Summary
Bu çalışma, dijital görüntü analizi kullanarak Drosophila melanogaster'in karın pigmentasyonunu hızlı ve hassas bir şekilde ölçmek için bir yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, fenotip edinimi ile veri analizi arasındaki usulleri düzene sokar ve numune montajı, görüntü toplama, piksel değeri çıkarımı ve kalitenin ölçülmesini içerir.
Abstract
Pigmentasyon, morfolojik olarak basit ancak oldukça uyarlanabilir nitelikte olan bir özelliktir. Morfolojik fenotiplerin gelişimini ve gelişimini anlamak için kapsamlı bir model olarak hizmet etmiştir. Drosophila melanogaster'teki abdominal pigmentasyon, araştırmacıların morfolojideki inter-ve intraspecifik varyasyonların altında yatan lokusları tanımlamasına imkan tanımak için özellikle yararlı olmuştur. Ancak, D. melanogaster karın pigmentasyonu, niceliksel olarak değil, skorlama yoluyla, pıgmentasyon verilerine uygulanabilen istatistiksel analiz biçimlerini sınırlayan, büyük ölçüde tahlil edilmiştir. Bu çalışma, yetişkin D. melanogaster'in karın pigmentasyon örneğinin çeşitli yönlerinin nicelleştirilmesini sağlayan yeni bir metodoloji tanımlamaktadır . Protokol örnek montaj, görüntü yakalama, veri çıkarma ve analiz içerir. Görüntü yakalama ve analiz özelliği makroları için kullanılan tüm yazılımlarAçık kaynaklı görüntü analizi için yazılmıştır. Bu yaklaşımın avantajı, farklı görüntüleme sistemleri arasında yüksek oranda tekrarlanabilir bir metodoloji kullanarak pigmentasyon özelliklerini tam olarak ölçebilmesidir. Teknik, yetişkin D. melanogaster'in tergal pigmentasyon modellerindeki değişimi ölçmek için kullanılmış olmakla birlikte, metodoloji sayısız farklı organizmalardaki pigmentasyon kalıplarına esnek ve geniş ölçüde uygulanabilir.
Introduction
Pigmentasyon, türler, popülasyonlar ve bireyler arasında ve hatta ontogeny sırasında bireyler arasında muazzam fenotipik varyasyon gösterir 1,2,3,4,5,6. Çok çeşitli hayvanlarda pigmentasyon üzerine yapılan sayısız araştırmalar olmasına rağmen, pigmentasyon, belki de en iyi Drosophila melanogaster'da incelenmiştir ; burada moleküler genetiğin tam gücünün, pigmentasyonu düzenleyen gelişimsel ve fizyolojik mekanizmaları aydınlattığı ve bu mekanizmaların nasıl geliştiği , 6 . D. melanogaster 7,8'deki pigmentlerin biyokimyasal sentezini düzenleyen genler ve zamansal ve uzamsal di'yi kontrol eden genler hakkında çok şey bilinmektedirBu biyo sentezin mahsulü 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Dahası, genetik haritalama, D. melanogaster'ın pigmentasyonundaki intra-ve spesifik farklılıkların altında yatan genetik lokusları belirledi 14,15,16,17. Pigmentasyon paternleri 15 , 21 , 22'nin uyarlanabilir önemi olduğu gibi, davranış 18 , 19 ve bağışıklık 19 , 20 gibi pigmentasyon ve pleiotropik özellikler arasındaki ilişki de araştırılmıştır. Bu nedenle, D. melanogaster pigmentasyonu güçlü ama basit bir m olarak ortaya çıkmıştırKarmaşık fenotiplerin gelişimi ve evrimi için odel.
Yetişkin D. melanogaster pigmentasyon vücudun, özellikle kanat ve dorsal göğüs ve karın üzerinde melanizasyon farklı desenler ile karakterizedir. Bununla birlikte, dorsal karında her kütikül plakasının (tergit) pigmentasyonu en fazla araştırma dikkati çekmiştir. Bu pigmentasyonda ( Şekil 1A -F ) genetik 17 , 23 ve çevresel 24 , 25 faktörlerden dolayı önemli farklılıklar vardır. Karın tergitinin kütikülü, ön ve arka gelişim bölmelerinden oluşur ( Şekil 1G ) ve bunların her biri pigmentasyon ve süsleme temelinde daha da alt bölümlere ayrılabilir 26 . Ön kompartıman altı adet kütikül(A1-a6) ve arka bölüm üç (p1-p3) içerir ( Şekil 1G ). Bunların arasından, p1, p2 ve aluminyum kütikül genellikle gerilmemiş abdomenlerde trolitin altına katlanarak gizli kalırlar. Güvenilir görünür kütikülün özelliği, burada "pigment bandı" olarak adlandırılan ve a4 (kıllı kıllı kıllı) ve beyazlatılmış (büyük kıllı kıllı kütikulak tipleri) grubun arka kenarında Ön kenardan daha yoğun olarak pigmentlenmiştir ( Şekil 1G ). Bu bandın ön kısmı, hafifçe pigmentli kıllı kütikülün, kılların öne arkasında (a2) değil, arka kısmında (a3) bulunduğu bir bölgedir. Sinekler arasındaki pigmentasyon değişikliği hem pigmentasyon yoğunluğunda hem de pigment band genişliğinde gözlemlenir. Genelde varyasyon, en arka segmentlerde (abdominal segment 5, 6 ve 7) en büyük ve daha ön segmentlerde (abdominal seGents 3 ve 4) 24 . Dahası, D. melanogaster pigmentasyonunda cinsel bir dimorfizm vardır, erkekler genellikle tamamen pigmente beşinci ve altıncı karın tergitlerine sahiptir ( Şekil 4C ).
D. melanogaster'in karın pigmentasyonunda yapılan birçok çalışmada pigmentasyon kategorik veya sıradan bir nitelik olarak ele alınmıştır; desen kalitatif olarak 27 , 28 , 29 veya yarı kantitatif olarak 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 skalasında ölçülmüştür , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . Bu yöntemler kesinlikle kaçınılmaz olarak eksiklik çekmektedir ve pigmentasyonun subjektif değerlendirmesine dayanıyorlar çünkü çalışmalardaki verileri karşılaştırmak zordur. Birkaç yazar, pigmentasyonun mekansal boyutlarını, 38 , 39 belirli bir kütikül tipinin pigmentasyon yoğunluğunu, 23 , 25 , 39 , 40'u veya karın tergiti boyunca pigmentasyonun ortalama yoğunluğunu 41 , 42 , 43 olarak nicelendirdi. Bununla birlikte, bu niceleme yöntemleri abdominal pigmentasyonun yoğunluğunu ve mekansal dağılımını aynı anda ölçmez ve bu nedenle pigmentasyonun abd'de nasıl değiştiği nüanslarını yakalamazOminal tergite. Ayrıca, bu 38 , 41 , 42 , 43 sayım yöntemlerinin birçoğu abdominal kütikülün diseksiyonu ve montajını gerektirir. Bu, hem zaman alıcıdır hem de örnekleri yok eder ve ek morfolojik analizler için kullanılamaz hale getirir. Karın pigmentasyonunun gelişimi ve gelişiminin anlaşılması derinleştikçe, hem mekansal dağılımı hem de pigmentasyon yoğunluğunu hızlı ve titizlikle ölçmek için daha karmaşık araçlar gerekecektir.
Bu yöntemin genel amacı, D. melanogaster'ın karın pigmentasyonunun tekrarlanabilir ve daha kesin bir ölçümünü elde etmek için dijital görüntü analizini kullanmaktır . Metodoloji üç aşamayı içermektedir. İlk olarak, yetişkin sineği yıkıcı olmayan bir şekilde monte edilir ve sırt karnının dijital bir görüntüsü alınır. İkinci olarak, bir ImageJ makrosunu kullanarak, kullanıcıA2 kütikülün önünden a5 kütikülün posterioruna (yeşil kutu, Şekil 1G ) uzanan, hem üçüncü hem de dördüncü abdominal segmentler üzerinde uzanan bir ön-arka piksel şeridi tanımlar. Bu şeridin genişliğindeki ortalama piksel değeri daha sonra uzun ekseni boyunca çıkarılarak, tergitin önünden posteriora değiştiği için pigmentasyonun mekansal dağılımını ve yoğunluğunu yakalayan bir profil oluşturur. Üçüncüsü, bir kübik mürekkep püskürtme metodu kullanılarak matematiksel olarak pigmentasyon profilini tarif etmek için bir R yazısı kullanılır. R betiği daha sonra, a2-a5 kütikül genişliğini, pigment bandının genişliğini ve pigmentasyonun maksimum ve minimum seviyelerini çıkarmak için spline'ı ve birinci ve ikinci türevlerini kullanır. Metod, bu nedenle hem mekansal özellikleri hem de abdominal pigmentasyonun derinliğini nicelleştirir.
Bu metodoloji, üçüncü ve dördüncü abdominal tergitlerin pigmentasyonunu,1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 numaralı çok sayıda önceki çalışmaların odağı haline geldi. Bu çalışmalar daha özel olarak ya da daha posterior tergitlerle birlikte yapıldı. Beşinci ve altıncı karın tergastan daha az değişken olmasına rağmen, üçüncü ve dördüncü tergitler erkeklerde tamamen pigmente değildir, bu nedenle bu protokol hem erkek hem de kadınlara uygulanabilir. Bununla birlikte, burada gösterildiği gibi, protokol kadınlarda beşinci ve altıncı karın tergitlerinde pigmentasyon ölçmek için kullanılabilir. Ayrıca, pigmentasyon profilinin özelliklerini çıkarmak için kullanılan küçük değişiklikler, metodun pigmentasyondaki değişikliği niceliksel olarak belirlemek için kullanılmasına izin vermelidirorganizmalar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Numune Montajı
NOT: Görüntülemeden önce ölü sinekleri% 70 etanol içinde suda saklayın.
- 60 mm x 15 mm Petri kabında kaynar suda çözünen% 1.25 agara 10 mL koyun ve ayarlanmasına izin verin.
- Bir diseksiyon mikroskopu altında, jelin yüzeyinde ~ 20 mm, 2 mm genişliğinde, 1 mm derin oluk yapmak için bir çift ince noktalı forseps kullanın. İnce forseps kullanarak, sinekin dorsal yüzü jelin üzerine çıkıntı yapacak şekilde yetişkin bir sinekin ventral yüzünü oyuğa gömer.
NOT: Jelin gevşemesi, numuneye zarar vermeden kolayca yeniden konumlandırılmasını sağlar. Aynı oluk birden çok numune için kullanılabilir, ancak kirli, parçalanmış ve zamanla kullanılamaz hale gelecektir. Kullanıcı daha sonra aynı jöle içinde bir başka oluk daha yapabilir. Her plaka, ~ 200 sinek çekmek için kullanılabilir. - Mumu kütikülündeki herhangi bir ışık yansımasını azaltmak ve kanat hasarını önlemek için sudaki% 70 etanol içindeki numuneyi tamamen örtünÖrnek muamelesi.
2. Mikroskop Kurulumu
NOT: Görüntüler, diseksiyon kapsamı, aktarılan ışık tabanı, dijital kamera ve gooseneck soğuk ışık kaynağı bilgisayar çalıştıran bir görüntü yakalama kontrol yazılımı kullanılarak eklenir. Yazılım talimatları, ImageJ 45'i içeren açık kaynaklı bir yazılım olan Micro-Manager v1.4.20 44'e özeldir.
- Mikroskopu, dijital kamerayı, çift gooseneck soğuk ışık kaynağını ve bilgisayarı açın.
- Bir Micro-Manager penceresi ve bir ImageJ penceresi açmak için görüntü yakalama yazılımını çalıştırın. ImageJ penceresinde, tüm görüntüleri 8 bit olarak ayarlamak için "Görüntü"> "Tür"> "8-Bit" seçeneğini tıklayın. Kameradan gerçek zamanlı bir önizleme gösteren bir "Snap / Live" penceresi açmak için Micro-Manager penceresinde "canlı" seçeneğini tıklayın.
- Ne olursa, "Snap / Live" penceresinin boyutunu en üst düzeye çıkarınyapanlara. Micro-Manager penceresinin "Contrast" sekmesindeki açılan "Display mode" menüsünde "Grayscale" seçin.
- Soğuk ışık kaynağını maksimum yoğunluğuna getirin ve her gooseneck ipuçlarını sahneden yaklaşık 120 mm (bir tanesi solda ve bir tanesi sağda) konumlandırın.
NOT: Kullanıcılar dairesel bir aydınlatıcı kullanabilir, ancak bu sinek karın çevresinde bir yansıma ışığı halkası oluşturabilir. - Manuel olarak mikroskop büyütme değerini 60X yapın, böylece sahne alanı sahnede yaklaşık 3 mm çapında bir alan yakalar.
- Sahneye 2 mm'lik bir mikrometre yerleştirin (gerekirse arka planı beyaza çevirin). Canlı önizlemeye bakarken, sahne mikrometresine odaklanın ve "Pozlama" kutusundaki ms cinsinden pozlama süresini girerek Mikro-Yönetici penceresindeki pozlamayı ayarlayın.
- Kamerayı mekansal olarak kalibre etmek için, "düz çizgi" aracını seçin.O ImageJ pencere ve sahne mikrometresi uzunluğu bir çizgi çizin. "Ölçeği Ayarla" penceresini açmak için ImageJ penceresinde "Analiz et"> "Ölçek Yap" ı tıklayın, "Bilinen mesafe" kutusuna mikrometrenin uzunluğunu μm olarak girin ve "Birim uzunluğu" bölümüne "μm" girin. kutu.
- Bakınız "Ölçeği Ayarla" penceresinde ölçeği "piksel / μm" olarak görüntüler. Ölçeği not edin ve "Tamam" ı tıklayın.
- Sahne mikrometresinin bir görüntüsünü yakalamak için "Snap / Live" penceresinde "Stop" (Durdur) ve ardından "Snap" (Sabitleme) düğmesini tıklayın.
- Gerekirse görüntüleri tekrar mekansal olarak kalibre etme yeteneğinden emin olmak için görüntüyü 8 bitlik gri tonlamalı bir TIFF olarak kaydedin. ImageJ penceresinde "Dosya"> "Farklı Kaydet"> "Tiff ..." seçeneğini tıklayın. Dosyayı tarayıcıda nereye kaydedeceğinizi belirtin, dosyayı adlandırın ve "Kaydet" i tıklayın.
- Sahneyi siyaha çevir ve yerini değiştirSahnede agar içine monte edilmiş bir sinek tutan bir Petri tablası (adım 1.1-1.2).
- Mikroskopta bakınız ve pıgmenti modelini en iyi görmek için dorsal orta hattın düz olduğunu doğrulamak için sinekleri konumlandırın. Karın görünümünün engellenmemesi için herhangi bir kanat ve uzantıları hareket ettirin. Pigmentli kütikül (a2-a5) görünmüyorsa, karnın yanal olarak sıkıştırın (buna rağmen, genellikle sinirlenmek için sineklerin% 70 etanol içinde depolanan sinekler).
NOT: Sineği konumlandırırken kullanıcının daha düşük bir büyütme (20X) kullanması gerekebilir. Devam etmeden önce büyütme 60X değerine geri getirilmelidir. - Sinek karnına elle odaklanın. Dorsal abdomen üzerindeki gölgeleri ve yansımayı en aza indirgemek için ışık kaynağının ipuçlarını elle ayarlayın.
- Bilgisayar ekranındaki canlı önizlemeye bakarken ve Micro-Manager penceresinin "Contrast" sekmesindeki piksel değer histogramını kullanırken,Önizleme görüntüsünün piksel değerlerinin aralığını en yükseğe çıkarmak için adım 2.4'te açıklandığı gibi pozlamayı ayarlayın.
- Sinek ve Petri kabını çıkarın ve sinek gibi aynı pozisyonda görüş alanına ortalanmış bir voltaj ölçerine bağlı bir LED (430-660 nm spektral çıktısı) ile değiştirin. LED ve voltaj ölçeri, ışık ölçer 46 olarak kullanın ve LED'i vuran ışık (~ 125 mV) tarafından üretilen voltajı kaydedin.
NOT: LED ve gerilim ölçer, ışık düzeylerinin tek bir denemedeki çoklu görüntüleme oturumlarında sabit kalmasını sağlamak için kullanılır. - Deney süresince, ışık kaynağının konumunu veya yoğunluğunu, mikroskopun büyütülmesini veya kameranın maruz kalmasını daha fazla değiştirmeyin.
3. Numune Görüntüleme
- Bir karın (adımları 1.1-1.3) monte edilmiş bir sinek tutan bir Petri kabı siyah mikroskop stage.Adjust konumda böylece sinek üçüncü ve fourt2.9. Adımda tarif edildiği gibi abdominal segmentler görülebilir ve dorsal orta çizgi düzdür. Devam etmeden önce büyütmede 60x olduğundan emin olun.
- Mikroskopu, üçüncü ve dördüncü dorsal abdominal tergitlerin odaklanacağı şekilde elle odaklama. Adım 2.6'da anlatıldığı gibi bir görüntüyü 8-bit gri tonlamalı bir TIFF olarak elde etmek için görüntü yakalama yazılımını kullanın.
NOT: Görüntü renkle alınabilir ve daha sonra analiz için gri skala dönüştürülebilir. - 2. adımda açıklandığı gibi resmi "SESH000_sampleID.tiff" olarak kaydedin.
NOT: Burada [SESH] sabittir, oturum numarası [000] ve değişkentir, ancak üç basamaklı olmalı ve [sampleID] kullanıcının isteği ne olursa olsun, ek bir alt çizgi (_) karakteri içermemeli ve Sabit uzunlukta olmalı. [SampleID], pigmentasyon verilerinin ( örn. Sıcaklık veya soy) analizinde kullanılan faktörlerin ayrıntılarını içermelidir; ayırt edici olmayan alfabeCal karakteri, örneğin kısa çizgi (-). Bu, bu faktörlerin standart istatistik yazılımını kullanarak [sampleID] dışında kolayca ayrıştırılmasını sağlar. - Petri kabını sahneden çıkarın ve sineği bir sonraki numune ile değiştirin. Aydınlatma seviyelerini, büyütme veya pozlamayı daha fazla ayarlamadan tüm numuneler görüntülene kadar adım 3.1-3.3'ü tekrarlayın.
4. Birden Fazla Oturum Arasında Görüntüleme
- Görüntülerin birden fazla oturumda ele alınması gerekiyorsa, oturum yoğunluğunu, pozlamayı ve büyütmeyi oturumlar boyunca koruyun. Her oturumun başında kameranın mekansal kalibrasyonunu (adım 2.4) ve sahnedeki ışık yoğunluğunu (LED / voltaj ölçeri, adım 2.12 ile ölçülen şekilde) kontrol edin.
- Gerekirse, görüntüleri tekrar mekansal olarak kalibre etme yeteneğinden emin olmak için sahne mikrometresinin bir görüntüsünü yakalayın ve kaydedin (adım 2.5-2.7).
- En az 15 kontrol numunesi kullanın ve her seansda rasgele yeniden görüntü oluşturun.W oturum etkilerinin tespiti ve ortadan kaldırılması için. Oturumlar arasındaki yinelenen kontrol numunelerinin aynı [örnek kimlik] olduğundan farklı [SESH000] olduğundan emin olun.
NOT: Kontrol numuneleri, deney numuneleri ile aynı şekilde toplanan, depolanan ve monte edilen sineklerdir, ancak seanslar boyunca yeniden imgelenmektedir. Kontrol numunelerinin kesin sayısı, kullanıcının deney düzeneğine bağlı olacaktır. Daha fazla ayrıntı için tartışmaya bakın.
5. Görüntü Analizi
NOT: Görüntü analizi ImageJ 45'te yapılır ve ek bir dosya olarak verilen "Pigmentation.ijm Ölçümü" makrosunu kullanır.
- Analiz edilecek tüm görüntüleri aynı klasöre yerleştirin.
- ImageJ'yi başlatın ve dosya tarayıcısında "Pigmentation.ijm Ölçümü" nü seçerek "Eklentiler"> "Makro"> "Çalıştır" ı tıklayarak "Pigmentation.ijm Ölçümü" makrosunu çalıştırın ve "açık."
NOT: Sonraki tüm adımlar makro içinde bulunur. Her adım, ayrı bir makro komuttur. - "İşlemlerin Zorunlu Oldu" iletişim kutusu açılır ve "Görüntülerin depolandığı klasörü seç" yazısı görüntülenir. "Tamam" a tıklayın ve resimleri içeren klasörü seçmek için dosya tarayıcıyı kullanın ve ardından "seç" düğmesine tıklayın.
- "Verilerin saklanmasını istediğiniz klasörü seçin" şeklindeki bir "İşlem Gerekli" iletişim kutusu açılır. "Tamam" a tıklayın ve pigmentasyon profillerini kaydetmek için istediğiniz klasörü seçmek için dosya tarayıcısını kullanın. "Seç" i tıklayın.
- "Örnek kimliğinizde kaç tane karakter var?" Sorusuyla ilgili bir iletişim kutusu açılır. Veri girişi kutusuna, adım 3.3'te belirtildiği gibi [SampleID] içindeki karakter sayısını girin ve "Tamam" ı tıklayın.
- "Yatırım Getiriniz ne kadar geniş?" Sorusu ile bir iletişim kutusu açılır. Veri girişi kutusuna, anterior-(Yeşil dikdörtgen, Şekil 1G , Şekil 2A ve 2A '). "Tamam" ı tıklayın. Varsayılan 20 pikseldir.
NOT: Tüy ve kılların neden olduğu gürültüyü azaltmak için pigmentasyon profili, çizgi yerine kütikül şeridinde okunur. Bu şeridin genişliği resmin çözünürlüğüne bağlı olacaktır, ancak karnın genişliğinin ~ 1 / 20'si piksel olarak olmalıdır. - Makronun ilk sinek görüntüsünü açacağına ve bir sonraki sinekte ("Hayır" ı tıklayın) devam etmek için mevcut sinek miktarını ölçmek ("Evet" tıklayın), yoksa bir sinek Makroyu tıklayın ("İptal" i tıklayın).
- "Dorsal karın orta çizgisini ANTERIOR'dan POSTERIOR'a tanımlayın" şeklinde bir diyalog kutusunun açılacağını unutmayın. "Düz çizgi" aracı zaten seçilmiş olacaktır. Anteriordan posteriora bir çizgi çizerDorsal karın orta çizgisini tanımlamak için. "Tamam" ı tıklayın. Bakınız Şekil 2A ve 2A ', sarı çizgi.
NOT: Bu, resmin yönünü değiştirmek için, dorsal orta çizginin ekranda yatay olarak uzanması, sol ön kısım ise sonraki adımları kolaylaştırmak için kullanılır. - Not: "Tergite 4'ün POSTERIOR kenarını pigment bandının hemen arkasında tanımlayın" şeklinde bir iletişim kutusu açılır. "Düz çizgi" aracı zaten seçilmiş olacaktır. Çizginin (beyaz bir kare ile işaretli) merkezinin pigment bandının (kütikül a5) arka kenarına sadece posterior olarak oturacağı şekilde, arka orta çizgiden sağ yanal kenara doğru bir çizgi çizin. "Tamam;" ı tıklayın. Bkz. Şekil 2A ve 2A ', kırmızı çizgi.
NOT: R yazısı pigmentleme profilinden pigment bandının arka kenarını otomatik olarak algılar. - Bir diyalogunKutusu açılır ve "Tergite 4'ün ANTERIOR kenarını pigmentli kütikülün ön kenarında (a2) tanımlayın" şeklinde bir açıklama yapacaktır. "Düz çizgi" aracı zaten seçilmiş olacaktır. Çizginin merkezi (beyaz bir kare ile işaretli), pigmentli kütikülün (kütikül a2) ön kenarına oturacak şekilde, ön orta çizgiden sağ yan kenara bir çizgi çizin. "Tamam;" ı tıklayın. Bakınız Şekil 2A ve 2A ' , cam göbeği çizgi.
NOT: R yazısı, bu noktayı, tergitin pigmentli manikürinin ön kenarı olarak tanımlayacaktır. Görüntü üzerinde makro, pigmentasyon profilinin okuduğu ilgi bölgesi (ROI) gösterecektir (yeşil dikdörtgen, Şekil 2A ve 2A ', Şekil 2B ve 2B ' de büyütülmüştür). Makro, ROI için pigmentasyon profilini gösteren ikinci bir pencere açar (Şekil. E 2C ve 2C '), burada x ekseni, profilin arka kenarından gelen piksel sayısı olarak ifade edilen konumdur ve y ekseni, her konumdaki ortalama piksel değeridir. - Makro tarafından açılacak pigmentasyon profilinin grafiğini görüntüleyin. Gerektiğinde, pigmentasyon profilini etkileyecek herhangi bir yapı ( örn. Kıllar) içermemesi için ROI'nın konumunu ayarlamak için profil penceresinde "Canlı" yı tıklayın. Profil tatmin edici olduğunda, "Tamam" ı tıklayın.
- Tergite 3 için 5.8-5.11 adımlarını tekrarlayın.
NOT: Makro, pigmentasyon profillerini her biri "SESH000_samplename_TX_profile.csv" adlı iki CSV dosyası olarak dışa aktarır; burada [SESH000_samplename], resim adıdır ve [TX] üçüncü ve dördüncü tergitler için sırasıyla T3 veya T4'tür. - Makronun bir sonraki resmi açtığına dikkat edin. Tüm görüntüler analiz edilene kadar 5.7-5.13 adımlarını tekrarlayın.
NOT: Tüm veri analizi R 47'de yapılır ve verilen "Pigmentation.R Analizi" komutunu kullanır. Aşağıda, "L ...", analizin her bir parçası için komut satırının çalıştırılacağını belirtir. Analizin nasıl yapıldığı ile ilgili ek ayrıntılar için Ek Bilgi bölümüne bakın.
- Çalışma dizini (L6) ayarlamak için R komut dosyasını düzenleyin ve dosya yolunu .csv profillerini (L11) içeren klasöre tanımlayın.
- Profil klasöründe saklanan pigmentasyon profillerinin bir listesini oluşturmak için L13-15'i çalıştırın.
- Profilleri tek bir veri çerçevesine okumak için "okuyucu" ve "addPrimaryKey" işlevlerini (L17-41) yükleyin ve çalıştırın.
- Adım 2.5'te belirlendiği üzere, resimlerin mekansal kalibrasyonunu μm / piksel cinsinden belirtmek için L43'te komut dosyasını düzenleyin.
- Yükle "adjus" u çalıştır(X ekseni, Şekil 2C ve 2C '), ROI'nin piksellerinden-posterior kenarına-ROI'nin anterior-kenarından μm'ye dönüştürmek için "tents" fonksiyonu (L46-58) ve Piksel değerinden (0 = siyah, 255 = beyaz) pigmentasyon değerine (0 = pigment yok, 255 = maksimum pigment) profil profili değeri (y ekseni, Şekil 2C ve 2C ').
- Pigmentasyon profilleri ve birinci ve ikinci türevlerinin kübik eğrisini oluşturmak için "spline.der.er" fonksiyonunu (L60-71) yükleyin ve çalıştırın ( Şekil 2D -2F ve 2D '- 2F ').
- Önce pigment bandının arka (T 3 ) ve anterior (T 2 ) kenarlarının konumunu çıkartmak için "koord" ve "assmbly.coord" fonksiyonlarını (L74-163) yükleyin ve çalıştırın ( Şekil 2D ve 2D '; Ve a2 kütikülün arka kenarı (T1, Şekil 2D ve 2D ') ve daha sonra sırasıyla T3 ve Tl'de alınan maksimum (Pmax) ve minimum (Pmin) pigmentasyon değerlerini çıkarmak için kullanıldı.
NOT: a2 manikür kutusunun ön kenarı adım 5.9'da tanımlanmıştır. - İsteğe bağlı: Rastgele seçilmiş bir pigmentleme profili için "koordinat" fonksiyonunun T 1-3 konumlarını doğru olarak tanımlayıp tanımadığını kontrol etmek için "chek" fonksiyonunu (L165-175) yükleyin ve çalıştırın.
- "Oturum", "Örnek", "Tergite", "id" (Numune ve Tergite'nin bir birleşimi) başlıklar içeren bir veri tablosu oluşturmak için dizin ve ölçüm işlevlerini yükleyin ve çalıştırın (L178-193) "P max " "P min ", "W band " (pigment bandının genişliği , = T3 - T2) ve "W tergite " (pigmentli c genişliğiAletler a2-a5, = T3).
- Oturum etkileri nedeniyle ortaya çıkan sıkıntı faktörleri için P maks ve P min değerlerini düzelten bir veri tablosu oluşturmak için "düzeltme" fonksiyonunu (L196-234) yükleyin ve çalıştırın. Geçici olarak bitişik oturumlar boyunca tekrar görüntülemiş olan kontrol numunelerinden Pmax veya Pmin'deki ortalama artış (veya düşüş) kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokol, yetiştirme sıcaklığının abdominal pigmentasyon üzerine etkisini araştırmak için kullanılmıştır. Önceki çalışmalar , D. melanogaster 30 , 32 dahil olmak üzere, gelişim sıcaklığında bir artışın Drosophila'nın çeşitli türlerinde abdominal pigmentasyon yayılımında bir azalmaya neden olduğunu göstermiştir . Özellikle abdominal tergitler 3 ve 4'te pigmentasyonun boyutu (pigment bandının genişliği) 17 ° C'den 25 ° C'ye düşmekte ve 25 ° C'den 28 ° C'ye 24 , 36 aynı kalmaktadır. Bu çalışmalar 1-10 ölçekte pigmentasyon derecesini skorladı (0: pigment bandı yok, tergite tamamen sarı; 5: pigment bandı tergitin% 50'sini, 10: tergit tamamen karanlık). Kantitatif metodolojinin bu fenotipik plastisiti yakalayıp toplayamayacağını belirlemek için, pigmentasyon,E 17 ° C'de (yedi sinek), 25 ° C'de (dokuz sinek) ve 28 ° C'de (dokuz sinek) erişkinlere yetiştirilen, görünüşte vahşi tip sinek sineklerinin izogenik bir çizgisinin üçüncü ve dördüncü abdominal tergitleridir. Oturum etkileri ile ortaya çıkan sıkıntı faktörlerin giderilmesinde düzeltme prosedürünün etkililiğini belirlemek için, aynı sineklerin pigmentasyonu yeniden oluşturuldu ve bir, iki, dört ve sekiz gün sonra yeniden ölçülür. Bununla birlikte, aydınlatma koşulları ve oturumlar arasındaki maruz kalma, düzeltme prosedürünün kaldırılması için oturum etkilerinin olmasını sağlamak için bilerek değiştirildi. Görüntüler, Dryad dijital deposunda yayınlanmıştır.
İlk soru, oturumlar boyunca pigmentasyon önlemlerinde sistematik farklılıklar olup olmadığı idi. Bu, R 48'deki lme4 paketi kullanılarak karışık modelleri M ijk = S i + A j +Ε ijk ve M ij = Hem P max hem de P min için A j + ε ij , burada M pigment ölçüsü, S , oturum (rasgele etki), A , ölçülen abdominal tergite (rasgele etki) ve ε Artık hata (alt simgeler değişkenler içindeki düzeylerdir). Bir günlük olasılık oranı testi, oturumun tesadüfi bir faktör olarak dahil edilmesinin, uygunluğu önemli ölçüde arttırıp arttırmadığını test etmek için kullanıldı; Yaptı ( Tablo 1 ). Beklendiği gibi, varyans bileşenlerinin incelenmesi (REML 48 aracılığıyla üretilen), oturum etkilerinden kaynaklanan değişimin sırasıyla Pmax ve Pmin'deki toplam varyansın% 67'sini ve% 70'ini oluşturduğunu belirtmiştir ( Tablo 1 ).
On beş rastgele seçilen kontrol tergitleri (üçüncü veya dördüncü, sineklerdenKırmızı 17 ° C, 25 ° C veya 28 ° C) seçildi ve ortalama Pmax ve Pmin'deki değişiklikler oturumlar boyunca kalan tergitlerin pigmentasyon önlemlerini düzeltmek için kullanıldı. Düzeltilmiş pigmentasyon önlemleri üzerinde yapılan analizin tekrarlanması, oturum etkilerini ortadan kaldırdı ( Tablo 1 ) ve oturum etkilerinden kaynaklanan toplam varyans yüzdesini sıfıra indirdi. Reziduel hata, bir tahmindir, oturum etkileri kaldırıldıktan sonra bir ölçüm hatasıdır ve sırasıyla P max ve P min için% 22 ve% 27'dir ( Tablo 1 )
Sonra, düzeltilen veriler, sıcaklığın pigmentasyonun ve boyutun farklı yönleri üzerindeki etkisinin saptanıp ölçülemediğini belirlemek için kullanıldı. Karışık model M ijkm = T i * D j + X k + ε ijkm , verilere yerleştirildi , burada T D , tergastır (üçüncü veya dördüncü) ve X tek tek sinektir (rassal faktör). Pigmentasyon ve sıcaklık arasındaki ilişki doğrusal değildir 24 , 36 , T kategorik bir faktör olarak ele alınmıştır. Pigmentasyonun maksimum ve minimum seviyeleri ( Pmax ve Pmin) ile pigment bandı ve tergit genişliği ( W bandı ve W tergite ) test edildi. Sıcaklığın pigment bandının göreli genişliği ( R bandı = W band / W tergite ) üzerindeki etkisi de test edildi. Veriler, pigment bandının mutlak (W bandı ) ve bağıl ( R bandı ) genişliğinin 17 ° C'den 25 ° C'ye düştüğünü (hepsi için Tukey post-hoc testi, P <0.05) ve 25'den anlamlı olarak değişmediğini gösterdi ° C ila 28 ° C (Tukey post-hoc testi,
Sıcaklığın tergit genişliği üzerindeki etkisi daha karmaşıktı. D. melanogaster'da , vücut ve organ boyutu, sıcaklık ile doğrusal olmayan bir şekilde azalır 49 . Önceki çalışmalar beşinci karın tergitesinin genişliğinin 16.5 ° C'den 25 ° C'ye% 10, 25 ° C'den 29 ° C 50'ye % 4 oranında düştüğünü ileri sürmektedir. Genişliğinde belirgin bir azalma görülürkenDördüncü abdominal tergite 17 ° C ila 25 ° C arasında, hem üçüncü hem de dördüncü karın tergitlerinde genişlik 25 ° C'den 28 ° C'ye yükselmiştir ( Tablo 2 , Şekil 3D ). Karın tergastlarının genişliği esas olarak kullanıcı tarafından tanımlandığından (protokoldeki 5.9-5.10 arası adımlar), mevcut ve önceki çalışmalar arasındaki dengesizlik R yazısının pigmentasyon profilinden W tergiti çıkarma şekli nedeniyle olması muhtemel değildir. Daha ziyade, karın bölümünün ölçülme biçiminde, sineklerin genotiplerinde ve ölçülmekte olan karın tergitlerinin kesin yönlerinde farklılıkları yansıtabilir.
Bir sonraki soru, metodolojinin, pigmentasyonun mevcut değerlendirmelerini kullanarak toplanan verilere kıyaslanabilir verileri üretip üretemeyeceği idi. Bu yöntemler genellikle gözlemciye, her sineği bir yüzgüden birine öznel olarak atamalarını isterPigmentasyon derecesine dayanan fenotip sınıflarının sayısı 15 , 30 , 32 , 33 , 34 ve bu nedenle gözlemcinin pigment bandının genişliğini değerlendirme yeteneğine güvenir. Bu objektif yöntemin öznel yöntemlerle ne kadar iyi karşılaştırıldığını test etmek için, beş gözlemciden dördüncü abdominal tergitin pigment bandı genişliğine dayanarak 45 kadın abdomeni görüntüsünü sıralaması istendi. Gözlemciler arasındaki ortalama sıralama , bu metodoloji kullanılarak ölçülen W bandına dayalı sıralamayla karşılaştırıldı. Sübjektif ve objektif sıralamalar arasında güçlü bir korelasyon vardı ( Ek Tablo 1 , Ek Bilgi. Pdf), Spearmen's = 0.7342, P <0.0001).
Başka bir soru poz verdiImageJ'deki doğrusal ölçüm aracını kullanarak elle (görsel yöntem) pigment bandının genişliğini ölçmekle karşılaştırıldığında W bandını pigmentasyon spline'ından ayıklamak için bu yöntemin nasıl yapıldığı idi. Yine, iki metodoloji kullanılarak toplanan veriler arasında güçlü bir korelasyon bulunmuştur ( Yardımcı Şekil. 2 , Ek Bilgi. Pdf, OLS, r 2 = 0.49 , P <0.0001). Hesaplama yöntemi, pigment bandını "görsel" yöntemden daha dar olarak sürekli olarak ölçmüş olsa da, regresyon katsayısı 1'den anlamlı olarak farklı değildi ( P> 0.05).
Son soru, bu metodolojinin başka bağlamlarda karın pigmentasyonunu ölçmek için kullanılabileceği idi. Metodoloji, f için P max , P min , W bandı ve W tergite'yi çıkarabilirKadınlarda altıncı ve altıncı karın tergitleri, erkeklerde ise üçüncü ve dördüncü karın tergastları ( Şekil 4 ). Ayrıca metodoloji, vücuttaki kütikül pigmentasyonunda bir artış ve pigmentin önündeki manikürde pigmentasyonda belirli bir artış olduğunu gösteren, abanoz ( e 1 ) için sinek mutantlarındaki P max ve P min'deki artışın miktarını belirlemek için kullanılabilir Band 28 ( Şekil 4 ).
Şekil 1: D. melanogaster'te abdominal pigmentasyon . ( A - F ) Üç sıcaklıkta yetiştirilen iki genotipin (17 ° C, 25 ° C ve 28 ° C) kadınlarda karın pigmentasyonundaki değişim. A3 ve A4 üçüncü ve dördüncü abdominal terri Tes, sırasıyla. ( G ) Dorsal abdominal tergite, ön ve arka kompartmanı içerir; bunların sadece bir kısmı gerilmemiş abdominallerde güvenilir şekilde görünürdür. Bölmeler ayrıca farklı kütikül tiplerine ayrılmıştır: a1: pigmentsiz, kılsız; A2: hafif pigmentli ve kıllı; A3: hafif pigmentli, kıllı ve ılımlı kıl; A4: koyu renk pigmentli, kıllı ve orta kıllı; A5: koyu renkli pigmentli, kıllı ve geniş kıllı; A6: pigmentsiz ve tüyler; P3: pigmentsiz ve tüyler; P2: pigmentsiz ve kıl yok; Ve p1: renksiz ve tessellenmiş. Pigment bandı, a4 ve a5 kütiküllerinden oluşur. Analizde sadece pigmentli cutikler (a2-a5, yeşil kutu) kullanılır. Ölçek çubukları = (AF) olarak 200 μm. Tüm görüntülerin kontrastı, pigmentasyon örüntüsünü vurgulamak için ayarlanmıştır ve resimler açıklayıcıdır. Temsili sonuçların üretilmesi için kullanılan düzeltilmemiş görüntüler, Dryad dijital deposunda depolanır..com / files / ftp_upload / 55732 / 55732fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bu şekli daha geniş bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Karın pigmentasyonunun nicelleştirilmesi için görüntü ve veri analizi. ( A - F ) ve ( A - F ) farklı örnekler içindir ve analizin farklı kalitede görüntülerle nasıl başa çıktıklarını gösterin. ( A ) Kullanıcı ilk önce karın orta çizgisini (sarı çizgi), tergitin ön kenarını (camgöbeği çizgi) ve pigment bandının arka kenarına (kırmızı çizgiyle) biraz geride bir çizgi belirler. ImageJ makrosu, daha sonra, ( B ) 'de büyütülmüş bir ROI (kara kutu) oluşturmak üzere genişleyen anterior ve posterior hatların orta noktasından (beyaz kesikli çizgi) bir çizgi çizer. ( C ) ImageJ makrosu daha sonra exROI'nin ön-arka ekseni boyunca ortalama piksel değerini tahrik eder. Bu aşamada profilin posteriordan anteriora okunduğunu unutmayın. ( D - E ) R makrosu ortalama piksel değerlerini bir pigmentasyon değerine dönüştürür, pigmentasyon profilinin yönünü tersine çevirir, kübik bir spline ( S (x) ) ( D ) ile uyuşturur ve ilk ( S (x) ) ) ( E ) ve ikinci ( S (x) ) türevi. Komut daha sonra şunları tanımlar: T 3 , maksimum pigmentasyonun konumu, burada S (x) <0'dan> 0'a geçer, öne doğru spline'in posteriorundan hareket eder; T 2 , pigmentasyonda düşüşün en fazla olduğu ve S (x) maksimum olduğu pozisyon; Ve T 1 , tergite pigmentasyonunun minimumda olduğu ve S (x) geçişleri> 0 dan <0'a değişen, öne doğru hareket eden fRom T 2 ,. Güvenilir şekilde görülebilen tergitin ön kısmı (manikür a2'nin ön kısmı) kullanıcı tarafından tanımlanır. (AF) İlk türevin T 1'i bulmak için kullanılamadığı durumlarda, tipik olarak S (x) pigment bandına anterior olarak geçmez, senaryonun T 1 , S (x) 'in> T 2'den anteriora hareket ederken 0'dan <0'a kadar. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Dişi D. melanogasterinde sıcaklığın abdominal pigmentasyonun farklı yönlerine etkisi . ( A ) Pigment bandının genişliği ( W bandı , FŞekil 1). ( B ) Pigment bandı tergite oranla ( R bandı ). ( C ) Maksimum ( P max , üst çizgiler) ve minimum ( P min , alt çizgiler) pigmentasyon. ( D ) Tergit genişliği ( W tergite ). Noktalar, lineer karışık etki modellerinden en küçük kareler anlamına gelmektedir (Tablo 2). Hata çubukları standart hatayı gösterir ve işaretleyiciler tarafından gizlenebilir. Siyah çizgi üçüncü abdominal tergite aittir. Gri çizgi dördüncü abdominal tergastır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: Üçüncü ve dördüncü abdominal tergitler arasındaki pigmentasyon farklılıkları. Bu, ( A abanoz 1 dişiler, ( B ) vahşi tipli dişiler, ( C ) vahşi tip erkekler ve vahşi tipli dişi bayanlarda beşinci ve altıncı karın tergitleri. ( D ) Maksimum pigmentasyon, P max . ( E) Minimum pigmentasyon, P min . ( F ) Pigment bandının genişliği, W bandı . ( G ) Pigment bandının göreceli genişliği, R bandı . Farklı harflere sahip çubuklar önemli derecede farklıdır (Tukey HSD post-hoc testi, P <0.05). Abanoz 1 haricindeki herkes için N = 6, burada N = 4'tür. Ölçek çubukları = ( A - C ) cinsinden 200 μm'dir. Hata çubukları standart hatayı gösterir. Tüm görüntülerin kontrastı, pigmentasyon örüntüsünü vurgulamak için ayarlanmıştır ve resimler açıklayıcıdır. Lütfen cliBu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayın.
| Model Karşılaştırması | Varyans Bileşenleri (toplamın% 'si) | ||||||
| Pigmentasyon Özellikleri | model | df | Log-olabilirlik | X² |  (%) |  (%) |  (%) |
| P max düzeltilmemiş | M ij = A i + ε ij | 3 | -678,28 | 1.94 (1% 4) | 11.86 (% 86) | ||
| M ijk = S i + A j + ε ijk | 4 | -457,95 | 440,66 *** | 4.08 (% 26) | 10.71 (% 67) | 1.14 (% 7) | |
| P min Düzeltilmemiş | M ij = A i + ε ij | 3 | -875,03 | 6.05 (% 9) | 59.39 (% 91) | ||
| M ijk = S i + A j + ε ijk | 4 | -664,58 | 420,91 *** | 16.67 (% 22) | 53.08 (% 70) | 6,31 (% 8) | |
| P max düzeltildi | M ij = A i + ε ij | 3 | -445,05 | <Td> 4.08 (% 78) | 1.15 (% 22) | ||
| M ijk = S i + A j + ε ijk | 4 | -444,88 | 0,3378 | 4.08 (% 78) | 0.01 (<% 1) | 1.14 (% 22) | |
| P min Düzeltildi | M ij = A i + ε ij | 3 | -649,9 | 16.67 (% 73) | 6.24 (% 27) | ||
| M ijk = S i + A j + ε ijk | 4 | -649,9 | 0 | 16.67 (% 73) | 0 | 6,31 (% 27) | |
Tablo 1: Tergit ve seansın etkisinin doğrusal karışık etki modelleri. Tergite ve seanstan oluşan etkinin doğrusal karışık etki modelleriBeş seansta yeniden tayin edilen 50 tergite ait bumbinal pigmentasyon ( Pmax ve Pmin), REML ile varyans bileşenleri tahmin edildi. Modeller doğrusal karışık efekt modelleridir. M : Pigmentasyon ölçüsü; C : Kişisel tergite ölçülmüştür; S : Oturum; Ε : Artık hata. Önemli X² kalın yazıyla gösterilmiştir. * P <0.05. ** p <0.01. *** p <0.001.
| Kişisel özellik | Sıcaklık | tergite | Sıcaklık X Tergit | |
| Maksimal | Oran | 8.14 | 55.59 | 6.6 |
| P | 0.002 | <0.001 | ||
| Dakika | Oran | 4,41 | 66,11 | 6.36 |
| P | 0,026 | <0.001 | 0.002 | |
| W band | Oran | 113,93 | 0.01 | 0.64 |
| P | <0.001 | 0,931 | 0.531 | |
| W tergit | Oran | 1.79 | 0.92 | 5.11 |
| P | 0.191 | 0.338 | 0.007 | |
| R bandı | Oran 27.66 | 0.08 | 1.46 | |
| P | <0.001 | 0.782 | 0.23 |
Tablo 2: Sıcaklık ve tergite kimliğinin etkisi. Sıcaklık ve tergite kimliğinin etkisi 50 oturumdaki tergitlerdeki abdominal pigmentasyonun farklı yönleri üzerinde beş oturum boyunca yeniden ölçülmüştür. Modeller, doğrusal karışık etki modelleriydi ve bireysel sinek rasgele bir faktör olarak dahil edildi. P max : Maksimum pigmentasyon (düzeltilmiş); P min : Minimum pigmentasyon (düzeltilmiş); W bandı : Pigment bandının genişliği; W tergit : Tergit genişliği; R bandı : pigment bandının göreceli genişliği. Önemli sabit faktörler kalın olarak gösterilmiştir ( P < 0.05).
| yolunu kesmek | W band | Sıcaklık | tergite | |||
| 17C | 25˚C | Üçüncü | ||||
| Maksimal | β | 234,35 | 0.069 | 0.063 | -1,178 | -0,588 |
| F | 29,93 | 5,97 | 54,82 | |||
| P | <0.001 | 0.008 | <0.001 | |||
| Dakika | β | 223,96 | -0,137 | 3,931 | -3,024 | -1,54 |
| F | 19.33 | açıklık = "2"> 9.66 | 62.02 | |||
| P | <0.001 | 0.001 | <0.001 | |||
Tablo 3: Pigment band genişliği, sıcaklık ve tergite kimliğinin pigmentasyon seviyesine etkisi. 50 seansta pigment grubunun genişliği, sıcaklığı ve tergite kimliğinin pigmentasyon seviyesine etkisi beş seansta tekrar ölçülmüştür. Modeller, doğrusal karışık etki modelleriydi ve bireysel sinek rasgele bir faktör olarak dahil edildi. P max : Maksimum pigmentasyon (düzeltilmiş); P min : Minimum pigmentasyon (düzeltilmiş); W bandı : Pigment bandının genişliği; R bandı : pigment bandının göreceli genişliği.
Ek Dosya 1. Ek Bilgiler.Y_Information.pdf "target =" _ blank "> Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 2. Pigmentation.R scriptinin analizi. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 3. Pigmentation.ijm Ölçümü Bu dosyayı indirmek için tıklayınız .
Simülasyon R Komut. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu metodoloji, çoklu akışaşağı analizler için uygun niceliksel formda pigmentasyon verilerinin hassas, hızlı ve tekrarlanabilir kazanılmasını sağlar. Yöntem, sineklerin izogenik bir çizgisinde sıcaklığın abdominal pigmentasyon üzerindeki etkileri hakkında veri edinmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, metodoloji bireyler, popülasyonlar veya türler arasındaki pigmentasyon farklılıklarının altında yatan genleri veya belirli genlerin pigmentasyon kalıpları üzerindeki etkilerini keşfetmek için ters genetik çalışmaları belirlemek için ileri genetik çalışmalarında kullanılabilir. Yukarıda tartıştığımız gibi, D. melanogaster pigmentasyonun gelişimini ve gelişimini araştıran çok sayıda çalışma yapılmış olsa da, bu metodolojinin pigmentasyon verilerini niceliksel bir biçimde yakaladığı hassasiyet, daha güçlü istatistiksel yaklaşımlara izin verir. Bu da, araştırmacıların pigmentasyon paternlerini analiz ederken daha az numune kullanmalarına izin veriyor veya daha ince örnekleri aydınlatmalarına izin veriyorPigmentasyon yönleri. Ayrıca, bu yöntem, sinekin diseksiyonu gerektirmemektedir ve numunenin daha sonra morfolojik ölçümler veya genotipleme gibi ilave analizler için kullanılmasına izin verilmektedir. Gerçekten, metodoloji anestezi uygulanmış sinekler üzerinde potansiyel olarak kullanılabilir, bu da daha sonra pigmentasyon özelliklerine göre seçici olarak üretilebilir.
Görüntü analiziyle pigmentlemenin ölçülmesinde potansiyel bir sorun, pigmentasyon değerlerinin pigmentasyonun kendisinden ziyade bir görüntünün alındığı maruz kalma ve aydınlatma koşullarını yansıtabilmesidir. Sabit ışık seviyeleri, ışık pozisyonları, büyütme ve pozlama bu sorunları hafifletirken, oturum efektlerini tam olarak kontrol etmek için her oturumda tekrar tekrar kontrol görüntüleri almak gerekecektir. Bu yöntem, her oturumda onbeş kontrol örneğini yeniden görüntülemeyi ve P ma'daki oturumlar arası değişikliklerX ve P min , oturum efektlerini algılamak ve ortadan kaldırmak için kullanılır. Bununla birlikte, tekrar görüntülenecek olan kontrol numunelerinin kesin sayısı, kullanılan görüntüleme donanımı ve yazılımı, kullanıcıya ilgi pigmentasyonu yönü ve tedaviler arasındaki değişkene ve her birinde kaç resim çekildiğine bağlı olacaktır oturum, toplantı, celse. Aynı örneklerin beş seansta yeniden görüntülendiği bir ön deney yürütmek, kullanıcıya oturum efektleri, varyasyon, numune kimliği ve kalan varyansa bağlı olarak varyans hesaplamasına olanak tanır (düzeltme sonrası ölçüm hatasının bir tahmini) Oturum etkileri için) ( Tablo 1 ). Bu değerler, daha sonra, oturum etkileri tespit etmek ve kontrol etmek için her bir oturumda kaç tane kontrol görüntüsü alınması gerektiğini tahmin etmek için kullanılabilir. Basit bir R yazısı basıldı ve oturumlardaki pigmentasyon önlemlerini simüle etmek için böyle bir ön deneyden elde edilen verileri kullanıyor. KullanılabilirOturum başına kontrol görüntülerinin sayısının oturum etkilerini kaldırmak için yeterli olup olmadığını kontrol etmek. Bu betik ek bir dosya olarak sağlanmaktadır.
Kullanıcılar, oturumlarda rahatsızlık verici faktörler bulunduğundan endişeleniyorsa, John v.d., 2016 41'de açıklandığı gibi, aynı numuneyi oturum boyunca birden çok kez yeniden görüntüleyebilirler. Bu durumda, tek kontrol numunesi için [sampleID], bir oturumda her görüntülendiğinde değiştirilmelidir ( örneğin, control1, control2, control3, vb. ); Aksi takdirde, görüntüleme yazılımı önceki görüntüyü aynı adlı yeni resimle değiştirecektir. Düzeltme işlevi, düzeltmeyi zamansal olarak bitişik oturumlar arasındaki aynı [örnek kimliği] olan çoğaltılmış görüntülere dayandırır ve aynı örneklerin oturumlar içinde ve oturumlar arasında birden fazla kez görüntülendiği veya oturumlar arasında aynı kontrol örneği setinin görüntülendiği şekilde düzeltilir. Ne olursa olsun nasılE kontrol görüntüleri alınır, oturumlar blok olarak ele alınır ve mümkün olduğunca kullanıcıların rastgele bir blok tasarımı kullanması gerekir; böylece düzeltildikten sonra kalan tüm oturum efektleri istatistiksel olarak kontrol edilebilir. Başarısız olursa, örnekler rasgele oturumlara ayrılmalıdır, böylece oturum etkileri deneysel faktörlerle karıştırılmaz.
Protokol, her bir tergite karşı pigmentasyon değişikliğini temsil eden bir pigmentasyon profilinin oluşturulmasına dayanır. Bu profili oluşturmaya yarayan bir husus, karın kütikülünü örten koyu tüyler olup, tergite çapraz geçen herhangi bir ön-arka çizgi tarafından da ikiye bölünmüştür. Protokol, bu tüylerin oluşturduğu gürültüyü, bir kütikül bandında ortalanan pigmentasyon profilini alarak azaltır. Yine de, kullanıcılar, ince bir çizgi çizgisine dayanan profiller oluşturmak istiyorlarsa adım 5.6'da ROI genişliğini 1 piksel olarak ayarlayabilirler. Dahası, kullanıcılar tBir görüntünün içindeki pigment bandının genişliğinde değişiklikleri yakalamak için pigmentasyon profilinin yanal konumunu değiştirerek, aynı görüntüyü defalarca tekrarlar. Ancak bu durumda, kullanıcıların aynı görüntüyü defalarca kopyalamaları ve adım 5'i gerçekleştirmeden önce her kopyaya benzersiz bir ad vermeleri gerekir; çünkü ImageJ makrosu aynı adlı profilin üzerine yazacaktır.
Pigmentasyon profilinin oluşturulması sırasında ikinci önemli husus, Pigmentasyon R komut dosyasının analizinde spline.der.er fonksiyonu (L63) içinde tanımlanan kübik spline'in yumuşatma parametresidir. Uygun pürüzsüzleştirme parametresi görüntüleme kurulumuna ve çözünürlüğüne bağlıdır. Bir profilin aşırı pürüzsüzleştirilmesi, T 1 , T 2 ve T 3'ün koordinatlarını hesaplamak için kullanılan spline profilinin özelliklerini kaybedebilir ( Şekil 2D ve 2D '). Tersine, düzgünsüzleştirme,Profilin gürültüsünü ve sonuç olarak koordinat ekstraksiyonlarının doğruluğunu içerir. Çengel işlevi, spline ve türevlerinin grafiksel bir özetini üretir ve uygun bir yumuşatma parametresi seçmek için görsel ipucu olarak kullanılabilir.
Burada açıklanan metodoloji, kadın ve erkek D. melanogaster'te üçüncü ve dördüncü abdominal tergitlerin pigmentasyonu üzerine veri toplamaya odaklanmaktadır . Bununla birlikte, temsili sonuçlar kadınların beşinci ve altıncı karın bölümlerinin pigmentasyonunu ölçmek için de kullanılabileceğini göstermektedir. Ayrıca, metodoloji, pigmentasyonunu etkileyen genlerin mutantlarının neden olduğu fenotipteki farklılıkları tespit edebilir. ImageJ makro ve R komut dosyaları, farklı D. melanogaster türlerinin karınlarındaki pigmentlemeyi ölçmek için kolayca değiştirilebilir veya pigmentasyon kalıbının basmakalıp olması koşuluyla başka vücut parçalarının diğer taksonlarda pigmentlenmesine bile kolayca izin verilebilir. Son olarak, metodolojiRGB içindeki görüntüleri yakalayarak ve her bir kanalı ayrı ayrı analiz ederek pigmentasyon renklerinin yönlerini ölçmek için uyarlanabilirler.
Genel olarak, bu metodoloji yükselen fenomenoloji alanının bir parçasıdır 51 , 52 . Fenomenolojinin amacı, fenotipi etkileyen genetik ve çevresel etkileşimleri (hastalık dahil) ve bu etkileşimlerin biyolojik çeşitlilik oluşturmak için nasıl geliştiğini daha iyi anlamak için çok boyutlu, çok boyutlu fenotipik veri kümelerini üretmek ve analiz etmektir. Fenomiklerin potansiyelini yerine getirmesi için, fenotipik verilerin elde edilmesine yönelik metodolojiler açık ve kolayca farklı fenotiplere ve serbestçe mevcut hale getirilmiş olmalıdır. Standart ekipman kullanılarak çekilen görüntüleri analiz etmek için açık kaynaklı yazılımlar kullanarak, bu metodoloji bu amaca ulaşmak için yardımcı olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma National Science Foundation tarafından IOS-1256565 ve AWS için IOS-1557638 tarafından finanse edildi. Patricia Wittkopp'a ve bu yazının daha önceki bir sürümüne ilişkin yararlı yorumları için üç anonim gözden geçirenimize teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Biology Forceps | FST | 11252-30 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Dissecting Scope | Leica | MZ16FA | |
| Base | Leica | MDG41 | |
| Camera | Leica | DFC280 | |
| Gooseneck Cold Light Source | Schott | ACE 1 | |
| Image Acquisition Control Software | Micro-Manager v1.3.20 | https://micro-manager.org/ | |
| Image Analysis Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Data Analysis Software | R 3.3.2 | https://www.r-project.org/ | |
| LED | Thor Labs | LEDWE-15 | |
| Multimeter | Fluke | Fluke 75 Series II | |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Celltreat Scientific Products | 229663 | |
| Stage micrometer | Klarman Rulings, Inc. | KR-867 |
References
- Wittkopp, P. J., Beldade, P. Development and evolution of insect pigmentation: Genetic mechanisms and the potential consequences of pleiotropy. Semin. Cell Dev. Biol. 20 (1), 65-71 (2009).
- Lindgren, J. Interpreting melanin-based coloration through deep time: a critical review. Proc Roy Soc B-Biol Sci. 282 (1813), (2015).
- Kronforst, M. R., Papa, R. The Functional Basis of Wing Patterning in Heliconius Butterflies: The Molecules Behind Mimicry. Genetics. 200 (1), 1-19 (2015).
- Albert, N. W., Davies, K. M., Schwinn, K. E. Gene regulation networks generate diverse pigmentation patterns in plants. Plant Signal Behav. 9, e29526 (2014).
- Monteiro, A. Origin, development, and evolution of butterfly eyespots. Annu Rev Entomol. 60, 253-271 (2015).
- Kronforst, M. R. Unraveling the thread of nature's tapestry: the genetics of diversity and convergence in animal pigmentation. Pigm Cell Melanoma Res. 25 (4), 411-433 (2012).
- Wright, T. R. The genetics of biogenic amine metabolism, sclerotization, and melanization in Drosophila melanogaster. Adv Genet. 24, 127-222 (1987).
- True, J. R. Insect melanism: the molecules matter. TREE. 18 (12), 640-647 (2003).
- Kopp, A., Duncan, I. Control of cell fate and polarity in the adult abdominal segments of Drosophila by optomotor-blind. Development. 124 (19), 3715-3726 (1997).
- Kopp, A., Muskavitch, M. A., Duncan, I. The roles of hedgehog and engrailed in patterning adult abdominal segments of Drosophila. Development. 124 (19), 3703-3714 (1997).
- Kopp, A., Blackman, R. K., Duncan, I. Wingless, decapentaplegic and EGF receptor signaling pathways interact to specify dorso-ventral pattern in the adult abdomen of Drosophila. Development. 126 (16), 3495-3507 (1999).
- Kopp, A., Duncan, I., Godt, D., Carroll, S. B. Genetic control and evolution of sexually dimorphic characters in Drosophila. Nature. 408 (6812), 553-559 (2000).
- Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134 (4), 610-623 (2008).
- Wittkopp, P. J., Williams, B. L., Selegue, J. E., Carroll, S. B. Drosophila pigmentation evolution: divergent genotypes underlying convergent phenotypes. Proc Natl Acad Sci Usa. 100 (4), 1808-1813 (2003).
- Brisson, J. A., De Toni, D. C., Duncan, I., Templeton, A. R. Abdominal pigmentation variation in drosophila polymorpha: geographic variation in the trait, and underlying phylogeography. Evolution. 59 (5), 1046-1059 (2005).
- Brisson, J. A., Templeton, A. R., Duncan, I. Population genetics of the developmental gene optomotor-blind (omb) in Drosophila polymorpha: evidence for a role in abdominal pigmentation variation. Genetics. 168 (4), 1999-2010 (2004).
- Dembeck, L. M. Genetic Architecture of Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 11 (5), e1005163 (2015).
- Drapeau, M. D., Radovic, A., Wittkopp, P. J., Long, A. D. A gene necessary for normal male courtship, yellow, acts downstream of fruitless in the Drosophila melanogaster larval brain. J Neurobiol. 55 (1), 53-72 (2003).
- Hodgetts, R. B., O'Keefe, S. L. Dopa decarboxylase: a model gene-enzyme system for studying development, behavior, and systematics. Annu Rev Entomol. 51, 259-284 (2006).
- Marmaras, V. J., Charalambidis, N. D., Zervas, C. G. Immune response in insects: the role of phenoloxidase in defense reactions in relation to melanization and sclerotization. Arch Insect Biochem Physiol. 31 (2), 119-133 (1996).
- Kalmus, H. The Resistance to Desiccation of Drosophila Mutants Affecting Body Colour. Proc Roy Soc London B. 130 (859), 185-201 (1941).
- Rajpurohit, S., Gibbs, A. G. Selection for abdominal tergite pigmentation and correlated responses in the trident: a case study in Drosophila melanogaster. Biol J Linn Soc. 106 (2), 287-294 (2012).
- Pool, J. E., Aquadro, C. F. The genetic basis of adaptive pigmentation variation in Drosophila melanogaster. Mol Ecol. 16 (14), 2844-2851 (2007).
- Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Developmental constraints on an adaptive plasticity: reaction norms of pigmentation in adult segments of Drosophila melanogaster. Evol Dev. 2 (5), 249-260 (2000).
- Shakhmantsir, I., Massad, N. L., Kennell, J. A. Regulation of cuticle pigmentation in drosophila by the nutrient sensing insulin and TOR signaling pathways. Dev Dyn. 243 (3), 393-401 (2014).
- Struhl, G., Barbash, D. A., Lawrence, P. A. Hedgehog organises the pattern and polarity of epidermal cells in the Drosophila abdomen. Development. 124 (11), 2143-2154 (1997).
- Jeong, S., Rokas, A., Carroll, S. B. Regulation of body pigmentation by the Abdominal-B Hox protein and its gain and loss in Drosophila evolution. Cell. 125 (7), 1387-1399 (2006).
- Wittkopp, P. J., True, J. R., Carroll, S. B. Reciprocal functions of the Drosophila yellow and ebony proteins in the development and evolution of pigment patterns. Development. 129 (8), 1849-1858 (2002).
- True, J. R. Drosophila tan encodes a novel hydrolase required in pigmentation and vision. PLoS Genet. 1 (5), e63 (2005).
- David, J. R., Capy, P., Gauthier, J. P. Abdominal pigmentation and growth temperature in Drosophila melanogaster: Similarities and differences in the norms of reaction of successive segments. J Evol Biol. 3 (5-6), (1990).
- Gibert, J. M., Peronnet, F., Schlotterer, C. Phenotypic plasticity in Drosophila pigmentation caused by temperature sensitivity of a chromatin regulator network . PLoS Genet. 3 (2), e30 (2007).
- Gibert, P., Moreteau, B., Scheiner, S. M. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila: correlated variations between segments. Genet Sel Evol. 30 (2), 181 (1998).
- Matute, D. R., Harris, A. The influence of abdominal pigmentation on desiccation and ultraviolet resistance in two species of Drosophila. Evolution. 67 (8), 2451-2460 (2013).
- Das, A., Mohanty, S., Parida, B. Abdominal pigmentation and growth temperature in Indian Drosophila melanogaster: Evidence for genotype-environment interaction. J Biosci. 19 (2), 267-275 (1994).
- Hollocher, H., Hatcher, J. L., Dyreson, E. G. Evolution of abdominal pigmentation differences across species in the Drosophila dunni subgroup. Evolution. 54 (6), 2046-2056 (2000).
- Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila melanogaster: genetic repeatability of quantitative parameters in two successive generations. Heredity. 92 (6), 499-507 (2004).
- Carbone, M. A., Llopart, A., deAngelis, M., Coyne, J. A., Mackay, T. F. Quantitative trait loci affecting the difference in pigmentation between Drosophila yakuba and D. santomea. Genetics. 171, 211-225 (2005).
- Kopp, A., Graze, R. M., Xu, S., Carroll, S. B., Nuzhdin, S. V. Quantitative trait loci responsible for variation in sexually dimorphic traits in Drosophila melanogaster. Genetics. 163 (2), 771-787 (2003).
- Bastide, H., Yassin, A., Johanning, E. J., Pool, J. E. Pigmentation in Drosophila melanogaster reaches its maximum in Ethiopia and correlates most strongly with ultra-violet radiation in sub-Saharan Africa. BMC Evol Biol. 14, 179 (2014).
- Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326 (5960), 1663-1667 (2009).
- John, A. V., Sramkoski, L. L., Walker, E. A., Cooley, A. M., Wittkopp, P. J. Sensitivity of Allelic Divergence to Genomic Position: Lessons from the Drosophila tan Gene. G3. 6 (9), 2955-2962 (2016).
- Wittkopp, P. J. Local adaptation for body color in Drosophila americana. Heredity. 106 (4), 592-602 (2011).
- Wittkopp, P. J. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
- Edelstein, A. D. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), e10 (2014).
- U. S. National Institutes of Health. ImageJ v.1.50i. , Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2016).
- Mims, F. M. How to Use LEDs to Detect Light. Make:. 36, 136-138 (2013).
- R: Language and Environment for Statistical Computing v.3.3.2. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: https://www.r-project.org/ (2016).
- Bates, D., Machler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting Linear Mixed-Effects Models Using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
- Shingleton, A. W., Estep, C. M., Driscoll, M. V., Dworkin, I. Many ways to be small: different environmental regulators of size generate distinct scaling relationships in Drosophila melanogaster. Proc Roy Soc Lond B Biol Sci. 276 (1667), 2625-2633 (2009).
- French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
- Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nat Rev Genet. 11 (12), 855-866 (2010).
- Kültz, D. New frontiers for organismal biology. BioSci. 63 (6), 464-471 (2013).
