Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

قياس التصبغ البطن في Published: June 1, 2017 doi: 10.3791/55732
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, Lake Forest College

Summary

يقدم هذا العمل طريقة لقياس بسرعة وبدقة تحديد تصبغ البطن من ميلانوغاستر ذبابة الفاكهة باستخدام تحليل الصورة الرقمية. هذا الأسلوب يبسط الإجراءات بين اكتساب النمط الظاهري وتحليل البيانات ويشمل عينة تصاعد، والحصول على الصور، واستخراج قيمة بكسل، وقياس سمة.

Abstract

التصبغ هو سمة مورفولوجيا بسيطة ولكنها متغيرة للغاية والتي غالبا ما يكون لها أهمية تكيفية. وقد خدم على نطاق واسع كنموذج لفهم تطور وتطور المظاهر المورفولوجية. كان تصبغ البطن في ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر مفيدة بشكل خاص، مما يسمح للباحثين لتحديد موقع التي تكمن وراء الاختلافات بين وداخل الاختلافات في التشكل. حتى الآن، ومع ذلك، D. ميلانوغاستر تصبغ البطن قد تم تقييمه إلى حد كبير نوعيا، من خلال التهديف، وليس كميا، مما يحد من أشكال التحليل الإحصائي التي يمكن تطبيقها على بيانات التصبغ. يصف هذا العمل منهجية جديدة تسمح لكمية من جوانب مختلفة من نمط تصبغ البطن من الكبار D. ميلانوغاستر . ويتضمن البروتوكول تصاعد العينة، التقاط الصور، استخراج البيانات، والتحليل. جميع البرامج المستخدمة لالتقاط الصور وتحليلها وحدات الماكرومكتوبة لتحليل الصور مفتوحة المصدر. ميزة هذا النهج هو القدرة على قياس بدقة الصباغ تصبغ باستخدام منهجية التي يمكن استنساخه للغاية عبر أنظمة التصوير المختلفة. في حين تم استخدام هذه التقنية لقياس الاختلاف في أنماط تصبغ تيرغال للكبار D. ميلانوغاستر ، منهجية مرنة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع في أنماط تصبغ في عدد لا يحصى من الكائنات الحية المختلفة.

Introduction

ويظهر التصبغ تباين ظاهري هائل بين الأنواع، والسكان، والأفراد، وحتى داخل الأفراد خلال أونتوجيني 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 . على الرغم من أن هناك دراسات لا تعد ولا تحصى من تصبغ في مجموعة واسعة من الحيوانات، وربما كان أفضل تصبغ في ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر ، حيث تم استخدام القوة الكاملة للعلم الوراثي الجزيئي لتوضيح الآليات التنموية والفسيولوجية التي تنظم تصبغ وكيف تتطور هذه الآليات 1 ، 6 . ومن المعروف الكثير عن الجينات التي تنظم التركيب الكيميائي الحيوي للأصباغ في D. ميلانوغاستر 7 ، 8 والجينات التي تتحكم في الزمانية والمكانية ديستريبوتيون أوف ذي بيوسينثيسيس 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 . وعلاوة على ذلك، وقد رسم الخرائط الجينية تحديد الموقع الجيني الكامنة وراء الاختلافات داخل والتداخل في تصبغ في D. ميلانوغاستر 14 ، 15 ، 16 ، 17 . وقد تم أيضا استكشاف العلاقات بين تصبغ و سمات متعددة المظاهر، مثل السلوك 18 و 19 والحصانة 19 و 20 ، وكذلك أهمية التكيف من أنماط تصبغ 15 ، 21 ، 22 . على هذا النحو، وقد ظهرت تصبغ في D. ميلانوغاستر باعتبارها قوية لكنها بسيطة مأوديل لتطوير وتطور الظواهر المعقدة.

التصبغ في البالغين D. ميلانوغاستر يتميز أنماط متميزة من ميلانيزاتيون في جميع أنحاء الجسم، وخاصة على الأجنحة والصدر الظهرية والبطن. هذا هو تصبغ كل لوحة جراحية (تيرجيت) على البطن الظهرية، ومع ذلك، التي تلقت معظم الاهتمام البحثي. هناك تباين كبير في هذا التصبغ ( الشكل 1A -F )، وذلك بسبب كل من 17 و 23 وراثية 24 و 25 العوامل الوراثية. يتكون بشرة ترجيت البطن تتكون من المقصورات التنموية الأمامية والخلفية ( الشكل 1G )، كل منها يمكن تقسيمها أكثر اعتمادا اعتمادا على تصبغ والزخرفة 26 . يتضمن المقصورة الأمامية ستة بشرةأنواع (a1-a6)، وتشمل المقصورة الخلفية ثلاثة (p1-p3) ( الشكل 1G ). من هذه، p1، p2، ​​a1 بشرة وعادة ما تطوى تحت تيرجيت في الامم المتحدة-- امتدت البطن بحيث تكون مخفية. وتتميز بشرة مرئية موثوق بها من قبل مجموعة من التصبغ الثقيل، ويشار إليها هنا باسم "الفرقة الصباغ"، تتألف من أنواع بشرة a4 (شعر مع شعيرات معتدلة) و a5 (شعر مع شعيرات كبيرة)، مع الحافة الخلفية من الفرقة أكثر مصطبغة بشكل مكثف من الحافة الأمامية ( الشكل 1G ). الأمامي إلى هذا النطاق هو منطقة من بشرة مصطبغة بخفة، والتي لديها شعيرات الخلفي (a3) ​​ولكن ليس الأمامي (a2). ويلاحظ التباين في تصبغ بين الذباب في كل من كثافة التصبغ وفي عرض الفرقة الصباغ. بشكل عام، والتباين هو الأكبر في الجزء الخلفي الخلفي (شرائح البطن 5 و 6 و 7)، وأقل في الأجزاء الأمامية أكثر (البطن البطنالبندان 3 و 4) 24 . وعلاوة على ذلك، هناك ديمورفيسم الجنسي في D. ميلانوغاستر تصبغ، مع الذكور عموما مصطبغة كليا الخامس والسادس تيرجيتس البطن ( الشكل 4C ).

في معظم دراسات تصبغ البطن في D. ميلانوغاستر ، تم التعامل مع التصبغ كصفية أو سمة ترتيبية، مع نمط قياس نوعيا 27 ، 28 ، 29 أو شبه كميا على مقياس 14 ، 15 ، 16 ، 17 ، 24 ، 30 ، 31 ، 32 ، 33 ، 34 ، 35، 36 ، 37 . هذه الطرق لا محالة تعاني من نقص في الدقة، ولأنها تعتمد على التقييم الذاتي للتصبغ، فمن الصعب مقارنة البيانات عبر الدراسات. وقد قيم العديد من المؤلفين الأبعاد المكانية لتصبغ 38 ، 39 ، وشدة تصبغ نوع بشرة معينة 23 ، 25 ، 39 ، 40 ، أو متوسط ​​شدة تصبغ عبر تيرجيت البطن ككل 41 ، 42 ، 43 . ومع ذلك، فإن هذه الطرق الكمية لا تقيس كل من كثافة والتوزيع المكاني لتصبغ البطن في وقت واحد، وبالتالي لا التقاط الفروق الدقيقة في كيفية تصبغ يختلف عبر عبدالترجيت الأميني. وعلاوة على ذلك، العديد من هذه الطرق الكمية 38 ، 41 ، 42 ، 43 تتطلب تشريح وتركيب بشرة في البطن. هذا على حد سواء مضيعة للوقت ويدمر العينة، مما يجعلها غير متوفرة للتحليلات المورفولوجية إضافية. كما أن فهم تطور وتطور تصبغ البطن يعمق، وسوف تكون هناك حاجة إلى أدوات أكثر تطورا لقياس بسرعة وبدقة كل من التوزيع المكاني وكثافة التصبغ.

الهدف العام من هذه الطريقة هو الاستفادة من تحليل الصور الرقمية للحصول على مقياس قابل للتكرار وأكثر دقة لتصبغ البطن في D. ميلانوغاستر . وتشمل المنهجية ثلاث مراحل. أولا، ذبابة الكبار هو غير مدمرة شنت، ويتم أخذ صورة رقمية للبطن الظهرية. ثانيا، باستخدام ماكرو إيماجيج، المستخدمويحدد الشريط الأمامي الخلفي من بكسل يمتد من الأمامي من بشرة a2 إلى الخلفي من بشرة a5 (المربع الأخضر، الشكل 1G ) على كل من شرائح البطن الثالث والرابع. ثم يتم استخراج متوسط ​​قيمة بكسل عبر عرض هذا الشريط على طول محورها الطويل، وتوليد ملف تعريف الذي يلتقط التوزيع المكاني وكثافة التصبغ لأنها تتغير من الأمامي إلى الخلفي من الترجيت. ثالثا، يستخدم النص البرمجي R لوصف التشكيل الجانبي رياضيا باستخدام خط مكعب. ثم يستخدم النصي R الخيط ومشتقاته الأولى والثانية لاستخراج عرض بشرة a2-a5، وعرض الفرقة الصباغ، والحد الأقصى ومستويات الحد الأدنى من تصبغ. وبالتالي فإن الطريقة تحدد كل من الخصائص المكانية وعمق تصبغ البطن.

هذه المنهجية كميا تصبغ من تيرجيتس البطن الثالث والرابع،والتي كانت محور العديد من الدراسات السابقة 1 ، 15 ، 23 ، 24 ، 25 ، 28 ، 33 ، 39 ، 42 ، إما حصريا أو بالاقتران مع تارجيتس الخلفي أكثر. على الرغم من أن أقل تغيرا من تارجيتس الخامس والسادس في البطن، و تيرجيتس الثالث والرابع ليست مصطبغة تماما في الذكور، لذلك هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على كل من الذكور والإناث. ومع ذلك، كما هو مبين هنا، يمكن استخدام بروتوكول لقياس التصبغ في تارجيتس البطن الخامس والسادس في الإناث. وعلاوة على ذلك، فإن التعديلات الطفيفة للنصوص المستخدمة لاستخلاص خصائص المظهر الجانبي للصبغ ينبغي أن تسمح باستخدام الطريقة لتحديد التغير في التصبغ في مجموعة واسعة من الأنواع الأخرىالكائنات الحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تركيب العينة

ملاحظة: تخزين الذباب الميت في الايثانول 70٪ في الماء قبل التصوير.

  1. صب 10 مل من أجار 1.25٪ المذاب في الماء المغلي في 60 مم × 15 ملم طبق بتري والسماح لها لتعيين.
  2. تحت المجهر تشريح، واستخدام زوج من ملقط غرامة نقطة لجعل ~ 20 مم أونغ، 2 مم واسعة، 1 ملم الأخدود العميق في سطح هلام. باستخدام ملقط غرامة، تضمين الجانب البطني من ذبابة الكبار في الأخدود، مع الجانب الظهري من يطير إسقاط فوق هلام.
    ملاحظة: رخاوة من هلام يسمح لسهولة إعادة وضع دون الإضرار العينة. نفس الأخدود يمكن استخدامها لعينات متعددة، على الرغم من أنها سوف تصبح قذرة، مكسورة، وغير صالحة للاستعمال مع مرور الوقت. يمكن للمستخدم ثم جعل أخدود آخر في نفس هلام. كل لوحة يمكن استخدامها لصورة ~ 200 الذباب.
  3. تغطية تماما العينة في 70٪ من الإيثانول في الماء للحد من أي انعكاسات الضوء من بشرة شمعية ومنع الجناح الضررتلاعب العينة.

2. إعداد المجهر

ملاحظة: يتم الحصول على الصور باستخدام نطاق تشريح، تنتقل ضوء قاعدة، وكاميرا رقمية، و غوزينيك مصدر الضوء البارد تعلق على جهاز الكمبيوتر تشغيل صورة برنامج السيطرة على اكتساب. تعليمات البرنامج خاصة إلى مايكرو مدير v1.4.20 44 ، وهو برنامج مفتوح المصدر الذي يتضمن إيماجيج 45 .

  1. بدوره على المجهر، وكاميرا رقمية، مزدوجة معقوفة مصدر الضوء البارد، والكمبيوتر.
  2. قم بتشغيل برنامج التقاط الصور لفتح نافذة ميكرو-ماناجر ونافذة إيماجيج. في إطار إيماجيج انقر فوق "إيماج"> "تايب"> "8-بيت" لتعيين جميع الصور بتنسيق 8 بت. انقر على "مباشر" في نافذة ميكرو-ماناجر لفتح نافذة "سناب / ليف" تظهر معاينة في الوقت الفعلي من الكاميرا.
    1. تعظيم حجم نافذة "المفاجئة / لايف" إذا نcessary. حدد "تدرج الرمادي" في القائمة المنسدلة "وضع العرض" في علامة التبويب "التباين" في نافذة ميكرو-ماناجر.
  3. بدوره على مصدر الضوء البارد إلى أقصى شدة لها ووضع نصائح من كل معقوفة إلى ما يقرب من 120 ملم من المرحلة، واحدة على اليسار واحد على اليمين.
    ملاحظة: يمكن للمستخدمين أيضا استخدام المنور الحلقي، على الرغم من أن هذا قد تولد حلقة من الضوء المنعكس حول البطن يطير.
  4. تعيين يدويا التكبير المجهر إلى 60X بحيث مجال الرؤية يلتقط مساحة حوالي 3 ملم في القطر على خشبة المسرح.
  5. وضع ميكرومتر المرحلة 2 مم على خشبة المسرح (تحويل الخلفية إلى الأبيض إذا لزم الأمر). أثناء النظر في المعاينة المباشرة، والتركيز على ميكرومتر المرحلة وضبط التعرض في إطار مايكرو مدير عن طريق إدخال الوقت التعرض في مللي ثانية في المربع "التعرض".
  6. لمعايرة مكانيا الكاميرا، حدد "خط مستقيم" أداة في رانه إطار إيماجيج ورسم خط طول ميكرومتر المرحلة. في إطار إيماجيج انقر فوق "تحليل"> "تعيين مقياس" لفتح نافذة "تعيين مقياس"، أدخل طول ميكرومتر في ميكرون في مربع "المسافة المعروفة"، وأدخل "ميكرون" في "وحدة طول" صندوق.
    1. انظر أن نافذة "تعيين مقياس" ثم يعرض المقياس في "بكسل / ميكرون". ضع علامة على المقياس وانقر على "موافق".
  7. في نافذة "سناب / لايف"، انقر فوق "إيقاف" ثم "التقط" لالتقاط صورة من ميكرومتر المرحلة.
  8. حفظ الصورة بتنسيق الرمادي تيف 8 بت لضمان القدرة على معايرة مكانيا الصور مرة أخرى إذا لزم الأمر. في نافذة إيماجيج انقر فوق "ملف"> "حفظ باسم"> "تيف ..." حدد مكان حفظ الملف في مستعرض الملفات، واسم الملف، ثم انقر فوق "حفظ".
  9. تبديل المرحلة إلى الأسود والمكانطبق بيتري يحمل ذبابة شنت في أجار (الخطوات 1.1-1.2) على المسرح.
  10. ننظر من خلال المجهر ووضع الطاير للتأكد من أن خط الوسط الظهري هو مستقيم من أجل أفضل عرض نمط تصبغ. نقل أي أجنحة و الزوائد للتأكد من أن وجهة نظر البطن هو دون عائق. إذا كان إهاب مصطبغة (a2-a5) غير مرئية، والضغط على البطن أفقيا حتى هو عليه (على الرغم من أن البطن من الذباب المخزنة في الايثانول 70٪ في المياه تمتد، حتى أن هذا ليس من الضروري عادة).
    ملاحظة: عند تحديد المواقع يطير، قد يحتاج المستخدم إلى استخدام التكبير أقل (20X). يجب إعادة التكبير إلى 60X قبل المتابعة.
  11. التركيز يدويا على البطن الظهرية من الطاير. ضبط يدويا نصائح من مصدر الضوء لتقليل الظلال والتأمل على البطن الظهرية.
  12. أثناء النظر في المعاينة المباشرة على شاشة الكمبيوتر، واستخدام الرسم البياني قيمة بكسل في علامة التبويب "التباين" من إطار مايكرو مدير،ضبط التعرض كما هو موضح في الخطوة 2.4 لتعظيم مجموعة من قيم بكسل صورة المعاينة.
  13. إزالة ذبابة وطبق بتري واستبدالها مع ليد (الناتج الطيفي من 430-660 نانومتر) متصلا متر الجهد، تتمحور في مجال الرؤية في نفس الموقف كما يطير. استخدام ليد والجهد متر كمقياس الضوء 46 وتسجيل الجهد الناتجة عن ضوء ضرب ليد (~ 125 مف).
    ملاحظة: يتم استخدام ليد والجهد متر لضمان أن مستويات الضوء ثابتة عبر جلسات التصوير متعددة في تجربة واحدة.
  14. طوال مدة التجربة، لا مزيد من تغيير موقف أو كثافة مصدر الضوء، وتكبير المجهر، أو التعرض للكاميرا.

3. عينة التصوير

  1. وضع طبق بتري عقد ذبابة التي شنت في أجار (الخطوات 1.1-1.3) على المسرح المجهر الأسود.ضبط موقف الذبابة بحيث الثالثة والرابعةح قطاعات البطن مرئية وخط الوسط الظهرية على التوالي حتى، كما هو موضح في الخطوة 2.9. تأكد من أن التكبير عند 60x قبل المتابعة.
  2. التركيز يدويا المجهر مثل أن الثالث والرابع تارجيتس الظهرية في البطن هي في التركيز. استخدام برنامج التقاط الصور للحصول على صورة ك تيف الرمادي 8 بت، كما هو موضح في الخطوة 2.6.
    ملاحظة: الصورة يمكن التقاطها في اللون وتحويلها لاحقا إلى تدرج الرمادي للتحليل.
  3. احفظ الصورة باسم "SESH000_sampleID.tiff"، كما هو موضح في الخطوة 2.7.
    ملاحظة: هنا، [سيش] ثابت، [000] هو رقم الجلسة ومتغير ولكن يجب أن يكون ثلاثة أرقام طويلة، و [سامبليد] هو كل ما يرغب المستخدم، على الرغم من أنه يجب ألا يحتوي على أي حروف سفلية إضافية (_) و يجب أن يكون طول ثابت. [سامبليد] يجب أن يتضمن تفاصيل العوامل المستخدمة في تحليل بيانات التصبغ (على سبيل المثال، درجة الحرارة أو النسب)، مفصولة من غير الأبجدية المميزةكال، مثل الواصلة (-). وهذا يسمح بتحليل هذه العوامل بسهولة من [سامبليد] باستخدام برامج إحصائية قياسية.
  4. إزالة طبق بيتري من المرحلة واستبدال الطاير مع العينة التالية. كرر الخطوات من 3.1-3.3 حتى يتم تصوير جميع العينات، دون مزيد من تعديل مستويات الإضاءة، والتكبير، أو التعرض.

4. التصوير عبر جلسات متعددة

  1. إذا كانت الصور تحتاج إلى أن تؤخذ على جلسات متعددة، والحفاظ على شدة الضوء، والتعرض، والتكبير عبر جلسات. في بداية كل دورة، تحقق من المعايرة المكانية للكاميرا (الخطوة 2.4) وشدة الضوء في المرحلة (مقاسا من قبل ليد / الجهد متر، الخطوة 2.12).
  2. التقاط وحفظ صورة من ميكرومتر المرحلة (خطوات 2،5--2،7) لضمان القدرة على معايرة مكانيا الصور مرة أخرى، إذا لزم الأمر.
  3. استخدام ما لا يقل عن 15 عينات السيطرة وبشكل عشوائي إعادة صورة لهم في كل جلسة إلى ألوث للكشف عن آثار الدورة والقضاء عليها. تأكد من أن عينات التحكم المكررة بين الجلسات لها نفس [سامبليد] ولكن مختلفة [SESH000].
    ملاحظة: عينات السيطرة هي الذباب جمعها، وتخزينها، ومثبتة بشكل مماثل لعينات التجريبية ولكن يتم إعادة تصوير عبر جلسات. يعتمد العدد الدقيق لعينات التحكم على الإعداد التجريبي للمستخدم. انظر المناقشة لمزيد من التفاصيل.

5. تحليل الصورة

ملاحظة: يتم إجراء تحليل الصورة في إيماجيج 45 ويستخدم "قياس Pigmentation.ijm،" الماكرو المقدمة كملف تكميلي.

  1. ضع جميع الصور ليتم تحليلها في نفس المجلد.
  2. بدء تشغيل إيماجيج وتشغيل ماكرو "قياس Pigmentation.ijm" عن طريق النقر على "الإضافات"> "ماكرو"> "تشغيل"، واختيار "قياس Pigmentation.ijm" في متصفح الملفات، والنقر على "فتح."
    ملاحظة: كافة الخطوات اللاحقة ضمن الماكرو. كل خطوة هي أمر ماكرو الفردية.
  3. لاحظ أن مربع الحوار "الإجراء المطلوب" يفتح، مشيرا إلى "اختيار المجلد حيث يتم تخزين الصور." انقر فوق "موافق" واستخدم متصفح الملفات لتحديد المجلد الذي يحتوي على الصور ثم انقر فوق "اختيار".
  4. لاحظ أن مربع الحوار "الإجراء المطلوب" سوف يفتح مربع، مشيرا إلى "اختيار المجلد حيث تريد تخزين البيانات." انقر فوق "موافق" واستخدام متصفح الملف لتحديد المجلد المطلوب لحفظ التشكيلات الجانبية تصبغ. انقر على "اختيار".
  5. لاحظ أنه سيتم فتح مربع حوار يسأل "كم عدد الأحرف في نموذج التعريف؟" في مربع إدخال البيانات، أدخل عدد الأحرف في [سامبليد]، كما هو محدد في الخطوة 3.3، ثم انقر على "موافق".
  6. لاحظ أنه سيتم فتح مربع حوار، يسأل "ما مدى عائد الاستثمار؟" في مربع إدخال البيانات، أدخل عرض بكسل من الأمامي-الشريط الخلفي الذي على طول الملف الشخصي تصبغ هو أن تقرأ (المستطيل الأخضر، الشكل 1G ، الشكل 2A ، و 2 A '). انقر فوق موافق؛" الافتراضي هو 20 بكسل.
    ملاحظة: يتم قراءة الملف الشخصي تصبغ عبر شريط من بشرة، بدلا من خط، للحد من الضوضاء بسبب الشعر والشعيرات. عرض هذا الشريط سوف تعتمد على دقة الصورة، ولكن ينبغي أن يكون ~ 1/20 من عرض البطن، في بكسل.
  7. لاحظ أن الماكرو سوف يفتح صورة ذبابة الأولى، وسوف يسأل مربع حوار ما إذا كان لقياس ذبابة الحالية (انقر فوق "نعم")، للذهاب إلى ذبابة المقبل (انقر فوق "لا")، أو للخروج من ماكرو (انقر فوق "إلغاء").
  8. لاحظ أنه سيتم فتح مربع حوار، مشيرا إلى "تحديد خط الوسط للبطن الظهرية، من أنتيريور إلى ما بعد البيع". سيتم بالفعل تحديد أداة "الخط المستقيم". رسم خط من الأمامي إلى الخلفيلتحديد خط الوسط للبطن الظهرية. انقر فوق موافق؛" انظر الشكل 2A و 2 A ، الخط الأصفر.
    ملاحظة: يستخدم هذا لإعادة توجيه الصورة بحيث خط الوسط الظهرية تقع أفقيا عبر الشاشة، مع الأمامي على اليسار، مما يجعل الخطوات اللاحقة أسهل.
  9. لاحظ أنه سيتم فتح مربع حوار، مشيرا إلى "تحديد حافة بوستيريور من تيرجيت 4 خلف الفرقة الصبغة مباشرة". سيتم بالفعل تحديد أداة "الخط المستقيم". رسم خط من حافة خط الوسط الخلفي إلى الحافة اليمنى الوحشية، بحيث مركز الخط (ملحوظ من مربع أبيض) يجلس فقط خلفي إلى الحافة الخلفية من الفرقة الصباغ (إهاب a5). انقر فوق موافق؛". انظر الشكل 2A و 2 A ، خط أرجواني.
    ملاحظة: سوف يكتشف النص البرمجي R تلقائيا الحافة الخلفية للنطاق الصباغ من ملف التصبغ.
  10. لاحظ أن الحوارمربع فتح، مشيرا إلى "تحديد الحافة الأمامية من تيرجيت 4 في الحافة الأمامية من بشرة مصطبغة (a2)." سيتم بالفعل تحديد أداة "الخط المستقيم". رسم خط من حافة خط الوسط الأمامي إلى الحافة اليمنى الجانبية، بحيث مركز الخط (ملحوظ من مربع أبيض) يجلس على الحافة الأمامية من بشرة مصطبغة (إهاب a2). انقر فوق موافق؛". انظر الشكل 2A و 2 A ' ، خط سماوي.
    ملاحظة: سوف R النصي تحديد هذه النقطة كما الحافة الأمامية للبشرة المصطبغة من ترجيت. على الصورة، فإن الماكرو تظهر المنطقة ذات الاهتمام (روي) على طول الذي يتم قراءة الملف الشخصي تصبغ (المستطيل الأخضر، الشكل 2A و 2 A '، الموسع في الشكل 2B و 2 B'). سوف الماكرو أيضا فتح نافذة ثانية تظهر الشخصي تصبغ للعائد على الاستثمار ( الشكل ه 2C و 2C ')، حيث يكون المحور س هو الموضع المعبر عنه بعدد البكسلات من الحافة الخلفية للملف الجانبي، ويكون المحور ص هو متوسط ​​قيمة البكسل في كل موضع.
  11. عرض المؤامرات من الملف الشخصي تصبغ التي سيتم فتحها من قبل الماكرو. إذا لزم الأمر، انقر على "مباشر" في نافذة الملف الشخصي لضبط موضع عائد الاستثمار بحيث لا يتضمن أي هياكل (على سبيل المثال، شعيرات) من شأنها أن تؤثر على التشكيل الجانبي. بعد أن يكون الملف الشخصي مرضيا، انقر على "موافق".
  12. كرر الخطوات من 5.8-5.11 ل تيرجيت 3.
    ملاحظة: يقوم الماكرو بعد ذلك بتصدير ملفات تعريف التصبغ كملفين كسف، كل منهما اسمه "SESH000_samplename_TX_profile.csv"، حيث يكون [SESH000_samplename] هو اسم الصورة و [تكس] إما T3 أو T4 ل تيرجيتس الثالثة والرابعة، على التوالي.
  13. لاحظ أن الماكرو يفتح الصورة التالية. كرر الخطوات من 5.7-5.13 حتى يتم تحليل جميع الصور.
jove_title "> 6. المعالجة المسبقة للبيانات وتحليلها وتصحيح الجلسة

ملاحظة: يتم إجراء جميع تحليل البيانات في R 47 ويستخدم "تحليل Pigmentation.R" النصي المقدمة. أدناه، "L ..." يشير إلى السطر (الأسطر) من البرنامج النصي لتشغيل لكل جزء من التحليل. انظر المعلومات التكميلية للحصول على تفاصيل إضافية حول كيفية إجراء التحليل.

  1. تحرير البرنامج النصي R لتعيين دليل العمل (L6) وتحديد فيليباث إلى المجلد الذي يحتوي على ملفات تعريف the.csv (L11).
  2. تشغيل L13-15 لإنشاء قائمة من التشكيلات الجانبية تصبغ المخزنة في مجلد الملف الشخصي.
  3. تحميل وتشغيل "القارئ" و "أدبريماريكي" وظائف (L17-41) لقراءة التشكيلات الجانبية في إطار بيانات واحد.
  4. تحرير البرنامج النصي في L43 لتحديد المعايرة المكانية من الصور في ميكرون / بكسل، على النحو المحدد في الخطوة 2.5.
  5. تحميل وتشغيل "أدجوس(L46-58) لتحويل الوضع الجانبي (x- محور، الشكل 2C و 2 C ') من بكسل من الخلفي الحافة من عائد الاستثمار إلى μm من الأمامي حافة من عائد الاستثمار و (Y = أكسيس، الشكل 2C و 2C ') من قيمة البكسل (0 = أسود، 255 = أبيض) إلى قيمة التصبغ (0 = لا صبغة، 255 = الصباغ الأقصى).
  6. تحميل وتشغيل "spline.der.er" وظيفة (L60-71) لتوليد خليط مكعب من التشكيلات الجانبية ومشتقاته الأولى والثانية ( الشكل 2D -2F و 2D '- 2F ').
  7. تحميل وتشغيل "كورد" و "assmbly.coord" وظائف (L74-163)، أولا لاستخراج موقف الخلفي (T 3 ) والحواف الأمامية (T 2 ) من الفرقة الصباغ ( الشكل 2D و 2D '؛) والحافة الخلفية للبشرة a2 (T 1 ، الشكل 2D و 2D ')، ومن ثم لاستخراج الحد الأقصى (P ماكس ) والحد الأدنى (P دقيقة ) القيم تصبغ، التي اتخذت في T 3 و T 1 ، على التوالي.
    ملاحظة: وقد تم بالفعل تعريف الحافة الأمامية للبشرة a2 في الخطوة 5.9.
  8. اختياري: تحميل وتشغيل "تشيك" وظيفة (L165-175) للتحقق ما إذا كانت وظيفة "كورد" تحديد المواقع بشكل صحيح T 1-3 لملف تصبغ اختيارها عشوائيا.
  9. قم بتحميل وتشغيل وظائف الفهرس والمقاييس (L178-193) لإنشاء جدول بيانات بالعناوين "سيسيون" و "سامبل" و "تيرجيت" و "إد" (تسلسل للعينة و تيرجيت) و "P ماكس " "P مين "، "W باند " (عرض النطاق الصباغ، = T3 - T 2 )، و "W تيرجيت " (عرض المصطبغة cأوتيكلس a2-a5، = T 3 ).
  10. قم بتحميل وتشغيل وظيفة "تصحيح" (L196-234) لإنشاء جدول بيانات يقوم بتصحيح P ماكس و P مين لأي عوامل إزعاج تنشأ نتيجة لتأثيرات الجلسة. استخدم متوسط ​​الزيادة (أو النقصان) في P ماكس أو P مين من عينات التحكم التي يتم تصويرها عبر جلسات متجاورة زمنيا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم استخدام البروتوكول لاستكشاف تأثير تربية درجات الحرارة على تصبغ البطن. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن زيادة في درجة الحرارة التنموية النتائج في انخفاض في انتشار تصبغ البطن في عدة أنواع من ذبابة الفاكهة ، بما في ذلك D. ميلانوغاستر 30 ، 32 . على وجه التحديد، في ترجيتس البطن 3 و 4، ومدى التصبغ (عرض الفرقة الصباغ) ينخفض ​​من 17 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية ويبقى نفسه من 25 درجة مئوية إلى 28 درجة مئوية 24 ، 36 . وسجلت هذه الدراسات مدى تصبغ على مقياس 1-10 (0: لا الصباغ الفرقة، الترجيت الأصفر تماما؛ 5: الفرقة الصباغ تحتل 50٪ من الترجيت؛ 10: ترجيت مظلمة تماما). لتحديد ما إذا كانت المنهجية الكمية يمكن التقاط هذه اللدونة المظهري، تم قياس تصبغ في ث(3) ذبابة بطينية من النوع الثالث، والرابع من خط إيزوجيني من ذباب الأنثى التي تبدو ظاهريا، وتربى من البيض إلى البالغ عند 17 درجة مئوية (سبعة ذباب)، و 25 درجة مئوية (تسعة ذباب)، و 28 درجة مئوية (تسعة ذباب). ولتحديد فعالية إجراء التصحيح عند إزالة العوامل المزعجة التي أدخلتها آثار الدورة، أعيد تصوير تصبغ نفس الذباب وأعيد قياسه بعد مرور واحد أو اثنين أو أربعة أو ثمانية أيام. غير أن ظروف الإضاءة والتعرض بين الدورات قد تغيرت عمدا للتأكد من أن هناك آثار الدورة لإجراءات التصحيح لإزالة. تم نشر الصور على مستودع درياد الرقمي.

والسؤال الأول المطروح هو ما إذا كانت هناك اختلافات منهجية في تدابير التصبغ عبر الجلسات. تم فحص هذا باستخدام حزمة lme4 في R 48 لتناسب النماذج المختلطة M إجك = S i + A j +i إيجك و M إيج = A j + ε إيج لكل من P ماكس و P مين ، حيث M هو قياس الصباغ، S هو الدورة (التأثير العشوائي)، A هو تيرجيت البطن المقاس (التأثير العشوائي)، و ε والخطأ المتبقي (المخطوطات هي مستويات ضمن المتغيرات). تم استخدام اختبار نسبة الاحتمال سجل لاختبار ما إذا كان إدراج الدورة كعامل عشوائي تحسنت بشكل ملحوظ في صالح؛ ( الجدول 1 ). وكما هو متوقع، فإن فحص مكونات التباين (التي تم توليدها من خلال ريمل 48 ) يشير إلى أن الاختلاف بسبب تأثيرات الدورة يمثل 67٪ و 70٪ من إجمالي التباين في P ماكس و P مين على التوالي ( الجدول 1 ).

خمسة عشر تم اختيارها عشوائيا السيطرة تريجيتس (إما الثالثة أو الرابعة، من الذباب رياالأحمر عند 17 درجة مئوية، 25 درجة مئوية، أو 28 درجة مئوية)، واستخدمت التغييرات في متوسط P ماكس و P مين لتصحيح مقاييس التصبغ من الترجيت المتبقية عبر الجلسات. وأدى تكرار التحليل على تدابير التصبغ المصححة إلى القضاء على آثار الدورة ( الجدول 1 ) وخفض النسبة المئوية لإجمالي التباين الناتج عن تأثيرات الدورة إلى الصفر. الخطأ المتبقي هو تقدير، خطأ في القياس بعد إزالة آثار الدورة، وكان 22٪ و 27٪ ل P ماكس و P دقيقة ، على التوالي ( الجدول 1 )

بعد ذلك، تم استخدام البيانات المصححة لتحديد ما إذا كان يمكن الكشف عن تأثير درجة الحرارة على جوانب مختلفة من التصبغ والحجم. تم تركيب النموذج المختلط M إجكم = T i * D j + X k + ε إجكم على البيانات، حيث T D هو ترجيت (الثالث أو الرابع)، و X هو ذبابة الفردية (عامل عشوائي). لأن العلاقة بين التصبغ ودرجة الحرارة ليست الخطية 24 ، 36 ، تم معاملة T كعامل فئوية. تم اختبار الحد الأقصى والحد الأدنى لمستويات التصبغ ( P ماكس و P مين ) وعرض نطاق الصبغة و تيرجيت ( W باند و W تيرجيت ). كما تم اختبار تأثير درجة الحرارة على العرض النسبي للنطاق الصباغ ( النطاق R = W باند / W تيرجيت ). وأظهرت البيانات أن العرض المطلق (W باند ) والنسب النسبي (النطاق الموجي) لنطاق الصبغة قد انخفض من 17 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية (اختبار توكي بعد الاختبار، P <0.05 للجميع) ولم يتغير كثيرا من 25 ° C إلى 28 درجة مئوية (توكي بعد الاختبار المخصص، الجدول 2 ، الشكل 3A و 3 B)، وهو ما يتفق مع الدراسات السابقة 24 ، 36 . لوحظ نفس النمط بالنسبة إلى الحد الأقصى والمستوى الأدنى من التصبغ، P ماكس و P دقيقة ( الجدول 2 ، الشكل 3C ). لم يتم وصف تأثير درجة الحرارة على مستوى التصبغ من قبل، ولكنه يظهر في البداية متسقا مع الدراسات الأخرى التي تبين أن الحد الأدنى لمستوى التصبغ في الترجيت البطني الرابع يرتبط ارتباطا إيجابيا مع عرض الفرقة الصباغ في السكان ويلديب 39 . ومع ذلك، في حين تشير البيانات من هذه الدراسة إلى وجود علاقة إيجابية بين P ماكس و W باند ، فإنها تظهر علاقة سلبية بين P دقيقة و W باند( الجدول 3 ). هذا الاختلاف بين الدراسات الحالية والسابقة قد يعكس الاختلافات في كيفية تأثير العوامل الوراثية والبيئية على العلاقة بين مستوى ومدى تصبغ البطن. ومع ذلك، تظهر هذه النتائج التمثيلية أن البروتوكول غير قادر على تحديد أنماط التصبغ التي تم تحديدها سابقا من خلال المنهجيات النوعية فحسب، بل أيضا للكشف عن أنماط جديدة لا تستطيع المنهجيات النوعية الكشف عنها.

وكان تأثير درجة الحرارة على عرض ترجيت أكثر تعقيدا. في D. ميلانوغاستر ، الجسم وحجم الجهاز الانخفاض غير الخطية مع درجة الحرارة 49 . وتشير الدراسات السابقة إلى أن عرض تارجيت البطن الخامس ينخفض ​​بنسبة 10٪ من 16.5 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية، و 4٪ أخرى من 25 درجة مئوية إلى 29 درجة مئوية 50 . في حين كان هناك انخفاض غير كبير في عرضتارجيت البطن الرابع من 17 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية، على حد سواء الثالث والرابع تارجيتس البطن ارتفعت في العرض من 25 درجة مئوية إلى 28 درجة مئوية ( الجدول 2 ، الشكل 3D ). منذ عرض ترجيتس البطن هو أساسا تعريف من قبل المستخدم (الخطوات 5،9-5،10 في البروتوكول)، والتفاوت بين الدراسات الحالية والسابقة من غير المرجح أن يكون راجعا إلى الطريقة التي استخراج R النصي W تيرجيت من التشكيل الجانبي. بدلا من ذلك، فإنه قد تعكس الاختلافات في الطريقة التي يقاس الجزء البطن، في الأنماط الجينية للذباب، وفي الجوانب الدقيقة من تارجيتس البطن التي يتم قياسها.

والسؤال التالي المطروح هو ما إذا كانت المنهجية يمكن أن تولد بيانات مماثلة للبيانات المجمعة باستخدام التقييمات الحالية للتصبغ. وعادة ما تطلب هذه الأساليب من المراقب أن يعين كل ذبابة بشكل فردي إلى إحدى الزعانفإيت عدد من الطبقات المظهري على أساس مدى تصبغ 15 ، 30 ، 32 ، 33 ، 34 وبالتالي تعتمد على قدرة المراقب لتقييم عرض الفرقة الصباغ. لاختبار مدى جودة هذا الأسلوب الهدف بالمقارنة مع الأساليب الذاتية، طلب من خمسة مراقبين لترتيب 45 صورة من بطن الإناث على أساس عرض الفرقة الصباغ من ترجيت البطن الرابع. تم مقارنة متوسط ​​الترتيب بين المراقبين مع الترتيب القائم على نطاق W، قياسا باستخدام هذه المنهجية. كان هناك ارتباط قوي بين التصنيف الذاتي والموضوعي ( الشكل التكميلي 1 ، في المعلومات التكميلية. بدف)، سبيرمن = 0.7342، P <0.0001).

طرح سؤال آخركان هذا الأسلوب لاستخراج W باند من خيط تصبغ مقارنة قياس عرض الفرقة الصباغ باليد (طريقة بصرية) باستخدام أداة القياس الخطي في إيماجيج. مرة أخرى، تم العثور على ارتباط قوي بين البيانات التي تم جمعها باستخدام المنهجيتين ( الشكل التكميلي 2 ، في المعلومات التكميلية. بدف، عملية شريان الحياة للسودان، r 2 = 0.49 ، P <0.0001). على الرغم من أن الطريقة الحسابية قاست باستمرار نطاق الصباغ على أنه أضيق من الطريقة "المرئية"، فإن معامل الانحدار لم يكن مختلفا بشكل ملحوظ عن 1 ( P> 0.05).

والسؤال الأخير المطروح هو ما إذا كان يمكن استخدام هذه المنهجية لقياس تصبغ البطن في سياقات أخرى. يمكن للمنهجية استخراج P ماكس ، P دقيقة ، W باند ، و W تيرجيت ل fإفث والسادس تارجيتس البطن في الإناث والثالث والرابعة البطن تارجيتس في الذكور ( الشكل 4 ). وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام المنهجية لتحديد كمية الزيادة في P ماكس و P دقيقة في الطافور متحولة للأبنوس ( ه 1 )، والتي تظهر زيادة في تصبغ جزيئي في جميع أنحاء الجسم وزيادة محددة في تصبغ الأمامي بشرة إلى الصباغ الفرقة 28 ( الشكل 4 ).

شكل 1
الشكل 1: تصبغ البطن في D. ميلانوغاستر . ( A - F ) التباين في تصبغ البطن في الإناث من اثنين من الأنماط الجينية تربيتها في ثلاث درجات حرارة (17 درجة مئوية، 25 درجة مئوية، و 28 درجة مئوية). A3 و A4 هي الثالثة والرابعة البطن الترجي تيس، على التوالي. ( G ) تارجيت البطن الظهرية يتضمن المقصورة الأمامية والخلفية، وأجزاء منها فقط يمكن رؤيتها بشكل موثوق في بطانات الامم المتحدة امتدت. تقسم المقصورات أيضا إلى أنواع بشرة متميزة: a1: الامم المتحدة مصطبغة، لا الشعر. a2: مصطبغة بخفة والشعر؛ a3: المصطبغة بخفة، الشعر، ومعتدل الشعر الخشن؛ a4: مصطبغة داكن، الشعر، ومعتدل الشعر الخشن؛ a5: المصطبغة داكن، الشعر، و شعيرات كبيرة؛ a6: الامم المتحدة-- مصطبغة والشعر؛ p3: الامم المتحدة-- مصطبغة والشعر؛ p2: الامم المتحدة مصطبغة ولا الشعر. و p1: الامم المتحدة مصطبغة و تيسيلاتد. يتكون الشريط الصباغ من البشرة a4 و a5. يتم استخدام البشرة المصطبغة فقط (a2-a5، المربع الأخضر) في التحليل. الحانات مقياس = 200 ميكرون في (أف). تم تعديل تباين جميع الصور لتسليط الضوء على نمط تصبغ، والصور هي توضيحية. وتوضع الصور غير المعدلة المستخدمة لتوليد النتائج التمثيلية على مستودع درياد الرقمي..com / فيليز / ftp_upload / 55732 / 55732fig1large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: صورة وتحليل البيانات لقياس تصبغ البطن. ( A - F ) و ( A - F ) لعينات مختلفة وتظهر كيف يتعامل التحليل مع صور ذات جودة مختلفة. ( A ) يحدد المستخدم أولا خط الوسط للبطن (الخط الأصفر)، والحافة الأمامية للالترجيت (خط سماوي)، وخط الخلفي قليلا إلى الحافة الخلفية من الفرقة الصباغ (خط أرجواني). ثم يرسم الماكرو إيماجيج خطا من منتصف الخط الأمامي والخلفي (خط أبيض متقطع)، والذي يتسع ليشكل عائد استثمار (صندوق أسود)، مكبر في ( B ). ( C ) الماكرو إيماجيج ثم السابقينمساحات متوسط ​​قيمة بكسل على طول المحور الأمامي الخلفي للعائد على الاستثمار. لاحظ أنه في هذه المرحلة، يتم قراءة الملف الشخصي من الخلفي إلى الأمامي. ( D - E ) يقوم الماكرو R بتحويل قيم البكسل المتوسطة إلى قيمة تصبغ، ويعكس اتجاه المظهر الجانبي للتصبغ، ويناسبه مع سبر مكعب ( S (x) ) ( D )، ويحسب الأول ( S (x ) ) ( E ) والثانية ( S (x) ) مشتق من سبلين ( F ). ثم يحدد البرنامج النصي: T 3 ، موقف التصبغ الأقصى، حيث S (x) يتحول من <0 إلى> 0، يتحرك أمامي من الخلف للخلف. T 2 ، الموقف حيث الانخفاض في التصبغ هو أعظم و S (x) هو الحد الأقصى. و T 1 ، الموضع الذي يكون فيه التصبغ الترجيدي عند حده الأدنى و S (x) من 0 إلى 0، يتحرك أمامي fروم T 2 ،. يتم تعريف الأمامي من تيرجيت مرئية موثوق (الأمامي من إهاب a2) من قبل المستخدم. (أف) في الحالات التي لا يمكن فيها استخدام المشتقة الأولى للعثور على T 1 ، عادة لأن S (x) لا يعبر 0 أماميا عن نطاق الصبغة، فإن النص البرمجي سيحدد T 1 كموقف ينتقل فيه S (x) من> 0 إلى <0 عندما تتحرك أمامي من T 2 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3: تأثير درجة الحرارة على جوانب مختلفة من تصبغ البطن في الإناث D. ميلانوغاستر . ( A ) عرض الفرقة الصباغ ( W باند ، Fإيغور 1). ( B ) الفرقة الصباغ كنسبة من الترجيت ( R باند ). ( C ) الحد الأقصى ( P ماكس ، الخطوط العليا) والحد الأدنى ( P دقيقة ، خطوط أقل) تصبغ. ( D ) عرض تارجيت ( W تيرجيت ). النقاط هي أقل الوسائل مربع من نماذج مختلطة تأثير تأثير (الجدول 2). تمثل أشرطة الخطأ الخطأ القياسي وقد تكون محجوبة بواسطة العلامات. الخط الأسود هو تيرجيت البطن الثالث. الخط الرمادي هو تارجيت البطن الرابع. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4
الشكل 4: الاختلافات في تصبغ بين ترجيتس البطن الثالث والرابع. يظهر هذا في ( A الأبنوس 1 الإناث، ( ب ) ويلديب الإناث، ( C ) الذكور ويلديب، و ترجيتس البطن الخامس والسادس في الإناث ويلديب. ( D ) الحد الأقصى تصبغ، P ماكس . ( E) الحد الأدنى تصبغ، P دقيقة . ( F ) عرض الفرقة الصباغ، W الفرقة . ( G ) العرض النسبي من الفرقة الصباغ، R الفرقة . الحانات مع أحرف مختلفة مختلفة بشكل كبير (توكي هسد بعد الاختبار، P <0.05). N = 6 للجميع باستثناء الأبنوس 1 ، حيث N = 4. الحانات مقياس = 200 ميكرون في ( A - C ). تمثل أشرطة الخطأ الخطأ القياسي. تم تعديل تباين جميع الصور لتسليط الضوء على نمط تصبغ، والصور هي توضيحية. يرجى كليسك هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

<تد> 4.08 (78٪)
مقارنة النموذج الفرق (٪ من الإجمالي)
سمة التصبغ نموذج مدافع تسجيل احتمال X² معادلة (٪) معادلة (٪) معادلة (٪)
P ماكس غير مصححة M ij = A i + ε إيج 3 -678.28 1-94 (1 -4٪) 11.86 (86٪)
M إجك = S i + A j + ε إجك 4 -457.95 440.66 *** 4.08 (26٪) 10.71 (67٪) 1.14 (7٪)
P دقيقة غير مصححة M ij = A i + ε إيج 3 -875.03 6.05 (9٪) 59.39 (91٪)
M إجك = S i + A j + ε إجك 4 -664.58 420.91 *** 16.67 (22٪) 53.08 (70٪) 6.31 (8٪)
P ماكس تصحيح M ij = A i + ε إيج 3 -445.05 1.15 (22٪)
M إجك = S i + A j + ε إجك 4 -444.88 0.3378 4.08 (78٪) 0.01 (<1٪) 1.14 (22٪)
P دقيقة تصحيح M ij = A i + ε إيج 3 -649.9 16.67 (73٪) 6.24 (27٪)
M إجك = S i + A j + ε إجك 4 -649.9 0 16.67 (73٪) 0 6.31 (27٪)

الجدول 1: النماذج الخطية المختلطة لتأثير الترجيت والجلسة. خطي مختلط تأثير نماذج من تأثير الترجيت والجلسة على أ( P ماكس أند P مين ) من 50 تارجيتس إعادة قياسها عبر خمس جلسات، مع مكونات التباين المقدرة من خلال ريمل. وكانت النماذج نماذج مختلطة ذات تأثير مختلط. م : قياس التصبغ. a : الفردية ترغيت قياس. S : سيسيون؛ ε : الخطأ المتبقي. يتم عرض X2 كبيرة بخط غامق. * p <0.05. ** p <0.01. *** p <0.001.

سمة درجة الحرارة Tergite درجة الحرارة
x تيرجيت
P ماكس F -ratio 8.14 55.59 6.6
P 0.002 <0.001
P دقيقة F -ratio 4.41 66.11 6.36
P 0.026 <0.001 0.002
W الفرقة F -ratio 113.93 0.01 0.64
P <0.001 0.931 0.531
W تيرجيت F -ratio 1.79 0.92 5.11
P 0.191 0.338 0.007
R الفرقة F -ratio td> 27.66 0.08 1.46
P <0.001 0.782 0.23

الجدول 2: تأثير درجة الحرارة والهوية الترجيتية. تأثير درجة الحرارة وهوية الترجيت على جوانب مختلفة من تصبغ البطن في 50 تراجيتس إعادة قياسها عبر خمس جلسات. وكانت النماذج نماذج مختلطة ذات تأثير مختلط، مع تضمين ذبابة فردية كعامل عشوائي. P ماكس : الحد الأقصى تصبغ (تصحيح). P دقيقة : الحد الأدنى تصبغ (تصحيح). الفرقة W : عرض الفرقة الصباغ. W تيرجيت : عرض تيرجيت؛ R الفرقة : العرض النسبي من الفرقة الصباغ. وتظهر العوامل الثابتة الهامة بالخط العريض ( P < 0.05).

t.within صفحة = "دائما">
اعترض W الفرقة درجة الحرارة Tergite
17C 25C الثالث
P ماكس β 234.35 0.069 0.063 -1.178 -0.588
F 29.93 5.97 54.82
P <0.001 0.008 <0.001
P دقيقة β 223.96 -0.137 3.931 -3.024 -1.54
F 19.33 تمتد = "2"> 9.66 62.02
P <0.001 0.001 <0.001

الجدول 3: تأثير عرض نطاق الصباغ، ودرجة الحرارة، وهوية الترجيت على مستوى التصبغ. تأثير عرض نطاق الصباغ، ودرجة الحرارة، والهوية الترجيت على مستوى التصبغ في 50 تارجيتس إعادة قياسها عبر خمس جلسات. وكانت النماذج نماذج مختلطة ذات تأثير مختلط، مع تضمين ذبابة فردية كعامل عشوائي. P ماكس : الحد الأقصى تصبغ (تصحيح). P دقيقة : الحد الأدنى تصبغ (تصحيح). الفرقة W: عرض الفرقة الصباغ. R الفرقة : العرض النسبي من الفرقة الصباغ.

ملف تكميلي 1. سوبليمنتالي المعلومات.y_Information.pdf "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

ملف تكميلي 2. تحليل النصي Pigmentation.R. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 3. قياس Pigmentation.ijm الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.

محاكاة R النصي. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وتسمح هذه المنهجية بالاكتساب الدقيق والسريع والمتكرر لبيانات التصبغ في شكل كمي مناسب للتحليلات المتعددة للمصب. وقد استخدمت هذه الطريقة للحصول على بيانات عن تأثير درجة الحرارة على تصبغ البطن في خط إيزوجينيك من الذباب. ومع ذلك، يمكن استخدام المنهجية في الدراسات الوراثة إلى الأمام لتحديد الجينات التي تكمن وراء الاختلافات التصبغ بين الأفراد، والسكان، أو الأنواع، أو الدراسات الوراثية العكسية لاستكشاف آثار جينات محددة على أنماط تصبغ. على الرغم من أن، كما نوقش أعلاه، كانت هناك عدد لا يحصى من الدراسات التي استكشفت تطوير وتطور D. ميلانوغاستر تصبغ، والدقة التي هذه المنهجية التقاط البيانات تصبغ في شكل كمي يسمح لنهج إحصائية أكثر قوة. وهذا بدوره يسمح للباحثين باستخدام عينات أقل عند تحليل أنماط التصبغ، أو يسمح لهم لتوضيح أكثر دقةجوانب التصبغ. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة لا تتطلب تشريح الذبابة، والسماح للعينة لاستخدامها لاحقا لتحليلات إضافية، مثل القياسات المورفولوجية أو التنميط الجيني. في الواقع، يمكن استخدام المنهجية على الذباب تخدير، والتي يمكن بعد ذلك ولدت بشكل انتقائي على أساس خصائص تصبغها.

وهناك مشكلة محتملة تتعلق بقياس التصبغ من خلال تحليل الصور هي أن قيم التصبغ قد تعكس التعرض وظروف الإضاءة التي تم التقاط صورة فيها، بدلا من مستوى التصبغ نفسه. في حين أن استخدام مستويات الإضاءة الثابتة، والمواقف الخفيفة، والتكبير، والتعرض يساعد على تخفيف هذه القضايا، فمن المرجح أنه سيكون لا يزال من الضروري اتخاذ عدة صور التحكم المتكررة في كل دورة للسيطرة الكاملة لآثار الدورة. وتشمل هذه الطريقة إعادة التصوير خمسة عشر عينات السيطرة كل دورة واستخدام التغييرات بين الدورات في P ماx و P دقيقة للكشف عن آثار الدورة والقضاء عليها. ومع ذلك، فإن العدد الدقيق لعينات السيطرة التي ينبغي إعادة تصويرها تعتمد على أجهزة التصوير والبرمجيات المستخدمة، وجانب تصبغ الفائدة للمستخدم، وكيف متغير هو بين العلاجات، وكيف يتم التقاط العديد من الصور في كل جلسة. إن إجراء تجربة أولية يتم فيها إعادة تصوير العينات نفسها على مدى خمس جلسات سيسمح للمستخدم بحساب التباين الناتج عن تأثيرات الجلسة، والتباين الناتج عن هوية العينة، والتباين المتبقي (وهو تقدير خطأ القياس بعد التصحيح لآثار الدورة) ( الجدول 1 ). ويمكن بعد ذلك استخدام هذه القيم لتقدير عدد صور التحكم التي يجب اتخاذها في كل جلسة للكشف عن آثار الدورة والتحكم فيها. وقد كتب نص بسيط R ويستخدم البيانات من هذه التجربة الأولية لمحاكاة تدابير تصبغ عبر جلسات. يمكن استخدامهللتحقق من أن عدد صور التحكم لكل جلسة كافية لإزالة تأثيرات الجلسة. يتم توفير هذا البرنامج النصي كملف تكميلي.

إذا كان المستخدمون يشعرون بالقلق من وجود عوامل إزعاج داخل الجلسات، يمكنهم أيضا إعادة تصوير نفس العينة عدة مرات خلال الجلسة، كما هو موضح في جون وآخرون، 2016 41 . في هذه الحالة، يجب تغيير [سامبليد] لعينة التحكم المفردة في كل مرة يتم إعادة تصويرها في جلسة ما (على سبيل المثال، عنصر التحكم 1، عنصر التحكم 2، عنصر التحكم 3، إلخ ). وإلا، فإن برامج التصوير تحل محل الصورة السابقة مع صورة جديدة من نفس الاسم. تقوم وظيفة التصحيح على تصحيحها على الصور المكررة مع نفس [سامبليد] بين الجلسات المجاورة مؤقتا، وسوف تصحح، ما إذا كان يتم إعادة تصوير نفس العينة عدة مرات داخل وبين الدورات أو ما إذا كان يتم تصوير نفس مجموعة من عينات التحكم بين الجلسات. بغض النظر عن كيفية ثتؤخذ صور التحكم الإلكتروني، وينبغي التعامل مع الجلسات على أنها كتل، وحيثما كان ذلك ممكنا، ينبغي على المستخدمين أن يستخدموا تصميما عشوائيا للكتل بحيث يمكن التحكم في أي آثار دورة تبقى بعد التصحيح إحصائيا. وإذا تعذر ذلك، يجب أن يتم تعيين العينات عشوائيا إلى جلسات بحيث لا يتم الخلط بين آثار الدورة والعوامل التجريبية.

ويعتمد البروتوكول على توليد التشكيل الجانبي الذي يمثل التغيير في تصبغ عبر كل ترجيت. قضية واحدة مع توليد هذا الملف هو الشعر الداكن التي تغطي بشرة في البطن، والتي هي بيسيكتد دائما من قبل أي خط الأمامي الخلفي الذي يعبر تيرجيت. بروتوكول يقلل من الضوضاء الناتجة عن هذه الشعر عن طريق أخذ الشخصية تصبغ متوسط ​​عبر نطاق من بشرة. ومع ذلك، يمكن للمستخدمين تعيين عرض عائد الاستثمار إلى 1 بكسل في الخطوة 5.6 إذا كانوا يرغبون في إنشاء التشكيلات التي تقوم على خط رقيق من بشرة. وعلاوة على ذلك، يمكن للمستخدمين تحليل tانه نفس الصورة عدة مرات، وتغيير الموقف الجانبي من التشكيل الجانبي لالتقاط التغيرات في عرض الفرقة الصباغ داخل جزء. في هذه الحالة، ومع ذلك، سوف يحتاج المستخدمون لنسخ نفس الصورة عدة مرات وإعطاء كل نسخة اسم فريد قبل إجراء الخطوة 5.1، حيث أن ماكرو إيماجيج سوف الكتابة فوق التشكيلات من نفس الاسم.

ومن الاعتبارات الهامة الثانية عند توليد التشكيل الجانبي هو معلمة التمهيد للخط المكعب، المعرفة في الدالة spline.der.er (L63) في تحليل التصبغ R. تعتمد معلمة التمهيد المناسبة على إعداد التصوير والقرار. الإفراط في تمهيد ملف التعريف يمكن أن يؤدي إلى فقدان خصائص الملف الجانبي سبلين المستخدمة لحساب إحداثيات T 1 ، T 2 ، و T 3 ( الشكل 2D و 2D '). على العكس من ذلك، تحت تجانس يزيد منالضوضاء من التشكيل الجانبي وبالتالي دقة الاستخراج الإحداثيات. وتنتج الدالة تشيك ملخصا بيانيا للخلية ومشتقاتها ويمكن استخدامها كدليل مرئي لاختيار معلمة التمهيد المناسبة.

المنهجية الموصوفة هنا تركز على التقاط البيانات على تصبغ من تيرجيتس البطن الثالث والرابع في الإناث والذكور D. ميلانوغاستر . ومع ذلك، تشير النتائج التمثيلية أنه يمكن أيضا أن تستخدم لقياس تصبغ الشرائح البطن الخامس والسادس للإناث. وعلاوة على ذلك، يمكن للمنهجية الكشف عن الاختلافات في النمط الظاهري الناجمة عن المسوخ من الجينات التي تؤثر على التصبغ. يمكن بسهولة الماكرو إيماجيج و R المخطوطات تعديلها لقياس تصبغ في أبدونز من أنواع D. ميلانوغاستر مختلفة، أو حتى تصبغ أجزاء الجسم الأخرى في أصناف أخرى، شريطة أن نمط تصبغ هو النمطية. وأخيرا، المنهجيةيمكن أيضا تكييفها لقياس جوانب لون التصبغ عن طريق التقاط الصور في رغب وتحليل كل قناة على حدة.

بشكل عام، هذه المنهجية هي جزء من مجال الناشئة من فينوميكس 51 ، 52 . الهدف من فينوميكس هو توليد وتحليل مجموعات البيانات الظاهرية متعددة الأبعاد كبيرة لفهم أفضل للتفاعلات الوراثية والبيئية التي تؤثر على النمط الظاهري، بما في ذلك المرض، وكيف تتطور هذه التفاعلات لتوليد التنوع البيولوجي. ل فينوميكس لتحقيق إمكاناتها، ومع ذلك، منهجيات للحصول على البيانات المظهرية يجب أن تكون واضحة ومتكيفة بسهولة لمختلف الظواهر، وكذلك متاحة بحرية. وباستخدام برمجيات مفتوحة المصدر لتحليل الصور الملتقطة باستخدام المعدات القياسية، تساعد هذه المنهجية على تحقيق هذا الهدف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية المنح يوس-1256565 و يوس-1557638 إلى أوس. نشكر باتريشيا ويتكوب وثلاثة مراجعين مجهولين لتعليقاتهم المفيدة على نسخة سابقة من هذه الورقة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 Biology Forceps FST 11252-30
Agar Sigma-Aldrich 5040
Dissecting Scope Leica MZ16FA
Base Leica MDG41
Camera Leica DFC280
Gooseneck Cold Light Source Schott ACE 1
Image Acquisition Control Software Micro-Manager v1.3.20 https://micro-manager.org/
Image Analysis Software ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/
Data Analysis Software R 3.3.2 https://www.r-project.org/
LED Thor Labs LEDWE-15
Multimeter Fluke Fluke 75 Series II
60 mm x 15 mm Petri dish Celltreat Scientific Products 229663
Stage micrometer Klarman Rulings, Inc. KR-867

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wittkopp, P. J., Beldade, P. Development and evolution of insect pigmentation: Genetic mechanisms and the potential consequences of pleiotropy. Semin. Cell Dev. Biol. 20 (1), 65-71 (2009).
  2. Lindgren, J. Interpreting melanin-based coloration through deep time: a critical review. Proc Roy Soc B-Biol Sci. 282 (1813), (2015).
  3. Kronforst, M. R., Papa, R. The Functional Basis of Wing Patterning in Heliconius Butterflies: The Molecules Behind Mimicry. Genetics. 200 (1), 1-19 (2015).
  4. Albert, N. W., Davies, K. M., Schwinn, K. E. Gene regulation networks generate diverse pigmentation patterns in plants. Plant Signal Behav. 9, e29526 (2014).
  5. Monteiro, A. Origin, development, and evolution of butterfly eyespots. Annu Rev Entomol. 60, 253-271 (2015).
  6. Kronforst, M. R. Unraveling the thread of nature's tapestry: the genetics of diversity and convergence in animal pigmentation. Pigm Cell Melanoma Res. 25 (4), 411-433 (2012).
  7. Wright, T. R. The genetics of biogenic amine metabolism, sclerotization, and melanization in Drosophila melanogaster. Adv Genet. 24, 127-222 (1987).
  8. True, J. R. Insect melanism: the molecules matter. TREE. 18 (12), 640-647 (2003).
  9. Kopp, A., Duncan, I. Control of cell fate and polarity in the adult abdominal segments of Drosophila by optomotor-blind. Development. 124 (19), 3715-3726 (1997).
  10. Kopp, A., Muskavitch, M. A., Duncan, I. The roles of hedgehog and engrailed in patterning adult abdominal segments of Drosophila. Development. 124 (19), 3703-3714 (1997).
  11. Kopp, A., Blackman, R. K., Duncan, I. Wingless, decapentaplegic and EGF receptor signaling pathways interact to specify dorso-ventral pattern in the adult abdomen of Drosophila. Development. 126 (16), 3495-3507 (1999).
  12. Kopp, A., Duncan, I., Godt, D., Carroll, S. B. Genetic control and evolution of sexually dimorphic characters in Drosophila. Nature. 408 (6812), 553-559 (2000).
  13. Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134 (4), 610-623 (2008).
  14. Wittkopp, P. J., Williams, B. L., Selegue, J. E., Carroll, S. B. Drosophila pigmentation evolution: divergent genotypes underlying convergent phenotypes. Proc Natl Acad Sci Usa. 100 (4), 1808-1813 (2003).
  15. Brisson, J. A., De Toni, D. C., Duncan, I., Templeton, A. R. Abdominal pigmentation variation in drosophila polymorpha: geographic variation in the trait, and underlying phylogeography. Evolution. 59 (5), 1046-1059 (2005).
  16. Brisson, J. A., Templeton, A. R., Duncan, I. Population genetics of the developmental gene optomotor-blind (omb) in Drosophila polymorpha: evidence for a role in abdominal pigmentation variation. Genetics. 168 (4), 1999-2010 (2004).
  17. Dembeck, L. M. Genetic Architecture of Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 11 (5), e1005163 (2015).
  18. Drapeau, M. D., Radovic, A., Wittkopp, P. J., Long, A. D. A gene necessary for normal male courtship, yellow, acts downstream of fruitless in the Drosophila melanogaster larval brain. J Neurobiol. 55 (1), 53-72 (2003).
  19. Hodgetts, R. B., O'Keefe, S. L. Dopa decarboxylase: a model gene-enzyme system for studying development, behavior, and systematics. Annu Rev Entomol. 51, 259-284 (2006).
  20. Marmaras, V. J., Charalambidis, N. D., Zervas, C. G. Immune response in insects: the role of phenoloxidase in defense reactions in relation to melanization and sclerotization. Arch Insect Biochem Physiol. 31 (2), 119-133 (1996).
  21. Kalmus, H. The Resistance to Desiccation of Drosophila Mutants Affecting Body Colour. Proc Roy Soc London B. 130 (859), 185-201 (1941).
  22. Rajpurohit, S., Gibbs, A. G. Selection for abdominal tergite pigmentation and correlated responses in the trident: a case study in Drosophila melanogaster. Biol J Linn Soc. 106 (2), 287-294 (2012).
  23. Pool, J. E., Aquadro, C. F. The genetic basis of adaptive pigmentation variation in Drosophila melanogaster. Mol Ecol. 16 (14), 2844-2851 (2007).
  24. Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Developmental constraints on an adaptive plasticity: reaction norms of pigmentation in adult segments of Drosophila melanogaster. Evol Dev. 2 (5), 249-260 (2000).
  25. Shakhmantsir, I., Massad, N. L., Kennell, J. A. Regulation of cuticle pigmentation in drosophila by the nutrient sensing insulin and TOR signaling pathways. Dev Dyn. 243 (3), 393-401 (2014).
  26. Struhl, G., Barbash, D. A., Lawrence, P. A. Hedgehog organises the pattern and polarity of epidermal cells in the Drosophila abdomen. Development. 124 (11), 2143-2154 (1997).
  27. Jeong, S., Rokas, A., Carroll, S. B. Regulation of body pigmentation by the Abdominal-B Hox protein and its gain and loss in Drosophila evolution. Cell. 125 (7), 1387-1399 (2006).
  28. Wittkopp, P. J., True, J. R., Carroll, S. B. Reciprocal functions of the Drosophila yellow and ebony proteins in the development and evolution of pigment patterns. Development. 129 (8), 1849-1858 (2002).
  29. True, J. R. Drosophila tan encodes a novel hydrolase required in pigmentation and vision. PLoS Genet. 1 (5), e63 (2005).
  30. David, J. R., Capy, P., Gauthier, J. P. Abdominal pigmentation and growth temperature in Drosophila melanogaster: Similarities and differences in the norms of reaction of successive segments. J Evol Biol. 3 (5-6), (1990).
  31. Gibert, J. M., Peronnet, F., Schlotterer, C. Phenotypic plasticity in Drosophila pigmentation caused by temperature sensitivity of a chromatin regulator network . PLoS Genet. 3 (2), e30 (2007).
  32. Gibert, P., Moreteau, B., Scheiner, S. M. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila: correlated variations between segments. Genet Sel Evol. 30 (2), 181 (1998).
  33. Matute, D. R., Harris, A. The influence of abdominal pigmentation on desiccation and ultraviolet resistance in two species of Drosophila. Evolution. 67 (8), 2451-2460 (2013).
  34. Das, A., Mohanty, S., Parida, B. Abdominal pigmentation and growth temperature in Indian Drosophila melanogaster: Evidence for genotype-environment interaction. J Biosci. 19 (2), 267-275 (1994).
  35. Hollocher, H., Hatcher, J. L., Dyreson, E. G. Evolution of abdominal pigmentation differences across species in the Drosophila dunni subgroup. Evolution. 54 (6), 2046-2056 (2000).
  36. Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila melanogaster: genetic repeatability of quantitative parameters in two successive generations. Heredity. 92 (6), 499-507 (2004).
  37. Carbone, M. A., Llopart, A., deAngelis, M., Coyne, J. A., Mackay, T. F. Quantitative trait loci affecting the difference in pigmentation between Drosophila yakuba and D. santomea. Genetics. 171, 211-225 (2005).
  38. Kopp, A., Graze, R. M., Xu, S., Carroll, S. B., Nuzhdin, S. V. Quantitative trait loci responsible for variation in sexually dimorphic traits in Drosophila melanogaster. Genetics. 163 (2), 771-787 (2003).
  39. Bastide, H., Yassin, A., Johanning, E. J., Pool, J. E. Pigmentation in Drosophila melanogaster reaches its maximum in Ethiopia and correlates most strongly with ultra-violet radiation in sub-Saharan Africa. BMC Evol Biol. 14, 179 (2014).
  40. Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326 (5960), 1663-1667 (2009).
  41. John, A. V., Sramkoski, L. L., Walker, E. A., Cooley, A. M., Wittkopp, P. J. Sensitivity of Allelic Divergence to Genomic Position: Lessons from the Drosophila tan Gene. G3. 6 (9), 2955-2962 (2016).
  42. Wittkopp, P. J. Local adaptation for body color in Drosophila americana. Heredity. 106 (4), 592-602 (2011).
  43. Wittkopp, P. J. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
  44. Edelstein, A. D. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), e10 (2014).
  45. U. S. National Institutes of Health. ImageJ v.1.50i. , Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2016).
  46. Mims, F. M. How to Use LEDs to Detect Light. Make:. 36, 136-138 (2013).
  47. R: Language and Environment for Statistical Computing v.3.3.2. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: https://www.r-project.org/ (2016).
  48. Bates, D., Machler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting Linear Mixed-Effects Models Using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
  49. Shingleton, A. W., Estep, C. M., Driscoll, M. V., Dworkin, I. Many ways to be small: different environmental regulators of size generate distinct scaling relationships in Drosophila melanogaster. Proc Roy Soc Lond B Biol Sci. 276 (1667), 2625-2633 (2009).
  50. French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
  51. Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nat Rev Genet. 11 (12), 855-866 (2010).
  52. Kültz, D. New frontiers for organismal biology. BioSci. 63 (6), 464-471 (2013).

Tags

علم الوراثة، العدد 124، التصبغ، ذبابة الفاكهة، الاختلاف المظهري، المجهري، تحليل الصور الرقمية، فينوميكس
قياس التصبغ البطن في<em&gt; ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saleh Ziabari, O., Shingleton, A. W. … More

Saleh Ziabari, O., Shingleton, A. W. Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (124), e55732, doi:10.3791/55732 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter