Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Kvantificering af abdominal pigmentering i Published: June 1, 2017 doi: 10.3791/55732
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, Lake Forest College

Summary

Dette arbejde præsenterer en metode til hurtigt og præcist at kvantificere abdominal pigmentering af Drosophila melanogaster ved hjælp af digital billedanalyse . Denne metode strømlinierer procedurerne mellem fænotypeindsamling og dataanalyse og omfatter prøvemontering, billedoptagelse, pixelværdisekstraktion og egenskabsmåling.

Abstract

Pigmentering er et morfologisk simpelt men meget variabelt træk, som ofte har adaptiv betydning. Det har tjent udbredt som en model til forståelse for udviklingen og udviklingen af ​​morfologiske fænotyper. Abdominal pigmentering i Drosophila melanogaster har været særlig nyttig, så forskere kan identificere de loci, der ligger til grund for inter- og intraspecifikke variationer i morfologi. Hidtil har D. melanogaster abdominale pigmentering i vid udstrækning blevet analyseret kvalitativt gennem scoring snarere end kvantitativt, hvilket begrænser formerne for statistisk analyse, som kan anvendes på pigmenteringsdata. Dette værk beskriver en ny metode, der muliggør kvantificering af forskellige aspekter af abdominal pigmenteringsmønster af voksen D. melanogaster . Protokollen omfatter prøvemontering, billedoptagelse, dataudvinding og analyse. Al den software, der bruges til makroer til billedoptagelse og analysefunktionerSkrevet til open source image analyse. Fordelen ved denne fremgangsmåde er evnen til præcist at måle pigmenteringskarakteristika ved anvendelse af en metode, der er stærkt reproducerbar på tværs af forskellige billeddannelsessystemer. Selv om teknikken er blevet brugt til at måle variation i tergalpigmenteringsmønstre af voksen D. melanogaster , er metoden fleksibel og bredt anvendelig på pigmenteringsmønstre i utallige forskellige organismer.

Introduction

Pigmentering viser enorm fænotypisk variation mellem arter, populationer og individer, og endog inden for enkeltpersoner under ontogeni 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Selv om der er utallige studier af pigmentering i en bred vifte af dyr, er pigmentering måske bedst studeret i Drosophila melanogaster , hvor den fulde kraft af molekylær genetik er blevet brugt til at belyse de udviklingsmæssige og fysiologiske mekanismer, som regulerer pigmentering og hvordan disse mekanismer udvikler sig 1 , 6 . Meget er kendt om generne der regulerer den biokemiske syntese af pigmenter i D. melanogaster 7 , 8 og generne der styrer den tidsmæssige og rumlige diFordeling af denne biosyntese 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Endvidere har genetisk kortlægning identificeret de genetiske lokaliteter, der ligger til grund for intra- og interspecifikke forskelle i pigmentering i D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 . Sammenhængen mellem pigmentering og pleiotropiske træk, såsom adfærd 18 , 19 og immunitet 19 , 20 , er også blevet undersøgt, ligesom den adaptive betydning af pigmenteringsmønstre 15 , 21 , 22 . Som sådan er pigmentering i D. melanogaster fremkommet som en kraftfuld, men simpel mOdel for udvikling og udvikling af komplekse fænotyper.

Pigmentering i voksen D. melanogaster er karakteriseret ved forskellige melaniseringsmønstre over hele kroppen, især på vingerne og dorsale thorax og mave. Det er pigmenteringen af ​​hver kutikulær plade (tergit) på dorsalunderlivet, der dog har fået mest forskningsopmærksomhed. Der er betydelig variation i denne pigmentering ( figur 1A- F ) på grund af både genetiske 17 , 23 og miljø 24 , 25 faktorer. Kirtiklen af ​​en abdominal tergit består af forreste og bageste udviklingsrum ( figur 1G ), som hver især kan opdeles yderligere, afhængig af pigmentering og udsmykning 26 . Det forreste rum indeholder seks krydderierTyper (a1-a6), og det bageste rum indeholder tre (p1-p3) ( figur 1G ). Af disse foldes p1-, p2- og a1-kutiklen typisk under tergitten i ustrakte abdomener, så de er skjulte. Den pålideligt synlige kutikula er kendetegnet ved et band med tung pigmentering, heri omtalt som et "pigmentbånd", der består af kutikeltyper a4 (håret med moderat børstehår) og a5 (håret med store børster) med bandets bageste kant Mere intenst pigmenteret end den forreste kant ( figur 1G ). Foran for dette band er en region med let pigmenteret håret kutikula, som har børster bagtil (a3), men ikke anteriorly (a2). Variation i pigmentering mellem fluer observeres i både intensiteten af ​​pigmentering og i bredden af ​​pigmentbåndet. Generelt er variation størst i de mest bageste segmenter (mavesegmenterne 5, 6 og 7) og er lavere i de mere fremre segmenter (abdominal seGment 3 og 4) 24 . Derudover er der en seksuel dimorfisme i D. melanogaster pigmentering, hvor mænd generelt har fuldt pigmenteret femte og sjette buk tergitter ( figur 4C ).

I de fleste studier af abdominal pigmentering i D. melanogaster er pigmentering blevet behandlet som et kategorisk eller ordinært træk, idet mønsteret måles kvalitativt 27 , 28 , 29 eller semikvantitativt på en skala 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 31 , 32 , 33 , 34 , 3536 , 37 . Disse metoder har uundgåeligt en mangel på præcision, og fordi de er afhængige af den subjektive vurdering af pigmentering, er det svært at sammenligne dataene i tværs af undersøgelserne. Flere forfattere har kvantificeret de rumlige dimensioner af pigmentering 38 , 39 , intensiteten af ​​pigmentering af en bestemt kutikeltype 23 , 25 , 39 , 40 eller den gennemsnitlige intensitet af pigmentering over buk-tergitten som helhed 41 , 42 , 43 . Ikke desto mindre måler disse kvantificeringsmetoder ikke både intensiteten og den rumlige fordeling af abdominal pigmentering samtidigt og derfor ikke fanger nuancerne af, hvordan pigmentering varierer over abdOminal tergite. Desuden kræver adskillige af disse kvantificeringsmetoder 38 , 41 , 42 , 43 dissektionen og montering af abdominal cuticle. Dette er både tidskrævende og ødelægger prøven, hvilket gør den utilgængelig til yderligere morfologiske analyser. Da forståelsen af ​​udvikling og udvikling af abdominal pigmentering fordybes, vil mere sofistikerede værktøjer til hurtigt og præcist måle både rumlig fordeling og intensitet af pigmentering kræves.

Det overordnede mål med denne metode er at udnytte digital billedanalyse for at opnå en replikerbar og mere præcis måling af abdominal pigmentering i D. melanogaster . Metoden omfatter tre faser. For det første er den voksne flyve ikke destruktivt monteret, og et digitalt billede af dorsalunderlivet er taget. For det andet bruger brugeren en ImageJ-makroDefinerer en anterior-posterior stribe af pixels, der strækker sig fra forenden af ​​a2-cuticleen til den bageste af a5-kutikulaen (grøn boks, figur 1G ) på både det tredje og det fjerde abdominalsegment. Den gennemsnitlige pixelværdi på tværs af bredden af ​​denne strimmel ekstraheres derefter langs sin længdeakse, hvilket frembringer en profil, der fanger den rumlige fordeling og intensiteten af ​​pigmentering, når den ændrer sig fra den forreste til den bageste del af tergitten. For det tredje bruges et R-script til at beskrive pigmenteringsprofilen matematisk ved hjælp af en kubisk spline. R-scriptet anvender derefter spline og dets første og andet derivat til at ekstrahere bredden af ​​a2-a5-cuticleen, pigmentbåndets bredde og de maksimale og minimale pigmenteringsniveauer. Metoden kvantificerer derfor både de rumlige egenskaber og dybden af ​​abdominal pigmentering.

Denne metode kvantificerer pigmenteringen af ​​den tredje og fjerde abdominal tergit,Som har været i fokus for mange tidligere studier 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , enten udelukkende eller i kombination med mere posterior tergitter. Selvom den er mindre variabel end den femte og den sekste abdominale tergitter, er den tredje og fjerde tergit ikke fuldstændigt pigmenteret hos mænd, så denne protokol kan anvendes til både mænd og kvinder. Ikke desto mindre, som vist her, kan protokollen anvendes til måling af pigmentering i femte og sjette buk tergitter hos kvinder. Endvidere bør mindre modifikationer af de skrifter, der anvendes til ekstraktion af pigmenteringsprofilens karakteristika, tillade, at metoden anvendes til at kvantificere variationen i pigmentering i en lang række andreorganismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Prøvemontering

BEMÆRK: Opbevar døde fluer i 70% ethanol i vand før billeddannelse.

  1. Hæld 10 ml 1,25% agar opløst i kogende vand i en 60 mm x 15 mm petriskål, og lad den indstille.
  2. Under et dissekeringsmikroskop skal du bruge et par fint punktpinde til at lave en ~ 20 mm ong, 2 mm bred, 1 mm dyb rille i gelens overflade. Ved hjælp af fine tang, indlejrer du den ventrale side af en voksenflyv i rillen med den dorsale side af fluen, der rager over gelen.
    BEMÆRK: Gelens løshed muliggør nem omplacering uden at beskadige prøven. Den samme rille kan bruges til flere prøver, selvom det bliver snavset, brudt og ubrugeligt med tiden. Brugeren kan derefter lave en anden rille i samme gel. Hver plade kan bruges til billede ~ 200 fluer.
  3. Helt dække prøven i 70% ethanol i vand for at reducere eventuelle refleksioner fra vokspartiklerne og for at forhindre vingebeskadigelseIndprøve manipulation.

2. Mikroskopopsætning

BEMÆRK: Billederne er erhvervet ved hjælp af et dissekeringsområde, transmitteret lysbase, digitalkamera og gooseneck-kold lyskilde, der er knyttet til en computer, der kører billedoptagelsesstyringssoftware. Software instruktioner er specifikke for Micro-Manager v1.4.20 44 , som er en open source software, der inkorporerer ImageJ 45 .

  1. Tænd mikroskopet, digitalkameraet, den dobbelte gooseneck-kold lyskilde og computeren.
  2. Kør billedoptagelsessoftwaren for at åbne et Micro-Manager-vindue og et ImageJ-vindue. I ImageJ vinduet klik på "Image"> "Type"> "8-Bit" for at indstille alle billeder som 8-bit. Klik på "Live" i Micro-Manager-vinduet for at åbne et "Snap / Live" -vindue, der viser en realtidsvisning fra kameraet.
    1. Maksimér størrelsen af ​​"Snap / Live" vinduet hvis necessary. Vælg "Gråskala" i rullemenuen "Skærmtilstand" -menuen på fanen "Kontrast" i Micro-Manager-vinduet.
  3. Tænd den kolde lyskilde til sin maksimale intensitet, og sæt tipperne på hver stangdæksel til ca. 120 mm fra scenen, den ene til venstre og den ene til højre.
    BEMÆRK: Brugere kan også bruge en ringformet belysning, selv om dette kan generere en ring af reflekteret lys omkring flyveunderlivet.
  4. Indstil mikroskop forstørrelsen manuelt til 60X manuelt, så synsfeltet fanger et område på ca. 3 mm i diameter på scenen.
  5. Placér et 2 mm trin mikrometer på scenen (skifter baggrunden til hvid om nødvendigt). Mens du kigger på live preview, skal du fokusere på scenemikrometeret og justere eksponeringen i Micro-Manager-vinduet ved at indtaste eksponeringstiden i ms i boksen "Eksponering".
  6. For at rumligt kalibrere kameraet skal du vælge værktøjet "lige linje" i tHan ImageJ vindue og tegne en linje længden af ​​scenen mikrometer. I vinduet ImageJ klik på "Analyser"> "Set Scale" for at åbne vinduet "Set Scale", indtast længden af ​​mikrometeret i μm i feltet "Kendt afstand" og indtast "μm" i "Enhedens længde" boks.
    1. Se, at vinduet "Set Scale" viser derefter skalaen i "pixels / μm." Noter skalaen og klik på "OK".
  7. I vinduet "Snap / Live" skal du klikke på "Stop" og derefter "Snap" for at optage et billede af scene mikrometer.
  8. Gem billedet som en 8-bit gråtonet TIFF for at sikre evnen til at kalibrere billederne igen, hvis det er nødvendigt. I vinduet ImageJ klik på "File"> "Save As"> "Tiff ..." Angiv, hvor du skal gemme filen i filbrowseren, navngiv filen og klik på "Gem".
  9. Skift scenen til sort og stedEn petriskål med en flyvemaskine monteret i agar (trin 1.1-1.2) på scenen.
  10. Se gennem mikroskopet og placer flyet for at sikre, at den dorsale midterlinie er lige op for at se bedst pigmenteringsmønstret. Flyt eventuelle vinger og vedhæng for at sikre, at syn på maven er uhindret. Hvis den pigmenterede kutikula (a2-a5) ikke er synlig, skal du klemme maven lateralt, indtil den er (selvom flyvebukken er opbevaret i 70% ethanol i vandstræk, så dette ikke er normalt nødvendigt).
    BEMÆRK: Når du placerer fluen, skal brugeren muligvis bruge en mindre forstørrelse (20X). Forstørrelsen skal returneres til 60X, inden den fortsættes.
  11. Manuelt fokusere på flyets dorsale mave. Manuel justering af lyskildens tips for at minimere skyggerne og refleksionen på dorsalunderlivet.
  12. Mens du kigger på det levende eksempel på computerskærmen og bruger pixelværdihistogrammet på fanen "Kontrast" i Micro Manager-vinduet,Juster eksponeringen som beskrevet i trin 2.4 for at maksimere pixelværdierne for forhåndsvisningsbilledet.
  13. Fjern flyve- og petriskålen og udskift dem med en LED (spektraludgang på 430-660 nm), der er forbundet til en spændingsmåler, centreret i synsfeltet i samme position som flyvefladen. Brug lysdioden og spændingsmåleren som en lysmåler 46 og optag den spænding, der genereres af lyset, der rammer LED'en (~ 125 mV).
    BEMÆRK: LED- og spændingsmåleren bruges til at sikre, at lysniveauerne er konstante på tværs af flere billedbehandlinger inden for et enkelt forsøg.
  14. I løbet af eksperimentet ændrer du ikke positionen eller intensiteten af ​​lyskilden, forstørrelsen af ​​mikroskopet eller kameraets eksponering.

3. Prøvebilleddannelse

  1. Placer en petriskål, der holder en flyvemaskine monteret i agar (trin 1.1-1.3) på det sorte mikroskop stadium. Juster flyens position, så den tredje og fjerdeH abdominalsegmenter er synlige, og den dorsale midterlinie er lige op, som beskrevet i trin 2.9. Sørg for at forstørrelsen er 60 gange, inden du fortsætter.
  2. Manuelt fokuserer mikroskopet sådan, at den tredje og fjerde dorsale abdominal tergite er i fokus. Brug billedoptagelsessoftwaren til at erhverve et billede som en 8-bit gråtonet TIFF, som beskrevet i trin 2.6.
    BEMÆRK: Billedet kan fanges i farve og derefter konverteres til gråtoner til analyse.
  3. Gem billedet som "SESH000_sampleID.tiff" som beskrevet i trin 2.7.
    BEMÆRK: Her er [SESH] konstant, [000] er sessionsnummeret og er variabelt, men skal være tre cifre langt, og [sampleID] er, hvad brugeren ønsker, selvom det ikke må indeholde yderligere understregningstegn (_) og Skal være af konstant længde. [SampleID] skal indeholde detaljer om de faktorer, der anvendes til analyse af pigmenteringsdataene ( f.eks. Temperatur eller afstamning), adskilt af et karakteristisk ikke-alfabetiskCal karakter, såsom en bindestreg (-). Dette gør det muligt let at analysere disse faktorer ud af [sampleID] ved hjælp af standard statistisk software.
  4. Fjern Petriskålen fra scenen og erstat flyet med næste prøve. Gentag trin 3.1-3.3, indtil alle eksemplarer er blevet afbildet uden yderligere justering af belysningsniveauer, forstørrelse eller eksponering.

4. Imaging over flere sessioner

  1. Hvis billeder skal tages over flere sessioner, skal du opretholde lysintensiteten, eksponeringen og forstørrelsen på tværs af sessioner. I begyndelsen af ​​hver session kontrolleres kameras kalibrering (trin 2.4) og lysintensiteten på scenen (målt ved LED / spændingsmåler, trin 2.12).
  2. Optag og gem et billede af scenemikrometeren (trin 2.5-2.7) for at sikre evnen til at kalibrere billederne igen, hvis det er nødvendigt.
  3. Brug mindst 15 kontrolprøver og tilfældigt re-image dem i hver session til alloW til påvisning og eliminering af sessionseffekter. Sørg for, at duplikat kontrolprøver mellem sessioner har samme [sampleID] men forskellige [SESH000].
    BEMÆRK: Kontrolprøverne er fluer opsamlet, opbevaret og monteret identisk til forsøgseksempler, men genoptages på tværs af sessioner. Det præcise antal kontrolprøver afhænger af brugerens eksperimentelle opsætning. Se diskussionen for yderligere detaljer.

5. Billedanalyse

BEMÆRK: Billedanalyse udføres i ImageJ 45 og bruger makroen "Mætning af Pigmentation.ijm", der leveres som en supplerende fil.

  1. Placer alle billeder, der skal analyseres i samme mappe.
  2. Start ImageJ og kør makroen "Measurement of Pigmentation.ijm" ved at klikke på "Plugins"> "Macro"> "Run" og vælge "Measurement of Pigmentation.ijm" i filbrowseren og klikke på "åben."
    BEMÆRK: Alle efterfølgende trin er inden for makroen. Hvert trin er en individuel makro kommando.
  3. Bemærk, at der åbnes en dialogboks "Action Required", der angiver "Vælg den mappe, hvor billederne er gemt." Klik på "OK", og brug filbrowseren til at vælge den mappe, der indeholder billederne, og klik derefter på "vælg".
  4. Bemærk, at en dialogboks "Action Required" vil åbne, med angivelse af "Vælg den mappe, hvor du vil have dataene gemt." Klik på "OK", og brug filbrowseren til at vælge den ønskede mappe for at gemme pigmenteringsprofiler. Klik på "vælg".
  5. Bemærk, at en dialogboks åbnes, spørger "Hvor mange tegn i dit eksempel-id?" Indtast antallet af tegn i [SampleID] i datatilførselsboksen som angivet i trin 3.3, og klik på "OK".
  6. Bemærk, at en dialogboks åbnes, spørger "Hvor bredt er dit ROI?" Indtast pixelbredden af ​​den anterior-Bageste strimmel langs hvilken pigmenteringsprofilen skal læses (grønt rektangel, figur 1G , figur 2A og 2A '). Klik på "OK;" Standardværdien er 20 pixels.
    BEMÆRK: Pigmenteringsprofilen læses på tværs af en strimmel af cuticle, snarere end en linje, for at reducere støj på grund af hår og børster. Bredden af ​​denne strimmel vil afhænge af billedets opløsning, men den skal være ~ 1/20 af bredden af ​​underlivet, i pixels.
  7. Bemærk, at makroen åbner billedet af den første flyve, og en dialogboks spørger om at måle den nuværende flyve (klik "Ja") for at gå videre til næste flyve (klik på "Nej") eller for at afslutte Makro (klik på "Annuller").
  8. Bemærk, at en dialogboks åbnes med angivelse af "Definer midterlinien af ​​den dorsale mave, fra ANTERIOR til POSTERIOR." Værktøjet "lige linje" vil allerede blive valgt. Tegn en linje fra forreste til bagesteAt definere midterlinien af ​​dorsalunderlivet. Klik på "OK;" Se figur 2A og 2A ', gul linje.
    BEMÆRK: Dette bruges til at omdirigere billedet, så den dorsale midterlinie ligger vandret over skærmen, med forreste til venstre, hvilket gør de efterfølgende trin lettere.
  9. Bemærk, at der åbnes en dialogboks med angivelse af "Definer Tergite 4's afslappende kant lige bag pigmentbåndet." Værktøjet "lige linje" vil allerede blive valgt. Tegn en linje fra den bakre midterkant til den højre sidekant, således at midtpunktet af linjen (markeret med en hvid firkant) sidder lige bagved til den bageste kant af pigmentbåndet (kutiklen a5). Klik på "OK;". Se figur 2A og 2A ', magenta linje.
    BEMÆRK: R- scriptet registrerer automatisk pigmentbåndets bageste kant fra pigmenteringsprofilen.
  10. Bemærk at en dialogboksBoksen åbnes med angivelse af "Definer Tergite 4's kanten på den forreste kant af den pigmenterede kutikula (a2)." Værktøjet "lige linje" vil allerede blive valgt. Tegn en linje fra den forreste midterkant til den højre sidekant, således at midtpunktet af linjen (markeret med en hvid firkant) sidder ved den forreste kant af det pigmenterede kutikula (kutikula a2). Klik på "OK;". Se figur 2A og 2A ' , cyan linje.
    BEMÆRK: R- scriptet definerer dette punkt som den forreste kant af tergitets pigmenterede kutikula. På billedet vil makroen vise interesseområdet (ROI), hvor pigmenteringsprofilen læses (grønt rektangel, figur 2A og 2A ', forstørret i figur 2B og 2B '). Makroen åbner også et andet vindue, der viser pigmenteringsprofilen for afkastet ( figur E 2C og 2C '), hvor x-aksen er positionen udtrykt som antallet af pixels fra profilens bageste kant, og y-aksen er den gennemsnitlige pixelværdi i hver position.
  11. Se diagrammerne for pigmenteringsprofilen, der åbnes af makroen. Klik om nødvendigt på "Live" i profilvinduet for at justere placeringen af ​​afkastet, så det ikke indeholder nogen strukturer ( fx børster), som ville påvirke pigmenteringsprofilen. Når profilen er tilfredsstillende, skal du klikke på "OK".
  12. Gentag trin 5.8-5.11 for Tergite 3.
    BEMÆRK: Makroen eksporterer derefter pigmenteringsprofilerne som to CSV-filer, hver med navnet "SESH000_samplename_TX_profile.csv", hvor [SESH000_samplename] er billednavnet, og [TX] er henholdsvis T3 eller T4 for henholdsvis den tredje og fjerde tergite.
  13. Bemærk, at makroen åbner det næste billede. Gentag trin 5.7-5.13 indtil alle billeder er blevet analyseret.
Jove_title "> 6. Dataforbehandling, analyse og sessionskorrektion

BEMÆRK: Alle data analyser udføres i R 47 og bruger scriptet "Analysis of Pigmentation.R". Nedenfor angiver "L ...", hvilken linje (r) af scriptet skal køre for hver del af analysen. Se supplerende oplysninger for yderligere oplysninger om, hvordan analysen udføres.

  1. Rediger R- scriptet for at indstille arbejdsmappen (L6) og definer filepathen til mappen, der indeholder the.csv-profilerne (L11).
  2. Kør L13-15 for at generere en liste over pigmenteringsprofiler, der er gemt i profilmappen.
  3. Indlæs og kør "læseren" og "addPrimaryKey" -funktionerne (L17-41) for at læse profilerne i en enkelt dataramme.
  4. Rediger scriptet ved L43 for at angive den geografiske kalibrering af billederne i μm / pixels, som bestemt i trin 2.5.
  5. Indlæs og kør "adjusTments "-funktionen (L46-58) for at konvertere profilpositionen (x-akse, figur 2C og 2C ') fra pixel-fra-posterior-edge-of-ROI til μm-from-front-edge-of-ROI og Profilværdi (y-akse, figur 2C og 2C ') fra pixelværdien (0 = sort, 255 = hvid) til pigmenteringsværdien (0 = intet pigment, 255 = maksimal pigment).
  6. Indlæs og kør funktionen "spline.der.er" (L60-71) for at generere pigmenteringsprofilens kubiske splines og dens første og anden derivat ( Figur 2D -2F og 2D '- 2F ').
  7. Indlæs og kør funktionen "koord" og "assmbly.coord" (L74-163), først for at ekstrahere positionen af ​​pigmentbåndets bakre (T3) og forreste (T2) kanter ( Figur 2D og 2D ';) Og den bageste kant af a2-kutiklet (T 1 , Figur 2D og 2D ') og derefter at ekstrahere de maksimale (P max ) og minimale (P min ) pigmenteringsværdier taget ved henholdsvis T 3 og T 1 .
    BEMÆRK: Den forreste kant af a2-kutiklen er allerede defineret i trin 5.9.
  8. Valgfrit: Indlæs og kør funktionen "chek" (L165-175) for at kontrollere, om "koord" -funktionen korrekt identificerer positionerne T 1-3 for en tilfældigt valgt pigmenteringsprofil.
  9. Indlæs og kør indeks og målefunktioner (L178-193) for at generere en datatabel med overskrifterne "Session", "Sample", "Tergite", "id" (en sammenkobling af Sample og Tergite), "P max " "P min ", "W- band " (bredden af pigmentbåndet , = T3 - T2) og "W- tergit " (bredden af ​​pigmenteret cUtikler a2-a5, = T3).
  10. Indlæs og kør "korrektion" funktionen (L196-234) for at generere en datatabel, der korrigerer P max og P min for eventuelle gener faktorer der opstår som følge af sessionseffekter. Brug den gennemsnitlige stigning (eller formindskelse) i P max eller P min fra kontrolprøverne, der er genoptimeret over tidsmæssigt tilstødende sessioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen blev brugt til at undersøge virkningen af ​​opdrætstemperatur på abdominal pigmentering. Tidligere undersøgelser har vist, at en stigning i udviklingstemperaturen resulterer i et fald i spredningen af ​​abdominal pigmentering hos flere arter af Drosophila , herunder D. melanogaster 30 , 32 . Specifikt falder pigmentens omfang (bredden af ​​pigmentbåndet) i mave-tergitter 3 og 4 fra 17 ° C til 25 ° C og forbliver det samme fra 25 ° C til 28 ° C 24 , 36 . Disse undersøgelser scorede omfanget af pigmentering på en 1-10 skala (0: nej pigmentbånd, tergit helt gul; 5: pigmentbånd indtager 50% af tergitten; 10: tergit helt mørkt). For at fastslå, om den kvantitative metode kunne fange denne fænotypiske plasticitet, blev pigmenteringen målt i thE tredje og fjerde abdominal tergitter af en isogen linje af tilsyneladende vildtype kvindelige fluer, opdrættet fra æg til voksen ved 17 ° C (syv fluer), 25 ° C (ni fluer) og 28 ° C (ni fluer). For at bestemme effektiviteten af ​​korrektionsproceduren ved fjernelse af generfaktorer, der blev indført ved sessionseffekter, blev pigmenteringen af ​​de samme fluer genoptimeret og målt igen en, to, fire og otte dage senere. Lysforholdene og eksponeringen mellem sessioner blev dog med vilje ændret for at sikre, at der var øjeffekter for, at korrektionsproceduren skulle fjernes. Billederne er blevet publiceret på Dryad Digital Repository.

Det første spørgsmål var, om der var systematiske forskelle i pigmenteringsforanstaltninger på tværs af sessioner. Dette blev undersøgt ved hjælp af lme4- pakken i R 48 for at passe til de blandede modeller M ijk = S i + A j +Ε ijk og M ij = A j + ε ij til både P max og P min , hvor M er pigmentmåling, S er sessionen (tilfældig effekt), A er abdominaltergien der måles (tilfældig effekt), og ε er Den resterende fejl (abonnementer er niveauer inden for variabler). En log-sandsynlighed ratio test blev brugt til at teste om inkluderingen af ​​session som en tilfældig faktor signifikant forbedrede pasformen; Det gjorde det ( tabel 1 ). Som forventet viste undersøgelsen af ​​variansekomponenterne (genereret gennem REML 48 ), at variation på grund af sessionseffekter svarede til 67% og 70% af den totale varians i henholdsvis P max og P min . ( Tabel 1 ).

Femten tilfældigt udvalgte kontrol tergitter (enten tredje eller fjerde, fra fluer reaRød ved 17 ° C, 25 ° C eller 28 ° C) blev valgt, og ændringer i deres gennemsnitlige P max og P min blev anvendt til at korrigere pigmenteringsmålene for de resterende tergitter på tværs af sessioner. Gentagelsen af ​​analysen af ​​de korrigerede pigmenteringsforanstaltninger eliminerede sessionseffekterne ( tabel 1 ) og reducerede procentdelen af ​​den totale varians som følge af sessionseffekter til nul. Resteringsfejlen er et estimat, en målefejl efter at sessionseffekterne er fjernet og var henholdsvis 22% og 27% for henholdsvis Pmax og Pmin ( Tabel 1 )

Derefter blev de korrigerede data brugt til at bestemme, om temperaturens virkning på forskellige aspekter af pigmentering og størrelse kunne detekteres. Den blandede model M ijkm = T i * D j + X k + ε ijkm blev monteret på dataene, hvor T D er tergitten (tredje eller fjerde), og X er den enkelte flyve (tilfældig faktor). Fordi forholdet mellem pigmentering og temperatur ikke er lineært 24 , 36 , blev T behandlet som en kategorisk faktor. Maksimale og minimale pigmenteringsniveauer ( P max og P min ) og bredden af ​​pigmentbåndet og af tergitten ( W- bånd og W- tergit ) blev testet. Effekten af ​​temperatur på den relative bredde af pigmentbåndet ( R- band = W- band / W- tergit ) blev også testet. Dataene viste, at den absolutte (W- bånd ) og relative ( R- bånd ) bredde af pigmentbåndet faldt fra 17 ° C til 25 ° C (Tukey post-hoc test, P <0,05 for alle) og ændrede ikke signifikant fra 25 ° C til 28 ° C (Tukey post-hoc test, tabel 2 , figur 3A og 3B ), hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser 24 , 36 . Det samme mønster blev observeret for maksimum og minimumsniveauet for pigmentering, Pmax og Pmin ( Tabel 2 , Figur 3C ). Effekten af ​​temperatur på pigmenteringsniveauet er ikke beskrevet tidligere, men forekommer i første omgang i overensstemmelse med andre undersøgelser, der viser, at minimumsniveauet for pigmentering i den fjerde abdominale tergit er positivt korreleret med pigmentbåndets bredde i vildtypepopulationer 39 . Selvom dataene fra denne undersøgelse viser et positivt forhold mellem P max og W- bånd , viser de et negativt forhold mellem P min og W båndet( Tabel 3 ). Denne forskel mellem de nuværende og tidligere undersøgelser kan afspejle forskelle i, hvordan genetiske og miljømæssige faktorer påvirker korrelationen mellem niveauet og omfanget af abdominal pigmentering. Ikke desto mindre viser disse repræsentative resultater, at protokollen ikke kun kan identificere pigmenteringsmønstre, der tidligere er etableret gennem kvalitative metoder, men også at afsløre nye, som kvalitative metoder ikke kan opdage.

Virkningen af ​​temperatur på tergitets bredde var mere kompleks. I D. melanogaster falder kropps- og organstørrelse ikke lineært med temperatur 49 . Tidligere undersøgelser tyder på, at bredden af ​​den femte abdominal tergit falder med 10% fra 16,5 ° C til 25 ° C og yderligere 4% fra 25 ° C til 29 ° C 50 . Mens der var et ubetydeligt fald i bredden afDen fjerde abdominal tergit fra 17 ° C til 25 ° C øgedes både den tredje og den fjerde abdominal tergit i bredde fra 25 ° C til 28 ° C ( tabel 2 , figur 3D ). Da bredden af ​​abdominal tergitterne i det væsentlige er defineret af brugeren (trin 5.9-5.10 i protokollen), er forskellen mellem de nuværende og tidligere undersøgelser usandsynligt, at skyldes den måde, hvorpå R- scriptet ekstraherer W- tigit fra pigmenteringsprofilen. Det kan snarere afspejle forskelle i måden, hvormed abdominalsegmentet måles, i fluerens genotyper, og i de præcise aspekter af de abdominale tergitter, der måles.

Det næste spørgsmål var, om metoden kunne generere data, der kunne sammenlignes med data indsamlet ved hjælp af eksisterende vurderinger af pigmentering. Disse metoder beder normalt observatøren om subjektivt at tildele hver flyvning til en af ​​en finDet er antallet af fænotypiske klasser baseret på omfanget af pigmentering 15 , 30 , 32 , 33 , 34 og er derfor afhængige af observatørens evne til at vurdere bredden af ​​pigmentbåndet. For at teste, hvor godt denne objektive metode sammenlignes med subjektive metoder, blev fem observatører bedt om at rangere 45 billeder af kvindelige abdomener baseret på bredden af ​​pigmentbåndet i den fjerde abdominal tergit. Den gennemsnitlige rangering på tværs af observatører blev sammenlignet med rangordningen baseret på W- bånd , målt ved hjælp af denne metode. Der var en stærk sammenhæng mellem de subjektive og objektive placeringer ( Supplerende Figur 1 , i Supplerende Information.pdf), Spearmen = 0,7342, P <0,0001).

Et andet spørgsmål stillede sigVar hvordan denne metode til at udvinde W- bånd fra pigmenteringsspline sammenlignet med måling af pigmentbåndets bredde for hånd (visuel metode) ved hjælp af det lineære måleværktøj i ImageJ . Igen blev der fundet en stærk korrelation mellem data indsamlet under anvendelse af de to metoder ( Supplementær Figur 2 , i Supplerende Information.pdf, OLS, R2 = 0,49 , P <0,0001). Skønt beregningsmetoden målt pigmentbåndet konstant som værende snævrere end i den "visuelle" metode, var regressionskoefficienten ikke signifikant forskellig fra 1 ( P> 0,05).

Det sidste spørgsmål stillede sig, om denne metode kunne bruges til at måle abdominal pigmentering i andre sammenhænge. Metoden kunne ekstrahere P max , P min , W bånd og W tergit for fIfth og sjette abdominal tergitter hos kvinder og tredje og fjerde abdominal tergitter hos mænd ( figur 4 ). Desuden kan metoden anvendes til at kvantificere stigningen i P max og P min i fluer mutant for ebenholt ( e 1 ), hvilket viser en stigning i kutikulær pigmentering på tværs af kroppen og en specifik stigning i pigmenteringen af ​​kutiklet frem for pigmentet Bånd 28 ( figur 4 ).

figur 1
Figur 1: Abdominal pigmentering i D. melanogaster . ( A - F ) Variation i abdominal pigmentering hos kvinder af to genotyper opdrættet ved tre temperaturer (17 ° C, 25 ° C og 28 ° C). A3 og A4 er den tredje og fjerde abdominal tergi Tes, henholdsvis. ( G ) Dorsal abdominal tergit omfatter et forreste og bageste rum, hvoraf kun dele er pålideligt synlige i ikke-strakte buer. Kufferne er yderligere opdelt i forskellige kutikeltyper: a1: ikke-pigmenteret, ingen hår; A2: let pigmenteret og hår; A3: let pigmenteret, hår og moderat børstehår; A4: mørkt pigmenteret, hår og moderat børstehår; A5: mørkt pigmenteret, hår og stor børstehår; A6: ikke-pigmenteret og hår; P3: ikke-pigmenteret og hår; P2: ikke-pigmenteret og ingen hår; Og p1: upigmenteret og tesselleret. Pigmentbåndet består af cuticles a4 og a5. Kun i pigmenterede cuticles (a2-a5, green box) anvendes i analysen. Skalestænger = 200 μm i (AF). Kontrast af alle billeder er blevet justeret for at fremhæve pigmenteringsmønsteret, og billederne er illustrative. Ujusterede billeder, der bruges til at generere de repræsentative resultater, deponeres på Dryad Digital Repository..com / files / ftp_upload / 55732 / 55732fig1large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2: Billed- og dataanalyse til kvantificering af abdominal pigmentering. ( A - F ) og ( A - F ) er til forskellige enheder og viser, hvordan analysen omhandler billeder af forskellig kvalitet. ( A ) Brugeren definerer først bukets midterlinie (gul linje), tergitets forkant (cyan linje) og en linje lidt bagved pigmentbåndets bageste kant (magenta linje). ImageJ-makroen tegner så en linje fra midtpunktet af de forreste og bakre linjer (hvid streget linje), som den udvider til at danne en ROI (sort boks) forstørret i ( B ). ( C ) ImageJ makroen exKanaliserer den gennemsnitlige pixelværdi langs ROI'ens anterior-posterior akse. Bemærk, at profilen på dette stadium læses fra posterior til anterior. ( D - E ) R- makroen konverterer de gennemsnitlige pixelværdier til en pigmenteringsværdi, reverserer retningen af ​​pigmenteringsprofilen, passer den med en kubisk spline ( S (x) ) ( D ) og beregner den første ( S (x ) ) ( E ) og andet ( S (x) ) derivat af spline ( F ). Skriptet identificerer derefter: T 3 , positionen for maksimal pigmentering, hvor S (x) overgår fra <0 til> 0, bevæger sig fremadrettet fra den bageste del af splineen; T 2 , den position, hvor nedgangen i pigmenteringen er størst og S (x) er maksimal; Og T1 , den position, hvor tergitpigmenteringen er mindst og S (x) overgange fra> 0 til <0, flytter anteriorly fRom T 2 ,. Den forreste del af den pålidelige synlige tergit (anterior af cuticle a2) er defineret af brugeren. (AF) I tilfælde, hvor det første derivat ikke kan bruges til at finde T 1 , typisk fordi S (x) ikke krydser 0 anteriorly til pigmentbåndet, vil scriptet definere T 1 som den position, hvor S (x) overgange fra> 0 til <0, når du flytter forfra fra T2 . Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: Effekten af ​​temperatur på forskellige aspekter af abdominal pigmentering hos kvindelig D. melanogaster . ( A ) Pigmentbåndets bredde ( W- band , FIgur 1). ( B ) Pigmentbånd som andel af tergit ( R- bånd ). ( C ) Maksimum ( P max , øvre linjer) og minimale ( P min , lavere linjer) pigmentering. ( D ) Tergitbredden ( W tergit ). Punkterne er mindst kvadratiske midler fra lineære blandede effektmodeller (tabel 2). Fejlstængerne repræsenterer standardfejlen og kan være dækket af markørerne. Den sorte linje er tredje abdominal tergit. Den grå linje er den fjerde abdominal tergit. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4
Figur 4: Forskelle i pigmentering mellem tredje og fjerde abdominal tergitter. Dette er vist i ( A ebenholt 1 hunner, ( B ) vildtypehunner, ( C ) vildtype-hanner og den femte og sjette bukettergitis hos vildtypehunner. ( D ) Maksimal pigmentering, P max . ( E) Minimum pigmentering, P min . ( F ) Bredden af ​​pigmentbåndet, W- båndet . ( G ) Relativ bredde af pigmentbåndet, R- båndet . Stænger med forskellige bogstaver er signifikant forskellige (Tukey HSD post-hoc test, P <0,05). N = 6 for alle undtagen ibenholt 1 , hvor N = 4. Skalestænger = 200 μm i ( A - C ). Fejlstavene repræsenterer standardfejlen. Kontrast af alle billeder er blevet justeret for at fremhæve pigmenteringsmønsteret, og billederne er illustrative. Venligst cliCk her for at se en større version af denne figur.

<Td> 4,08 (78%)
Model Sammenligning Variantkomponenter (% af total)
Pigmentation Egenskab Model df Log-sandsynlighed -X ligning (%) ligning (%) ligning (%)
P max Ukorrigeret M ij = A i + ε ij 3 -678,28 1,94 (14%) 11,86 (86%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -457,95 440,66 *** 4,08 (26%) 10,71 (67%) 1,14 (7%)
P min ukorrigeret M ij = A i + ε ij 3 -875,03 6,05 (9%) 59,39 (91%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -664,58 420,91 *** 16,67 (22%) 53,08 (70%) 6,31 (8%)
P max korrigeret M ij = A i + ε ij 3 -445,05 1,15 (22%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -444,88 0,3378 4,08 (78%) 0,01 (<1%) 1,14 (22%)
P min rettet M ij = A i + ε ij 3 -649,9 16,67 (73%) 6,24 (27%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -649,9 0 16,67 (73%) 0 6,31 (27%)

Tabel 1: Lineære blandede effektmodeller af effekten af ​​tergit og session. Lineære mixed-effect modeller af effekten af ​​tergit og session på aBuminale pigmentering ( P max og P min ) på 50 tergitter målt igen over fem sessioner med varianskomponenter estimeret gennem REML. Modeller var lineære mixed-effect modeller. M : Pigmenteringsforanstaltning; A : Individuel tergit målt S : Session; Ε : Restfejl. Signifikant X² vises med fed skrift. * P <0,05. ** p <0,01. *** p <0,001.

Egenskab Temperatur Tergite Temperatur
X Tergite
P max F -ratio 8,14 55.59 6.6
P 0,002 <0,001
P min F -ratio 4,41 66,11 6,36
P 0,026 <0,001 0,002
W band F -ratio 113,93 0,01 0,64
P <0,001 0,931 0,531
W tergit F -ratio 1,79 0,92 5.11
P 0,191 0,338 0.007
R band F -ratio 27,66 0,08 1,46
P <0,001 0,782 0,23

Tabel 2: Effekt af temperatur og tergitidentitet. Virkningen af ​​temperatur og tergit identitet På forskellige aspekter af abdominal pigmentering i 50 tergitter genmåles over fem sessioner. Modeller var lineære mixed-effect modeller, med individuel fly inkluderet som en tilfældig faktor. P max : Maksimal pigmentering (korrigeret); P min : Minimum pigmentering (korrigeret); W- bånd : Bredde af pigmentbånd; W tergit : Tergitbredde; R- bånd : Relativ bredde af pigmentbånd. Væsentlige faste faktorer er angivet med fed skrift ( P < 0,05).

Intercept W band Temperatur Tergite
17C 25˚C Tredje
P max β 234,35 0,069 0,063 -1,178 -0,588
F 29,93 5,97 54,82
P <0,001 0,008 <0,001
P min β 223,96 -0,137 3,931 -3,024 -1,54
F 19.33 span = "2"> 9,66 62.02
P <0,001 0.001 <0,001

Tabel 3: Effekt af pigmentbåndbredde, temperatur og tergitidentitet på pigmenteringsniveauet. Effekten af ​​pigmentbåndets bredde, temperatur og tergitidentitet på pigmenteringsniveauet i 50 tergitter blev målt igen over fem sessioner. Modeller var lineære mixed-effect modeller, med individuel fly inkluderet som en tilfældig faktor. P max : Maksimal pigmentering (korrigeret); P min : Minimum pigmentering (korrigeret); W- bånd : Bredde af pigmentbånd; R- bånd : Relativ bredde af pigmentbånd.

Supplerende fil 1. Supplementaly Information.Y_Information.pdf "target =" _ blank "> Venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2. Analyse af Pigmentation.R script. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3. Måling af Pigmentation.ijm Klik venligst her for at downloade denne fil.

Simulation R Script. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne metode muliggør den præcise, hurtige og gentagelige opsamling af pigmenteringsdata i en kvantitativ form, som er egnet til flere downstream-analyser. Metoden er blevet brugt til at indhente data om effekten af ​​temperatur på abdominal pigmentering i en isogen fluevogn. Metoden kan dog anvendes i fremad genetik undersøgelser for at identificere gener, der ligger til grund for pigmenteringsforskelle mellem individer, populationer eller arter eller omvendte genetiske undersøgelser for at undersøge virkningerne af specifikke gener på pigmenteringsmønstre. Selv om der som nævnt ovenfor har været utallige undersøgelser, der har undersøgt udviklingen og udviklingen af D. melanogaster- pigmentering, er den præcision, med hvilken denne metode indfanger pigmenteringsdata i en kvantitativ form, mulighed for mere kraftfulde statistiske tilgange. Dette til gengæld gør det muligt for forskere at bruge færre prøver, når de analyserer pigmenteringsmønstre, eller giver dem mulighed for at belyse mere subtileAspekter af pigmentering. Desuden kræver denne metode ikke dissektion af fluen, så prøven efterfølgende kan anvendes til yderligere analyser, såsom morfologiske målinger eller genotyping. Faktisk kunne metoden potentielt anvendes på bedøvede fluer, som derefter kunne selektivt opdrættes baseret på deres pigmenteringsegenskaber.

Et potentielt problem med måling af pigmentering gennem billedanalyse er, at pigmenteringsværdierne kan reflektere eksponeringen og lysforholdene under hvilke et billede blev taget, snarere end selve pigmenteringsniveauet. Ved hjælp af faste lysniveauer hjælper lyspositioner, forstørrelse og eksponering med at lette disse problemer, men det er sandsynligt, at det stadig er nødvendigt at tage flere gentagelsesstyringsbilleder i hver session for fuldt ud at kontrollere sessionseffekter. Denne metode indbefatter re-imaging femten kontrolprøver hver session og bruger mellem-session ændringerne i P maX og p min for at detektere og eliminere sessionseffekter. Det præcise antal kontrolprøver, der skal genindspilles, afhænger dog af billedbehandlingens hardware og software, der anvendes, aspektet af pigmentering af interesse for brugeren, og hvor variabel det er mellem behandlinger, og hvor mange billeder der tages i hver session. Gennemførelse af et foreløbigt eksperiment, hvor de samme prøver genindstilles over fem sessioner, vil tillade brugeren at beregne variansen som følge af sessionseffekter, variansen som følge af prøveidentitet og restvariancen (hvilket er et estimat af målefejl efter korrektion For sessionseffekter) ( tabel 1 ). Disse værdier kan derefter bruges til at estimere, hvor mange kontrolbilleder der skal tages i hver session for at registrere og kontrollere sessionseffekter. Et simpelt R- script er skrevet og bruger data fra et sådant foreløbigt eksperiment for at simulere pigmenteringsforanstaltninger på tværs af sessioner. Det kan brugesAt kontrollere, at antallet af kontrolbilleder pr. Session er tilstrækkeligt til at fjerne sessionseffekterne. Dette script leveres som en supplerende fil.

Hvis brugerne er bekymrede over, at der er gener i forhold til sessioner, kan de også genoprette samme prøve flere gange i løbet af sessionen som beskrevet i John et al., 2016 41 . I dette tilfælde skal [sampleID] for enkeltkontrolprøven ændres hver gang det genoptages inden for en session ( f.eks. Kontrol1, kontrol2, kontrol3 osv. ); Ellers vil billedprogrammet erstatte det forrige billede med det nye billede med samme navn. Korrektionsfunktionen baserer sin korrektion på duplikatbilleder med det samme [sampleID] mellem tidsmæssigt tilstødende sessioner og korrigerer, om det samme eksempel genoptages flere gange inden for og mellem sessioner, eller om det samme sæt kontrolprøver er afbildet imellem sessioner. Uanset hvordan thE-kontrolbilleder tages, sessioner skal behandles som blokke, og hvor det er muligt, bør brugerne anvende et randomiseret blokdesign, så at eventuelle sessionseffekter, der forbliver efter korrektion, kan statistisk kontrolleres for. Hvis dette ikke lykkes, skal prøver tilfældigt tildeles sessioner, så sessionseffekter ikke forstyrres af eksperimentelle faktorer.

Protokollen er baseret på dannelsen af ​​en pigmenteringsprofil, der repræsenterer ændringen i pigmentering over hver tergit. Et problem med at generere denne profil er de mørke hår, der dækker mavemuskelen, som altid bies af en for-posterior linje, der krydser tergitten. Protokollen reducerer den støj, der genereres af disse hår, ved at tage pigmenteringsprofilen gennemsnitligt over et snitbånd. Ikke desto mindre kan brugerne angive bredden af ​​afkastet til 1 pixel i trin 5.6, hvis de ønsker at generere profiler, der er baseret på en tynd linje af neglebånd. Endvidere kan brugerne analysere tHan samme billede flere gange, ændrer den laterale position af pigmenteringsprofilen for at fange ændringer i bredden af ​​pigmentbåndet inden for et segment. I dette tilfælde skal brugerne imidlertid kopiere det samme billede flere gange og give hver kopi et unikt navn, før de gennemfører trin 5.1, da ImageJ-makroen overskriver profiler med samme navn.

En anden vigtig betragtning ved dannelsen af ​​pigmenteringsprofilen er udjævningsparameteren for den kubiske spline, defineret i spline.der.er-funktionen (L63) i analysen af ​​pigmentering R- script. Den passende udjævningsparameter afhænger af billedopsætningen og opløsningen. Over-udjævning af en profil kan resultere i tab af karakteristika for splineprofilen, der anvendes til at beregne koordinaterne for T1, T2 og T3 ( Figur 2D og 2D '). Omvendt øger under-udjævningStøj fra profilen og følgelig nøjagtigheden af ​​koordinatekstraktionerne. Chek- funktionen giver et grafisk resumé af spline og dets derivater og kan bruges som en visuel cue til at vælge en passende udjævningsparameter.

Den her beskrevne metode fokuserer på indfangning af data om pigmenteringen af ​​den tredje og fjerde abdominal tergit hos kvindelig og mandlig D. melanogaster . Imidlertid viser de repræsentative resultater, at det også kan anvendes til måling af pigmenteringen af ​​femte og sjette abdominal segmenter af kvinder. Desuden kan metoden detektere forskelle i fænotype forårsaget af mutanter af gener, som påvirker pigmentering. ImageJ makro og R scripts kan let ændres til måling af pigmentering i abdomene af forskellige D. melanogaster arter eller endog pigmentering af andre kropsdele i andre taxa, forudsat at pigmenteringsmønsteret er stereotypisk. Endelig metodologienKan også tilpasses til måling af aspekter af pigmenteringsfarve ved at fange billeder i RGB og analysere hver kanal separat.

Generelt er denne metode en del af det fremvoksende felt af phenomics 51 , 52 . Målet med phenomics er at generere og analysere store multidimensionelle fænotypiske datasæt for bedre at forstå de genetiske og miljømæssige interaktioner, der påvirker fænotype, herunder sygdom, og hvordan disse interaktioner udvikler sig til at generere biologisk mangfoldighed. For phenomics at opfylde sit potentiale må metoder til at erhverve fænotypiske data være ligetil og let tilpasset forskellige fænotyper såvel som frit tilgængelige. Ved at bruge open source software til at analysere billeder taget med standardudstyr, hjælper denne metode med at nå dette mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af National Science Foundation tildeler IOS-1256565 og IOS-1557638 til AWS. Vi takker Patricia Wittkopp og tre anonyme korrekturlæsere for deres nyttige kommentarer til en tidligere version af dette papir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 Biology Forceps FST 11252-30
Agar Sigma-Aldrich 5040
Dissecting Scope Leica MZ16FA
Base Leica MDG41
Camera Leica DFC280
Gooseneck Cold Light Source Schott ACE 1
Image Acquisition Control Software Micro-Manager v1.3.20 https://micro-manager.org/
Image Analysis Software ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/
Data Analysis Software R 3.3.2 https://www.r-project.org/
LED Thor Labs LEDWE-15
Multimeter Fluke Fluke 75 Series II
60 mm x 15 mm Petri dish Celltreat Scientific Products 229663
Stage micrometer Klarman Rulings, Inc. KR-867

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wittkopp, P. J., Beldade, P. Development and evolution of insect pigmentation: Genetic mechanisms and the potential consequences of pleiotropy. Semin. Cell Dev. Biol. 20 (1), 65-71 (2009).
  2. Lindgren, J. Interpreting melanin-based coloration through deep time: a critical review. Proc Roy Soc B-Biol Sci. 282 (1813), (2015).
  3. Kronforst, M. R., Papa, R. The Functional Basis of Wing Patterning in Heliconius Butterflies: The Molecules Behind Mimicry. Genetics. 200 (1), 1-19 (2015).
  4. Albert, N. W., Davies, K. M., Schwinn, K. E. Gene regulation networks generate diverse pigmentation patterns in plants. Plant Signal Behav. 9, e29526 (2014).
  5. Monteiro, A. Origin, development, and evolution of butterfly eyespots. Annu Rev Entomol. 60, 253-271 (2015).
  6. Kronforst, M. R. Unraveling the thread of nature's tapestry: the genetics of diversity and convergence in animal pigmentation. Pigm Cell Melanoma Res. 25 (4), 411-433 (2012).
  7. Wright, T. R. The genetics of biogenic amine metabolism, sclerotization, and melanization in Drosophila melanogaster. Adv Genet. 24, 127-222 (1987).
  8. True, J. R. Insect melanism: the molecules matter. TREE. 18 (12), 640-647 (2003).
  9. Kopp, A., Duncan, I. Control of cell fate and polarity in the adult abdominal segments of Drosophila by optomotor-blind. Development. 124 (19), 3715-3726 (1997).
  10. Kopp, A., Muskavitch, M. A., Duncan, I. The roles of hedgehog and engrailed in patterning adult abdominal segments of Drosophila. Development. 124 (19), 3703-3714 (1997).
  11. Kopp, A., Blackman, R. K., Duncan, I. Wingless, decapentaplegic and EGF receptor signaling pathways interact to specify dorso-ventral pattern in the adult abdomen of Drosophila. Development. 126 (16), 3495-3507 (1999).
  12. Kopp, A., Duncan, I., Godt, D., Carroll, S. B. Genetic control and evolution of sexually dimorphic characters in Drosophila. Nature. 408 (6812), 553-559 (2000).
  13. Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134 (4), 610-623 (2008).
  14. Wittkopp, P. J., Williams, B. L., Selegue, J. E., Carroll, S. B. Drosophila pigmentation evolution: divergent genotypes underlying convergent phenotypes. Proc Natl Acad Sci Usa. 100 (4), 1808-1813 (2003).
  15. Brisson, J. A., De Toni, D. C., Duncan, I., Templeton, A. R. Abdominal pigmentation variation in drosophila polymorpha: geographic variation in the trait, and underlying phylogeography. Evolution. 59 (5), 1046-1059 (2005).
  16. Brisson, J. A., Templeton, A. R., Duncan, I. Population genetics of the developmental gene optomotor-blind (omb) in Drosophila polymorpha: evidence for a role in abdominal pigmentation variation. Genetics. 168 (4), 1999-2010 (2004).
  17. Dembeck, L. M. Genetic Architecture of Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 11 (5), e1005163 (2015).
  18. Drapeau, M. D., Radovic, A., Wittkopp, P. J., Long, A. D. A gene necessary for normal male courtship, yellow, acts downstream of fruitless in the Drosophila melanogaster larval brain. J Neurobiol. 55 (1), 53-72 (2003).
  19. Hodgetts, R. B., O'Keefe, S. L. Dopa decarboxylase: a model gene-enzyme system for studying development, behavior, and systematics. Annu Rev Entomol. 51, 259-284 (2006).
  20. Marmaras, V. J., Charalambidis, N. D., Zervas, C. G. Immune response in insects: the role of phenoloxidase in defense reactions in relation to melanization and sclerotization. Arch Insect Biochem Physiol. 31 (2), 119-133 (1996).
  21. Kalmus, H. The Resistance to Desiccation of Drosophila Mutants Affecting Body Colour. Proc Roy Soc London B. 130 (859), 185-201 (1941).
  22. Rajpurohit, S., Gibbs, A. G. Selection for abdominal tergite pigmentation and correlated responses in the trident: a case study in Drosophila melanogaster. Biol J Linn Soc. 106 (2), 287-294 (2012).
  23. Pool, J. E., Aquadro, C. F. The genetic basis of adaptive pigmentation variation in Drosophila melanogaster. Mol Ecol. 16 (14), 2844-2851 (2007).
  24. Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Developmental constraints on an adaptive plasticity: reaction norms of pigmentation in adult segments of Drosophila melanogaster. Evol Dev. 2 (5), 249-260 (2000).
  25. Shakhmantsir, I., Massad, N. L., Kennell, J. A. Regulation of cuticle pigmentation in drosophila by the nutrient sensing insulin and TOR signaling pathways. Dev Dyn. 243 (3), 393-401 (2014).
  26. Struhl, G., Barbash, D. A., Lawrence, P. A. Hedgehog organises the pattern and polarity of epidermal cells in the Drosophila abdomen. Development. 124 (11), 2143-2154 (1997).
  27. Jeong, S., Rokas, A., Carroll, S. B. Regulation of body pigmentation by the Abdominal-B Hox protein and its gain and loss in Drosophila evolution. Cell. 125 (7), 1387-1399 (2006).
  28. Wittkopp, P. J., True, J. R., Carroll, S. B. Reciprocal functions of the Drosophila yellow and ebony proteins in the development and evolution of pigment patterns. Development. 129 (8), 1849-1858 (2002).
  29. True, J. R. Drosophila tan encodes a novel hydrolase required in pigmentation and vision. PLoS Genet. 1 (5), e63 (2005).
  30. David, J. R., Capy, P., Gauthier, J. P. Abdominal pigmentation and growth temperature in Drosophila melanogaster: Similarities and differences in the norms of reaction of successive segments. J Evol Biol. 3 (5-6), (1990).
  31. Gibert, J. M., Peronnet, F., Schlotterer, C. Phenotypic plasticity in Drosophila pigmentation caused by temperature sensitivity of a chromatin regulator network . PLoS Genet. 3 (2), e30 (2007).
  32. Gibert, P., Moreteau, B., Scheiner, S. M. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila: correlated variations between segments. Genet Sel Evol. 30 (2), 181 (1998).
  33. Matute, D. R., Harris, A. The influence of abdominal pigmentation on desiccation and ultraviolet resistance in two species of Drosophila. Evolution. 67 (8), 2451-2460 (2013).
  34. Das, A., Mohanty, S., Parida, B. Abdominal pigmentation and growth temperature in Indian Drosophila melanogaster: Evidence for genotype-environment interaction. J Biosci. 19 (2), 267-275 (1994).
  35. Hollocher, H., Hatcher, J. L., Dyreson, E. G. Evolution of abdominal pigmentation differences across species in the Drosophila dunni subgroup. Evolution. 54 (6), 2046-2056 (2000).
  36. Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila melanogaster: genetic repeatability of quantitative parameters in two successive generations. Heredity. 92 (6), 499-507 (2004).
  37. Carbone, M. A., Llopart, A., deAngelis, M., Coyne, J. A., Mackay, T. F. Quantitative trait loci affecting the difference in pigmentation between Drosophila yakuba and D. santomea. Genetics. 171, 211-225 (2005).
  38. Kopp, A., Graze, R. M., Xu, S., Carroll, S. B., Nuzhdin, S. V. Quantitative trait loci responsible for variation in sexually dimorphic traits in Drosophila melanogaster. Genetics. 163 (2), 771-787 (2003).
  39. Bastide, H., Yassin, A., Johanning, E. J., Pool, J. E. Pigmentation in Drosophila melanogaster reaches its maximum in Ethiopia and correlates most strongly with ultra-violet radiation in sub-Saharan Africa. BMC Evol Biol. 14, 179 (2014).
  40. Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326 (5960), 1663-1667 (2009).
  41. John, A. V., Sramkoski, L. L., Walker, E. A., Cooley, A. M., Wittkopp, P. J. Sensitivity of Allelic Divergence to Genomic Position: Lessons from the Drosophila tan Gene. G3. 6 (9), 2955-2962 (2016).
  42. Wittkopp, P. J. Local adaptation for body color in Drosophila americana. Heredity. 106 (4), 592-602 (2011).
  43. Wittkopp, P. J. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
  44. Edelstein, A. D. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), e10 (2014).
  45. U. S. National Institutes of Health. ImageJ v.1.50i. , Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2016).
  46. Mims, F. M. How to Use LEDs to Detect Light. Make:. 36, 136-138 (2013).
  47. R: Language and Environment for Statistical Computing v.3.3.2. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: https://www.r-project.org/ (2016).
  48. Bates, D., Machler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting Linear Mixed-Effects Models Using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
  49. Shingleton, A. W., Estep, C. M., Driscoll, M. V., Dworkin, I. Many ways to be small: different environmental regulators of size generate distinct scaling relationships in Drosophila melanogaster. Proc Roy Soc Lond B Biol Sci. 276 (1667), 2625-2633 (2009).
  50. French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
  51. Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nat Rev Genet. 11 (12), 855-866 (2010).
  52. Kültz, D. New frontiers for organismal biology. BioSci. 63 (6), 464-471 (2013).

Tags

Genetik Pigmentation Drosophila fænotypisk variation mikroskopi digital billedanalyse phenomics
Kvantificering af abdominal pigmentering i<em&gt; Drosophila melanogaster</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saleh Ziabari, O., Shingleton, A. W. … More

Saleh Ziabari, O., Shingleton, A. W. Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (124), e55732, doi:10.3791/55732 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter