Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Kvantifiserende abdominal pigmentering i Published: June 1, 2017 doi: 10.3791/55732
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, Lake Forest College

Summary

Dette arbeidet presenterer en metode for raskt og nøyaktig kvantifisering av abdominal pigmentering av Drosophila melanogaster ved hjelp av digital bildeanalyse . Denne metoden strømlinjeformer prosedyrene mellom fenotypeinnsamling og dataanalyse og inkluderer prøvemontering, bildeoppkjøp, pikselverdigekstraksjon og egenskapsmåling.

Abstract

Pigmentering er et morfologisk enkelt, men svært variabelt trekk som ofte har adaptiv betydning. Det har tjent mye som en modell for å forstå utviklingen og utviklingen av morfologiske fenotyper. Abdominal pigmentering i Drosophila melanogaster har vært spesielt nyttig, slik at forskere kan identifisere loci som ligger til grund for inter- og intraspesifikke variasjoner i morfologi. Hittil har D. melanogaster abdominal pigmentering imidlertid i stor grad blitt analysert kvalitativt, gjennom scoring, snarere enn kvantitativt, som begrenser former for statistisk analyse som kan brukes på pigmenteringsdata. Dette arbeidet beskriver en ny metodikk som muliggjør kvantifisering av ulike aspekter av abdominalpigmenteringsmønsteret for voksen D. melanogaster . Protokollen inkluderer prøvemontering, bildeopptak, datautvinning og analyse. All programvare som brukes til makroer for bildeopptak og analysefunksjonerSkrevet for åpen kildekode bildeanalyse. Fordelen med denne tilnærmingen er evnen til å måle pigmenteringstrekkene nøyaktig ved hjelp av en metodikk som er svært reproduserbar på tvers av forskjellige bildesystemer. Mens teknikken har blitt brukt til å måle variasjon i tergalpigmenteringsmønstrene av voksen D. melanogaster , er metoden fleksibel og bredt anvendelig for pigmenteringsmønstre i utallige forskjellige organismer.

Introduction

Pigmentering viser enorm fenotypisk variasjon mellom arter, populasjoner og individer, og til og med innen enkeltpersoner under ontogeni 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Selv om det finnes myriade studier av pigmentering i et stort utvalg av dyr, har pigmentering kanskje best studert i Drosophila melanogaster , hvor full molekylær genetikk har blitt brukt til å belyse utviklings- og fysiologiske mekanismer som regulerer pigmentering og hvordan disse mekanismer utvikler seg 1 , 6 . Mye er kjent om gener som regulerer den biokjemiske syntese av pigmenter i D. melanogaster 7 , 8 og generene som styrer den tidsmessige og romlige diFordeling av denne biosyntesen 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Videre har genetisk kartlegging identifisert de genetiske lokaliteter som ligger til grunn for intra- og interspesifikke forskjeller i pigmentering i D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 . Forholdene mellom pigmentering og pleiotropiske egenskaper, som for eksempel oppførsel 18 , 19 og immunitet 19 , 20 , har også blitt utforsket, som har den adaptive betydningen av pigmenteringsmønstre 15 , 21 , 22 . Som sådan har pigmentering i D. melanogaster dukket opp som en kraftig, men likevel enkel mOdel for utvikling og utvikling av komplekse fenotyper.

Pigmentering i voksen D. melanogaster er preget av tydelige mønstre av melanisering over hele kroppen, spesielt på vingene og dorsalt thorax og underliv. Det er pigmenteringen av hver kutikulær plate (tergitt) på dorsal underliv, men som har fått mest forskningsoppmerksomhet. Det er betydelig variasjon i denne pigmenteringen ( Figur 1A- F ), på grunn av både genetiske 17 , 23 og miljø 24 , 25 faktorer. Kutikulaen i en bukertergitt består av fremre og bakre utviklingsrom ( figur 1G ), som hver kan videreoppdeles, avhengig av pigmentering og utsmykning 26 . Den fremre delen inneholder seks krysningerTyper (a1-a6), og det bakre rommet inneholder tre (p1-p3) ( figur 1G ). Av disse foldes p1-, p2- og a1-kutikkene typisk under tergitten i ustrakte buk, slik at de er skjulte. Den pålitelige synlige kutikulaen er preget av et bånd av tung pigmentering, her referert til som et "pigmentbånd", bestående av kutikeltyper a4 (hårete med moderate børster) og a5 (hårete med store børster), med båndets bakre kant Mer intenst pigmentert enn den fremre kanten ( figur 1G ). Foran for dette bandet er en region med lettpigmentert hårete kutikula, som har børstene posteriorly (a3), men ikke anteriorly (a2). Variasjon i pigmentering mellom fluer observeres i både intensiteten av pigmentering og i bredden av pigmentbåndet. Generelt er variasjon størst i de mest bakre segmentene (magesegmentene 5, 6 og 7) og er lavere i de mer fremre segmentene (magesekkenGruppe 3 og 4) 24 . Videre er det en seksuell dimorfisme i D. melanogaster- pigmentering, med hanner som generelt har fullpigmentert femte og sjette buk-tergitt ( figur 4C ).

I de fleste studier av abdominalpigmentering i D. melanogaster har pigmentering blitt behandlet som et kategorisk eller ordinært trekk, med mønsteret målt kvalitativt 27 , 28 , 29 eller halvkvantitativt på en skala 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . Disse metodene har uunngåelig lider av mangel på presisjon, og fordi de er avhengige av den subjektive vurderingen av pigmentering, er det vanskelig å sammenligne dataene på tvers av studier. Flere forfattere har kvantifisert de romlige dimensjonene av pigmentering 38 , 39 , intensiteten av pigmentering av en bestemt kutikeltype 23 , 25 , 39 , 40 eller den gjennomsnittlige intensiteten av pigmentering over buk-tergitten som helhet 41 , 42 , 43 . Ikke desto mindre måler disse kvantifiseringsmetodene ikke både intensiteten og den romlige fordeling av abdominal pigmentering samtidig, og derfor fanger ikke nyansene av hvordan pigmenteringen varierer over abdOminal tergitt. Videre krever flere av disse kvantifiseringsmetodene 38 , 41 , 42 , 43 disseksjonen og montering av bukekjøttet. Dette er både tidkrevende og ødelegger prøven, noe som gjør den utilgjengelig for ytterligere morfologiske analyser. Etter hvert som forståelsen av utviklingen og utviklingen av abdominalpigmentering øker, vil mer avanserte verktøy for å raskt og nøyaktig måle både romlig fordeling og intensitet av pigmentering kreves.

Det overordnede målet med denne metoden er å benytte digital bildeanalyse for å oppnå et replikerbart og mer presist mål for abdominalpigmenteringen i D. melanogaster . Metoden inkluderer tre faser. Først er voksenflyget ikke-destruktivt montert, og et digitalt bilde av dorsal underlivet er tatt. For det andre, bruker en ImageJ makro, brukerenDefinerer en anterior-posterior stripe av piksler som strekker seg fra fremsiden av a2-kutikken til baksiden av a5-kutikulaen (grønn boks, figur 1G ) på både det tredje og det fjerde abdominalsegmentet. Den gjennomsnittlige pikselverdien over bredden av denne stripen blir deretter ekstrahert langs sin langsakse, og genererer en profil som fanger den romlige fordeling og intensiteten av pigmentering når den endres fra den fremre til den bakre delen av tergitten. For det tredje brukes et R-skript for å beskrive pigmenteringsprofilen matematisk ved hjelp av en kubisk spline. R-skriptet bruker deretter spline og dets første og andre derivat for å trekke ut bredden på a2-a5-kutikkelen, bredden av pigmentbåndet, og maksimale og minste nivåer av pigmentering. Metoden kvantifiserer derfor både romlige egenskaper og dybden av abdominal pigmentering.

Denne metoden kvantifiserer pigmenteringen av den tredje og fjerde abdominal tergitt,Som har vært i fokus i mange tidligere studier 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , enten utelukkende eller i kombinasjon med mer bakre tergitter. Selv om den er mindre variabel enn den femte og sjette buk-tergittene, er den tredje og fjerde tergitt ikke fullstendig pigmentert hos menn, så denne protokollen kan brukes til både menn og kvinner. Likevel, som vist her, kan protokollen brukes til å måle pigmentering i femte og sjette buk tergitt hos kvinner. Videre bør mindre modifikasjoner av skriptene som brukes til å trekke ut pigmenteringsprofilens karakteristikker, tillate at metoden brukes til å kvantifisere variasjonen i pigmentering i et bredt spekter av andreorganismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Prøvemontering

MERK: Oppbevar døde fluer i 70% etanol i vann før bildebehandling.

  1. Hell 10 ml 1,25% agar oppløst i kokende vann i en 60 mm x 15 mm petriskål og la den settes.
  2. Under et disseksjonsmikroskop skal du bruke et par fintpennpinner til å lage en ~ 20 mm, 2 mm bred, 1 mm dyp rille i overflaten av gelen. Ved hjelp av fine tang, legg inn den ventrale siden av en voksenfly i sporet, med den dorsale siden av flyet som rager over gelen.
    MERK: Gelens løshet gjør det enkelt å plassere uten å skade prøven. Den samme sporet kan brukes til flere prøver, selv om det blir skittent, ødelagt og ubrukelig med tiden. Brukeren kan da lage en annen spor i samme gel. Hver plate kan brukes til bilde ~ 200 fluer.
  3. Helt dekke prøven i 70% etanol i vann for å redusere eventuelle refleksjoner fra voksartikkelet og for å hindre vingeskadeÅ bruke prøvehåndtering.

2. Mikroskopoppsett

MERK: Bilder er anskaffet ved hjelp av et dissekeringsområde, overført lysbase, digitalkamera og gooseneck-kald lyskilde festet til en datamaskin som kjører bildeoppkjøpsstyringsprogramvare. Programvareinstruksjoner er spesifikke for Micro-Manager v1.4.20 44 , som er en åpen kildekode programvare som inneholder ImageJ 45 .

  1. Slå på mikroskopet, digitalkameraet, doble gooseneck-kald lyskilde og datamaskin.
  2. Kjør bildeopptaksprogramvaren for å åpne et Micro-Manager-vindu og et ImageJ-vindu. I ImageJ-vinduet klikker du på "Bilde"> "Type"> "8-bit" for å angi alle bilder som 8-bit. Klikk "live" i Micro-Manager-vinduet for å åpne et "Snap / Live" -vindu som viser en forhåndsvisning i sanntid fra kameraet.
    1. Maksimer størrelsen på "Snap / Live" -vinduet hvis necessary. Velg "Gråskala" i rullegardinmenyen "Skjermmodus" på "Kontrast" -fanen i Micro Manager-vinduet.
  3. Slå på den kalde lyskilden til maksimal intensitet og plasser spissene til hver spindelbøtte til ca 120 mm fra scenen, en til venstre og en til høyre.
    MERK: Brukere kan også bruke en ringformet belysning, selv om dette kan generere en ring av reflektert lys rundt flybukken.
  4. Sett mikroskop forstørrelsen manuelt til 60X manuelt slik at synsfeltet fanger et område på omtrent 3 mm i diameter på scenen.
  5. Plasser en mikrometer på 2 mm trinn på scenen (bytter bakgrunnen til hvit hvis nødvendig). Mens du ser på live forhåndsvisningen, fokuserer du på scenemikrometeret og justerer eksponeringen i Micro-Manager-vinduet ved å angi eksponeringstiden i ms i boksen "Eksponering".
  6. For å romlig kalibrere kameraet, velg verktøyet "rett linje" i tHan ImageJ vindu og tegne en linje lengden på scenen mikrometer. I ImageJ-vinduet klikker du på "Analyser"> "Set Scale" for å åpne vinduet "Set Scale", skriv inn lengden på mikrometeret i μm i "Kjent avstand" -boksen, og skriv inn "μm" i "Enhetens lengde" eske.
    1. Se at "Set Scale" -vinduet så viser skalaen i "piksler / μm." Legg merke til skalaen og klikk på "OK".
  7. I "Snap / Live" -vinduet klikker du på "Stopp" og deretter "Snap" for å fange et bilde av scenemikrometeret.
  8. Lagre bildet som en 8-bit gråskala TIFF for å sikre muligheten til å kalibrere bildene igjen, hvis nødvendig. I ImageJ-vinduet klikker du på "File"> "Save As"> "Tiff ..." Angi hvor du skal lagre filen i filbrowseren, navn filen og klikk "Lagre".
  9. Bytt scenen til svart og plassEn petriskål som holder en fly montert i agar (trinn 1.1-1.2) på scenen.
  10. Se gjennom mikroskopet og plasser flyet for å sikre at dorsal midtlinjen er rett opp for å best se pigmenteringsmønsteret. Flytt noen vinger og vedlegg for å sikre at utsikten over magen er uhindret. Hvis den pigmenterte kutikulaen (a2-a5) ikke er synlig, klemma magen lateralt til den er (selv om bukenes buk lagres i 70% etanol i vannstreng, slik at dette vanligvis ikke er nødvendig).
    MERK: Når du plasserer flyet, må brukeren kanskje bruke en lavere forstørrelse (20X). Forstørrelsen må returneres til 60X før du fortsetter.
  11. Manuell fokus på dorsal underlivet i flyet. Manuell justering av lyskildens tips for å minimere skyggene og refleksjonen på dorsal underliv.
  12. Mens du ser på levende forhåndsvisning på dataskjermen, og bruker pikselværdihistogrammet i "Kontrast" -fanen i Micro Manager-vinduet,Juster eksponeringen som beskrevet i trinn 2.4 for å maksimere rekkevidden av pikselverdier av forhåndsvisningsbildet.
  13. Fjern fly- og petriskålen og erstatt dem med en LED (spektralutgang på 430-660 nm) koblet til en spenningsmåler, sentrert i synsfeltet i samme posisjon som flyet. Bruk lysdioden og spenningsmåleren som lysmåler 46 og ta opp spenningen generert av lyset som rammer LED-lampen (~ 125 mV).
    MERK: Lysdioden og spenningsmåleren brukes til å sikre at lysnivåene er konstante på tvers av flere bildebehandlinger i et enkelt eksperiment.
  14. For eksperimentets varighet må du ikke endre posisjonen eller intensiteten til lyskilden, forstørrelsen av mikroskopet eller eksponeringen av kameraet.

3. Prøvebilder

  1. Plasser en Petri-tallerken som holder en fly montert i agar (trinn 1.1-1.3) på det svarte mikroskopetrinnet. Juster flygens posisjon slik at den tredje og fjerdeH abdominalsegmenter er synlige og dorsal midtlinjen er rett opp, som beskrevet i trinn 2.9. Kontroller at forstørrelsen er 60 ganger før du fortsetter.
  2. Manuelt fokusere mikroskopet slik at den tredje og fjerde dorsale buk-tergittene er i fokus. Bruk bildeopptaksprogramvaren til å skaffe et bilde som en 8-bit gråtonet TIFF, som beskrevet i trinn 2.6.
    MERK: Bildet kan fanges i farger og deretter konverteres til gråtoner for analyse.
  3. Lagre bildet som "SESH000_sampleID.tiff", som beskrevet i trinn 2.7.
    MERK: Her er [SESH] konstant, [000] er øktnummeret og er variabelt, men må være tre sifre lenge, og [sampleID] er hva brukeren ønsker, selv om det ikke må inneholde noen ekstra underskriftstegn (_) og Må være av konstant lengde. [SampleID] skal inneholde detaljer om faktorene som brukes i analysen av pigmenteringsdataene ( f.eks. Temperatur eller avstand), adskilt av et karakteristisk ikke-alfabetiskCal karakter, for eksempel en bindestrek (-). Dette lar disse faktorene enkelt bli analysert ut av [sampleID] ved hjelp av standard statistisk programvare.
  4. Fjern petriskålen fra scenen og erstatt flyet med neste prøve. Gjenta trinn 3.1-3.3 til alle prøvene er avbildet, uten å justere lysnivåene, forstørrelsen eller eksponeringen ytterligere.

4. Imaging over flere økter

  1. Hvis bilder må tas over flere økter, behold lysintensiteten, eksponeringen og forstørrelsen på tvers av øktene. På begynnelsen av hver økt, kontroller kameras kalibrering av kameraet (trinn 2.4) og lysintensiteten på scenen (målt ved LED / spenningsmåler, trinn 2.12).
  2. Ta opp og lagre et bilde av scenemikrometeren (trinn 2.5-2.7) for å sikre muligheten til å kalibrere bildene på nytt, hvis nødvendig.
  3. Bruk minst 15 kontrollprøver og tilfeldigvis re-bildet dem i hver økt til alloW for påvisning og eliminering av økt effekt. Kontroller at duplikatkontrollprøver mellom øktene har samme [sampleID] men forskjellige [SESH000].
    MERK: Kontrollprøvene er fluer samlet, lagret og montert identisk til eksperimentelle eksempler, men blir re-avbildet på tvers av øktene. Det presise antallet kontrollprøver vil avhenge av brukerens eksperimentelle oppsett. Se diskusjonen for ytterligere detaljer.

5. Bildeanalyse

MERK: Bildeanalyse utføres i ImageJ 45 og bruker "Meting av Pigmentation.ijm", makro som en tilleggsfil.

  1. Plasser alle bildene som skal analyseres i samme mappe.
  2. Start ImageJ og kjør makroen "Measurement of Pigmentation.ijm" ved å klikke på "Plugins"> "Macro"> "Run", velg "Measurement of Pigmentation.ijm" i filbrowseren og klikk på "åpen."
    MERK: Alle påfølgende trinn er innenfor makroen. Hvert trinn er en individuell makrokommando.
  3. Merk at en dialogboks "Handlingskrevd" åpnes, med angivelse av "Velg mappen der bildene er lagret." Klikk "OK" og bruk filbrowseren til å velge mappen som inneholder bildene og klikk deretter "velg".
  4. Vær oppmerksom på at en dialogboks "Handlingskrevd" åpnes, og sier "Velg mappen hvor du vil lagre dataene". Klikk "OK" og bruk filbrowseren til å velge ønsket mappe for å lagre pigmenteringsprofiler. Klikk på "velg".
  5. Merk at en dialogboks åpnes, spør "Hvor mange tegn i eksempeldokumentet ditt?" Skriv inn antall tegn i [SampleID], som angitt i trinn 3.3, i innmatingsboksen, og klikk på "OK".
  6. Legg merke til at en dialogboks åpnes, og spør "Hvor bredt er avkastningen din?" I datainnmatingsboksen skriver du inn pikselbredden på den fremre-Bakre stripe langs hvilken pigmenteringsprofilen skal leses (grønt rektangel, figur 1G , figur 2A og 2A '). Klikk på "OK;" Standard er 20 piksler.
    MERK: Pigmenteringsprofilen er lest over en strikke av kutikk, i stedet for en linje, for å redusere støy på grunn av hår og børster. Bredden på denne stripen vil avhenge av oppløsningen av bildet, men den skal være ~ 1/20 av bredden på magen, i piksler.
  7. Merk at makroen vil åpne bildet av den første flygaen, og en dialogboks vil spørre om du skal måle dagens fly (klikk "Ja") for å gå videre til neste fly (klikk "Nei"), eller for å gå ut av Makro (klikk på "Avbryt").
  8. Merk at en dialogboks åpnes, med angivelse "Definer midtlinjen til dorsal underlivet, fra ANTERIOR til POSTERIOR." Rettlinjeverktøyet er allerede valgt. Tegn en linje fra fremre til bakreÅ definere midtlinjen til dorsal underliv. Klikk på "OK;" Se figur 2A og 2A ', gul linje.
    MERK: Dette brukes til å omdirigere bildet slik at dorsal midtlinjen ligger horisontalt over skjermen, med fremre til venstre, noe som gjør de etterfølgende trinnene lettere.
  9. Vær oppmerksom på at en dialogboks åpnes, med angivelse av "Definer POSTERIOR-kanten av Tergite 4 like bak pigmentbåndet." Rettlinjeverktøyet er allerede valgt. Tegn en linje fra den bakre midterkanten til den høyre sidekanten, slik at midtpunktet av linjen (merket med et hvitt torg) sitter like bakover til bakre kant av pigmentbåndet (kutiks a5). Klikk på "OK;". Se figur 2A og 2A ', magenta linje.
    MERK: R- skriptet vil automatisk oppdage den bakre kanten av pigmentbåndet fra pigmenteringsprofilen.
  10. Legg merke til at en dialogboksBoksen vil åpne, med angivelse "Definer den bakre kanten av Tergite 4 på den fremre kanten av pigmentert kutikula (a2)." Rettlinjeverktøyet er allerede valgt. Tegn en linje fra den fremre midterkanten til den høyre sidekanten, slik at midtpunktet av linjen (merket med et hvitt torg) sitter ved den fremre kanten av den pigmenterte kutikkelen (kutiks a2). Klikk på "OK;". Se figur 2A og 2A ' , cyan linje.
    MERK: R- skriptet vil definere dette punktet som den fremre kanten av tergittens pigmenterte kutikula. På bildet vil makroen vise region av interesse (ROI) langs hvilken pigmenteringsprofilen leses (grønt rektangel, figur 2A og 2A ', forstørret i figur 2B og 2B '). Makroen vil også åpne et andre vindu som viser pigmenteringsprofilen for avkastningen ( Figur E 2C og 2C '), hvor x-aksen er posisjonen, uttrykt som antall piksler fra den bakre kanten av profilen, og y-aksen er gjennomsnittspikselverdien i hver posisjon.
  11. Se plottene i pigmenteringsprofilen som åpnes av makroen. Hvis nødvendig, klikk "Live" i profilvinduet for å justere plasseringen av avkastningen slik at den ikke inneholder noen strukturer ( f.eks. Børster) som vil påvirke pigmenteringsprofilen. Når profilen er tilfredsstillende, klikk "OK".
  12. Gjenta trinn 5.8-5.11 for Tergite 3.
    MERK: Makroen eksporterer deretter pigmenteringsprofilene som to CSV-filer, hver med navnet "SESH000_samplename_TX_profile.csv," der [SESH000_samplename] er bildetavnet, og [TX] er henholdsvis T3 eller T4 for henholdsvis tredje og fjerde tergitt.
  13. Merk at makroen åpner neste bilde. Gjenta trinnene 5.7-5.13 til alle bildene er analysert.
Jove_title "> 6. Dataforbehandling, analyse og øktkorreksjon

MERK: Alle data analyser utføres i R 47 og bruker skriptet "Analysis of Pigmentation.R". Nedenfor angir "L ..." hvilken linje (r) av skriptet som skal kjøres for hver del av analysen. Se tilleggsinformasjonen for ytterligere detaljer om hvordan analysen utføres.

  1. Rediger R- skriptet for å angi arbeidskatalogen (L6) og definer filepathen i mappen som inneholder the.csv-profilene (L11).
  2. Kjør L13-15 for å generere en liste over pigmenteringsprofiler som er lagret i profilmappen.
  3. Last inn og kjør "leseren" og "addPrimaryKey" -funksjonene (L17-41) for å lese profilene i en enkelt dataramme.
  4. Rediger skriptet ved L43 for å angi romlig kalibrering av bildene i μm / piksler, som bestemt i trinn 2.5.
  5. Last inn og kjør "adjus"Tments "-funksjonen (L46-58) for å konvertere profilposisjonen (x-akse, figur 2C og 2C ') fra piksler-fra-bakre kant-av-avkastning til μm-fra-fremre kanten av ROI og Profilverdien (y-akse, figur 2C og 2C ') fra pikselverdien (0 = svart, 255 = hvit) til pigmenteringsverdien (0 = ingen pigment, 255 = maksimal pigment).
  6. Last inn og kjør funksjonen "spline.der.er" (L60-71) for å generere den kubiske spline av pigmenteringsprofilene og dens første og andre derivater ( Figur 2D -2F og 2D '- 2F ').
  7. Last inn og kjør funksjonene "koord" og "assmbly.coord" (L74-163), først for å trekke ut plasseringen av bakre (T3) og fremre (T2) kanter av pigmentbåndet ( Figur 2D og 2D ';) Og den bakre kanten av a2 kutikulaen (T 1 , Figur 2D og 2D '), og deretter ekstrahere de maksimale (P max ) og minimale (P min ) pigmenteringsverdier, tatt ved henholdsvis T 3 og T 1 .
    MERK: Den fremre kanten av a2-kutikken er allerede definert i trinn 5.9.
  8. Valgfritt: Legg inn og kjør funksjonen "chek" (L165-175) for å sjekke om "koord" -funksjonen er korrekt å identifisere posisjoner T 1-3 for en tilfeldig valgt pigmenteringsprofil.
  9. Last inn og kjør indeks- og beregningsfunksjonene (L178-193) for å generere en datatabell med overskriftene "Session", "Sample", "Tergite", "id" (en sammenstilling av Sample og Tergite), "P max " "P min ", "W- bånd " (bredden av pigmentbåndet , = T3 - T2) og "W- tergitt " (bredden av pigmentert cUtikler a2-a5, = T3).
  10. Last inn og kjør "korreksjon" -funksjonen (L196-234) for å generere en datatabell som korrigerer P max og P min for eventuelle generfaktorer som oppstår på grunn av økt effekter. Bruk den gjennomsnittlige økningen (eller reduksjonen) i P max eller P min fra kontrollprøverne som er tatt opp på tvers av tidsmessig tilstøtende økter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen ble brukt til å undersøke effekten av oppdrettstemperatur på abdominal pigmentering. Tidligere studier har vist at en økning i utviklingstemperaturen resulterer i en reduksjon av spredningen av abdominalpigmentering hos flere arter Drosophila , inkludert D. melanogaster 30 , 32 . Spesielt i dimma-tergittene 3 og 4 reduseres omfanget av pigmentering (bredden av pigmentbåndet) fra 17 ° C til 25 ° C og forblir det samme fra 25 ° C til 28 ° C 24 , 36 . Disse studiene scoret omfanget av pigmentering på en 1-10 skala (0: nei pigmentbånd, tergitt helt gul; 5: pigmentbånd opptar 50% av tergitt; 10: tergitt helt mørkt). For å fastslå om den kvantitative metoden kunne fange denne fenotypiske plasticitet ble pigmenteringen målt i thE tredje og fjerde abdominal tergitt av en isogen linje av tilsynelatende wildtype kvinnelige fluer, oppdret fra egg til voksen ved 17 ° C (syv fluer), 25 ° C (ni fluer) og 28 ° C (ni fluer). For å fastslå effektiviteten av korreksjonsprosedyren ved å fjerne overbelastningsfaktorer introdusert av økeseffekter ble pigmenteringen av de samme fluene gjentatt og ommålt en, to, fire og åtte dager senere. Lysforholdene og eksponeringen mellom øktene ble imidlertid med hensikt endret for å sikre at det var økt effekt for korrigeringsprosedyren å fjerne. Bildene er lagt ut på Dryad digitale arkiv.

Det første spørsmålet var om det var systematiske forskjeller i pigmenteringsforanstaltninger på tvers av øktene. Dette ble undersøkt ved hjelp av lme4- pakken i R 48 for å passe de blandede modellene M ijk = S i + A j +Ε ijk og M ij = A j + ε ij til både P max og P min , hvor M er pigmentmålet, S er økten (tilfeldig effekt), A er abdominal tergitt målt (tilfeldig effekt), og e er Restfeilen (abonnementene er nivåer innenfor variabler). En logglikelihood ratio test ble brukt til å teste om inkluderingen av økt som en tilfeldig faktor signifikant forbedret passformen; Det gjorde det ( tabell 1 ). Som forventet viste undersøkelsen av variansekomponentene (generert gjennom REML 48 ) at variasjon på grunn av økt effekt utgjorde 67% og 70% av den totale variansen i henholdsvis Pmax og Pmin ( Tabell 1 ).

Femten tilfeldig utvalgte kontrolltergitter (enten tredje eller fjerde, fra fluer reaRød ved 17 ° C, 25 ° C eller 28 ° C) ble valgt, og endringer i deres gjennomsnittlige P max og P min ble brukt til å korrigere pigmenteringsmålinger av de resterende tergittene på tvers av øktene. Gjentatt analysen av de korrigerte pigmenteringsmålingene eliminert sesjonseffekter ( tabell 1 ) og reduserte prosentandelen av totalvariasjon på grunn av økt effekt til null. Resteringsfeilen er et estimat, en målefeil etter at økteffekter er fjernet, og var 22% og 27% for henholdsvis Pmax og Pmin ( Tabell 1 )

Deretter ble de korrigerte dataene brukt til å bestemme om effekten av temperatur på forskjellige sider av pigmentering og størrelse kunne påvises. Den blandede modellen M ijkm = T i * D j + X k + ε ijkm ble montert på dataene, hvor T D er tergitt (tredje eller fjerde), og X er den enkelte fly (tilfeldig faktor). Fordi forholdet mellom pigmentering og temperatur ikke er lineært 24 , 36 , ble T behandlet som en kategorisk faktor. Maksimum og minimum pigmenteringsnivåer ( P max og P min ) og bredden av pigmentbåndet og tergittet ( W- bånd og W- tergitt ) ble testet. Effekten av temperatur på den relative bredden av pigmentbåndet ( R- band = W- band / W- tergitt ) ble også testet. Dataene viste at den absolutte (W- bånd ) og relative ( R- båndbredden) av pigmentbåndet ble redusert fra 17 ° C til 25 ° C (Tukey post-hoc test, P <0,05 for alle) og endret ikke signifikant fra 25 ° C til 28 ° C (Tukey post-hoc test, Tabell 2 , Figur 3A og 3B ), som er i overensstemmelse med tidligere studier 24 , 36 . Det samme mønster ble observert for maksimalt og minimalt nivå av pigmentering, Pmax og Pmin ( Tabell 2 , Figur 3C ). Effekten av temperatur på pigmenteringsnivået har ikke blitt beskrevet før, men det ser utgangspunktet sammen med andre studier som viser at minimumsnivået for pigmentering i fjerde buketergitt er positivt korrelert med bredden av pigmentbåndet i villtypepopulasjoner 39 . Imidlertid, mens dataene fra denne studien indikerer et positivt forhold mellom P max og W- bånd , viser de et negativt forhold mellom P min og W båndet( Tabell 3 ). Denne forskjellen mellom dagens og tidligere studier kan gjenspeile forskjeller i hvordan genetiske og miljømessige faktorer påvirker korrelasjonen mellom nivået og omfanget av abdominal pigmentering. Ikke desto mindre viser disse representative resultatene at protokollen ikke bare kan identifisere pigmenteringsmønster som tidligere ble etablert gjennom kvalitative metoder, men også å avsløre nye som kvalitative metoder ikke kan oppdage.

Effekten av temperatur på tergittets bredde var mer kompleks. I D. melanogaster faller kropps- og organstørrelse ikke lineært med temperatur 49 . Tidligere studier tyder på at bredden på den femte buketergiten minker med 10% fra 16,5 ° C til 25 ° C, og ytterligere 4% fra 25 ° C til 29 ° C 50 . Mens det var en ikke-signifikant reduksjon i bredden påDen fjerde abdominal tergitt fra 17 ° C til 25 ° C økte både den tredje og fjerde buk tergitt i bredde fra 25 ° C til 28 ° C ( Tabell 2 , Figur 3D ). Siden bredden av buk-tergittene er i hovedsak definert av brukeren (trinnene 5.9-5.10 i protokollen), er forskjellen mellom nåværende og tidligere studier usannsynlig å være på grunn av måten R- skriptet trekker ut W tergitt fra pigmenteringsprofilen. Snarere kan det gjenspeile forskjeller på måten som magesegmentet måles på, i flygens genotyper, og i de nøyaktige aspektene av buk-tergittene som måles.

Det neste spørsmålet var om metoden kunne generere data som er sammenlignbare med data samlet inn ved hjelp av eksisterende vurderinger av pigmentering. Disse metodene ber vanligvis observatøren å subjektivt tildele hver fly til en av en finDet er antall fenotypiske klasser basert på omfanget av pigmentering 15 , 30 , 32 , 33 , 34 og er derfor avhengig av observatørens evne til å vurdere bredden av pigmentbåndet. For å teste hvor godt denne objektive metoden sammenlignet med subjektive metoder, ble fem observatører bedt om å rangere 45 bilder av kvinnelige abdomener basert på bredden av pigmentbåndet i den fjerde buketergiten. Gjennomsnittlig rangering på tvers av observatører ble sammenlignet med rangeringen basert på W- bånd , målt ved hjelp av denne metoden. Det var en sterk sammenheng mellom subjektive og objektive rangeringer ( Supplementary Figure 1 , i Supplementary Information.pdf), Spearmen's = 0.7342, P <0,0001).

Et annet spørsmål stodVar hvordan denne metoden for å trekke ut W- bånd fra pigmenteringsspline sammenlignet med å måle bredden av pigmentbåndet for hånd (visuell metode) ved hjelp av det lineære måleverktøyet i ImageJ . Igjen ble det funnet en sterk korrelasjon mellom data innsamlet ved hjelp av de to metodene ( tilleggs figur 2 , i tilleggsinformasjon.pdf, OLS, r2 = 0,49 , P <0,0001). Selv om beregningsmetoden måler pigmentbåndet på samme måte som smalere enn i den "visuelle" metoden, var regresjonskoeffisienten ikke signifikant forskjellig fra 1 ( P> 0,05).

Det endelige spørsmålet var om denne metoden kunne brukes til å måle abdominal pigmentering i andre sammenhenger. Metoden kunne trekke ut P max , P min , W bånd og W tergitt for fIfth og sjette buk tergitt hos kvinner og den tredje og fjerde buk tergitt hos menn ( figur 4 ). Videre kan metoden brukes til å kvantifisere økningen i P max og P min i fluer mutant for ebenholt ( e 1 ), som viser en økning i kutikulær pigmentering over hele kroppen og en spesifikk økning i pigmentering av kutiklet foran pigmentet Bånd 28 ( figur 4 ).

Figur 1
Figur 1: Abdominal pigmentering i D. melanogaster . ( A - F ) Variasjon i abdominal pigmentering hos kvinner av to genotyper oppdret ved tre temperaturer (17 ° C, 25 ° C og 28 ° C). A3 og A4 er den tredje og fjerde abdominal tergi Tes, henholdsvis. ( G ) Dorsal abdominal tergitt inneholder et fremre og bakre rom, kun deler av dem er pålitelig synlige i ustrakte buk. Kupéene er videre oppdelt i forskjellige kutikeltyper: a1: ikke-pigmentert, ingen hår; A2: lett pigmentert og hår; A3: lett pigmentert, hår og moderat børste; A4: mørkt pigmentert, hår og moderat børste; A5: mørkt pigmentert, hår og stor børste; A6: ikke-pigmentert og hår; P3: ikke-pigmentert og hår; P2: ikke-pigmentert og ikke hår; Og p1: ikke-pigmentert og tessellert. Pigmentbåndet består av cuticles a4 og a5. Bare pigmenterte kutikler (a2-a5, grønn boks) brukes i analysen. Skalestenger = 200 μm i (AF). Kontrasten av alle bilder er justert for å markere pigmenteringsmønsteret, og bildene er illustrerende. Ujusterte bilder som brukes til å generere de representative resultatene, blir deponert på Dryad Digital Repository..com / files / ftp_upload / 55732 / 55732fig1large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: Bilde- og dataanalyse for kvantifisering av abdominal pigmentering. ( A - F ) og ( A - F ) er for forskjellige prøver og viser hvordan analysen omhandler bilder av forskjellig kvalitet. ( A ) Brukeren definerer først midtlinjen til magen (gul linje), den fremre kanten av tergitten (cyanlinjen), og en linje litt bakre til den bakre kanten av pigmentbåndet (magenta linjen). ImageJ-makroen trekker deretter en linje fra midtpunktet til de fremre og bakre linjene (hvit strekket linje), som den utvider for å danne en avkastning (svart boks) forstørret i ( B ). ( C ) ImageJ makroen da exStrekker gjennomsnittlig pikselverdi langs den fremre og bakre akse av avkastningen. Merk at profilen på dette stadiet leses fra bakre til fremre. ( D - E ) R- makroen konverterer de gjennomsnittlige pikselverdiene til en pigmenteringsverdi, reverserer retningen av pigmenteringsprofilen, passer den med en kubisk spline ( S (x) ) ( D ), og beregner den første ( S (x ) ) ( E ) og andre ( S (x) ) derivat av spline ( F ). Skriptet identifiserer deretter: T 3 , plasseringen av maksimal pigmentering, hvor S (x) overganger fra <0 til> 0, beveger seg fremover fra baksiden av spline; T 2 , posisjonen hvor nedgangen i pigmenteringen er størst og S (x) er maksimal; Og T 1 , posisjonen hvor tergittpigmenteringen er minst og S (x) overganger fra> 0 til <0, flytter anteriorly fRom T 2 ,. Forsiden av den pålitelige synlige tergitt (anterior av kutikkelen a2) er definert av brukeren. (AF) I tilfeller der det første derivatet ikke kan brukes til å finne T 1 , typisk fordi S (x) ikke krysser 0 anteriorly til pigmentbåndet, vil skriptet definere T 1 som posisjonen der S (x) overganger fra> 0 til <0 når du flytter anteriorly fra T 2 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: Effekten av temperatur på forskjellige aspekter av abdominal pigmentering hos kvinnelige D. melanogaster . ( A ) Bredde av pigmentbåndet ( W- band , FIgure 1). ( B ) Pigmentbånd som andel av tergitt ( R- bånd ). ( C ) Maksimum ( P max , øvre linjer) og minimum ( P min , nedre linjer) pigmentering. ( D ) Tergittbredde ( W tergitt ). Poengene er minst kvadratiske midler fra lineære mixed-effect-modeller (tabell 2). Feilbarene representerer standardfeilen og kan være skjult av markørene. Den svarte linjen er tredje abdominal tergitt. Den grå linjen er den fjerde abdominal tergitt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4: Forskjeller i pigmentering mellom tredje og fjerde abdominal tergitt. Dette er vist i ( A ebony 1 kvinner, ( B ) wildtype kvinner, ( C ) wildtype hanner, og den femte og sjette buk tergittene hos wildtype kvinner. ( D ) Maksimal pigmentering, P max . ( E) Minimum pigmentering, P min . ( F ) Bredde av pigmentbåndet, W- bånd . ( G ) Relativ bredde av pigmentbåndet, R- båndet . Barer med forskjellige bokstaver er vesentlig forskjellige (Tukey HSD post-hoc test, P <0,05). N = 6 for alle unntatt ebony 1 , hvor N = 4. Skalestenger = 200 μm i ( A - C ). Feilbarene representerer standardfeilen. Kontrasten av alle bilder er justert for å markere pigmenteringsmønsteret, og bildene er illustrerende. Vennligst cliCk her for å se en større versjon av denne figuren.

<Td> 4,08 (78%)
Modell sammenligning Variantkomponenter (% av totalt)
Pigmenteringstrekk Modell df Log-sannsynligheten X² ligningen (%) ligningen (%) ligningen (%)
P max Ukorrigert M ij = A i + ε ij 3 -678,28 1,94 (14%) 11,86 (86%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -457,95 440,66 *** 4,08 (26%) 10,71 (67%) 1,14 (7%)
P min ukorrigert M ij = A i + ε ij 3 -875,03 6,05 (9%) 59,39 (91%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -664,58 420,91 *** 16,67 (22%) 53,08 (70%) 6,31 (8%)
P max korrigert M ij = A i + ε ij 3 -445,05 1,15 (22%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -444,88 0,3378 4,08 (78%) 0,01 (<1%) 1,14 (22%)
P min rettet M ij = A i + ε ij 3 -649,9 16,67 (73%) 6,24 (27%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -649,9 0 16,67 (73%) 0 6,31 (27%)

Tabell 1: Lineære blandede effektmodeller av effekten av tergitt og økt. Lineære blandede effektmodeller av effekten av tergitt og økt på aBominalpigmentering (Pmax og Pmin) på 50 tergitter målt på nytt over fem økter, med varianskomponenter estimert gjennom REML. Modeller var lineære mixed-effect modeller. M : Pigmenteringsmåling; A : Individuell tergitt målt; S : Session; Ε : Restfeil. Betydende X² vises med fet skrift. * P <0,05. ** p <0,01. *** p <0,001.

Trekk Temperatur Tergite Temperatur
X Tergite
P max F -ratio 8,14 55.59 6.6
P 0,002 <0,001
P min F -ratio 4,41 66.11 6,36
P 0,026 <0,001 0,002
W band F -ratio 113,93 0.01 0,64
P <0,001 0,931 0,531
W tergitt F -ratio 1,79 0,92 5.11
P 0,191 0,338 0,007
R- bånd F -ratio 27,66 0,08 1,46
P <0,001 0,782 0,23

Tabell 2: Effekt av temperatur og tergittidentitet. Effekten av temperatur og tergittidentitet På forskjellige sider av abdominal pigmentering i 50 tergitter ble målt på tvers av fem økter. Modeller var lineære mixed-effect modeller, med individuelle fly inkludert som en tilfeldig faktor. P max : Maksimal pigmentering (korrigert); P min : Minimum pigmentering (korrigert); W- bånd : Bredde av pigmentbånd; W tergitt : Tergittbredden; R- bånd : Relativ bredde av pigmentbånd. Vesentlige faste faktorer er vist i fet skrift ( P < 0,05).

Avskjære W band Temperatur Tergite
17C 25 ° C Tredje
P max β 234,35 0,069 0,063 -1,178 -0,588
F 29,93 5,97 54.82
P <0,001 0,008 <0,001
P min β 223,96 -0,137 3,931 -3,024 -1,54
F 19.33 span = "2"> 9,66 62.02
P <0,001 0,001 <0,001

Tabell 3: Effekt av pigmentbåndbredde, temperatur og tergittidentitet på pigmenteringsnivået. Effekt av pigmentbåndbredde, temperatur og tergittidentitet på pigmenteringsnivået i 50 tergitter, målt på nytt over fem økter. Modeller var lineære mixed-effect modeller, med individuelle fly inkludert som en tilfeldig faktor. P max : Maksimal pigmentering (korrigert); P min : Minimum pigmentering (korrigert); W- bånd : Bredde av pigmentbånd; R- bånd : Relativ bredde av pigmentbånd.

Supplerende fil 1. Supplementaly Information.Y_Information.pdf "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil 2. Analyse av Pigmentation.R script. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende fil 3. Måling av Pigmentation.ijm Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Simulering R Script. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne metoden tillater det presise, raske og repeterbare oppkjøpet av pigmenteringsdata i en kvantitativ form som er egnet for flere nedstrømsanalyser. Metoden har blitt brukt til å erverve data om effekten av temperatur på abdominal pigmentering i en isogen fluørlinje. Metoden kan imidlertid brukes i fremmedsgenetikkstudier for å identifisere gener som ligger til grunn for pigmenteringsforskjeller mellom individer, populasjoner eller arter, eller revers-genetiske studier for å undersøke effekten av bestemte gener på pigmenteringsmønstre. Selv om det som omtalt ovenfor har vært utallige studier som har utforsket utviklingen og utviklingen av D. melanogaster pigmentering, er nøyaktigheten ved hvilken denne metoden fanger pigmenteringsdata i kvantitativ form mulig for mer kraftige statistiske tilnærminger. Dette tillater igjen at forskere bruker færre prøver når de analyserer pigmenteringsmønstre, eller tillater dem å belyse mer subtilAspekter av pigmentering. Videre krever denne metoden ikke disseksjon av flyet, slik at prøven senere kan brukes til ytterligere analyser, som morfologiske målinger eller genotyping. Faktisk kan metoden potensielt brukes på bedøvede fluer, som deretter kan selektivt oppdras basert på deres pigmenteringsegenskaper.

Et potensielt problem med måling av pigmentering gjennom bildeanalyse er at pigmenteringsverdiene kan reflektere eksponeringen og lysforholdene under hvilke et bilde ble tatt, i stedet for selve pigmenteringsnivået. Ved bruk av faste belysningsnivåer bidrar lysposisjoner, forstørrelser og eksponering til å lindre disse problemene. Det er sannsynlig at det fortsatt vil være nødvendig å ta flere gjentatte kontrollbilder i hver økt for å fullt ut kontrollere sessionseffekter. Denne metoden inkluderer å omforme femten kontrollprøver hver sesjon og bruke mellom-øktendringene i P maX og p min for å oppdage og eliminere økt effekter. Det nøyaktige antall kontrollprøver som skal gjenimporteres, vil imidlertid avhenge av bildebehandlingens maskinvare og programvare som brukes, aspektet av pigmentering av interesse for brukeren og hvor variabel det er mellom behandlinger og hvor mange bilder som tas i hver økt. Gjennomføring av et foreløpig eksperiment hvor de samme prøvene blir reimaged over fem økter, vil tillate brukeren å beregne variansen på grunn av økteffekter, variansen på grunn av prøveidentitet og restvariancen (som er et estimat av målefeil etter korrigering For økt effekter) ( Tabell 1 ). Disse verdiene kan da brukes til å estimere hvor mange kontrollbilder som skal tas i hver økt for å oppdage og kontrollere sessionseffekter. Et enkelt R- skript er skrevet og bruker data fra et slikt foreløpig eksperiment for å simulere pigmenteringsmålinger på tvers av øktene. Den kan brukesFor å kontrollere at antall kontrollbilder per økt er tilstrekkelig til å fjerne økteffekter. Dette skriptet er gitt som en tilleggsfil.

Hvis brukerne er bekymret for at det er ubehagsfaktorer i øktene, kan de også reimage det samme prøven flere ganger gjennom hele sesjonen, som beskrevet i John et al., 2016 41 . I dette tilfellet må [sampleID] for enkeltkontrollprøven endres hver gang det blir re-avbildet i en økt ( f.eks . Kontroll1, kontroll2, kontroll3, etc. ); Ellers vil bildebehandlingsprogrammet erstatte det forrige bildet med det nye bildet med samme navn. Korrigeringsfunksjonen baserer sin korreksjon på dupliserte bilder med det samme [sampleID] mellom tidsmessige tilstøtende økter og vil korrigere, om samme prøve blir re-avbildet flere ganger i og mellom økter eller om det samme settet av kontrollprøver blir avbildet mellom øktene. Uansett hvordan thE-kontrollbilder blir tatt, økter bør behandles som blokker, og hvor det er mulig, bør brukerne bruke en randomisert blokkdesign slik at eventuelle øyeffekter som forblir etter korreksjon, kan kontrolleres statistisk for. Hvis dette ikke lykkes, må prøvene tilfeldigvis tildeles økter, slik at økteffekter ikke er forvirret med eksperimentelle faktorer.

Protokollen er basert på generering av en pigmenteringsprofil som representerer endringen i pigmentering over hver tergitt. Et problem med å generere denne profilen er de mørke hårene som dekker bukhinnen, som alltid bies av en anterior-posterior linje som krysser tergitten. Protokollen reduserer støyen som genereres av disse hårene ved å ta pigmenteringsprofilen i gjennomsnitt over et bånd av kutikula. Likevel kan brukerne angi bredden på avkastningen til 1 piksel i trinn 5.6 hvis de ønsker å generere profiler som er basert på en tynn linje av kutikula. Videre kan brukerne analysere tHan samme bilde flere ganger, endrer sidestillingen til pigmenteringsprofilen for å fange endringer i bredden av pigmentbåndet i et segment. I dette tilfellet må brukerne imidlertid kopiere det samme bildet flere ganger og gi hver kopi et unikt navn før du utfører trinn 5.1, siden ImageJ-makroen vil overskrive profiler med samme navn.

Et annet viktig hensyn når du genererer pigmenteringsprofilen er utjevningsparameteren for den kubiske spline, definert i spline.der.er-funksjonen (L63) i Analyse av Pigmentering R- skriptet. Den riktige utjevningsparameteren avhenger av bildeoppsettet og oppløsningen. Overmating av en profil kan føre til tap av egenskapene til splineprofilen som brukes til å beregne koordinatene til T 1 , T 2 og T 3 ( Figur 2D og 2D '). Omvendt øker underjevningenStøy av profilen og følgelig nøyaktigheten av koordinatekstraksjonene. Chek- funksjonen gir et grafisk sammendrag av spline og dets derivater, og kan brukes som en visuell signal for å velge en passende utjevningsparameter.

Metoden som beskrives her fokuserer på å fange data om pigmenteringen av den tredje og fjerde abdominal tergitt hos kvinnelige og mannlige D. melanogaster . Imidlertid viser de representative resultatene at det også kan brukes til å måle pigmenteringen av femte og sjette buk segmentene av kvinner. Videre kan metoden oppdage forskjeller i fenotype forårsaket av mutanter av gener som påvirker pigmentering. ImageJ makro- og R- skriptene kan enkelt modifiseres for å måle pigmentering i abdomene av forskjellige D. melanogaster- arter, eller til og med pigmentering av andre kroppsdeler i andre taxa, forutsatt at pigmenteringsmønsteret er stereotypisk. Til slutt, metodikkenKan også tilpasses til å måle aspekter av pigmenteringsfarge ved å ta bilder i RGB og analysere hver kanal separat.

Generelt er denne metoden en del av fremveksten av fenomikk 51 , 52 . Målet med fenomikk er å generere og analysere store flerdimensjonale fenotypiske datasett for bedre å forstå de genetiske og miljømessige interaksjonene som påvirker fenotype, inkludert sykdom, og hvordan disse interaksjonene utvikler seg for å generere biologisk mangfold. For fenomikk for å oppfylle sitt potensial, må metodene for å skaffe fenotypiske data være grei og enkelt tilpasset forskjellige fenotyper, så vel som fritt tilgjengelige. Ved hjelp av åpen programvare for å analysere bilder tatt med standardutstyr, bidrar denne metoden til å nå dette målet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av National Science Foundation tildeler IOS-1256565 og IOS-1557638 til AWS. Vi takker Patricia Wittkopp og tre anonyme anmeldere for deres nyttige kommentarer til en tidligere versjon av dette papiret.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 Biology Forceps FST 11252-30
Agar Sigma-Aldrich 5040
Dissecting Scope Leica MZ16FA
Base Leica MDG41
Camera Leica DFC280
Gooseneck Cold Light Source Schott ACE 1
Image Acquisition Control Software Micro-Manager v1.3.20 https://micro-manager.org/
Image Analysis Software ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/
Data Analysis Software R 3.3.2 https://www.r-project.org/
LED Thor Labs LEDWE-15
Multimeter Fluke Fluke 75 Series II
60 mm x 15 mm Petri dish Celltreat Scientific Products 229663
Stage micrometer Klarman Rulings, Inc. KR-867

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wittkopp, P. J., Beldade, P. Development and evolution of insect pigmentation: Genetic mechanisms and the potential consequences of pleiotropy. Semin. Cell Dev. Biol. 20 (1), 65-71 (2009).
  2. Lindgren, J. Interpreting melanin-based coloration through deep time: a critical review. Proc Roy Soc B-Biol Sci. 282 (1813), (2015).
  3. Kronforst, M. R., Papa, R. The Functional Basis of Wing Patterning in Heliconius Butterflies: The Molecules Behind Mimicry. Genetics. 200 (1), 1-19 (2015).
  4. Albert, N. W., Davies, K. M., Schwinn, K. E. Gene regulation networks generate diverse pigmentation patterns in plants. Plant Signal Behav. 9, e29526 (2014).
  5. Monteiro, A. Origin, development, and evolution of butterfly eyespots. Annu Rev Entomol. 60, 253-271 (2015).
  6. Kronforst, M. R. Unraveling the thread of nature's tapestry: the genetics of diversity and convergence in animal pigmentation. Pigm Cell Melanoma Res. 25 (4), 411-433 (2012).
  7. Wright, T. R. The genetics of biogenic amine metabolism, sclerotization, and melanization in Drosophila melanogaster. Adv Genet. 24, 127-222 (1987).
  8. True, J. R. Insect melanism: the molecules matter. TREE. 18 (12), 640-647 (2003).
  9. Kopp, A., Duncan, I. Control of cell fate and polarity in the adult abdominal segments of Drosophila by optomotor-blind. Development. 124 (19), 3715-3726 (1997).
  10. Kopp, A., Muskavitch, M. A., Duncan, I. The roles of hedgehog and engrailed in patterning adult abdominal segments of Drosophila. Development. 124 (19), 3703-3714 (1997).
  11. Kopp, A., Blackman, R. K., Duncan, I. Wingless, decapentaplegic and EGF receptor signaling pathways interact to specify dorso-ventral pattern in the adult abdomen of Drosophila. Development. 126 (16), 3495-3507 (1999).
  12. Kopp, A., Duncan, I., Godt, D., Carroll, S. B. Genetic control and evolution of sexually dimorphic characters in Drosophila. Nature. 408 (6812), 553-559 (2000).
  13. Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134 (4), 610-623 (2008).
  14. Wittkopp, P. J., Williams, B. L., Selegue, J. E., Carroll, S. B. Drosophila pigmentation evolution: divergent genotypes underlying convergent phenotypes. Proc Natl Acad Sci Usa. 100 (4), 1808-1813 (2003).
  15. Brisson, J. A., De Toni, D. C., Duncan, I., Templeton, A. R. Abdominal pigmentation variation in drosophila polymorpha: geographic variation in the trait, and underlying phylogeography. Evolution. 59 (5), 1046-1059 (2005).
  16. Brisson, J. A., Templeton, A. R., Duncan, I. Population genetics of the developmental gene optomotor-blind (omb) in Drosophila polymorpha: evidence for a role in abdominal pigmentation variation. Genetics. 168 (4), 1999-2010 (2004).
  17. Dembeck, L. M. Genetic Architecture of Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 11 (5), e1005163 (2015).
  18. Drapeau, M. D., Radovic, A., Wittkopp, P. J., Long, A. D. A gene necessary for normal male courtship, yellow, acts downstream of fruitless in the Drosophila melanogaster larval brain. J Neurobiol. 55 (1), 53-72 (2003).
  19. Hodgetts, R. B., O'Keefe, S. L. Dopa decarboxylase: a model gene-enzyme system for studying development, behavior, and systematics. Annu Rev Entomol. 51, 259-284 (2006).
  20. Marmaras, V. J., Charalambidis, N. D., Zervas, C. G. Immune response in insects: the role of phenoloxidase in defense reactions in relation to melanization and sclerotization. Arch Insect Biochem Physiol. 31 (2), 119-133 (1996).
  21. Kalmus, H. The Resistance to Desiccation of Drosophila Mutants Affecting Body Colour. Proc Roy Soc London B. 130 (859), 185-201 (1941).
  22. Rajpurohit, S., Gibbs, A. G. Selection for abdominal tergite pigmentation and correlated responses in the trident: a case study in Drosophila melanogaster. Biol J Linn Soc. 106 (2), 287-294 (2012).
  23. Pool, J. E., Aquadro, C. F. The genetic basis of adaptive pigmentation variation in Drosophila melanogaster. Mol Ecol. 16 (14), 2844-2851 (2007).
  24. Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Developmental constraints on an adaptive plasticity: reaction norms of pigmentation in adult segments of Drosophila melanogaster. Evol Dev. 2 (5), 249-260 (2000).
  25. Shakhmantsir, I., Massad, N. L., Kennell, J. A. Regulation of cuticle pigmentation in drosophila by the nutrient sensing insulin and TOR signaling pathways. Dev Dyn. 243 (3), 393-401 (2014).
  26. Struhl, G., Barbash, D. A., Lawrence, P. A. Hedgehog organises the pattern and polarity of epidermal cells in the Drosophila abdomen. Development. 124 (11), 2143-2154 (1997).
  27. Jeong, S., Rokas, A., Carroll, S. B. Regulation of body pigmentation by the Abdominal-B Hox protein and its gain and loss in Drosophila evolution. Cell. 125 (7), 1387-1399 (2006).
  28. Wittkopp, P. J., True, J. R., Carroll, S. B. Reciprocal functions of the Drosophila yellow and ebony proteins in the development and evolution of pigment patterns. Development. 129 (8), 1849-1858 (2002).
  29. True, J. R. Drosophila tan encodes a novel hydrolase required in pigmentation and vision. PLoS Genet. 1 (5), e63 (2005).
  30. David, J. R., Capy, P., Gauthier, J. P. Abdominal pigmentation and growth temperature in Drosophila melanogaster: Similarities and differences in the norms of reaction of successive segments. J Evol Biol. 3 (5-6), (1990).
  31. Gibert, J. M., Peronnet, F., Schlotterer, C. Phenotypic plasticity in Drosophila pigmentation caused by temperature sensitivity of a chromatin regulator network . PLoS Genet. 3 (2), e30 (2007).
  32. Gibert, P., Moreteau, B., Scheiner, S. M. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila: correlated variations between segments. Genet Sel Evol. 30 (2), 181 (1998).
  33. Matute, D. R., Harris, A. The influence of abdominal pigmentation on desiccation and ultraviolet resistance in two species of Drosophila. Evolution. 67 (8), 2451-2460 (2013).
  34. Das, A., Mohanty, S., Parida, B. Abdominal pigmentation and growth temperature in Indian Drosophila melanogaster: Evidence for genotype-environment interaction. J Biosci. 19 (2), 267-275 (1994).
  35. Hollocher, H., Hatcher, J. L., Dyreson, E. G. Evolution of abdominal pigmentation differences across species in the Drosophila dunni subgroup. Evolution. 54 (6), 2046-2056 (2000).
  36. Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila melanogaster: genetic repeatability of quantitative parameters in two successive generations. Heredity. 92 (6), 499-507 (2004).
  37. Carbone, M. A., Llopart, A., deAngelis, M., Coyne, J. A., Mackay, T. F. Quantitative trait loci affecting the difference in pigmentation between Drosophila yakuba and D. santomea. Genetics. 171, 211-225 (2005).
  38. Kopp, A., Graze, R. M., Xu, S., Carroll, S. B., Nuzhdin, S. V. Quantitative trait loci responsible for variation in sexually dimorphic traits in Drosophila melanogaster. Genetics. 163 (2), 771-787 (2003).
  39. Bastide, H., Yassin, A., Johanning, E. J., Pool, J. E. Pigmentation in Drosophila melanogaster reaches its maximum in Ethiopia and correlates most strongly with ultra-violet radiation in sub-Saharan Africa. BMC Evol Biol. 14, 179 (2014).
  40. Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326 (5960), 1663-1667 (2009).
  41. John, A. V., Sramkoski, L. L., Walker, E. A., Cooley, A. M., Wittkopp, P. J. Sensitivity of Allelic Divergence to Genomic Position: Lessons from the Drosophila tan Gene. G3. 6 (9), 2955-2962 (2016).
  42. Wittkopp, P. J. Local adaptation for body color in Drosophila americana. Heredity. 106 (4), 592-602 (2011).
  43. Wittkopp, P. J. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
  44. Edelstein, A. D. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), e10 (2014).
  45. U. S. National Institutes of Health. ImageJ v.1.50i. , Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2016).
  46. Mims, F. M. How to Use LEDs to Detect Light. Make:. 36, 136-138 (2013).
  47. R: Language and Environment for Statistical Computing v.3.3.2. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: https://www.r-project.org/ (2016).
  48. Bates, D., Machler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting Linear Mixed-Effects Models Using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
  49. Shingleton, A. W., Estep, C. M., Driscoll, M. V., Dworkin, I. Many ways to be small: different environmental regulators of size generate distinct scaling relationships in Drosophila melanogaster. Proc Roy Soc Lond B Biol Sci. 276 (1667), 2625-2633 (2009).
  50. French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
  51. Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nat Rev Genet. 11 (12), 855-866 (2010).
  52. Kültz, D. New frontiers for organismal biology. BioSci. 63 (6), 464-471 (2013).

Tags

Genetikk utgave 124 pigmentering Drosophila fenotypisk variasjon mikroskopi digital bildeanalyse fenomics
Kvantifiserende abdominal pigmentering i<em&gt; Drosophila melanogaster</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saleh Ziabari, O., Shingleton, A. W. … More

Saleh Ziabari, O., Shingleton, A. W. Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (124), e55732, doi:10.3791/55732 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter