Summary
Este trabalho apresenta um método para quantificar rápida e precisamente a pigmentação abdominal de Drosophila melanogaster usando a análise de imagem digital. Este método simplifica os procedimentos entre aquisição de fenótipo e análise de dados e inclui montagem de espécimes, aquisição de imagem, extração de valor de pixel e medição de características.
Abstract
A pigmentação é uma característica morfologicamente simples, mas altamente variável que muitas vezes tem significância adaptativa. Ele serviu extensivamente como um modelo para a compreensão do desenvolvimento e evolução de fenótipos morfológicos. A pigmentação abdominal na Drosophila melanogaster tem sido particularmente útil, permitindo que os pesquisadores identifiquem os loci subjacentes às variações inter-e intraspecíficas da morfologia. Até agora, no entanto, a pigmentação abdominal de D. melanogaster tem sido amplamente testada qualitativamente, através da pontuação, em vez de quantitativamente, o que limita as formas de análise estatística que podem ser aplicadas aos dados de pigmentação. Este trabalho descreve uma nova metodologia que permite a quantificação de vários aspectos do padrão de pigmentação abdominal de D. melanogaster adulta . O protocolo inclui montagem de amostras, captura de imagem, extração de dados e análise. Todo o software usado para captura e análise de imagens tem macrosEscrito para análise de imagens de código aberto. A vantagem dessa abordagem é a capacidade de medir precisamente os traços de pigmentação usando uma metodologia que é altamente reprodutível em diferentes sistemas de imagem. Embora a técnica tenha sido usada para medir a variação nos padrões de pigmentação tergal do adulto D. melanogaster , a metodologia é flexível e amplamente aplicável aos padrões de pigmentação em inúmeros organismos diferentes.
Introduction
A pigmentação mostra uma enorme variação fenotípica entre espécies, populações e indivíduos, e mesmo dentro de indivíduos durante a ontogenia 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Embora existam inúmeros estudos de pigmentação em uma grande variedade de animais, a pigmentação talvez tenha sido melhor estudada em Drosophila melanogaster , onde o poder total da genética molecular tem sido utilizado para elucidar os mecanismos de desenvolvimento e fisiologia que regulam a pigmentação e como esses mecanismos evoluem 1 , 6 . Sabe-se muito sobre os genes que regulam a síntese bioquímica de pigmentos em D. melanogaster 7 , 8 e os genes que controlam o diário temporal e espacialAtribuição desta biossíntese 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Além disso, o mapeamento genético identificou os loci genéticos subjacentes às diferenças intra e interespecíficas na pigmentação em D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 . As relações entre pigmentação e traços pleiotrópicos, como o comportamento 18 , 19 e a imunidade 19 , 20 , também foram exploradas, assim como o significado adaptativo dos padrões de pigmentação 15 , 21 , 22 . Como tal, a pigmentação em D. melanogaster emergiu como um poderoso e simples mOdel para o desenvolvimento e evolução de fenótipos complexos.
A pigmentação no adulto D. melanogaster é caracterizada por padrões distintos de melanização em todo o corpo, particularmente nas asas e tórax dorsal e abdômen. É a pigmentação de cada placa cuticular (tergita) no abdômen dorsal, no entanto, que recebeu a maior atenção na pesquisa. Existe uma variação considerável nesta pigmentação ( Figura 1A- F ), por causa de fatores genéticos 17 , 23 e ambientais 24 , 25 . A cutícula de um tergito abdominal é constituída por compartimentos de desenvolvimento anteriores e posteriores ( Figura 1G ), cada um dos quais pode ser subdividido em função da pigmentação e ornamentação 26 . O compartimento anterior inclui seis cutículasTipos (a1-a6), e o compartimento posterior inclui três (p1-p3) ( Figura 1G ). Destes, a cutícula p1, p2 e a1 são tipicamente dobradas sob o tergito em abdômen não esticado, de modo que estejam escondidas. A cutícula fecamente visível é caracterizada por uma banda de pigmentação pesada, aqui referida como uma "faixa de pigmento", composta de tipos de cutícula a4 (cabeludo com cerdas moderadas) e a5 (cabeludo com cerdas largas), com a borda posterior da banda Mais intensamente pigmentado do que a borda anterior ( Figura 1G ). Anterior a essa faixa é uma região de cutícula peluda ligeiramente pigmentada, que tem cerdas posterior (a3) mas não anteriormente (a2). A variação na pigmentação entre as moscas é observada na intensidade da pigmentação e na largura da banda de pigmento. Em geral, a variação é maior nos segmentos mais posteriores (segmentos abdominais 5, 6 e 7) e é menor nos segmentos mais anteriores (ponto abdominalGentios 3 e 4) 24 . Além disso, há um dimorfismo sexual na pigmentação de D. melanogaster , com os machos geralmente tendo quinto e sexto tergitos abdominal totalmente pigmentados ( Figura 4C ).
Na maioria dos estudos de pigmentação abdominal em D. melanogaster , a pigmentação foi tratada como uma característica categórica ou ordinal, com o padrão medido 27 , 28 , 29 ou semi-quantitativamente na escala 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 31 , 32 , 33 , 34 , 3536 , 37 . Esses métodos inevitavelmente sofrem de uma falta de precisão, e porque eles dependem da avaliação subjetiva da pigmentação, é difícil comparar os dados entre os estudos. Vários autores quantificaram as dimensões espaciais da pigmentação 38 , 39 , a intensidade da pigmentação de um tipo de cutícula particular 23 , 25 , 39 , 40 ou a intensidade média de pigmentação em todo o tergito abdominal como um todo 41 , 42 , 43 . No entanto, esses métodos de quantificação não medem simultaneamente a intensidade e a distribuição espacial da pigmentação abdominal e, portanto, não captam as nuances de como a pigmentação varia no abd.Tergito ominal. Além disso, vários desses métodos de quantificação 38 , 41 , 42 , 43 exigem a dissecção e a montagem da cutícula abdominal. Isso é demorado e destrói a amostra, tornando-a indisponível para análises morfológicas adicionais. À medida que a compreensão do desenvolvimento e evolução da pigmentação abdominal se aprofunda, serão necessárias ferramentas mais sofisticadas para medir rápida e precisamente a distribuição espacial e a intensidade da pigmentação.
O objetivo geral deste método é utilizar a análise de imagem digital para obter uma medida replicável e precisa da pigmentação abdominal em D. melanogaster . A metodologia inclui três estágios. Primeiro, a mosca adulta é montada de forma não destrutiva, e uma imagem digital do abdômen dorsal é tomada. Em segundo lugar, usando uma macro ImageJ, o usuárioDefine uma faixa de pixels anterio-posterior que se estende desde a parte anterior da cutícula a2 até a parte posterior da cutícula a5 (caixa verde, Figura 1G ) tanto no terceiro como no quarto segmentos abdominais. O valor médio de pixels em toda a largura desta tira é então extraído ao longo de seu eixo longo, gerando um perfil que capta a distribuição espacial e a intensidade da pigmentação à medida que ela muda da anterior para a posterior do tergito. Em terceiro lugar, um roteiro R é usado para descrever o perfil de pigmentação matematicamente usando um spline cúbico. O roteiro R então usa o spline e sua primeira e segunda derivada para extrair a largura da cutícula a2-a5, a largura da faixa de pigmento e os níveis máximo e mínimo de pigmentação. O método, portanto, quantifica as características espaciais e a profundidade da pigmentação abdominal.
Esta metodologia quantifica a pigmentação do terço e quarto tergitos abdominais,Que tem sido o foco de numerosos estudos anteriores 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , exclusivamente ou em combinação com mais tergitos posteriores. Embora menos variável do que o quinto e sexto tergitos abdominais, o terceiro e o quarto tergitos não são completamente pigmentados em machos, pelo que este protocolo pode ser aplicado tanto aos machos como às fêmeas. No entanto, como mostrado aqui, o protocolo pode ser usado para medir a pigmentação no quinto e sexto tergitos abdominais em fêmeas. Além disso, modificações menores dos scripts utilizados para extrair as características do perfil de pigmentação devem permitir que o método seja usado para quantificar a variação na pigmentação em uma grande variedade de outrosOrganismos.
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Protocol
1. Montagem da amostra
NOTA: Armazene as moscas mortas em etanol a 70% na água antes da imagem.
- Despeje 10 mL de agar 1,25% dissolvido em água fervente em uma placa de Petri de 60 mm x 15 mm e deixe-o ajustar.
- Sob um microscópio de dissecação, use um par de pinças de ponto fino para criar um sulco de aproximadamente 20 mm de largura, 2 mm de largura e 1 mm de profundidade na superfície do gel. Usando pinças finas, incorpora o lado ventral de uma mosca adulta no sulco, com o lado dorsal da mosca projetando acima do gel.
NOTA: A folga do gel permite um fácil reposicionamento sem danificar a amostra. O mesmo sulco pode ser usado para vários espécimes, embora ele se torne sujo, quebrado e inutilizável com o tempo. O usuário pode fazer outro sulco no mesmo gel. Cada placa pode ser usada para imagens ~ 200 moscas. - Cubra completamente o espécime em etanol a 70% em água para reduzir quaisquer reflexos de luz da cutícula cerosa e para evitar danos nas asas durManipulação de espécimes.
2. Configuração do microscópio
NOTA: As imagens são adquiridas usando um escopo de dissecação, uma base de luz transmitida, uma câmera digital e uma fonte de luz fria de colo de ganso anexada a um computador que executa o software de controle de aquisição de imagens. As instruções de software são específicas do Micro-Manager v1.4.20 44 , que é um software de código aberto que incorpora o ImageJ 45 .
- Ligue o microscópio, câmera digital, fonte de luz fria de gooseneck e computador.
- Execute o software de captura de imagem para abrir uma janela Micro-Manager e uma janela ImageJ. Na janela ImageJ, clique em "Imagem"> "Tipo"> "8 bits" para configurar todas as imagens como 8 bits. Clique em "live" na janela Micro-Manager para abrir uma janela "Snap / Live" que mostra uma pré-visualização em tempo real da câmera.
- Maximize o tamanho da janela "Snap / Live" se neCessary. Selecione "Escala de cinza" no menu suspenso "Modo de exibição" na guia "Contraste" da janela Micro-Manager.
- Ligue a fonte de luz fria a sua intensidade máxima e posicione as pontas de cada colar de ganso até aproximadamente 120 mm do palco, um à esquerda e um à direita.
NOTA: Os usuários também podem usar um iluminador anular, embora isso possa gerar um anel de luz refletida em torno do abdômen da mosca. - Ajuste manualmente a ampliação do microscópio para 60X, de modo que o campo de visão capture uma área de aproximadamente 3 mm de diâmetro no palco.
- Coloque um micrómetro de estágio de 2 mm no palco (alterando o fundo para o branco, se necessário). Ao olhar para a visualização ao vivo, concentre-se no micômetro do palco e ajuste a exposição na janela do Micro-Manager, digitando o tempo de exposição em ms na caixa "Exposição".
- Para calibrar espacialmente a câmera, selecione a ferramenta "linha reta" em tEle ImageJ janela e desenhar uma linha do comprimento do micrômetro do palco. Na janela ImageJ, clique em "Analisar"> "Definir Escala" para abrir a janela "Definir Escala", digite o comprimento do micômetro em μm na caixa "Distância conhecida" e digite "μm" na "Unidade de comprimento" caixa.
- Veja que a janela "Set Scale", em seguida, exibe a escala em "pixels / μm". Anote a escala e clique em "OK".
- Na janela "Snap / Live", clique em "Parar" e depois em "Snap" para capturar uma imagem do micrómetro do estágio.
- Salve a imagem como um TIFF em escala de cinza de 8 bits para garantir a capacidade de calibrar espacialmente as imagens novamente, se necessário. Na janela ImageJ, clique em "Arquivo"> "Salvar como"> "Tiff ..." Especifique onde salvar o arquivo no navegador de arquivos, nomeie o arquivo e clique em "Salvar".
- Mude o palco para preto e coloqueUma placa de Petri que contém uma mosca montada em ágar (etapas 1.1-1.2) no palco.
- Olhe através do microscópio e posicione a mosca para garantir que a linha média dorsal seja direta para melhor visualizar o padrão de pigmentação. Mova as asas e os apêndices para garantir que a visão do abdome seja desobstruída. Se a cutícula pigmentada (a2-a5) não estiver visível, aperte o abdômen lateralmente até que esteja (embora o abdômen das moscas seja armazenado em etanol a 70% na água, de modo que isso geralmente não seja necessário).
NOTA: Ao posicionar a mosca, o usuário pode precisar usar uma ampliação menor (20X). A ampliação deve ser retornada para 60X antes de prosseguir. - Focalize manualmente o abdômen dorsal da mosca. Ajuste manualmente as pontas da fonte de luz para minimizar as sombras e a reflexão no abdômen dorsal.
- Ao olhar para a visualização ao vivo na tela do computador, e usando o histograma do valor do pixel na guia "Contraste" da janela Micro-Manager,Ajuste a exposição conforme descrito na etapa 2.4 para maximizar o alcance dos valores de pixel da imagem de pré-visualização.
- Remova a mosca e a placa de Petri e substitua-os por um LED (saída espectral de 430-660 nm) conectado a um medidor de tensão, centrado no campo de visão na mesma posição que a mosca. Use o LED e o medidor de tensão como um medidor de luz 46 e grave a tensão gerada pela luz que atinge o LED (~ 125 mV).
NOTA: O LED e o medidor de tensão são usados para garantir que os níveis de luz sejam constantes em várias sessões de imagem dentro de uma única experiência. - Durante a duração da experiência, não altere ainda mais a posição ou intensidade da fonte de luz, a ampliação do microscópio ou a exposição da câmera.
3. Imagem de amostra
- Coloque uma placa de Petri segurando uma mosca montada em ágar (passos 1.1-1.3) no estágio do microscópio preto. Ajuste a posição da mosca para que o terceiro e o quatroH são visíveis os segmentos abdominais e a linha média dorsal é direta, conforme descrito no passo 2.9. Certifique-se de que a ampliação seja de 60x antes de prosseguir.
- Focalize manualmente o microscópio de modo que o terço e o quarto tergito abdominal dorsal estejam focados. Use o software de captura de imagem para adquirir uma imagem como um TIFF de escala de cinza de 8 bits, conforme descrito no passo 2.6.
NOTA: A imagem pode ser capturada em cores e posteriormente convertida em escala de cinza para análise. - Salve a imagem como "SESH000_sampleID.tiff", conforme descrito no passo 2.7.
NOTA: Aqui, [SESH] é constante, [000] é o número da sessão e é variável, mas deve ter três dígitos e [sampleID] é o que o usuário deseja, embora não contenha caracteres de sublinhado adicionais (_) e Deve ter um comprimento constante. [SampleID] deve incluir detalhes dos fatores utilizados na análise dos dados de pigmentação ( por exemplo, temperatura ou linhagem), separados por um distintivo não alfabéticoCaracterístico, como um hífen (-). Isso permite que esses fatores sejam facilmente analisados em [sampleID] usando o software estatístico padrão. - Retire a placa de Petri do palco e substitua a mosca pelo próximo espécime. Repita as etapas 3.1-3.3 até que todos os espécimes tenham sido fotografados, sem ajustar ainda mais os níveis de iluminação, ampliação ou exposição.
4. Imaging entre várias sessões
- Se as imagens precisam ser tomadas em várias sessões, mantenha a intensidade da luz, a exposição e a ampliação nas sessões. No início de cada sessão, verifique a calibração espacial da câmera (etapa 2.4) e a intensidade da luz no estágio (conforme medido pelo LED / medidor de tensão, etapa 2.12).
- Capture e guarde uma imagem do micrômetro do estágio (etapas 2.5-2.7) para garantir a capacidade de calibrar espacialmente as imagens novamente, se necessário.
- Use pelo menos 15 espécimes de controle e re-crie-os aleatoriamente em cada sessão para alloW para a detecção e eliminação dos efeitos da sessão. Certifique-se de que os espécimes de controle duplicados entre as sessões tenham o mesmo [sampleID] mas diferente [SESH000].
NOTA: As amostras de controle são moscas coletadas, armazenadas e montadas de forma idêntica a espécimes experimentais, mas são reimprimidas em todas as sessões. O número exato de espécimes de controle dependerá da configuração experimental do usuário. Veja a discussão para mais detalhes.
5. Análise de imagem
NOTA: A análise de imagem é realizada no ImageJ 45 e usa a macro "Measurement of Pigmentation.ijm" fornecida como um arquivo suplementar.
- Coloque todas as imagens a serem analisadas na mesma pasta.
- Inicie ImageJ e execute a macro "Measurement of Pigmentation.ijm" clicando em "Plugins"> "Macro"> "Executar", selecionando "Medição de Pigmentation.ijm" no navegador de arquivos e clicando em "aberto."
NOTA: Todas as etapas subseqüentes estão dentro da macro. Cada passo é um comando de macro individual. - Observe que uma caixa de diálogo "Ação necessária" é aberta, indicando "Escolha a pasta onde as imagens são armazenadas". Clique em "OK" e use o navegador de arquivos para selecionar a pasta que contém as imagens e clique em "escolher".
- Observe que uma caixa de diálogo "Ação necessária" será aberta, indicando "Escolha a pasta onde deseja que os dados sejam armazenados". Clique em "OK" e use o navegador de arquivos para selecionar a pasta desejada para salvar os perfis de pigmentação. Clique em "escolher".
- Observe que uma caixa de diálogo será aberta, perguntando "Quantos caracteres em sua identificação de amostra?" Na caixa de entrada de dados, digite o número de caracteres em [SampleID], conforme especificado na etapa 3.3, e clique em "OK".
- Observe que uma caixa de diálogo será aberta, perguntando "Quão grande é seu ROI?" Na caixa de entrada de dados, digite a largura do pixel da caixa anterior-Tira posterior ao longo da qual o perfil de pigmentação deve ser lido (retângulo verde, Figura 1G , Figura 2A e 2A '). Clique em "OK"; O padrão é 20 pixels.
NOTA: O perfil de pigmentação é lido através de uma tira de cutícula, em vez de uma linha, para reduzir o ruído devido a cabelos e cerdas. A largura desta tira dependerá da resolução da imagem, mas deve ser ~ 1 / 20th da largura do abdômen, em pixels. - Observe que a macro abrirá a imagem da primeira mosca e uma caixa de diálogo perguntará se deve medir a mosca atual (clique em "Sim"), para passar para a próxima mosca (clique em "Não") ou para sair da Macro (clique em "Cancelar").
- Observe que uma caixa de diálogo será aberta, indicando "Definir a linha média do abdômen dorsal, de ANTERIOR a POSTERIOR". A ferramenta "linha direta" já será selecionada. Desenhe uma linha anterior a posteriorPara definir a linha média do abdômen dorsal. Clique em "OK"; Ver Figura 2A e 2A ', linha amarela.
NOTA: Isso é usado para reorientar a imagem de modo que a linha média dorsal esteja horizontalmente na tela, com a anterior na esquerda, facilitando as etapas subseqüentes. - Observe que uma caixa de diálogo será aberta, indicando "Definir a borda POSTERIOR do Tergite 4 logo atrás da banda de pigmento". A ferramenta "linha direta" já será selecionada. Desenhe uma linha da borda da linha média posterior para a borda lateral direita, de modo que o centro da linha (marcado por um quadrado branco) se senta apenas posteriormente ao bordo posterior da banda de pigmento (cutícula a5). Clique em "OK;". Veja a Figura 2A e 2A ', linha magenta.
NOTA: O script R irá detectar automaticamente a borda posterior da banda de pigmento a partir do perfil de pigmentação. - Observe que um diálogoA caixa será aberta, indicando "Definir a borda ANTERIOR do Tergite 4 na borda anterior da cutícula pigmentada (a2)". A ferramenta "linha direta" já será selecionada. Desenhe uma linha da borda da linha média anterior para a borda lateral direita, de modo que o centro da linha (marcado por um quadrado branco) assente na borda anterior da cutícula pigmentada (cutícula a2). Clique em "OK;". Veja a Figura 2A e 2A ' , linha ciana.
NOTA: O script R definirá este ponto como a borda anterior da cutícula pigmentada do tergite. Na imagem, a macro mostrará a região de interesse (ROI) ao longo da qual o perfil de pigmentação é lido (retângulo verde, Figura 2A e 2A ', ampliado na Figura 2B e 2B '). A macro também abrirá uma segunda janela mostrando o perfil de pigmentação do ROI ( Figur E 2C e 2C '), onde o eixo x é a posição, expresso como o número de pixels a partir do bordo posterior do perfil, e o eixo y é o valor médio de pixel em cada posição. - Veja as parcelas do perfil de pigmentação que serão abertas pela macro. Se necessário, clique em "Live" na janela de perfil para ajustar a posição do ROI para que não inclua estruturas ( por exemplo, cerdas) que influenciem o perfil de pigmentação. Uma vez que o perfil seja satisfatório, clique em "OK".
- Repita as etapas 5.8-5.11 para o Tergite 3.
NOTA: A macro exporta os perfis de pigmentação como dois arquivos CSV, cada um chamado "SESH000_samplename_TX_profile.csv", onde [SESH000_samplename] é o nome da imagem e [TX] é T3 ou T4 para o terceiro e quarto tergites, respectivamente. - Observe que a macro abre a próxima imagem. Repita as etapas 5.7-5.13 até que todas as imagens tenham sido analisadas.
NOTA: Toda a análise de dados é realizada em R 47 e usa o script "Análise de pigmentação.R" fornecido. Abaixo, "L ..." indica qual linha (s) do script executar para cada parte da análise. Consulte as Informações Suplementares para obter detalhes adicionais sobre como a análise é conduzida.
- Edite o script R para configurar o diretório de trabalho (L6) e defina o caminho do arquivo para a pasta que contém os perfis .csv (L11).
- Execute L13-15 para gerar uma lista dos perfis de pigmentação armazenados na pasta de perfil.
- Carregue e execute as funções "leitor" e "addPrimaryKey" (L17-41) para ler os perfis em um único quadro de dados.
- Edite o script em L43 para especificar a calibração espacial das imagens em μm / pixels, conforme determinado no passo 2.5.
- Carregar e executar o "ajuste"Tilt "(L46-58) para converter a posição do perfil (eixo dos x, Figura 2C e 2C ') de pixels-de-posterior-borda-de-ROI para μm-de-ângulo anterior-ROI e o Valor do perfil (eixo y, Figura 2C e 2C ') do valor do pixel (0 = preto, 255 = branco) ao valor da pigmentação (0 = nenhum pigmento, 255 = pigmento máximo).
- Carregue e execute a função "spline.der.er" (L60-71) para gerar a spline cúbica dos perfis de pigmentação e suas derivadas primeira e segunda ( Figura 2D -2F e 2D '- 2F ').
- Carregue e execute as funções "coord" e "assmbly.coord" (L74-163), primeiro para extrair a posição das bordas posterior (T 3 ) e anterior (T 2 ) da faixa de pigmento ( Figura 2D e 2D ';) E o bordo posterior da cutícula a2 (T 1 , Figura 2D e 2D ') e, em seguida, extrair os valores de pigmentação máximo (P max ) e mínimo (P min ), tomados em T 3 e T 1 , respectivamente.
NOTA: A borda anterior da cutícula a2 já foi definida no passo 5.9. - Opcional: carregue e execute a função "chek" (L165-175) para verificar se a função "coord" está identificando corretamente as posições T 1-3 para um perfil de pigmentação selecionado aleatoriamente.
- Carregue e execute as funções de índice e métricas (L178-193) para gerar uma tabela de dados com os títulos "Sessão", "Amostra", "Tergite", "id" (uma concatenação de Sample e Tergite), "P max " "P min ", " banda W" (largura da banda de pigmento, = T3 - T 2 ) e "W tergite " (largura do pigmento cUticles a2-a5, = T 3 ).
- Carregue e execute a função "correção" (L196-234) para gerar uma tabela de dados que corrija P max e P min para quaisquer fatores de incômodo decorrentes dos efeitos da sessão. Use o aumento médio (ou diminuição) em P max ou P min dos espécimes de controle reimprimidos em sessões temporariamente adjacentes.
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Representative Results
O protocolo foi utilizado para explorar o efeito da temperatura de criação na pigmentação abdominal. Estudos anteriores mostraram que um aumento na temperatura do desenvolvimento resulta em uma diminuição da disseminação da pigmentação abdominal em várias espécies de Drosophila , incluindo D. melanogaster 30 , 32 . Especificamente, em tergitos abdominais 3 e 4, a extensão da pigmentação (largura da banda de pigmento) diminui de 17 ° C a 25 ° C e permanece a mesma de 25 ° C a 28 ° C 24 , 36 . Estes estudos marcaram a extensão da pigmentação em uma escala de 1 a 10 (0: nenhuma banda de pigmento, tergite completamente amarela, 5: a banda de pigmento ocupa 50% do tergite, 10: o tergite completamente escuro). Para determinar se a metodologia quantitativa poderia captar esta plasticidade fenotípica, a pigmentação foi medida naE terceiro e quarto tergitos abdominais de uma linha isogênica de moscas femininas ostensivamente selvagens, criadas de ovo para adulto a 17 ° C (sete moscas), 25 ° C (nove moscas) e 28 ° C (nove moscas). Para determinar a eficácia do procedimento de correção na remoção de fatores de incômodo introduzidos pelos efeitos da sessão, a pigmentação das mesmas moscas foi reimprimida e re-medida um, dois, quatro e oito dias depois. As condições de iluminação e a exposição entre as sessões foram, no entanto, modificadas propositadamente para garantir que houve efeitos de sessão para o procedimento de correção a ser removido. As imagens foram postadas no repositório digital Dryad.
A primeira questão colocada era a existência de diferenças sistemáticas nas medidas de pigmentação nas sessões. Isso foi examinado usando o pacote lme4 em R 48 para caber os modelos mistos M ijk = S i + A j +Ε ijk e M ij = A j + ε ij para P max e P min , onde M é a medida do pigmento, S é a sessão (efeito aleatório), A é o tergito abdominal sendo medido (efeito aleatório) e ε é O erro residual (os índices são níveis dentro das variáveis). Um teste de razão log-verossimilhança foi usado para testar se a inclusão da sessão como um fator aleatório melhorou significativamente o ajuste; Fez ( Tabela 1 ). Como esperado, o exame dos componentes da variância (gerado através do REML 48 ) indicou que a variação devido aos efeitos da sessão representou 67% e 70% da variância total em P max e P min , respectivamente ( Tabela 1 ).
Quinze tergitos de controle selecionados aleatoriamente (terceira ou quarta, de moscas reaVermelho a 17 ° C, 25 ° C ou 28 ° C) e as alterações na P max e P min médias foram utilizadas para corrigir as medidas de pigmentação dos restantes tergites durante as sessões. A repetição da análise nas medidas de pigmentação corrigidas eliminou os efeitos da sessão ( Tabela 1 ) e reduziu a porcentagem de variância total devido aos efeitos da sessão para zero. O erro residual é uma estimativa, um erro de medição depois que os efeitos da sessão foram removidos e foi de 22% e 27% para P max e P min , respectivamente ( Tabela 1 )
Em seguida, os dados corrigidos foram utilizados para determinar se o efeito da temperatura em diferentes aspectos de pigmentação e tamanho poderia ser detectado. O modelo misto M ijkm = T i * D j + X k + ε ijkm foi ajustado aos dados, onde T D é o tergito (terceiro ou quarto), e X é a mosca individual (fator aleatório). Como a relação entre pigmentação e temperatura não é linear 24 , 36 , T foi tratada como um fator categórico. Foram testados os níveis máximo e mínimo de pigmentação ( P max e P min ) e a largura da banda de pigmento e do tergite ( banda W e W tergite ). O efeito da temperatura na largura relativa da banda de pigmento ( banda R = banda W / W tergite ) também foi testado. Os dados mostraram que a largura absoluta ( banda W ) e relativa ( banda R ) da banda de pigmento diminuiu de 17 ° C a 25 ° C (teste Tukey post-hoc, P <0,05 para todos) e não mudou significativamente de 25 ° C a 28 ° C (teste pós-hoc de Tukey,
O efeito da temperatura na largura do tergito foi mais complexo. Em D. melanogaster , o tamanho do corpo e do órgão diminui de forma não linear com a temperatura 49 . Estudos anteriores sugerem que a largura do quinto tergito abdominal diminui em 10% de 16,5 ° C para 25 ° C e 4% adicionais de 25 ° C a 29 ° C 50 . Embora tenha havido uma diminuição não significativa na largura deO quarto tergito abdominal de 17 ° C a 25 ° C, tanto o terço como o quarto tergitos abdominais aumentaram em largura de 25 ° C a 28 ° C ( Tabela 2 , Figura 3D ). Uma vez que a largura dos tergites abdominais é essencialmente definida pelo usuário (etapas 5.9-5.10 no protocolo), a disparidade entre os estudos atuais e anteriores é improvável devido à forma como o script R extrai W tergite do perfil de pigmentação. Em vez disso, pode refletir diferenças na forma como o segmento abdominal é medido, nos genótipos das moscas e nos aspectos precisos dos tergitos abdominais sendo medidos.
A próxima pergunta colocada foi se a metodologia poderia gerar dados comparáveis aos dados coletados usando avaliações de pigmentação existentes. Esses métodos geralmente pedem ao observador que atribua subjetivamente cada mosca a uma das pernasNúmero de classes fenotípicas com base na extensão da pigmentação 15 , 30 , 32 , 33 , 34 e, portanto, dependem da habilidade do observador para avaliar a largura da banda de pigmento. Para testar o quão bem este método objetivo se compara aos métodos subjetivos, cinco observadores foram convidados a classificar 45 imagens de abdômen feminino com base na largura da faixa de pigmento do quarto tergito abdominal. O ranking médio entre observadores foi comparado com o ranking baseado na banda W, conforme medido usando esta metodologia. Houve uma forte correlação entre os rankings subjetivo e objetivo ( Figura Suplementar 1 , em Informações Suplementares.pdf), Spearmen = 0.7342, P <0.0001).
Outra pergunta colocadaFoi como este método extraia a banda W da spline de pigmentação em comparação com a medida da largura da banda de pigmento à mão (método visual) usando a ferramenta de medição linear em ImageJ . Novamente, uma forte correlação foi encontrada entre os dados coletados usando as duas metodologias ( Figura 2 suplementar, em Informações Suplementares.pdf, OLS, r 2 = 0,49 , P <0,0001). Embora o método computacional tenha consistentemente medido a faixa de pigmento como sendo mais estreita do que no método "visual", o coeficiente de regressão não foi significativamente diferente de 1 ( P> 0,05).
A última pergunta colocada era se essa metodologia poderia ser usada para medir a pigmentação abdominal em outros contextos. A metodologia poderia extrair o P max , P min , W band e W tergite para o fIfth e sextos tergites abdominais em fêmeas e terceiro e quarto tergites abdominais em machos ( Figura 4 ). Além disso, a metodologia poderia ser utilizada para quantificar o aumento de P max e P min em moscas mutantes para ébano ( e 1 ), que mostram um aumento na pigmentação cuticular em todo o corpo e um aumento específico na pigmentação da cuticular anterior ao pigmento Banda 28 ( Figura 4 ).
Figura 1: pigmentação abdominal em D. melanogaster . ( A - F ) Variação na pigmentação abdominal em fêmeas de dois genótipos criados a três temperaturas (17 ° C, 25 ° C e 28 ° C). A3 e A4 são o terceiro e quarto tergi abdominal Tes, respectivamente. ( G ) O tergito abdominal dorsal inclui um compartimento anterior e posterior, apenas partes das quais são fisicamente visíveis em abdômen não esticado. Os compartimentos são subdivididos em diferentes tipos de cutícula: a1: não pigmentados, sem cabelos; A2: levemente pigmentados e cabelos; A3: pigmentados levemente, cabelos e cerdas moderadas; A4: pigmentados escuros, cabelos e cerdas moderadas; A5: pigmentados escuros, cabelos e cerdas grandes; A6: pigmentos não pigmentados e cabelos; P3: não pigmentados e cabelos; P2: não pigmentado e sem cabelos; E p1: não pigmentados e tesselados. A banda de pigmento é composta por cutículas a4 e a5. Somente cutículas pigmentadas (a2-a5, caixa verde) são usadas na análise. Barras de escala = 200 μm em (AF). O contraste de todas as imagens foi ajustado para realçar o padrão de pigmentação, e as imagens são ilustrativas. As imagens não ajustadas usadas para gerar os resultados representativos são depositadas no repositório digital Dryad..com / files / ftp_upload / 55732 / 55732fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise de imagem e dados para quantificar a pigmentação abdominal. ( A - F ) e ( A - F ) são para diferentes espécimes e mostram como a análise trata de imagens de qualidade diferente. ( A ) O usuário primeiro define a linha média do abdômen (linha amarela), a borda anterior do tergito (linha ciana) e uma linha ligeiramente posterior à borda posterior da banda de pigmento (linha magenta). A macro ImageJ desenha uma linha do ponto médio das linhas anterior e posterior (linha tracejada branca), que amplia para formar um ROI (caixa preta), ampliada em ( B ). ( C ) A macro ImageJ, então exLocaliza o valor médio de pixels ao longo do eixo anterior-posterior do ROI. Observe que, nesta fase, o perfil é lido de posterior para anterior. ( D - E ) A macro R converte os valores médios de pixel para um valor de pigmentação, inverte a direção do perfil de pigmentação, se encaixa com uma spline cúbica ( S (x) ) ( D ) e calcula a primeira ( S (x ) ) ( E ) e segunda ( S (x) ) derivada da spline ( F ). O script então identifica: T 3 , a posição de pigmentação máxima, onde S (x) transita de <0 a> 0, movendo-se anteriormente a partir da parte posterior da spline; T 2 , a posição onde o declínio na pigmentação é o maior e S (x) é o máximo; E T 1 , a posição onde a pigmentação do tergito é no mínimo e S (x) transições de> 0 para <0, movendo-se anteriormenteRom T 2 ,. A parte anterior do tergito fisicamente visível (anterior da cutícula a2) é definida pelo usuário. (AF) Nos casos em que a primeira derivada não pode ser usada para encontrar T 1 , tipicamente porque S (x) não atravessa 0 anteriormente para a banda de pigmento, o script definirá T 1 como a posição em que S (x) transita de> 0 a <0 quando se deslocam para a frente de T 2 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O efeito da temperatura em diferentes aspectos da pigmentação abdominal na fêmea D. melanogaster . ( A ) Largura da banda de pigmento ( banda W , FFigura 1). ( B ) A banda de pigmento como proporção do tergite ( banda R ). ( C ) Máximo ( P max , linhas superiores) e pigmentação mínima ( P min , linhas inferiores). ( D ) Largura do tergito ( W tergite ). Os pontos são menos meios quadrados de modelos de efeitos mistos lineares (Tabela 2). As barras de erro representam o erro padrão e podem ser obscurecidas pelos marcadores. A linha preta é o terceiro tergito abdominal. A linha cinza é o quarto tergito abdominal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Diferenças na pigmentação entre os tergitos abdominal terceiro e quarto. Isso é mostrado em ( A ébano 1 , ( B ) fêmeas de tipo selvagem, ( C ) machos de tipo selvagem e os tergitos de sexto e sexto em fêmeas de tipo selvagem. ( D ) Pigmentação máxima, P max . ( E) Pigmentação mínima, P min . ( F ) Largura da banda de pigmento, banda W. ( G ) Largura relativa da banda de pigmento, banda R. Barras com letras diferentes são significativamente diferentes (Teste pós-hoc Tukey HSD, P <0,05). N = 6 para todos, exceto o ébano 1 , onde N = 4. Barras de escala = 200 μm em ( A - C ). As barras de erro representam o erro padrão. O contraste de todas as imagens foi ajustado para realçar o padrão de pigmentação, e as imagens são ilustrativas. Por favor cliCk aqui para ver uma versão maior dessa figura.
| Comparação de modelos | Componentes de variância (% do total) | ||||||
| Traço de Pigmentação | Modelo | Df | Log probabilidade | X² |  (%) |  (%) |  (%) |
| P max Não corrigido | M ij = A i + ε ij | 3 | -678.28 | 1.94 (14%) | 11,86 (86%) | ||
| M ijk = S i + A j + ε ijk | 4 | -457.95 | 440.66 *** | 4,08 (26%) | 10,71 (67%) | 1,14 (7%) | |
| P min Não corrigido | M ij = A i + ε ij | 3 | -875.03 | 6,05 (9%) | 59,39 (91%) | ||
| M ijk = S i + A j + ε ijk | 4 | -664.58 | 420.91 *** | 16,67 (22%) | 53,08 (70%) | 6,31 (8%) | |
| P max corrigido | M ij = A i + ε ij | 3 | -445.05 | <Td> 4,08 (78%) | 1,15 (22%) | ||
| M ijk = S i + A j + ε ijk | 4 | -444.88 | 0.3378 | 4,08 (78%) | 0,01 (<1%) | 1,14 (22%) | |
| P min corrigido | M ij = A i + ε ij | 3 | -649.9 | 16,67 (73%) | 6,24 (27%) | ||
| M ijk = S i + A j + ε ijk | 4 | -649.9 | 0 | 16,67 (73%) | 0 | 6,31 (27%) | |
Tabela 1: Modelos lineares de efeito misto do efeito de tergite e sessão. Modelos lineares de efeito misto do efeito de tergite e sessão em umPigmentação bdominal ( P max e P min ) de 50 tergites re-medidos em cinco sessões, com componentes de variância estimados através de REML. Os modelos eram modelos de efeito mixto linear. M : medida de pigmentação; A : tergito individual medido; S : Sessão; Ε : erro residual. O X² significativo é mostrado em negrito. * P <0,05. ** p <0,01. *** p <0,001.
| Traço | Temperatura | Tergite | Temperatura X Tergite | |
| P max | F -ratio | 8.14 | 55,59 | 6.6 |
| P | 0,002 | <0,001 | ||
| P min | F -ratio | 4.41 | 66.11 | 6.36 |
| P | 0,026 | <0,001 | 0,002 | |
| Banda W | F -ratio | 113,93 | 0,01 | 0,64 |
| P | <0,001 | 0.931 | 0,531 | |
| W tergite | F -ratio | 1,79 | 0,92 | 5.11 |
| P | 0.191 | 0,338 | 0,007 | |
| Banda R | F -ratio 27.66 | 0,08 | 1,46 | |
| P | <0,001 | 0.782 | 0,23 |
Tabela 2: Efeito da temperatura e da identidade do tergite. O efeito da temperatura e da identidade do tergite Em diferentes aspectos da pigmentação abdominal em 50 tergites re-medidos em cinco sessões. Os modelos eram modelos de efeito mixto linear, com a mosca individual incluída como um fator aleatório. P max : pigmentação máxima (corrigida); P min : pigmentação mínima (corrigida); W banda : Largura da banda de pigmento; W tergite : Largura do tergito; Banda R : Largura relativa da banda de pigmento. Fatores fixos significativos são mostrados em negrito ( P < 0,05).
| Interceptar | Banda W | Temperatura | Tergite | |||
| 17˚C | 25˚C | Terceiro | ||||
| P max | Β | 234.35 | 0.069 | 0,063 | -1.178 | -0.588 |
| F | 29.93 | 5.97 | 54,82 | |||
| P | <0,001 | 0,008 | <0,001 | |||
| P min | Β | 223.96 | -0.137 | 3.931 | -3.024 | -1,54 |
| F | 19,33 | Span = "2"> 9.66 | 62.02 | |||
| P | <0,001 | 0.001 | <0,001 | |||
Tabela 3: Efeito da largura da banda de pigmento, temperatura e identidade do tergite no nível de pigmentação. Efeito da largura da banda de pigmento, temperatura e identidade do tergite no nível de pigmentação em 50 tergites re-medidos em cinco sessões. Os modelos eram modelos de efeito mixto linear, com a mosca individual incluída como um fator aleatório. P max : pigmentação máxima (corrigida); P min : pigmentação mínima (corrigida); W banda : Largura da banda de pigmento; Banda R: Largura relativa da banda de pigmento.
Arquivo suplementar 1. Informações suplementares.Y_Information.pdf "target =" _ blank "> Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo suplementar 2. Análise do script Pigmentation.R. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo suplementar 3. Medição de Pigmentation.ijm Clique aqui para baixar este arquivo.
Simulação R Script. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Esta metodologia permite a aquisição precisa, rápida e repetitiva de dados de pigmentação em uma forma quantitativa adequada para múltiplas análises a jusante. O método foi utilizado para adquirir dados sobre o efeito da temperatura na pigmentação abdominal em uma linha isogênica de moscas. No entanto, a metodologia poderia ser utilizada em estudos de genética direta para identificar genes que subjazem as diferenças de pigmentação entre indivíduos, populações ou espécies ou estudos genéticos reversos para explorar os efeitos de genes específicos nos padrões de pigmentação. Embora, como discutido acima, houve uma miríade de estudos que exploraram o desenvolvimento e a evolução da pigmentação de D. melanogaster, a precisão com que esta metodologia captura dados de pigmentação em uma forma quantitativa permite abordagens estatísticas mais poderosas. Isso, por sua vez, permite que os pesquisadores usem menos amostras ao analisar os padrões de pigmentação, ou lhes permite elucidar mais sutilAspectos da pigmentação. Além disso, este método não requer a dissecação da mosca, permitindo que a amostra seja posteriormente utilizada para análises adicionais, como medições morfológicas ou genotipagem. Na verdade, a metodologia poderia ser usada em moscas anestesiadas, que poderiam então ser criadas seletivamente com base em suas características de pigmentação.
Um problema potencial com a medição da pigmentação através da análise de imagem é que os valores de pigmentação podem refletir as condições de exposição e iluminação sob as quais uma imagem foi tirada, e não o nível de pigmentação propriamente dita. Ao usar níveis de iluminação fixos, as posições da luz, a ampliação e a exposição ajudam a aliviar esses problemas, é provável que ainda seja necessário levar várias imagens de controle de repetição em cada sessão para controlar completamente os efeitos da sessão. Este método inclui reimprimir quinze espécimes de controle cada sessão e usar as mudanças entre as sessões em P maX e P min para detectar e eliminar os efeitos da sessão. No entanto, o número exato de espécimes de controle que devem ser reimprimidos dependerá do hardware e software de imagem em uso, do aspecto da pigmentação de interesse para o usuário e de quão variável é entre os tratamentos e quantas imagens são tiradas em cada um sessão. Conduzir uma experiência preliminar em que os mesmos espécimes são reimprimidos ao longo de cinco sessões permitirá ao usuário calcular a variância devido aos efeitos da sessão, a variação devida à identidade da amostra e a variância residual (que é uma estimativa do erro de medição após a correção Para efeitos de sessão) ( Tabela 1 ). Esses valores podem então ser usados para estimar quantas imagens de controle precisam ser tomadas em cada sessão para detectar e controlar os efeitos da sessão. Um script R simples foi escrito e usa dados de tal experiência preliminar para simular medidas de pigmentação em todas as sessões. Isso pode ser usadoPara verificar se o número de imagens de controle por sessão é suficiente para remover os efeitos da sessão. Este script é fornecido como um arquivo suplementar.
Se os usuários estão preocupados com a existência de fatores incômodos dentro das sessões, eles também podem reimpor o mesmo espécime várias vezes ao longo da sessão, conforme descrito em John et al., 2016 41 . Neste caso, [sampleID] para o espécime de controle único deve ser alterado sempre que for reimprimido em uma sessão ( por exemplo , controle1, controle2, controle3, etc. ); Caso contrário, o software de imagem substituirá a imagem anterior pela nova imagem do mesmo nome. A função de correção baseia sua correção em imagens duplicadas com o mesmo [sampleID] entre sessões temporariamente adjacentes e corretamente, se o mesmo espécime é reimprimido várias vezes dentro e entre sessões ou se o mesmo conjunto de espécimes de controle são gravados entre as sessões. Independentemente de comoAs imagens de controle de e são tomadas, as sessões devem ser tratadas como blocos e, quando possível, os usuários devem empregar um design de blocos ao acaso para que quaisquer efeitos de sessão que permaneçam após a correção possam ser controlados estatisticamente. Na falta disso, os espécimes devem ser aleatoriamente designados para sessões para que os efeitos da sessão não sejam confundidos com fatores experimentais.
O protocolo baseia-se na geração de um perfil de pigmentação que representa a mudança na pigmentação em cada tergito. Um problema com a geração desse perfil é o cabelo escuro que cobre a cutícula abdominal, que são invariavelmente divididos em bispos por qualquer linha anterior-posterior que atravessa o tergito. O protocolo reduz o ruído gerado por esses cabelos, tomando o perfil de pigmentação em média em uma faixa de cutícula. No entanto, os usuários podem definir a largura do ROI para 1 pixel no passo 5.6 se desejam gerar perfis baseados em uma fina linha de cutícula. Além disso, os usuários podem analisar tA mesma imagem várias vezes, alterando a posição lateral do perfil de pigmentação para capturar mudanças na largura da faixa de pigmento dentro de um segmento. Nesse caso, no entanto, os usuários precisarão copiar a mesma imagem várias vezes e dar a cada cópia um nome exclusivo antes de executar o passo 5.1, uma vez que a macro ImageJ substituirá os perfis do mesmo nome.
Uma segunda consideração importante ao gerar o perfil de pigmentação é o parâmetro de suavização do spline cúbico, definido dentro da função spline.der.er (L63) no script Análise de pigmentação R. O parâmetro de suavização apropriado depende da configuração e resolução da imagem. O alisamento excessivo de um perfil pode resultar na perda das características do perfil spline usado para calcular as coordenadas de T 1 , T 2 e T 3 ( Figura 2D e 2D '). Por outro lado, o sub-alisamento aumentaRuído do perfil e conseqüentemente a precisão das extrações de coordenadas. A função chek produz um resumo gráfico da spline e suas derivadas e pode ser usado como uma sugestão visual para escolher um parâmetro de suavização apropriado.
A metodologia aqui descrita centra-se na captura de dados sobre a pigmentação do terço e quarto tergitos abdominais em mulheres do sexo masculino e D. melanogaster . No entanto, os resultados representativos indicam que também pode ser usado para medir a pigmentação do quinto e sexto segmentos abdominais das fêmeas. Além disso, a metodologia pode detectar diferenças no fenótipo causadas por mutantes de genes que afetam a pigmentação. A macro ImageJ e os scripts R podem ser facilmente modificados para medir a pigmentação no abdômen de diferentes espécies de D. melanogaster , ou mesmo pigmentação de outras partes do corpo em outros taxa, desde que o padrão de pigmentação seja estereotipado. Finalmente, a metodologiaTambém pode ser adaptado para medir os aspectos da cor da pigmentação, capturando imagens em RGB e analisando cada canal separadamente.
Em geral, essa metodologia faz parte do campo emergente do fenômeno 51 , 52 . O objetivo do fenômeno é gerar e analisar grandes conjuntos de dados fenotípicos multidimensionais para melhor compreender as interações genéticas e ambientais que influenciam o fenótipo, incluindo a doença, e como essas interações evoluem para gerar diversidade biológica. Para que os fenômenos atinjam o seu potencial, no entanto, as metodologias para a aquisição de dados fenotípicos devem ser diretas e facilmente adaptadas a diferentes fenótipos, bem como disponíveis gratuitamente. Ao usar software de código aberto para analisar imagens capturadas usando equipamentos padrão, esta metodologia ajuda a alcançar esse objetivo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional da Ciência que concede IOS-1256565 e IOS-1557638 à AWS. Agradecemos a Patricia Wittkopp e a três revisores anônimos por seus comentários úteis sobre uma versão anterior deste artigo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Biology Forceps | FST | 11252-30 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Dissecting Scope | Leica | MZ16FA | |
| Base | Leica | MDG41 | |
| Camera | Leica | DFC280 | |
| Gooseneck Cold Light Source | Schott | ACE 1 | |
| Image Acquisition Control Software | Micro-Manager v1.3.20 | https://micro-manager.org/ | |
| Image Analysis Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Data Analysis Software | R 3.3.2 | https://www.r-project.org/ | |
| LED | Thor Labs | LEDWE-15 | |
| Multimeter | Fluke | Fluke 75 Series II | |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Celltreat Scientific Products | 229663 | |
| Stage micrometer | Klarman Rulings, Inc. | KR-867 |
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