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Genetics

Quantifizierung der Bauchpigmentierung in Published: June 1, 2017 doi: 10.3791/55732
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, Lake Forest College

Summary

Diese Arbeit präsentiert eine Methode zur schnellen und präzisen Quantifizierung der Bauchpigmentierung von Drosophila melanogaster mittels digitaler Bildanalyse . Diese Methode rationalisiert die Vorgänge zwischen der Phänotyp-Erfassung und der Datenanalyse und umfasst die Probenmontage, die Bilderfassung, die Pixelwert-Extraktion und die Merkmalsmessung.

Abstract

Pigmentierung ist ein morphologisch einfaches, aber sehr variables Merkmal, das oft anpassungsfähige Bedeutung hat. Es hat vielmehr als Modell für das Verständnis der Entwicklung und Entwicklung von morphologischen Phänotypen gedient. Die Bauchpigmentierung in Drosophila melanogaster war besonders nützlich, so dass Forscher die Locus identifizieren können, die inter- und intraspezifischen Variationen in der Morphologie zugrunde liegen. Bisher wurde jedoch die D. melanogaster- Bauchpigmentierung weitgehend qualitativ durch Scoring statt quantitativ untersucht, was die Formen der statistischen Analyse begrenzt, die auf Pigmentationsdaten angewendet werden können. Diese Arbeit beschreibt eine neue Methodik, die die Quantifizierung verschiedener Aspekte des Bauchpigmentierungsmusters des erwachsenen D. melanogaster ermöglicht . Das Protokoll umfasst Probenmontage, Bildaufnahme, Datenextraktion und Analyse. Die gesamte Software, die für die Bildaufnahme und Analyse verwendet wird, verfügt über MakrosGeschrieben für Open-Source-Bildanalyse. Der Vorteil dieses Ansatzes ist die Fähigkeit, Pigmentierungsmerkmale präzise zu messen, wobei eine Methodik verwendet wird, die über verschiedene Abbildungssysteme hoch reproduzierbar ist. Während die Technik verwendet wurde, um die Variation in den tergischen Pigmentierungsmustern des erwachsenen D. melanogaster zu messen , ist die Methodik flexibel und breit auf Pigmentierungsmuster in unzähligen verschiedenen Organismen anwendbar.

Introduction

Die Pigmentierung zeigt eine enorme phänotypische Variation zwischen Arten, Populationen und Individuen und sogar innerhalb von Individuen während der Ontogenese 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Obwohl es in einer Vielzahl von Tieren unzählige Pigmenttests gibt, ist die Pigmentierung am besten in Drosophila melanogaster untersucht worden , wo die volle Kraft der Molekulargenetik verwendet wurde, um die Entwicklungs- und physiologischen Mechanismen zu erforschen, die die Pigmentierung regulieren und wie sich diese Mechanismen entwickeln 1 , 6 Es ist viel über die Gene bekannt, die die biochemische Synthese von Pigmenten in D. melanogaster 7 , 8 und den Genen, die das zeitliche und räumliche di kontrollieren, regulierenVerteilung dieser Biosynthese 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Darüber hinaus hat die genetische Kartierung die genetischen Loci identifiziert, die intra- und interspezifischen Unterschiede in der Pigmentierung in D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 liegen . Auch die Beziehungen zwischen Pigmentierung und pleiotropen Merkmalen wie Verhalten 18 , 19 und Immunität 19 , 20 wurden ebenso erforscht wie die adaptive Bedeutung der Pigmentierungsmuster 15 , 21 , 22 . Als solches ist die Pigmentierung in D. melanogaster als eine mächtige und dennoch einfache m aufgetauchtOdel für die Entwicklung und Entwicklung von komplexen Phänotypen.

Pigmentierung im erwachsenen D. melanogaster zeichnet sich durch deutliche Melanisierungsmuster über den Körper, besonders an den Flügeln und dem dorsalen Thorax und Bauch. Es ist die Pigmentierung jeder cuticular Platte (tergite) auf dem dorsalen Abdomen, jedoch, die die meisten Forschung Aufmerksamkeit erhalten hat. Es gibt eine beträchtliche Variation in dieser Pigmentierung (Abbildung 1A- F ), weil sowohl genetische 17 , 23 und Umwelt 24 , 25 Faktoren. Die Nagelhaut eines abdominalen Tergits besteht aus vorderen und hinteren Entwicklungsfächern (Abbildung 1G ), die jeweils je nach Pigmentierung und Ornamentierung weiter unterteilt werden können. Das vordere Fach umfasst sechs NagelhautTypen (a1-a6), und das hintere Kompartiment enthält drei (p1-p3) (Abbildung 1G ). Von diesen werden die p1, p2 und a1 Nagelhaut typischerweise unter dem Tergit in ungedehnten Abdomen gefaltet, so dass sie verborgen sind. Die zuverlässig sichtbare Nagelhaut zeichnet sich durch eine Bande von schwerer Pigmentierung aus, die hier als "Pigmentband" bezeichnet wird und aus Nagelhauttypen a4 (haarig mit mäßigen Borsten) und a5 (behaart mit großen Borsten) mit dem hinteren Rand des Bandes besteht Intensiver pigmentiert als die vordere Kante (Abbildung 1G ). Anterior zu dieser Band ist eine Region von leicht pigmentierten behaarten Nagelhaut, die Borsten nach hinten (a3) ​​aber nicht anteriorly (a2) hat. Eine Variation der Pigmentierung zwischen Fliegen wird sowohl in der Intensität der Pigmentierung als auch in der Breite des Pigmentbandes beobachtet. Im Allgemeinen ist die Variation am stärksten in den hintersten Segmenten (Bauchsegmente 5, 6 und 7) und ist in den anterioren Segmenten niedriger (abdominal seGionen 3 und 4) 24 . Darüber hinaus gibt es einen sexuellen Dimorphismus in D. melanogaster Pigmentierung, wobei Männer im Allgemeinen vollständig pigmentierte fünfte und sechste Bauch-Tergite (Abbildung 4C ) haben.

In den meisten Untersuchungen der Bauchpigmentierung in D. melanogaster wurde die Pigmentierung als kategorisches oder ordinales Merkmal behandelt, wobei das Muster qualitativ 27 , 28 , 29 oder halbquantitativ auf einer Skala 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 gemessen wurde , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . Diese Methoden leiden unweigerlich an einem Mangel an Präzision, und weil sie sich auf die subjektive Bewertung der Pigmentierung verlassen, ist es schwierig, die Daten über Studien zu vergleichen. Mehrere Autoren haben die räumlichen Dimensionen der Pigmentierung 38 , 39 , die Intensität der Pigmentierung eines bestimmten Häutchen Typ 23 , 25 , 39 , 40 oder die durchschnittliche Intensität der Pigmentierung über die Bauch-Tergit als Ganzes 41 , 42 , 43 quantifiziert. Dennoch messen diese Quantifizierungsmethoden nicht sowohl die Intensität als auch die räumliche Verteilung der Bauchpigmentierung gleichzeitig und erfassen daher nicht die Nuancen, wie sich die Pigmentierung über den Abd unterscheidetOminal tergite Weiterhin erfordern mehrere dieser Quantifizierungsverfahren 38 , 41 , 42 , 43 die Dissektion und Montage der Bauchhöhle. Dies ist sowohl zeitaufwändig als auch zerstört die Probe, so dass es für weitere morphologische Analysen nicht verfügbar ist. Als das Verständnis der Entwicklung und Entwicklung der Bauchpigmentierung vertieft, werden anspruchsvollere Werkzeuge zur schnellen und präzisen Messung sowohl der räumlichen Verteilung als auch der Intensität der Pigmentierung erforderlich sein.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die digitale Bildanalyse zu nutzen, um eine replizierbare und präzisere Messung der Bauchpigmentierung in D. melanogaster zu erhalten . Die Methodik umfasst drei Stufen. Zuerst wird die erwachsene Fliege zerstörungsfrei montiert und ein digitales Bild des dorsalen Bauches genommen. Zweitens, mit einem ImageJ-Makro, der BenutzerDefiniert einen anterior-posterioren Streifen von Pixeln, der sich von der vorderen Seite der a2-Nagelhaut bis zum hinteren der a5-Nagelhaut (grüner Kasten, Abbildung 1G ) auf dem dritten und vierten Bauchsegment erstreckt. Der mittlere Pixelwert über die Breite dieses Streifens wird dann entlang seiner langen Achse extrahiert, wodurch ein Profil erzeugt wird, das die räumliche Verteilung und die Intensität der Pigmentierung einfängt, wenn es sich von der vorderen zur hinteren des Tergits ändert. Drittens wird ein R-Skript verwendet, um das Pigmentprofil mathematisch mit einem kubischen Spline zu beschreiben. Das R-Skript verwendet dann das Spline und seine erste und zweite Ableitung, um die Breite der a2-a5-Nagelhaut, die Breite des Pigmentbandes und die maximale und minimale Pigmentierung zu extrahieren. Die Methode quantifiziert daher sowohl die räumlichen Eigenschaften als auch die Tiefe der Bauchpigmentierung.

Diese Methodik quantifiziert die Pigmentierung der dritten und vierten Bauch-Tergite,Die im Fokus zahlreicher früherer Studien 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 waren , entweder ausschließlich oder in Kombination mit mehr posterioren Tergiten. Obwohl weniger variabel als die fünfte und sechste Bauch-Tergite, die dritte und vierte Tergite sind nicht vollständig pigmentiert bei Männern, so dass dieses Protokoll kann sowohl für Männer und Frauen angewendet werden. Dennoch kann, wie hier gezeigt, das Protokoll verwendet werden, um die Pigmentierung in der fünften und sechsten Bauch-Tergite bei Frauen zu messen. Darüber hinaus sollten kleinere Modifikationen der Skripte, die verwendet werden, um die Eigenschaften des Pigmentierungsprofils zu extrahieren, das Verfahren zur Quantifizierung der Variation der Pigmentierung in einer Vielzahl von anderen verwendenOrganismen

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Protocol

1. Probenmontage

HINWEIS: Tote Fliegen in 70% Ethanol in Wasser vor der Bildgebung.

  1. Gießen Sie 10 ml 1,25% Agar in kochendem Wasser in einer 60 mm x 15 mm Petrischale aufgelöst und lassen Sie es einstellen.
  2. Unter einem Sektionsmikroskop verwenden Sie ein Paar Feinpinzetten, um eine ~ 20 mm ong, 2 mm breite, 1 mm tiefe Rille in der Oberfläche des Gels zu machen. Mit feinen Zangen, eingebettet die ventrale Seite einer erwachsenen Fliege in die Nut, wobei die dorsale Seite der Fliege über das Gel vorspringt.
    HINWEIS: Die Lockerheit des Gels ermöglicht eine einfache Neupositionierung ohne Beschädigung der Probe. Die gleiche Rille kann für mehrere Exemplare verwendet werden, obwohl es schmutzig, aufgebrochen und unbrauchbar mit der Zeit wird. Der Benutzer kann dann eine weitere Nut in demselben Gel machen. Jede Platte kann verwendet werden, um ~ 200 Fliegen abzubilden.
  3. Die Probe in 70% igem Ethanol vollständig in Wasser abdecken, um Lichtreflexionen aus der wachsartigen Nagelhaut zu reduzieren und die Flügelschäden zu verhindernProbekörpermanipulation.

2. Mikroskop-Setup

HINWEIS: Die Bilder werden unter Verwendung eines Sektionsbereichs, einer Durchlichtbasis, einer Digitalkamera und einer Schwanenhals-Kaltlichtquelle, die an einem Computer angeschlossen sind, der eine Bilderfassungssteuerungssoftware ausführt, aufgenommen. Software-Anweisungen sind spezifisch für Micro-Manager v1.4.20 44 , die eine Open-Source-Software ist, die ImageJ 45 enthält .

  1. Schalten Sie das Mikroskop, Digitalkamera, Doppel-Schwanenhals Kaltlichtquelle und Computer.
  2. Führen Sie die Bildaufnahme-Software aus, um ein Micro-Manager-Fenster und ein ImageJ-Fenster zu öffnen. Im ImageJ-Fenster klicken Sie auf "Image"> "Type"> "8-Bit", um alle Bilder als 8-Bit zu setzen. Klicken Sie im Mikro-Manager-Fenster auf "live", um ein Fenster "Snap / Live" zu öffnen, das eine Echtzeitvorschau von der Kamera zeigt.
    1. Maximieren Sie die Größe des "Snap / Live" -Fensters, wenn neCessary Wählen Sie im Pulldown-Menü "Display-Modus" im Register "Kontrast" des Micro-Manager-Fensters "Graustufen".
  3. Schalten Sie die kalte Lichtquelle auf ihre maximale Intensität ein und positionieren Sie die Spitzen jedes Schwanenhalses auf ca. 120 mm von der Bühne, eine auf der linken und eine auf der rechten Seite.
    HINWEIS: Die Benutzer können auch einen ringförmigen Illuminator verwenden, obwohl dies einen Ring von reflektiertem Licht um den Fliegenabdomen erzeugen kann.
  4. Manuelles Setzen der Mikroskopvergrößerung auf 60X, so dass das Gesichtsfeld eine Fläche von etwa 3 mm Durchmesser auf der Bühne einfängt.
  5. Legen Sie ein 2 mm Bühnenmikrometer auf die Bühne (Umschalten des Hintergrundes auf Weiß, wenn nötig). Beim Betrachten der Live-Vorschau konzentrieren Sie sich auf den Bühnenmikrometer und passen die Belichtung im Micro-Manager-Fenster an, indem Sie die Belichtungszeit in ms im Feld "Exposure" eingeben.
  6. Um die Kamera räumlich zu kalibrieren, wählen Sie das Werkzeug "Gerade" in tEr ImageJ Fenster und zeichne eine Linie die Länge der Bühnenmikrometer. Im ImageJ-Fenster klicken Sie auf "Analysieren"> "Set Scale", um das Fenster "Set Scale" zu öffnen, geben Sie die Länge des Mikrometers in μm in das Feld "Bekannte Distanz" ein und geben Sie "μm" in die "Längeneinheit" Box.
    1. Beachten Sie, dass das Fenster "Set Scale" dann die Skala in "Pixel / μm" anzeigt. Notieren Sie sich die Skala und klicken Sie auf "OK".
  7. Klicken Sie im Fenster "Snap / Live" auf "Stop" und dann "Snap", um ein Bild des Bühnenmikrometers zu erfassen.
  8. Speichern Sie das Bild als 8-Bit-Graustufen-TIFF, um die Möglichkeit zu gewährleisten, die Bilder bei Bedarf räumlich zu kalibrieren. Im ImageJ-Fenster klicken Sie auf "Datei"> "Speichern unter"> "Tiff ..." Geben Sie an, wo die Datei im Dateibrowser gespeichert werden soll, benennen Sie die Datei und klicken Sie auf "Speichern".
  9. Schalte die Bühne schwarz und platzEine Petrischale, die eine Fliege in Agar (Schritte 1.1-1.2) auf der Bühne montiert hat.
  10. Schauen Sie durch das Mikroskop und positionieren Sie die Fliege, um sicherzustellen, dass die dorsale Mittellinie gerade ist, um das Pigmentmuster am besten zu sehen. Bewegen Sie alle Flügel und Anhänge, um sicherzustellen, dass der Blick auf den Bauch ist ungehindert. Wenn die pigmentierte Nagelhaut (a2-a5) nicht sichtbar ist, quetschen Sie den Bauch seitlich, bis er ist (obwohl der Abdomen der Fliegen in 70% Ethanol in Wasser gespannt ist, so dass dies normalerweise nicht notwendig ist).
    HINWEIS: Bei der Positionierung der Fliege muss der Benutzer eine niedrigere Vergrößerung (20X) verwenden. Die Vergrößerung muss auf 60X zurückgesetzt werden, bevor Sie fortfahren.
  11. Manuell auf den dorsalen Abdomen der Fliege fokussieren Manuell die Spitzen der Lichtquelle einstellen, um die Schatten und die Reflexion auf dem Rückenabfall zu minimieren.
  12. Beim Betrachten der Live-Vorschau auf dem Computerbildschirm und mit dem Pixelwert-Histogramm auf der Registerkarte "Kontrast" des Micro-Manager-Fensters,Stellen Sie die Belichtung wie in Schritt 2.4 beschrieben ein, um den Bereich der Pixelwerte des Vorschaubildes zu maximieren.
  13. Entfernen Sie die Fliege und Petrischale und ersetzen Sie sie mit einer LED (spektrale Ausgabe von 430-660 nm), die an einen Spannungsmesser angeschlossen ist, der im Sichtfeld an der gleichen Position wie die Fliege zentriert ist. Verwenden Sie die LED und den Spannungsmesser als Lichtzähler 46 und notieren Sie die Spannung, die durch das auf die LED auftreffende Licht (~ 125 mV) erzeugt wird.
    HINWEIS: Der LED- und Spannungsmesser wird verwendet, um sicherzustellen, dass die Lichtwerte über mehrere Bildgebungssitzungen in einem einzigen Experiment konstant sind.
  14. Für die Dauer des Experiments darf die Position oder Intensität der Lichtquelle, die Vergrößerung des Mikroskops oder die Belichtung der Kamera nicht weiter verändert werden.

3. Probenbildgebung

  1. Legen Sie eine Petrischale mit einer Fliege in Agar (Schritte 1.1-1.3) auf dem schwarzen Mikroskopstadium montieren. Stellen Sie die Position der Fliege so ein, dass die dritte und vierteH Abdominalsegmente sind sichtbar und die dorsale Mittellinie ist gerade, wie in Schritt 2.9 beschrieben. Stellen Sie sicher, dass die Vergrößerung bei 60x ist, bevor Sie fortfahren.
  2. Manuell fokussieren Sie das Mikroskop so, dass die dritte und vierte dorsale Bauch-Tergite im Fokus sind. Verwenden Sie die Bildaufnahme-Software, um ein Bild als 8-Bit-Graustufen-TIFF zu erfassen, wie in Schritt 2.6 beschrieben.
    HINWEIS: Das Bild kann farbig aufgenommen und anschließend zur Analyse in Graustufen umgewandelt werden.
  3. Speichern Sie das Bild als "SESH000_sampleID.tiff", wie in Schritt 2.7 beschrieben.
    HINWEIS: Hier ist [SESH] konstant, [000] ist die Sitzungsnummer und ist variabel, muss aber drei Ziffern lang sein und [sampleID] ist was auch immer der Benutzer wünscht, obwohl er keine zusätzlichen Unterstrichzeichen (_) enthalten muss Muss eine konstante Länge haben. [SampleID] sollte Details der Faktoren enthalten, die bei der Analyse der Pigmentierungsdaten ( z. B. Temperatur oder Abstammung) verwendet werden, die durch ein unverwechselbares Nicht-Alphabeti getrennt sindCal-Charakter, wie ein Bindestrich (-). Dies ermöglicht es, diese Faktoren einfach aus [sampleID] unter Verwendung von standardisierter statistischer Software zu analysieren.
  4. Entfernen Sie die Petrischale von der Bühne und ersetzen Sie die Fliege mit dem nächsten Exemplar. Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.3, bis alle Exemplare abgebildet wurden, ohne die Beleuchtungsstärke, die Vergrößerung oder die Belichtung weiter einzustellen.

4. Imaging über mehrere Sessions

  1. Wenn Bilder über mehrere Sitzungen aufgenommen werden müssen, pflegen Sie die Lichtintensität, die Belichtung und die Vergrößerung über die Sitzungen. Prüfen Sie zu Beginn jeder Sitzung die räumliche Kalibrierung der Kamera (Schritt 2.4) und die Lichtintensität auf der Bühne (gemessen am LED / Spannungsmesser, Schritt 2.12).
  2. Erfassen und Speichern eines Bildes des Bühnenmikrometers (Schritte 2.5-2.7), um die Möglichkeit zu gewährleisten, die Bilder bei Bedarf räumlich zu kalibrieren.
  3. Verwenden Sie mindestens 15 Kontrollproben und geben Sie sie nach dem Zufallsprinzip in jeder Sitzung nach allo vorW für die Erkennung und Beseitigung von Session-Effekten. Stellen Sie sicher, dass doppelte Kontrollproben zwischen den Sitzungen die gleiche [sampleID] aber unterschiedliche [SESH000] haben.
    ANMERKUNG: Die Kontrollproben sind Fliegen, die gesammelt, gespeichert und identisch an experimentelle Exemplare angebracht werden, aber über Sessions neu abgebildet werden. Die genaue Anzahl der Kontrollproben hängt vom experimentellen Setup des Benutzers ab. Weitere Details finden Sie in der Diskussion.

5. Bildanalyse

HINWEIS: Die Bildanalyse wird in ImageJ 45 durchgeführt und verwendet das Makro "Measurement of Pigmentation.ijm", das als Ergänzungsdatei zur Verfügung gestellt wird.

  1. Platzieren Sie alle zu analysierenden Bilder im selben Ordner.
  2. Starten Sie ImageJ und führen Sie das Makro "Measurement of Pigmentation.ijm" durch Klicken auf "Plugins"> "Macro"> "Run", "Auswählen von" Pigmentation.ijm "im Dateibrowser und klicken Sie auf"öffnen."
    HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte befinden sich im Makro. Jeder Schritt ist ein einzelner Makrobefehl.
  3. Beachten Sie, dass ein Dialogfeld "Action Required" geöffnet wird, unter Angabe von "Wählen Sie den Ordner, in dem Bilder gespeichert sind". Klicken Sie auf "OK" und verwenden Sie den Dateibrowser, um den Ordner auszuwählen, der die Bilder enthält, und klicken Sie dann auf "Auswählen".
  4. Beachten Sie, dass ein Dialogfeld "Action Required" geöffnet wird, indem Sie "Wählen Sie den Ordner, in dem die Daten gespeichert werden sollen". Klicken Sie auf "OK" und wählen Sie mit dem Dateibrowser den gewünschten Ordner zum Speichern der Pigmentprofile aus. Klicken Sie auf "wählen".
  5. Beachten Sie, dass sich ein Dialogfeld öffnet und "Wie viele Zeichen in Ihrer Beispiel-ID?" Geben Sie im Eingabefeld Eingabe die Anzahl der Zeichen in [SampleID] ein, wie in Schritt 3.3 angegeben, und klicken Sie auf "OK".
  6. Beachten Sie, dass ein Dialogfenster geöffnet wird und fragt: "Wie weit ist dein ROI?" Geben Sie im Eingabefeld Eingabe die Pixelbreite des anterior-Posteriorer Streifen, entlang dem das Pigmentierungsprofil zu lesen ist (grünes Rechteck, Abbildung 1G , Abbildung 2A und 2A '). OK klicken;" Die Voreinstellung ist 20 Pixel.
    ANMERKUNG: Das Pigmentprofil wird über einen Streifensäge und nicht durch eine Linie gelesen, um Lärm durch Haare und Borsten zu reduzieren. Die Breite dieses Streifens hängt von der Auflösung des Bildes ab, aber es sollte ~ 1 / 20th der Breite des Bauches in Pixeln sein.
  7. Beachten Sie, dass das Makro das Bild der ersten Fliege öffnet und ein Dialogfenster fragt, ob die aktuelle Fliege zu messen ist (klicken Sie auf "Ja"), um zur nächsten Fliege zu gelangen (klicken Sie auf "Nein") oder um das zu verlassen Makro (klicken Sie auf "Abbrechen").
  8. Beachten Sie, dass sich ein Dialogfeld öffnet, unter Angabe von "Definieren Sie die Mittellinie des dorsalen Abdomens, von ANTERIOR bis POSTERIOR". Das Werkzeug "Gerade Linie" wird bereits ausgewählt. Zeichne eine Linie von vorne nach hintenUm die Mittellinie des dorsalen Bauches zu definieren. OK klicken;" Siehe Abbildung 2A und 2A ', gelbe Linie.
    HINWEIS: Dies wird verwendet, um das Bild neu auszurichten, so dass die dorsale Mittellinie horizontal über dem Bildschirm liegt, mit dem vorderen auf der linken Seite, wodurch die nachfolgenden Schritte erleichtert werden.
  9. Beachten Sie, dass sich ein Dialogfeld öffnet, unter Angabe von "Definieren Sie die POSTERIOR-Kante von Tergite 4 direkt hinter dem Pigmentband." Das Werkzeug "Gerade Linie" wird bereits ausgewählt. Zeichnen Sie eine Linie von der hinteren Mittellinienkante zur rechten Seitenkante, so dass die Mitte der Linie (markiert durch ein weißes Quadrat) gerade nach hinten zum hinteren Rand des Pigmentbandes (Nagelhaut a5) sitzt. OK klicken;". Siehe Abbildung 2A und 2A ', Magenta-Linie.
    HINWEIS: Das R- Skript erkennt automatisch die hintere Kante des Pigmentbandes aus dem Pigmentprofil.
  10. Beachten Sie, dass ein DialogKasten öffnet sich und sagt: "Definiere die ANTERIOR Kante von Tergite 4 an der vorderen Kante der pigmentierten Nagelhaut (a2)." Das Werkzeug "Gerade Linie" wird bereits ausgewählt. Zeichnen Sie eine Linie von der vorderen Mittellinie zur rechten Seitenkante, so dass die Mitte der Linie (markiert durch ein weißes Quadrat) am vorderen Rand der pigmentierten Nagelhaut (Nagelhaut a2) sitzt. OK klicken;". Siehe Abbildung 2A und 2A ' , Cyan-Linie.
    HINWEIS: Das R- Skript definiert diesen Punkt als die vordere Kante der pigmentierten Nagelhaut der Tergite. Auf dem Bild zeigt das Makro den interessierenden Bereich (ROI) an, entlang dem das Pigmentierungsprofil gelesen wird (grünes Rechteck, Fig. 2A und 2A ', vergrößert in Fig. 2B und 2B '). Das Makro öffnet auch ein zweites Fenster mit dem Pigmentprofil für den ROI ( Figur E 2C und 2C '), wobei die x-Achse die Position ist, ausgedrückt als Anzahl der Pixel von der hinteren Kante des Profils, und die y-Achse ist der durchschnittliche Pixelwert an jeder Position.
  11. Sehen Sie sich die Plots des Pigmentierungsprofils an, das vom Makro geöffnet wird. Wenn nötig, klicken Sie im Profilfenster auf "Live", um die Position des ROI so einzustellen, dass es keine Strukturen ( zB Borsten) enthält, die das Pigmentprofil beeinflussen würden. Sobald das Profil zufrieden stellend ist, klicken Sie auf "OK".
  12. Wiederholen Sie die Schritte 5.8-5.11 für Tergite 3.
    HINWEIS: Das Makro exportiert dann die Pigmentierungsprofile als zwei CSV-Dateien, die jeweils "SESH000_samplename_TX_profile.csv" genannt werden, wobei [SESH000_samplename] der Bildname ist und [TX] entweder T3 oder T4 für die dritte und vierte Tergite ist.
  13. Beachten Sie, dass das Makro das nächste Bild öffnet. Wiederholen Sie die Schritte 5.7-5.13, bis alle Bilder analysiert wurden.
Jove_title "> 6. Datenvorverarbeitung, Analyse und Sitzungskorrektur

HINWEIS: Alle Datenanalyse wird in R 47 durchgeführt und verwendet das Skript "Analyse von Pigmentation.R". Unten, "L ..." gibt an, welche Zeile (n) des Skripts für jeden Teil der Analyse laufen soll. Weitere Informationen darüber , wie die Analyse durchgeführt wird, finden Sie in den ergänzenden Informationen.

  1. Bearbeiten Sie das R- Skript, um das Arbeitsverzeichnis (L6) einzustellen und den Dateipfad in den Ordner zu definieren, der die .csv-Profile enthält (L11).
  2. Führen Sie L13-15 aus, um eine Liste der im Profilordner gespeicherten Pigmentierungsprofile zu erzeugen.
  3. Laden und führen Sie die Funktionen "Leser" und "addPrimaryKey" (L17-41), um die Profile in einem einzelnen Datenrahmen zu lesen.
  4. Bearbeiten Sie das Skript bei L43, um die räumliche Kalibrierung der Bilder in μm / Pixel anzugeben, wie in Schritt 2.5 bestimmt.
  5. Laden und führen Sie die "adjusTionen "-Funktion (L46-58), um die Profilposition (x-Achse, Abbildung 2C und 2C ') von Pixeln von-posterior-edge-of-ROI zu μm-von-anterior-edge-of-ROI und dem zu konvertieren Profilwert (y-Achse, Bild 2C und 2C ') vom Pixelwert (0 = schwarz, 255 = weiß) zum Pigmentierungswert (0 = kein Pigment, 255 = maximales Pigment).
  6. Laden Sie die Funktion "spline.der.er" (L60-71), um die kubische Spline der Pigmentierungsprofile und ihre ersten und zweiten Ableitungen zu erzeugen ( Abbildung 2D - 2F und 2D '- 2F ').
  7. Laden Sie die "coord" und "assmbly.coord" -Funktionen (L74-163), um zuerst die Position der hinteren (T 3 ) und anterior (T 2 ) Kanten des Pigmentbandes zu extrahieren (Abbildung 2D und 2D '(T1, Fig. 2D und 2D ') und dann die maximalen (P max ) und minimalen (P min ) Pigmentierungswerte, die bei T 3 bzw. T 1 aufgenommen wurden, extrahieren.
    HINWEIS: Die vordere Kante der a2-Nagelhaut wurde bereits in Schritt 5.9 definiert.
  8. Optional: Laden und starten Sie die Funktion "chek" (L165-175), um zu prüfen, ob die "Coord" -Funktion die Positionen T 1-3 für ein zufällig ausgewähltes Pigmentprofil korrekt identifiziert.
  9. Laden Sie die Index- und Metrikfunktionen (L178-193), um eine Datentabelle mit den Überschriften "Session", "Sample", "Tergite", "id" (eine Verkettung von Sample und Tergite), "P max ", zu erzeugen. "P min ", "W- Band " (Breite des Pigmentbandes, = T3 - T 2 ) und "W tergit " (Breite des pigmentierten cUticles a2-a5, = T 3 ).
  10. Laden und starten Sie die Funktion "Korrektur" (L196-234), um eine Datentabelle zu erzeugen, die P max und P min für irgendwelche Störungsfaktoren korrigiert, die durch Session-Effekte entstehen. Verwenden Sie die durchschnittliche Erhöhung (oder Abnahme) in P max oder P min von den Kontrollproben, die über die zeitlich benachbarten Sitzungen neu abgebildet wurden.

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Representative Results

Das Protokoll wurde verwendet, um die Wirkung der Aufzuchttemperatur auf die Bauchpigmentierung zu untersuchen. Frühere Studien haben gezeigt, dass eine Erhöhung der Entwicklungstemperatur zu einer Verringerung der Ausbreitung der Bauchpigmentierung bei mehreren Arten von Drosophila führt , einschließlich D. melanogaster 30 , 32 . Speziell bei den Bauch-Tergiten 3 und 4 nimmt das Ausmaß der Pigmentierung (Breite des Pigmentbandes) von 17 ° C auf 25 ° C ab und bleibt von 25 ° C bis 28 ° C 24 , 36 gleich . Diese Studien haben das Ausmaß der Pigmentierung auf einer 1-10-Skala (0: kein Pigmentband, Tergit vollständig gelb, 5: Pigmentband belegt 50% der Tergite, 10: Tergit ganz dunkel). Um festzustellen, ob die quantitative Methodik diese phänotypische Plastizität einfangen könnte, wurde die Pigmentierung in th gemessenE dritte und vierte Bauch-Tergite einer isogenen Linie von angeblich Wildtyp-weiblichen Fliegen, von Ei zu Erwachsenen bei 17 ° C (sieben Fliegen), 25 ° C (neun Fliegen) und 28 ° C (neun Fliegen) aufgezogen. Um die Wirksamkeit des Korrekturverfahrens bei der Beseitigung von Störungsfaktoren zu bestimmen, die durch Session-Effekte eingeführt wurden, wurde die Pigmentierung der gleichen Fliegen neu abgebildet und erneut gemessen, zwei, vier und acht Tage später. Die Beleuchtungsbedingungen und die Belichtung zwischen den Sitzungen wurden jedoch absichtlich geändert, um sicherzustellen, dass es Session-Effekte für das Korrekturverfahren zu entfernen gab. Die Bilder wurden auf dem Dryad Digital Repository veröffentlicht.

Die erste Frage war, ob es systematische Unterschiede in den Pigmentierungsmaßnahmen in den Sitzungen gab. Dies wurde unter Verwendung des lme4- Pakets in R 48 untersucht , um die gemischten Modelle M ijk = S i + A j + zu passenΕ ijk und M ij = a j + ε ij sowohl für P max als auch für p min , wobei M das Pigmentmaß ist, S die Sitzung (zufälliger Effekt) ist, A die abdominale Tergite ist (zufälliger Effekt) und ε ist Der Restfehler (Indizes sind Ebenen innerhalb von Variablen). Ein Protokoll-Likelihood-Verhältnis-Test wurde verwendet, um zu testen, ob die Einbeziehung der Sitzung als zufälliger Faktor die Passung wesentlich verbessert hat; Es tat ( Tabelle 1 ). Wie erwartet, zeigte die Untersuchung der Varianzkomponenten (erzeugt durch REML 48 ), dass die Variation aufgrund von Session-Effekten 67% bzw. 70% der Gesamtabweichung in P max bzw. P min ausmachte ( Tabelle 1 ).

Fünfzehn zufällig ausgewählte Kontroll-Tergite (entweder dritte oder vierte, aus Fliegen reaRot bei 17 ° C, 25 ° C oder 28 ° C) wurden ausgewählt, und Änderungen in ihrem mittleren P max und P min wurden verwendet, um die Pigmentierungsmaßnahmen der verbleibenden Tergite über Sitzungen zu korrigieren. Die Wiederholung der Analyse der korrigierten Pigmentierungsmaßnahmen beseitigte die Session-Effekte ( Tabelle 1 ) und reduzierte den Prozentsatz der Gesamtabweichung aufgrund von Session-Effekten auf Null. Der Restfehler ist eine Schätzung, ein Messfehler, nachdem die Session-Effekte entfernt wurden, und war 22% bzw. 27% für P max bzw. P min ( Tabelle 1 )

Als nächstes wurden die korrigierten Daten verwendet, um zu bestimmen, ob die Wirkung der Temperatur auf verschiedene Aspekte der Pigmentierung und Größe festgestellt werden konnte. Das gemischte Modell M ijkm = T i * D j + X k + ε ijkm wurde an die Daten angepasst , wobei T D ist die Tergite (dritte oder vierte), und X ist die individuelle Fliege (zufälliger Faktor). Da die Beziehung zwischen Pigmentierung und Temperatur nicht linear 24 , 36 ist , wurde T als kategorischer Faktor behandelt. Die maximalen und minimalen Pigmentmengen ( P max und P min ) und die Breite des Pigmentbandes und des Tergits ( W- Band und W tergite ) wurden getestet. Die Wirkung der Temperatur auf die relative Breite des Pigmentbandes ( R- Band = W- Band / W- Tergit ) wurde ebenfalls getestet. Die Daten zeigten, dass die absolute (W- Band- ) und relative ( R- Band- ) Breite des Pigmentbandes von 17 ° C auf 25 ° C (Tukey-post-hoc-Test, P <0,05 für alle) abnahm und sich nicht signifikant von 25 änderte ° C bis 28 ° C (Tukey Post-hoc-Test, Tabelle 2 , Abbildung 3A und 3B ), was mit den bisherigen Studien 24 , 36 übereinstimmt. Das gleiche Muster wurde für die maximale und minimale Pigmentierung, P max und P min ( Tabelle 2 , Abbildung 3C ) beobachtet. Die Wirkung der Temperatur auf dem Pigmentniveau ist bisher nicht beschrieben worden, aber es scheint zunächst mit anderen Studien übereinzustimmen, die zeigen, dass die minimale Pigmentierung im vierten Bauchgewebe positiv mit der Breite des Pigmentbandes in Wildtyppopulationen korreliert ist 39 . Allerdings zeigen die Daten aus dieser Studie eine positive Beziehung zwischen P max und W Band , sie zeigen jedoch eine negative Beziehung zwischen P min und W Band( Tabelle 3 ). Dieser Unterschied zwischen den aktuellen und früheren Studien kann Unterschiede in der Frage, wie genetische und Umweltfaktoren die Korrelation zwischen dem Niveau und dem Ausmaß der Bauchpigmentierung beeinflussen, widerspiegeln. Dennoch zeigen diese repräsentativen Ergebnisse, dass das Protokoll nicht nur die bereits durch qualitative Methoden etablierten Pigmentmuster identifizieren kann, sondern auch neue, die qualitative Methoden nicht erkennen können.

Die Wirkung der Temperatur auf die Breite der Tergite war komplexer. In D. melanogaster , Körper- und Orgelgröße fallen nicht linear mit der Temperatur 49 ab . Frühere Studien deuten darauf hin, dass die Breite des fünften Bauch-Tergits um 10% von 16,5 ° C auf 25 ° C und weitere 4% von 25 ° C auf 29 ° C abnimmt . Zwar gab es eine nicht signifikante Abnahme der Breite vonDer vierte Bauch-Tergit von 17 ° C bis 25 ° C, sowohl die dritte als auch die vierte Bauch-Tergite in der Breite von 25 ° C bis 28 ° C ( Tabelle 2 , Abbildung 3D ). Da die Breite der Bauch-Tergite im Wesentlichen durch den Benutzer definiert ist (Schritte 5.9-5.10 im Protokoll), ist es unwahrscheinlich, dass die Unterschiede zwischen den aktuellen und früheren Studien auf die Art und Weise zurückzuführen sind, wie die R- Skript Wpergite aus dem Pigmentierungsprofil extrahiert. Vielmehr kann es Unterschiede in der Art und Weise, in der das Bauchsegment gemessen wird, in den Genotypen der Fliegen und in den genauen Aspekten der abdominalen Tergiten, die gemessen werden, reflektieren.

Die nächste Frage stellte sich dar, ob die Methodik Daten generieren könnte, die mit Daten vergleichbar sind, die mit vorhandenen Pigmentmessungen bewertet wurden. Diese Methoden fordern den Betrachter in der Regel auf, jede Fliege subjektiv einer Rippe zuzuordnenDie Anzahl der phänotypischen Klassen, die auf dem Ausmaß der Pigmentierung 15 , 30 , 32 , 33 , 34 basieren und daher auf die Fähigkeit des Beobachters beruhen, die Breite des Pigmentbandes zu beurteilen. Um zu prüfen, wie gut diese objektive Methode mit subjektiven Methoden vergleichbar ist, wurden fünf Beobachter aufgefordert, 45 Bilder von weiblichen Abdomens auf der Grundlage der Breite des Pigmentbandes des vierten Bauch-Tergits zu ordnen. Die durchschnittliche Rangfolge über Beobachter wurde mit dem Ranking auf der Basis von W- Band verglichen , gemessen mit dieser Methodik. Es gab eine starke Korrelation zwischen dem subjektiven und objektiven Ranking ( Ergänzende Abbildung 1 , in Ergänzende Information.pdf), Spearmen's = 0.7342, P <0,0001).

Eine andere Frage gestelltWar, wie diese Methode, um W- Band aus dem Pigment-Spline zu extrahieren, verglichen mit der Messung der Breite des Pigmentbandes von Hand (visuelle Methode) mit dem linearen Messwerkzeug in ImageJ . Wieder wurde eine starke Korrelation zwischen den unter Verwendung der beiden Methoden gesammelten Daten gefunden ( Ergänzende Abbildung 2 , Ergänzende Information.pdf, OLS, r 2 = 0,49 , P <0,0001). Obwohl das Berechnungsverfahren das Pigmentband als schmaler als im "visuellen" Verfahren konsequent gemessen hat, war der Regressionskoeffizient nicht signifikant unterschiedlich als 1 ( P> 0,05).

Die letzte Frage stellte fest, ob diese Methodik zur Messung der Bauchpigmentierung in anderen Kontexten verwendet werden könnte. Die Methodik könnte die P max , P min , W Band und W tergite für die f extrahierenIfth und sechsten Bauch-Tergite bei Frauen und die dritte und vierte Bauch-Tergite bei Männern (Abbildung 4 ). Darüber hinaus könnte die Methodik verwendet werden, um die Zunahme von P max und P min in Fliegenmutanten für Ebenholz ( e 1 ) zu quantifizieren, die eine Zunahme der cutikulären Pigmentierung über den Körper und eine spezifische Zunahme der Pigmentierung der Nagelhaut vor dem Pigment zeigen Band 28 ( Fig. 4 ).

Abbildung 1
Abbildung 1: Bauchpigmentierung in D. melanogaster . ( A - F ) Variation der Bauchpigmentierung bei Weibchen von zwei Genotypen, die bei drei Temperaturen (17 ° C, 25 ° C und 28 ° C) aufgezogen wurden. A3 und A4 sind die dritte und vierte Bauch-Tergi Tes. ( G ) Die dorsale Bauch-Tergite umfasst ein vorderes und hinteres Kompartiment, von denen nur Teile in ungedehnten Abdomen zuverlässig sichtbar sind. Die Fächer sind weiter unterteilt in verschiedene Nagelhautarten: a1: unpigmentiert, keine Haare; A2: leicht pigmentiert und haare; A3: leicht pigmentiert, Haare und mäßige Borste; A4: dunkel pigmentiert, haare und mäßige borste; A5: dunkel pigmentiert, haare und große borste; A6: unpigmentiert und haare; P3: unpigmentiert und haare; P2: unpigmentiert und keine Haare; Und p1: unpigmentiert und tesselliert. Das Pigmentband besteht aus Nagelhaut a4 und a5. In der Analyse werden nur pigmentierte Nagelhaut (a2-a5, grüne Box) verwendet. Maßstäbe = 200 μm in (AF). Der Kontrast aller Bilder wurde angepasst, um das Pigmentmuster hervorzuheben, und die Bilder sind illustrativ. Unbereinigte Bilder, die zur Erzeugung der repräsentativen Ergebnisse verwendet werden, werden auf dem Dryad Digital Repository hinterlegt..com / files / ftp_upload / 55732 / 55732fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Bild- und Datenanalyse zur Quantifizierung der Bauchpigmentierung ( A - F ) und ( A - F ) sind für verschiedene Exemplare und zeigen, wie sich die Analyse mit Bildern unterschiedlicher Qualität beschäftigt. ( A ) Der Benutzer definiert zunächst die Mittellinie des Bauches (gelbe Linie), die vordere Kante der Tergite (Cyanlinie) und eine Linie etwas hinter der hinteren Kante des Pigmentbandes (magentafarbene Linie). Das ImageJ-Makro zeichnet dann eine Linie aus dem Mittelpunkt der vorderen und hinteren Linien (weiße gestrichelte Linie), die es erweitert, um einen ROI (Black Box) zu bilden, vergrößert in ( B ). ( C ) Das ImageJ-Makro dann exDen durchschnittlichen Pixelwert entlang der anterior-posterioren Achse des ROI. Beachten Sie, dass in diesem Stadium das Profil von hinten nach vorne gelesen wird. ( D - E ) Das R - Makro wandelt die mittleren Pixelwerte in einen Pigmentierungswert um, kehrt die Richtung des Pigmentierungsprofils um, passt mit einem kubischen Spline ( S (x) ) ( D ) und berechnet die erste ( S (x) ) ) ( E ) und der zweiten ( S (x) ) - Ableitung des Splines ( F ). Das Skript identifiziert dann: T 3 die Position der maximalen Pigmentierung, wobei S (x) von <0 bis> 0 übergeht und sich von der hinteren Seite des Splines nach vorne bewegt; T 2 , die Position, wo der Abfall der Pigmentierung am größten ist und S (x) maximal ist; Und T & sub1 ; , die Position, wo die Tergitpigmentierung auf ihrem Minimum ist und S (x) von> 0 bis <0 übergeht und sich nach vorne bewegtRom T 2 ,. Der vordere der zuverlässig sichtbaren Tergite (anterior der Nagelhaut a2) wird vom Benutzer definiert. (AF) In Fällen, in denen die erste Ableitung nicht verwendet werden kann, um T & sub1 ; zu finden, wird typischerweise, weil S (x) nicht 0 nach vorne an das Pigmentband kreuzt, T 1 als die Position definiert, in der S (x) von> übergeht 0 bis <0 bei der Verschiebung nach vorne von T 2 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Die Wirkung der Temperatur auf verschiedene Aspekte der Bauchpigmentierung bei weiblichen D. melanogaster . ( A ) Breite des Pigmentbandes ( W- Band , F.Igure 1). ( B ) Pigmentband als Anteil an Tergit ( R- Band ). ( C ) Maximal ( P max , obere Linien) und minimale ( P min , untere Linien) Pigmentierung. ( D ) Breite der Tergite ( W tergite ). Die Punkte sind am wenigsten quadratisch aus linearen Mixed-Effect-Modellen (Tabelle 2). Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler dar und können durch die Marker verdeckt werden. Die schwarze Linie ist die dritte Bauch-Tergite. Die graue Linie ist die vierte Bauch-Tergite. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Unterschiede in der Pigmentierung zwischen der dritten und vierten Bauch-Tergite. Dies wird in ( A Ebenholz 1 Weibchen, ( B ) Wildtyp-Weibchen, ( C ) Wildtyp-Männchen und die fünfte und sechste Bauch-Tergite bei Wildtyp-Weibchen. ( D ) Maximale Pigmentierung, P max . ( E) Minimale Pigmentierung, P min . ( F ) Breite des Pigmentbandes, W- Band . ( G ) Relative Breite des Pigmentbandes, R- Band . Bars mit verschiedenen Buchstaben sind signifikant unterschiedlich (Tukey HSD Post-hoc-Test, P <0,05). N = 6 für alle außer Ebenholz 1 , wobei N = 4. Maßstäbe = 200 μm in ( A - C ). Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler dar. Der Kontrast aller Bilder wurde angepasst, um das Pigmentmuster hervorzuheben, und die Bilder sind illustrativ. Bitte cliCk hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

<Td> 4,08 (78%)
Modellvergleich Abweichung Komponenten (% der Gesamtmenge)
Pigmentierung Modell Df Log-likelihood X² Gleichung (%) Gleichung (%) Gleichung (%)
P max unkorrigiert M ij = A i + ε ij 3 -678.28 1.94 (14%) 11,86 (86%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -457,95 440,66 *** 4,08 (26%) 10,71 (67%) 1,14 (7%)
P min Unkorrigiert M ij = A i + ε ij 3 -875.03 6,05 (9%) 59,39 (91%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -664,58 420,91 *** 16,67 (22%) 53,08 (70%) 6,31 (8%)
P max korrigiert M ij = A i + ε ij 3 -445,05 1,15 (22%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -444,88 0,3378 4,08 (78%) 0,01 (& lt; 1%) 1,14 (22%)
P min korrigiert M ij = A i + ε ij 3 -649,9 16,67 (73%) 6,24 (27%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -649,9 0 16,67 (73%) 0 6,31 (27%)

Tabelle 1: Lineare Mixed-Effect-Modelle der Wirkung von Tergite und Session. Lineare Mixed-Effect-Modelle der Wirkung von Tergite und Session auf aBdominale Pigmentierung ( P max und P min ) von 50 Tergiten, die über fünf Sitzungen neu gemessen wurden, wobei die Varianzkomponenten durch REML geschätzt wurden. Modelle waren lineare Mixed-Effect-Modelle. M : Pigmentierungsmaß; A : Einzelne Tergite gemessen; S : Session; Ε : Restfehler Signifikante X² sind fett dargestellt. * P <0,05 ** p <0,01. P <0,001.

Merkmal Temperatur Tergite Temperatur
X Tergite
P max F- ratio 8.14 55,59 6.6
P 0,002 <0,001
P min F- ratio 4.41 66.11 6.36
P 0,026 <0,001 0,002
W Band F- ratio 113,93 0,01 0,64
P <0,001 0,931 0,531
W tergite F- ratio 1,79 0,92 5.11
P 0,191 0,338 0,007
R- Band F- ratio 27.66 0,08 1,46
P <0,001 0,782 0,23

Tabelle 2: Einfluss der Temperatur und der Tergitidentität. Die Wirkung von Temperatur und Tergite Identität Auf verschiedene Aspekte der Bauchpigmentierung in 50 Tergiten, die über fünf Sitzungen neu gemessen wurden. Modelle waren lineare Mixed-Effect-Modelle, mit Einzelfliege als zufälliger Faktor enthalten. P max : Maximale Pigmentierung (korrigiert); P min : Minimale Pigmentierung (korrigiert); W Band : Breite des Pigmentbandes; W tergite : Breite der Tergite; R- Band : Relative Breite des Pigmentbandes Signifikante feste Faktoren sind fett dargestellt ( P < 0,05).

Abfangen W Band Temperatur Tergite
17˚C 25˚C Dritte
P max Β 234,35 0,069 0,063 -1.178 -0,588
F 29.93 5,97 54,82
P <0,001 0,008 <0,001
P min Β 223,96 -0.137 3.931 -3.024 -1,54
F 19.33 Span = "2"> 9.66 62.02
P <0,001 0,001 <0,001

Tabelle 3: Einfluss der Pigmentbandbreite, Temperatur und Tergitidentität auf die Pigmentierung. Wirkung der Pigmentbandbreite, Temperatur und Tergitidentität auf der Pigmentierung in 50 Tergiten, die über fünf Sitzungen neu gemessen wurden. Modelle waren lineare Mixed-Effect-Modelle, mit Einzelfliege als zufälliger Faktor enthalten. P max : Maximale Pigmentierung (korrigiert); P min : Minimale Pigmentierung (korrigiert); W Band : Breite des Pigmentbandes; R- Band : Relative Breite des Pigmentbandes

Ergänzende Datei 1. Ergänzende Informationen.Y_Information.pdf "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2. Analyse der Pigmentation.R Skript. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 3. Messung von Pigmentation.ijm Klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen .

Simulation R Skript. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Diese Methodik ermöglicht die präzise, ​​schnelle und wiederholbare Erfassung von Pigmentierungsdaten in quantitativer Form, die für mehrere nachgeschaltete Analysen geeignet ist. Die Methode wurde verwendet, um Daten über die Wirkung der Temperatur auf die Bauchpigmentierung in einer isogenen Linie von Fliegen zu erwerben. Allerdings könnte die Methodik in Forward-Genetics-Studien verwendet werden, um Gene zu identifizieren, die den Pigmentierungsunterschieden zwischen Individuen, Populationen oder Spezies zugrunde liegen, oder reverse-genetische Studien, um die Effekte spezifischer Gene auf Pigmentierungsmuster zu untersuchen. Obwohl, wie oben diskutiert, gab es unzählige Studien, die die Entwicklung und Evolution von D. melanogaster Pigmentierung erforscht haben, die Präzision, mit der diese Methode Pigmentierungsdaten in quantitativer Form einfängt, ermöglicht leistungsfähigere statistische Ansätze. Dies wiederum ermöglicht es Forschern, weniger Proben bei der Analyse von Pigmentierungsmustern zu verwenden, oder erlaubt ihnen, subtiler zu klärenAspekte der Pigmentierung. Darüber hinaus erfordert dieses Verfahren keine Sezierung der Fliege, so dass die Probe anschließend für zusätzliche Analysen wie morphologische Messungen oder Genotypisierung verwendet werden kann. In der Tat könnte die Methodik möglicherweise auf anästhesierte Fliegen verwendet werden, die dann selektiv auf der Grundlage ihrer Pigmentierungseigenschaften gezüchtet werden könnten.

Ein potentielles Problem bei der Messung der Pigmentierung durch die Bildanalyse ist, dass die Pigmentierungswerte die Belichtungs- und Lichtverhältnisse widerspiegeln können, unter denen ein Bild aufgenommen wurde, anstatt die Pigmentierung selbst. Bei der Verwendung von festen Beleuchtungsniveaus, Lichtpositionen, Vergrößerung und Belichtung hilft, diese Probleme zu lindern, ist es wahrscheinlich, dass es immer noch notwendig ist, mehrere Wiederholungssteuerbilder in jeder Sitzung zu nehmen, um die Session-Effekte vollständig zu kontrollieren. Diese Methode umfasst die Re-Imaging von fünfzehn Kontrollproben jeder Sitzung und unter Verwendung der Änderungen zwischen den Sitzungen in P maX und P min zur Erkennung und Beseitigung von Session-Effekten. Allerdings hängt die genaue Anzahl von Kontrollproben, die neu abgebildet werden sollen, von der bildgebenden Hardware und der verwendeten Software ab, dem Aspekt der Pigmentierung, die für den Benutzer von Interesse ist, und wie variabel es zwischen Behandlungen ist und wie viele Bilder in jedem aufgenommen werden Session. Die Durchführung eines Vorversuchs, bei dem die gleichen Exemplare über fünf Sitzungen neu abgebildet werden, ermöglicht es dem Benutzer, die Varianz aufgrund von Session-Effekten, der Varianz aufgrund der Probenidentität und der Restvarianz zu berechnen (was eine Schätzung des Messfehlers nach der Korrektur ist Für Sitzungseffekte) ( Tabelle 1 ). Diese Werte können dann verwendet werden, um zu schätzen, wie viele Steuerbilder in jeder Sitzung aufgenommen werden müssen, um Session-Effekte zu erkennen und zu steuern. Ein einfaches R- Skript wurde geschrieben und verwendet Daten aus einem solchen Vorversuch, um Pigmentierungsmaßnahmen über Sessions zu simulieren. Es kann benutzt werdenUm zu überprüfen, ob die Anzahl der Steuerbilder pro Sitzung ausreicht, um die Sitzungseffekte zu entfernen. Dieses Skript wird als Ergänzungsdatei bereitgestellt.

Wenn die Benutzer besorgt sind, dass es in den Sitzungen Störungsfaktoren gibt, können sie auch die gleiche Probe während der gesamten Sitzung mehrfach wiederherstellen, wie in John et al., 2016 41 beschrieben. In diesem Fall muss [sampleID] für die einzelne Kontrollprobe jedes Mal geändert werden, wenn es innerhalb einer Sitzung neu abgebildet wird ( z. B. control1, control2, control3 usw. ); Andernfalls ersetzt die Imaging-Software das vorherige Bild durch das neue Bild mit dem gleichen Namen. Die Korrekturfunktion stützt ihre Korrektur auf doppelte Bilder mit der gleichen [sampleID] zwischen zeitlich benachbarten Sitzungen und korrigiert, ob die gleiche Probe mehrmals innerhalb und zwischen den Sitzungen neu abgebildet wird oder ob derselbe Satz von Kontrollproben zwischen den Sitzungen abgebildet wird. Unabhängig davon, wie thE Kontrollbilder werden genommen, Sitzungen sollten als Blöcke behandelt werden, und wenn möglich sollten Benutzer ein randomisiertes Blockdesign verwenden, so dass alle Session-Effekte, die nach der Korrektur verbleiben, statistisch gesteuert werden können. Andernfalls sollten die Exemplare zufällig den Sitzungen zugeordnet werden, damit die Session-Effekte nicht mit experimentellen Faktoren verwechselt werden.

Das Protokoll beruht auf der Erzeugung eines Pigmentierungsprofils, das die Veränderung der Pigmentierung über jedem Tergit darstellt. Ein Problem bei der Erstellung dieses Profils sind die dunklen Haare, die die Bauch-Nagelhaut bedecken, die unweigerlich von einer anterior-posterioren Linie, die die Tergite kreuzt, halbiert werden. Das Protokoll reduziert das Rauschen, das von diesen Haaren erzeugt wird, indem man das Pigmentierungsprofil über ein Band von Nagelhaut gemittelt hat. Trotzdem können Benutzer die Breite des ROI auf 1 Pixel in Schritt 5.6 einstellen, wenn sie Profile erstellen möchten, die auf einer dünnen Linie von Nagelhaut basieren. Außerdem können die Benutzer t analysierenDas gleiche Bild mehrmals, das Ändern der lateralen Position des Pigmentierungsprofils, um Änderungen in der Breite des Pigmentbandes innerhalb eines Segments zu erfassen. In diesem Fall müssen die Benutzer jedoch das gleiche Bild mehrmals kopieren und jeder Kopie einen eindeutigen Namen geben, bevor sie Schritt 5.1 ausführt, da das ImageJ-Makro Profile mit demselben Namen überschreibt.

Eine zweite wichtige Betrachtung bei der Erzeugung des Pigmentierungsprofils ist der Glättungsparameter des kubischen Splines, der innerhalb der Spline.der.er-Funktion (L63) in der Analyse des Pigmentations- R- Skripts definiert ist. Der entsprechende Glättungsparameter hängt vom Bildaufbau und der Auflösung ab. Eine Überglättung eines Profils kann zu einem Verlust der Eigenschaften des Spline-Profils führen, das verwendet wird, um die Koordinaten von T & sub1 ; , T & sub2 ; und T & sub3 ; zu berechnen ( Fig. 2D und 2D '). Umgekehrt erhöht die Unterglättung dieRauschen des Profils und damit die Genauigkeit der Koordinaten-Extraktionen. Die Chek- Funktion erzeugt eine grafische Zusammenfassung des Splines und seiner Ableitungen und kann als visuelles Cue verwendet werden, um einen geeigneten Glättungsparameter zu wählen.

Die hier beschriebene Methodik konzentriert sich auf die Erfassung von Daten über die Pigmentierung der dritten und vierten Bauch-Tergite bei weiblichen und männlichen D. melanogaster . Allerdings zeigen die repräsentativen Ergebnisse, dass es auch verwendet werden kann, um die Pigmentierung der fünften und sechsten Bauchsegmente von Frauen zu messen. Darüber hinaus kann die Methodik Unterschiede im Phänotyp nachweisen, die durch Mutanten von Genen verursacht werden, die die Pigmentierung beeinflussen. Die ImageJ-Makro- und R- Skripte können leicht modifiziert werden, um die Pigmentierung in den Abdomen unterschiedlicher D. melanogaster- Spezies oder sogar Pigmentierung anderer Körperteile in anderen Taxa zu messen, vorausgesetzt, dass das Pigmentmuster stereotyp ist. Schließlich ist die MethodikKönnte auch angepasst werden, um Aspekte der Pigmentierung Farbe zu messen, indem sie Bilder in RGB erfassen und jeden Kanal separat analysieren.

Im Allgemeinen ist diese Methodik Teil des auftauchenden Feldes der Phänomen 51 , 52 . Das Ziel der Phänomene ist es, große multidimensionale phänotypische Datensätze zu generieren und zu analysieren, um die genetischen und umweltbedingten Interaktionen besser zu verstehen, die den Phänotyp beeinflussen, einschließlich Krankheit und wie sich diese Wechselwirkungen entwickeln, um biologische Vielfalt zu erzeugen. Für die Phänomene, um ihr Potenzial zu erfüllen, müssen jedoch Methoden zur Erfassung von phänotypischen Daten einfach und leicht an verschiedene Phänotypen angepasst werden, ebenso wie frei verfügbar. Durch die Verwendung von Open-Source-Software zur Analyse von Bildern, die mit Standardausrüstung aufgenommen wurden, hilft diese Methode, dieses Ziel zu erreichen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde gefördert von National Science Foundation gewährt IOS-1256565 und IOS-1557638 an AWS. Wir danken Patricia Wittkopp und drei anonymen Rezensenten für ihre hilfreiche Kommentare zu einer früheren Version dieses Artikels.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 Biology Forceps FST 11252-30
Agar Sigma-Aldrich 5040
Dissecting Scope Leica MZ16FA
Base Leica MDG41
Camera Leica DFC280
Gooseneck Cold Light Source Schott ACE 1
Image Acquisition Control Software Micro-Manager v1.3.20 https://micro-manager.org/
Image Analysis Software ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/
Data Analysis Software R 3.3.2 https://www.r-project.org/
LED Thor Labs LEDWE-15
Multimeter Fluke Fluke 75 Series II
60 mm x 15 mm Petri dish Celltreat Scientific Products 229663
Stage micrometer Klarman Rulings, Inc. KR-867

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Genetik Ausgabe 124 Pigmentierung Drosophila phänotypische Variation Mikroskopie digitale Bildanalyse Phänomie
Quantifizierung der Bauchpigmentierung in<em&gt; Drosophila melanogaster</em
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Saleh Ziabari, O., Shingleton, A. W. … More

Saleh Ziabari, O., Shingleton, A. W. Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (124), e55732, doi:10.3791/55732 (2017).

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