Summary
这项工作提出了一种使用数字图像分析快速准确量化黑腹果蝇腹部色素沉着的方法。该方法简化了表型获取和数据分析之间的过程，包括样本安装，图像采集，像素值提取和特征测量。
Abstract
色素是一种形态上简单但高度可变的特征，通常具有适应性意义。它广泛地作为了解形态表型发育和演化的模型。果蝇黑腹果蝇的腹部色素沉着症特别有用，使研究人员能够鉴定出形态学上和种内变异之间的基因座。然而，迄今为止， 黑腹果蝇腹部色素沉着已经在很大程度上通过评分而不是定量地测定，这限制了可用于色素数据的统计分析的形式。这项工作描述了一种新的方法，可以量化成年人黑腹果蝇腹部色素沉着模式的各个方面。该协议包括样品安装，图像捕获，数据提取和分析。用于图像捕获和分析的所有软件都是宏用于开源图像分析。这种方法的优点是能够使用在不同成像系统中高度可重复的方法精确测量色素沉着特征。虽然该技术已经被用于测量成年黑腹果蝇的terga色素沉积模式的变化 ，但是该方法是灵活的并且广泛适用于无数不同生物体中的色素沉着模式。
Introduction
染色显示物种，种群和个体之间以及甚至在个体发育1,2,3,4,5,6期间的个体内的巨大表型变异。尽管在各种各样的动物中有无数的色素沉着研究，但色素沉淀在黑腹果蝇中可能已被最好地研究，其中分子遗传学的全部功能被用于阐明调节色素沉着的发育和生理机制以及这些机制如何演变1 ， 6 。已知关于调节黑腹果糖7,8中颜料的生物化学合成的基因以及控制时间和空间di的基因这种生物合成的贡献9,10,11,12,13。此外，遗传作图已经确定了黑腹果蝇14,15,16,17中色素沉着的基因和种间差异的遗传基因座。色素沉着和多效性之间的关系，如行为18,19和免疫19,20也已经被探索，色素形态15,21,22的适应性意义。因此，黑腹果蝇的色素沉积已经成为一个强大但简单的model用于复杂表型的发展和演变。
成年人黑腹果蝇的色素沉着特征在于身体黑色化的特征，特别是在胸部和背部胸部和腹部。每个角质层（tergite）在背腹的色素沉着是受到最多研究关注的。由于遗传17,23和环境24,25因素，这种色素沉着（ 图1A -F ）有相当大的变化。腹部扁桃体的角质层由前后发育室（ 图1G ）组成，每个隔室可以根据色素沉着和装饰26进一步细分。前房包括六个角质层类型（a1-a6），后隔室包括三（p1-p3）（ 图1G ）。其中，p1，p2和a1角质层通常在未拉伸腹部的tergite下折叠，使得它们被隐藏。可见的可见角质层的特征在于一层重的色素沉着，这里称为“色素带”，由角质层类型a4（毛状的中度刷毛）和a5（毛状的大刷毛）组成，带的后缘比前边缘更强烈地着色（ 图1G ）。该带的前面是轻度着色的毛状角质层的区域，后面具有刷毛（a3）但不是前面的（a2）。在色素的强度和颜料带的宽度方面均观察到苍蝇之间色素沉着的变化。一般来说，大部分后段（腹部段5,6和7）的变化最大，前段较多（腹部gments 3和4） 24 。此外，黑腹果蝇色素沉着中存在性二态性，男性通常具有完全着色的第五和第六腹部白细胞（ 图4C ）。
在黑腹果蝇腹部色素沉着的大多数研究中，色素沉着已被视为一种分类或顺序性状，其特征是定性地测定了27,28,29或半定量地在14,15,16,17,24,30 ， 31,32,33,34,35， 36,37 。这些方法不可避免地缺乏精确度，并且由于它们依赖于色素沉着的主观评估，因此难以比较研究中的数据。一些作者量化了色素沉积的空间维度38,39 ，特异性角质层23,25,39,40的色素沉着强度，或整个腹部T细胞的平均色素沉积强度41,42,43 。然而，这些量化方法不能同时测量腹部色素沉着的强度和空间分布，因此不能捕捉染色体如何在整个abd中变化的细微差别主体tergite。此外，这些量化方法38,41,42,43中的几个需要腹部角质层的解剖和安装。这样做既耗时又破坏样本，使其不能用于额外的形态分析。随着对腹部色素沉着的发展和进化的理解加深，需要更复杂的工具来快速，准确地测量色素沉着的空间分布和强度。
该方法的总体目标是利用数字图像分析获得黑腹果蝇腹部色素沉着的可复制和更准确的测量。该方法包括三个阶段。首先，成年飞行是非破坏性的，并且背部腹部的数字图像被拍摄。其次，使用ImageJ宏，用户定义了从第二个角质层的前部延伸到第三个和第四个腹部节段上的a5角质层（绿色框， 图1G ）的后部的前后后条带。然后沿其长轴提取穿过该条带的宽度的平均像素值，产生一个轮廓，其捕捉到从tergite的前部到后部变化时的色素沉积的空间分布和强度。第三，R脚本用于使用三次样条数学地描述色素分布。然后，R脚本使用花键及其第一和第二导数来提取a2-a5角质层的宽度，颜料带的宽度以及色素沉着的最大和最小水平。因此，该方法量化了腹部色素沉着的空间特征和深度。
这种方法量化了第三和第四腹部白细胞的色素沉着，这些都是许多以前的研究1,15,23,24,25,28,33,39,42的重点，无论是专门还是与更多的后白蛋白组合。尽管比第五和第六腹部白细胞少变量，但第三和第四锥体在男性中并不完全着色，因此该方案可适用于男性和女性。然而，如图所示，方案可用于测量女性第五和第六腹部白细胞的色素沉着。此外，用于提取色素分布特征的脚本的微小修改应允许该方法用于量化各种其他色素沉着的变化生物。
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Protocol
样品安装
注意：成像之前，将死亡的苍蝇存放在70％乙醇的水中。
- 将10 mL 1.25％琼脂溶解在60 mm x 15 mm培养皿中的沸水中，并使其固化。
- 在解剖显微镜下，使用一对精细镊子在凝胶表面制作〜20 mm，2 mm宽，1 mm深的槽。使用细镊子，将成年蝇的腹侧嵌入凹槽中，飞行物的背侧突出于凝胶上方。
注意：凝胶的松动允许容易的重新定位而不损坏样品。同样的槽可以用于多个样品，尽管它会变脏，破碎，随着时间的推移不能使用。使用者可以在相同的凝胶中制作另一个槽。每片可用于拍摄〜200只苍蝇。 - 在70％乙醇水溶液中完全覆盖样品，以减少蜡状角质层的任何光反射，并防止机翼损伤标本操作。
2.显微镜设置
注意：图像采用解剖镜，传输光源，数码相机，鹅颈式冷光源连接到运行图像采集控制软件的计算机上。软件说明特定于Micro-Manager v1.4.20 44 ，它是一款集成了ImageJ 45的开源软件。
- 打开显微镜，数码相机，双鹅颈灯冷光源和电脑。
- 运行图像捕获软件打开一个Micro-Manager窗口和一个ImageJ窗口。在ImageJ窗口中单击“图像”>“类型”>“8位”将所有图像设置为8位。点击Micro-Manager窗口中的“live”，打开一个“Snap / Live”窗口，显示相机的实时预览。
- 如果ne，最大化“Snap / Live”窗口的大小cessary。在Micro-Manager窗口的“对比度”选项卡的下拉“显示模式”菜单中选择“灰度”。
- 将冷光源打开到最大强度，并将每个鹅颈管的尖端从舞台上放置大约120毫米，一个在左边，一个在右边。
注意：用户还可以使用环形照明器，尽管这可能会在飞腹周围产生一圈反射光。 - 手动将显微镜放大倍率设置为60倍，使得视野捕获到舞台上直径约3毫米的区域。
- 将2毫米级千分尺放在舞台上（如果需要，将背景切换到白色）。在观看实时预览时，请在“曝光”框中输入曝光时间（以ms为单位），在“微距管理器”窗口中调整曝光。
- 要在相机上进行空间校准，请选择t中的“直线”工具他的ImageJ窗口画一条线的长度的千分尺。在ImageJ窗口中单击“分析”>“设置刻度”打开“设置刻度”窗口，在“已知距离”框中输入千分尺的长度，单位为μm，并在“单位长度”中输入“μm”框。
- 看到“设置刻度”窗口然后以“像素/μm”显示刻度。记下比例尺，点击“确定”。
- 在“捕捉/实时”窗口中，单击“停止”，然后单击“捕捉”捕获舞台千分尺的图像。
- 将图像保存为8位灰度TIFF，以确保在必要时再次对图像进行空间校准。在ImageJ窗口中单击“文件”>“另存为”>“Tiff ...”指定在文件浏览器中保存文件的位置，命名文件，然后单击“保存”。
- 将舞台切换成黑色并放置在舞台上放置在琼脂上的飞行员（步骤1.1-1.2）。
- 通过显微镜观察并定位飞行，以确保背部中线直立，以便最佳地观察色素沉着模式。移动任何翅膀和附肢，以确保腹部的视线畅通无阻。如果着色的角质层（a2-a5）不可见，则横向挤压腹部，直到（尽管苍蝇的腹部存储在70％乙醇中的水分伸展，因此通常不是必需的）。
注意：定位飞行时，用户可能需要使用较低的放大倍率（20X）。放大倍数必须返回到60X才能继续。 - 手动关注飞行的背腹。手动调整光源的尖端，以尽量减少背部阴影和反射。
- 在查看计算机屏幕上的实时预览时，并在Micro-Manager窗口的“对比度”选项卡中使用像素值直方图，如步骤2.4所述调整曝光，以最大化预览图像的像素值的范围。
- 取出飞行和培养皿，并将其与连接到电压表的LED（光谱输出为430-660 nm）进行更换，以与飞行相同的位置为中心。使用LED和电压表作为光度计46 ，并记录由LED照射的LED产生的电压（〜125 mV）。
注意：LED和电压表用于确保单个实验中多个成像会话中的光线水平不变。 - 在实验期间，不要进一步改变光源的位置或强度，显微镜的放大倍率或照相机的曝光。
3.标本成像
- 将放置在黑色显微镜平台上的琼脂培养皿（步骤1.1-1.3）的培养皿放置，调整飞行的位置，使第三和第四h腹部节段是可见的，背部中线是直立的，如步骤2.9所述。进行前请确保放大倍数为60倍。
- 手动对焦显微镜，使第三和第四背腹部小白鼠在焦点。使用图像捕获软件获取图像作为8位灰阶TIFF，如步骤2.6所述。
注意：图像可以被彩色捕获，随后转换为灰度进行分析。 - 将图像另存为“SESH000_sampleID.tiff”，如步骤2.7所述。
注意：这里，[SESH]是常数，[000]是会话编号，是可变的，但必须是三位数长，[sampleID]是用户希望的，尽管它不能包含任何额外的下划线（_）字符，必须是一个恒定的长度。 [sampleID]应包括用于分析色素数据（ 例如温度或血统）的因素的细节，由独特的非字母表cal字符，如连字符（ - ）。这允许使用标准统计软件轻松地从[sampleID]中解析出这些因素。 - 从舞台上取出培养皿，用下一个标本取代飞行物。重复步骤3.1-3.3，直到所有样本都被成像，无需进一步调整照明水平，放大倍率或曝光。
4.多个会话成像
- 如果图像需要在多个会话中进行，请保持会话中的光线强度，曝光和放大倍率。在每个会话开始时，检查相机的空间校准（步骤2.4）和阶段的光强度（由LED /电压表测量，步骤2.12）。
- 捕获并保存舞台千分尺的图像（步骤2.5-2.7），以确保在必要时再次对图像进行空间校准。
- 使用至少15个对照样本，并在每个会话中随机重新形成对象w用于检测和消除会话效果。确保会话之间的重复控制标本具有相同的[sampleID]但不同[SESH000]。
注意：对照样品是与实验标本收集，储存和相同的苍蝇，但是在会话中重新成像。控制标本的精确数量将取决于用户的实验设置。有关详细信息，请参阅讨论。
图像分析
注意：图像分析在ImageJ 45中进行 ，并使用“Pigmentation.ijm测量”宏作为补充文件。
- 将要分析的所有图像放在同一文件夹中。
- 启动ImageJ并点击“插件”>“宏”>“运行”，在文件浏览器中选择“颜色测量”，然后点击“打开。”
注意：所有后续步骤都在宏中。每个步骤都是一个单独的宏命令。 - 请注意，“操作必需”对话框打开，说明“选择存储图像的文件夹”。单击“确定”，使用文件浏览器选择包含图像的文件夹，然后单击“选择”。
- 请注意，“必要操作”对话框将打开，说明“选择要存储数据的文件夹”。单击“确定”，使用文件浏览器选择所需的文件夹以保存色素分布。点击“选择”。
- 请注意，将打开一个对话框，询问“样本ID中有多少个字符？”在数据输入框中，输入[SampleID]中的字符数，如步骤3.3中所述，然后单击“确定”。
- 请注意，将打开一个对话框，询问“投资回报率有多大？”在数据输入框中，输入前方的像素宽度，后沿条沿着色素分布图被读取（绿色矩形， 图1G ， 图2A和2A '）。点击“确定”默认为20像素。
注意：色素分布在角质层条带上读取，而不是线条，以减少毛发和刷毛引起的噪音。该条的宽度取决于图像的分辨率，但它应该是腹部宽度的1/20，以像素为单位。 - 请注意，宏将打开第一次飞行的图像，一个对话框将询问是否测量当前飞行（单击“是”），进入下一个飞行（单击“否”），或退出宏（点击“取消”）。
- 请注意，将打开一个对话框，说明“定义背腹的中线，从ANTERIOR到POSTERIOR”。 “直线”工具已被选中。从前面到后面画一条线定义背腹的中线。点击“确定” 见图2A和2A '，黄线。
注意：这是用来重新调整图像的方向，使背面的水平线横过屏幕，左前方，使随后的步骤更容易。 - 请注意，将打开一个对话框，说明“定义颜色带后面的Tergite 4的POSTERIOR边”。 “直线”工具已被选中。从后中线边缘到右侧边缘绘制一条线，使得线的中心（由白色正方形标记）恰好位于颜料带（角质层a5）的后边缘的后方。点击“确定”。 见图2A和2A '，品红线。
注意： R脚本将自动检测色素分布中色素带的后缘。 - 注意一个对话框盒子将打开，说明“在着色角质层（a2）的前边缘定义Tergite 4的前端。 “直线”工具已被选中。从前中线边缘到右侧边缘绘制一条线，使得线的中心（由白色正方形标记）位于着色角质层（角质层a2）的前边缘。点击“确定”。参见图2A和2A' ，青色线。
注意： R脚本将这一点定义为Tergite着色角质层的前边缘。在图像上，宏将显示感兴趣区域（ROI），沿着该区域读取色素分布（绿色矩形， 图2A和2A '，在图2B和2B '中放大）。该宏还将打开一个第二个窗口，显示ROI的色素分布图 （ Figur e 2C和2C '），其中x轴是表示为从轮廓的后边缘的像素数的位置，并且y轴是每个位置处的平均像素值。 - 查看将由宏打开的色素分布图的图。如有必要，请在配置文件窗口中单击“实时”，以调整ROI的位置，使其不包含会影响色素形态的任何结构（ 如刷毛）。一旦配置文件满意，点击“确定”。
- 对Tergite 3重复步骤5.8-5.11。
注意：宏然后将色素分布导出为两个CSV文件，每个CSV文件分别命名为“SESH000_samplename_TX_profile.csv”，其中[SESH000_samplename]是图像名称，[TX]分别为第三和第四个小时的T3或T4。 - 请注意，宏会打开下一个图像。重复步骤5.7-5.13，直到所有图像都被分析。
注意：所有数据分析在R47中进行，并使用“Pigmentation.R”分析脚本。下面的“L ...”表示为分析的每个部分运行的脚本的哪一行。有关如何进行分析的更多详细信息，请参阅补充信息。
- 编辑R脚本以设置工作目录（L6）并将文件路径定义到包含.csv配置文件（L11）的文件夹。
- 运行L13-15生成存储在配置文件文件夹中的色素分布简档的列表。
- 加载并运行“reader”和“addPrimaryKey”函数（L17-41）将配置文件读入单个数据帧。
- 在L43编辑脚本以指定图像的空间校准，单位为μm/像素，如步骤2.5所示。
- 加载并运行“adj（L46-58）将轮廓位置（x轴， 图2C和2C '）从ROI的后边缘像素到ROI的前边缘转换为从像素值（0 =黑色，255 =白色）到色素值（0 =无颜料，255 =最大颜料）的轮廓值（y轴， 图2C和2C '）。
- 加载并运行“spline.der.er”函数（L60-71）以生成色素分布及其第一和第二导数的三次样条（ 图2D -2F和2D'- 2F '）。
- 加载并运行“coord”和“assmbly.coord”功能（L74-163），首先提取颜色带的后（T 3 ）和前（T 2 ）边缘的位置（ 图2D和2D ';）和a2角质层的后缘（T 1 ， 图2D和2D '），然后分别提取在T 3和T 1处获得的最大（P max ）和最小（P min ）色素沉着值。
注意：在第5.9步中已经定义了a2角质层的前边缘。 - 可选：加载并运行“chek”功能（L165-175），以检查“coord”功能是否正确识别随机选择的色素分布图的位置T 1-3 。
- 加载并运行索引和度量函数（L178-193），生成标题为“Session”，“Sample”，“Tergite”，“id”（Sample和Tergite的级联）“P max ”的数据表， “P min ”，“W 带 ”（颜料带的宽度，= T3-T 2 ）和“W tergite ”（着色c的宽度子粒a2-a5，= T 3 ）。
- 加载并运行“校正”功能（L196-234）以生成一个数据表，用于校正由于会话效应而产生的任何滋扰因素的P max和P min 。使用在时间上相邻的会话中重新成像的对照样本中P max或P min的平均增加（或降低）。
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Representative Results
该方案用于探讨饲养温度对腹部色素沉着的影响。以前的研究表明，发育温度的升高导致几种果蝇的腹部色素沉积的减少，包括黑腹果蝇 30,32 。具体来说，在腹部3和4中，着色程度（颜料带的宽度）从17℃降至25℃，并且在25℃至28℃之间保持相同。这些研究在1-10级（0：无色素带，tergite完全黄色; 5：颜料带占据tergite的50％; 10：tergite完全暗）中评分色素沉积程度。为了确定定量方法是否能够捕获这种表型可塑性，第七和第四个表面上野生型雌性蝇的同基因系的第三和第四个腹部细胞，在17℃（七只蝇），25℃（九只蝇）和28℃（九只苍蝇）从鸡蛋成虫饲养。为了确定校正程序在删除会话效应引起的麻烦因素方面的有效性，相同苍蝇的色素沉着被重新成像，并在一天，两天，四天和八天后重新测量。然而，会议期间的照明条件和曝光有意改变，以确保删除修正程序的会话效果。图像已发布在Dryad数字存储库中。
提出的第一个问题是是否在会议期间的色素沉着措施有系统的差异。这使用R48中的lme4包来检验以拟合混合模型M ijk = S i + A j +εijk和M ij = A j + εij对于P max 和P min ，其中M是颜料测量， S是会话（随机效应）， A是被测量的腹部Tergite（随机效应）， ε是残差（下标是变量内的水平）。使用对数似然比检验来测试是否将会话作为随机因素显着改善拟合度;它是（ 表1 ）。如预期的那样，通过REML 48生成的方差分量的检查表明，会话效应的变化分别占P max 和P min的总方差的67％和70％（ 表1 ）。
十五个随机选择的对照组（第三或第四，来自苍蝇）选择17℃，25℃或28℃的红色，并且使用它们的平均P max和P min的变化来校正剩余的tergites在整个会话中的色素沉着测量。重复对修正色素沉着测量的分析消除了会话效应（ 表1 ），并将会话效应的总方差百分比降低到零。剩余误差是一个估计值，会话效应消除后的测量误差分别为P max和P min的 22％和27％（ 表1 ）
接下来，使用校正数据来确定是否可以检测温度对色素沉着和大小不同方面的影响。混合模型M ijkm = T i * D j + X k + εijkm拟合到数据，其中T D是tergite（第三或第四）， X是单个飞行（随机因子）。由于色素沉着与温度之间的关系不是线性的，因此将T作为分类因子。测试了色素的最大和最小水平（ P max 和P min ）以及颜料带和Tergite（ W 带和W tergite ）的宽度。还测试了温度对颜料带的相对宽度（ R band = W band / W tergite ）的影响。数据显示，颜料带的绝对（W 带 ）和相对（ R 带 ）宽度从17℃下降到25℃（Tukey事后检验，全部P <0.05），并没有显着变化°C至28°C（Tukey事后检验，
温度对锥体宽度的影响更为复杂。在黑腹果蝇中 ，身体和器官大小随着温度49下降非线性。以前的研究表明，第五腹部小锥体的宽度从16.5℃降至25℃，另外从25℃升高到29℃ 50％ 。虽然宽度有一个非显着的下降第四腹部白细胞从17°C到25°C，第三和第四腹部白细胞的宽度从25°C增加到28°C（ 表2 ， 图3D ）。由于腹部锥体的宽度基本上由用户定义（协议中的步骤5.9-5.10），所以当前和以前的研究之间的差异不可能是由于R脚本从色素沉着特征中提取W tergite的方式。相反，它可能反映了测量腹部段的方式，苍蝇的基因型以及正在测量的腹部白细胞的确切方面的差异。
下一个问题是该方法是否可以产生与使用现有色素沉积评估收集的数据相当的数据。这些方法通常要求观察者主观地将每只飞行物分配给翅片之一基于色素沉积程度15,30,32,33,34的表型类别数量，因此依赖于观察者评估颜料带宽度的能力。为了测试这种客观方法与主观方法的比较，有五名观察员被要求根据第四腹部白细胞色素带的宽度对女性腹部进行45幅图像。将观察者的平均排名与基于W 波段的排名进行比较，使用该方法测量。主观客观排名（ 补充 图1 ，补充信息.pdf）之间存在强烈的相关性，Spearmen = 0.7342， P <0.0001）。
另一个问题与ImageJ中的线性测量工具相比，通过手动测量颜料带的宽度（视觉方法），这种方法从色素样条中提取W 带是如何的。再次，使用两种方法（ 补充 图2 ，补充信息.pdf，OLS， r 2 = 0.49 ，P <0.0001）收集的数据之间发现了强相关性。虽然计算方法一贯测量颜料带窄于“视觉”方法，但回归系数与1无显着差异（ P> 0.05）。
最后提出的问题是这种方法是否可以用于测量其他情况下的腹部色素沉着。该方法可以提取f的P max ，P min ，W band和W tergite女性第六和第六腹部白细胞以及男性第三和第四腹部扁桃体（ 图4 ）。此外，该方法可用于量化乌木 （ e 1 ）蝇类突变体中P max和P min的增加，其显示穿过身体的角质层色素沉着增加，并且在颜料之前角质层的着色特异性增加带28 （ 图4 ）。
图1：黑腹果蝇腹部色素沉着 （ A - F ）在三个温度（17℃，25℃和28℃）下饲养的两种基因型的雌性中，腹部色素沉着的变化。 A3和A4是第三和第四腹部tergi分别。 （ G ）背腹部白细胞包括前部和后部隔室，其中只有部分在未伸展的腹部可靠地可见。隔室进一步分为不同的角质层类型：a1：未着色，无毛发; a2：轻度着色和毛发; a3：轻度着色，毛发和中度鬃毛; a4：黑色色素，头发和中度毛; a5：黑色色素，头发和大鬃毛; a6：未着色和毛发; p3：未着色和毛发; p2：无色素，无毛发;和p1：未着色和细分。颜料带由角质层a4和a5组成。在分析中仅使用着色角质层（a2-a5，绿色盒子）。 （AF）中的比例尺= 200μm。已经调整了所有图像的对比度以突出色素形态，并且图像是说明性的。用于产生代表性结果的未经调整的图像存放在Dryad数字存储库中。.com / files / ftp_upload / 55732 / 55732fig1large.jpg“target =”_ blank“>请点击此处查看此图的较大版本。
图2：用于定量腹部色素沉着的图像和数据分析。 （ A - F ）和（ A - F ）用于不同的标本，并显示分析如何处理不同质量的图像。 （ A ）用户首先定义腹部（黄线）的中线，紫锥线（青色线）的前边缘，以及颜料带（品红线）的后边缘稍后的线。然后，ImageJ宏从前线和后线（白色虚线）的中点绘制一条线，其宽度形成ROI（黑盒子），放大（ B ）。 （ C ）ImageJ宏然后ex沿ROI的前后轴传播平均像素值。注意，在这个阶段，轮廓从后到后读。 （ D - E ） R宏将平均像素值转换为色素值，反转色素分布的方向，用三次样条（ S（x） ）（ D ）拟合，并计算第一（ S（x） ） ）（ E ）和第二（ S（x） ）导数。脚本然后识别： T 3 ，最大色素沉着的位置，其中S（x）从<0到> 0转变，从样条的后面向前移动; T 2 ，色素沉着减少最大的位置， S（x）最大;和T 1 ，Tergite色素沉着处于最小位置， S（x）从> 0转变为<0，向前移动from T 2 ，。可见光可见的前锥体（角质层a2前）由用户定义。 （AF）在一阶导数不能用于找到T 1的情况下 ，通常由于S（x）不与颜色带前方交叉0，脚本将定义T 1作为S（x）从>从T 2向前移动时0〜0。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3：温度对雌性黑腹果蝇腹部色素沉着的不同方面的影响 。 （ A ）颜料带的宽度（ W 带 ， F图1）。 （ B ）颜料带作为Tergite（ R 带 ）的比例。 （ C ）最大（ P max ，上线）和最小（ P min ，较低线）色素沉着。 （ D ）扁豆（ W tergite ）的宽度。点是线性混合效应模型的最小二乘方法（表2）。误差条表示标准误差，并可能被标记遮挡。黑线是第三个腹部小圆锥。灰线是第四个腹部的Tergite。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4：第三和第四腹部白蛋白之间色素沉着的差异。这在（ A 黑痣1名女性，（ B ）野生型女性，（ C ）野生型雄性，野生型女性第五和第六位腹部白细胞。 （ D ）最大色素沉着， P 最大 。 （ E）最小色素沉着， P min 。 （ F ）颜料带的宽度， W 带 。 （ G ）颜料带的相对宽度， R 带 。不同字母的酒吧显着不同（Tukey HSD post-hoc test， P <0.05）。 N = 6，除了乌木1 ，其中N = 4。（ A - C ）中的比例尺=200μm。误差条代表标准误差。已经调整了所有图像的对比度以突出色素形态，并且图像是说明性的。 请click这里查看这个数字的较大版本。
| 模型比较 | 差异成分（占总数的百分比） | ||||||
| 色素性状 | 模型 | DF | 数似然 | X 2 |  （％） |  （％） |  （％） |
| P max未校正 | M ij = A i + εij | 3 | -678.28 | 1.94（14％） | 11.86（86％） | ||
| M ijk = S i + A j + εijk | 4 | -457.95 | 440.66 *** | 4.08（26％） | 10.71（67％） | 1.14（7％） | |
| P min未校正 | M ij = A i + εij | 3 | -875.03 | 6.05（9％） | 59.39（91％） | ||
| M ijk = S i + A j + εijk | 4 | -664.58 | 420.91 *** | 16.67（22％） | 53.08（70％） | 6.31（8％） | |
| P max更正 | M ij = A i + εij | 3 | -445.05 | <td> 4.08（78％） | 1.15（22％） | ||
| M ijk = S i + A j + εijk | 4 | -444.88 | 0.3378 | 4.08（78％） | 0.01（<1％） | 1.14（22％） | |
| P min修正 | M ij = A i + εij | 3 | -649.9 | 16.67（73％） | 6.24（27％） | ||
| M ijk = S i + A j + εijk | 4 | -649.9 | 0 | 16.67（73％） | 0 | 6.31（27％） | |
表1：tergite和session的线性混合效应模型。线性混合效应模型对tergite和会话的影响在五个疗程中重新测量了50个tergites的腹部色素沉着（ P max和P min ），通过REML估计方差分量。模型是线性混合效应模型。 M ：色素测定A ：测量个体tergite; S ：会话ε ：残差重要X²以粗体显示。 * p <0.05。 ** p <0.01。 *** p <0.001。
| 特征 | 温度 | 背甲 | 温度 x Tergite | |
| 最大 | F -ratio | 8.14 | 55.59 | 6.6 |
| P | 0.002 | <0.001 | ||
| P 分钟 | F -ratio | 4.41 | 66.11 | 6.36 |
| P | 0.026 | <0.001 | 0.002 | |
| W 波段 | F -ratio | 113.93 | 0.01 | 0.64 |
| P | <0.001 | 0.931 | 0.531 | |
| W tergite | F -ratio | 1.79 | 0.92 | 5.11 |
| P | 0.191 | 0.338 | 0.007 | |
| R 乐队 | F -ratio 27.66 | 0.08 | 1.46 | |
| P | <0.001 | 0.782 | 0.23 |
表2：温度和tergite身份的影响。温度和tergite身份的影响 在五个会话中重新测量的50个tergites的腹部色素沉着的不同方面。模型是线性混合效应模型，个别飞行作为随机因素。 P max ：最大色素沉着（校正）; P min ：最小色素沉着（修正）; W 带 ：颜料带宽度t ite ite ite ite; R 带 ：颜料带的相对宽度。重要固定因素以粗体显示（ P < 0.05）。
| 截距 | W 波段 | 温度 | 背甲 | |||
| 17C | 25°C | 第三 | ||||
| 最大 | β | 234.35 | 0.069 | 0.063 | -1.178 | -0.588 |
| F | 29.93 | 5.97 | 54.82 | |||
| P | <0.001 | 0.008 | <0.001 | |||
| P 分钟 | β | 223.96 | -0.137 | 3.931 | -3.024 | -1.54 |
| F | 19.33 | 跨度= “2”> 9.66 | 62.02 | |||
| P | <0.001 | 0.001 | <0.001 | |||
表3：颜料带宽，温度和Tergite同一性对色素沉着水平的影响。颜色带宽，温度和tergite身份对五个会话中重新测量的50个tergites色素沉着水平的影响。模型是线性混合效应模型，个别飞行作为随机因素。 P max ：最大色素沉着（校正）; P min ：最小色素沉着（修正）; W 带 ：颜料带宽度R 带 ：颜料带的相对宽度。
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Discussion
该方法允许以适合多次下游分析的定量形式精确，快速和可重复地获取色素数据。该方法已被用于获取温度对苍蝇等基因系中腹部色素沉着的影响的数据。然而，该方法可以用于前向遗传学研究，以鉴定基因，这些基因是个体，群体或物种之间色素沉着差异的基础，或反向遗传研究，以探索特定基因对色素沉着模式的影响。尽管如上所述，已经有无数研究探讨了黑腹果蝇色素沉着的发展和进化，这种方法以定量形式捕获色素数据的精度允许更强大的统计方法。这反过来允许研究人员在分析色素沉着模式时使用较少的样品，或者允许他们澄清更微妙色素沉着的方面。此外，该方法不需要对蝇的解剖，允许样品随后用于额外的分析，例如形态学测量或基因分型。实际上，该方法可以潜在地用于麻醉的苍蝇，然后可以根据其色素沉着特征选择性地繁殖。
通过图像分析测量色素沉着的一个潜在问题是色素沉淀值可能反映了拍摄图像的曝光和照明条件，而不是色素沉着水平。在使用固定照明级别时，光照位置，放大倍数和曝光有助于缓解这些问题，但是在每个会话中仍然需要采取几个重复控制图像来完全控制会话效果。该方法包括对每个会话中的15个对照标本进行重新成像，并使用P ma中的会话间变化x和P min来检测和消除会话效果。然而，应该重新成像的对照样本的精确数量将取决于所使用的成像硬件和软件，用户感兴趣的色素沉着的方面以及处理之间的变化以及在每个处理中获取多少图像会话。进行初步实验，其中相同标本在五个会话中重新成像将允许用户计算由于会话效应，样本身份的差异和残差方差（这是校正后的测量误差的估计）用于会话效果）（ 表1 ）。然后可以使用这些值来估计在每个会话中需要采用多少控制图像来检测和控制会话效果。已经编写了一个简单的R脚本，并使用这种初步实验的数据来模拟会话中的色素沉着测量。可以使用以检查每个会话的控制图像数量是否足以删除会话效果。该脚本作为补充文件提供。
如果用户担心会话中有滋扰因素，他们还可以在整个会话中重复对同一样本进行多次重写，如John 等人， 2016 41所述。在这种情况下，每次在会话中重新映像（ 例如 control1，control2，control3 等 ）时，必须更改单个对照样本的[sampleID]。否则，成像软件将用相同名称的新图像替换以前的图像。校正功能使其在时间上相邻的会话之间具有相同[sampleID]的重复图像的校正，并且将校正相同样本是否在会话之间和之间重复成像多次，或者是否在会话之间对相同组的对照样本进行成像。无论如何e控制图像被采取，会话应被视为块，并且在可能的情况下，用户应该采用随机区块设计，以便可以统计地控制校正后保留的任何会话效果。没有这个，标本应该被随机分配到会话中，以便会话效果不会与实验因素混淆。
该方案依赖于代表色素沉着变化的色素形成图，其表示每个紫锥体的色素沉着变化。产生这种形态的一个问题是覆盖腹部角质层的黑色头发，其通过任何前后线穿过扁桃体而总是平分。该方案通过取代在角质层带上平均的色素分布来降低这些毛发产生的噪音。然而，如果希望产生基于角质层细线的轮廓，则用户可以在步骤5.6中将ROI的宽度设置为1个像素。此外，用户可以分析t相同的图像多次，改变色素分布的横向位置以捕获片段内的颜料带的宽度的变化。然而，在这种情况下，用户需要复制相同的图像多次，并在执行步骤5.1之前给每个副本一个唯一的名称，因为ImageJ宏将覆盖同名的配置文件。
生成色素分布图时，第二个重要的考虑因素是三色样条的平滑参数，它定义在色素分析R脚本分析中的样条函数（L63）中。适当的平滑参数取决于成像设置和分辨率。轮廓的过度平滑可导致用于计算T 1 ，T 2和T 3坐标的样条轮廓的特性的损失（ 图2D和2D '）。相反，欠平滑增加了轮廓的噪声和坐标提取的精度。 chek函数产生样条曲线及其派生词的图形摘要，可用作视觉提示来选择适当的平滑参数。
这里描述的方法重点是捕获女性和男性黑腹果蝇中第三和第四腹部白细胞色素沉着的数据 。然而，代表性的结果表明，它也可以用于测量女性第五和第六腹部的色素沉着。此外，该方法可以检测由影响色素沉着的基因突变体引起的表型差异。 ImageJ宏和R脚本可以轻松修改，以测量不同黑腹果蝇物种的腹部色素沉着 ，甚至其他分类群中其他身体部位的色素沉着，只要色素沉着模式是刻板印象的。最后，方法论也可以适应于通过在RGB中捕获图像并分别分析每个通道来测量色素沉着色的方面。
一般来说，这种方法是新兴领域的一部分， 51，52 。现象学的目标是产生和分析大型多维表型数据集，以更好地了解影响表型的遗传和环境相互作用，包括疾病，以及这些相互作用如何发展以产生生物多样性。然而，为了实现其潜力，用于获取表型数据的方法应该是直接的，并且易于适应于不同的表型，并且可以自由获得。通过使用开源软件分析使用标准设备捕获的图像，该方法有助于实现此目标。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
这项工作由国家科学基金会授予IOS-1256565和IOS-1557638资助给AWS。感谢Patricia Wittkopp和三位匿名评论者对本文早期版本的有益评论。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Biology Forceps | FST | 11252-30 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Dissecting Scope | Leica | MZ16FA | |
| Base | Leica | MDG41 | |
| Camera | Leica | DFC280 | |
| Gooseneck Cold Light Source | Schott | ACE 1 | |
| Image Acquisition Control Software | Micro-Manager v1.3.20 | https://micro-manager.org/ | |
| Image Analysis Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Data Analysis Software | R 3.3.2 | https://www.r-project.org/ | |
| LED | Thor Labs | LEDWE-15 | |
| Multimeter | Fluke | Fluke 75 Series II | |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Celltreat Scientific Products | 229663 | |
| Stage micrometer | Klarman Rulings, Inc. | KR-867 |
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