/ | |
| Image Analysis Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Data Analysis Software | R 3.3.2 | https://www.r-project.org/ | |
| LED | Thor Labs | LEDWE-15 | |
| Multimeter | Fluke | Fluke 75 Series II | |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Celltreat Scientific Products | 229663 | |
| Stage micrometer | Klarman Rulings, Inc. | KR-867 |
References
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