Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

Количественное определение пигментации брюшной полости в doi: 10.3791/55732 Published: June 1, 2017

Summary

В этой работе представлен метод быстрого и точного количественного определения абдоминальной пигментации Drosophila melanogaster с использованием цифрового анализа изображений . Этот метод упрощает процедуры регистрации фенотипов и анализа данных и включает в себя установку образца, сбор изображений, извлечение значений пикселей и измерение признаков.

Abstract

Пигментация - это морфологически простая, но очень переменная черта, которая часто имеет адаптивное значение. Он широко использовался как модель для понимания развития и эволюции морфологических фенотипов. Пигментация брюшной полости у Drosophila melanogaster особенно полезна, что позволяет исследователям идентифицировать локусы, лежащие в основе межвидовых и внутривидовых изменений морфологии. До сих пор, однако, брюшная пигментация D. melanogaster в значительной степени анализировалась качественно, за счет скоринга, а не количественно, что ограничивает формы статистического анализа, которые могут быть применены к данным пигментации. Эта работа описывает новую методологию, которая позволяет количественно оценить различные аспекты картины брюшной пигментации у взрослого D. melanogaster . Протокол включает в себя монтаж образцов, захват изображений, извлечение данных и анализ. Все программное обеспечение, используемое для макросъемки и анализа изображенийНаписанный для анализа изображений с открытым исходным кодом. Преимуществом этого подхода является способность точно измерять пигментные черты с использованием методики, которая очень воспроизводима в разных системах визуализации. Хотя эта методика использовалась для измерения вариаций в моделях пигментации трогала у взрослого D. melanogaster , эта методология является гибкой и широко применимой к образцам пигментации в множестве различных организмов.

Introduction

Пигментация показывает огромные фенотипические различия между видами, популяциями и индивидуумами и даже внутри индивидуумов во время онтогенеза 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Несмотря на многочисленные исследования пигментации у самых разных животных, пигментация, пожалуй, лучше всего изучалась у Drosophila melanogaster , где полная сила молекулярной генетики использовалась для выяснения механизмов развития и физиологии, которые регулируют пигментацию и как эти механизмы развиваются 1 , 6 . Многое известно о генах, которые регулируют биохимический синтез пигментов в D. melanogaster 7 , 8 и генах, которые контролируют временную и пространственную диСтроение этого биосинтеза 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Кроме того, генетическое картирование выявило генетические локусы, лежащие в основе внутри- и межвидовых различий в пигментации у D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 . Также были изучены взаимосвязи между пигментацией и плейотропными чертами, такими как поведение 18 , 19 и иммунитет 19 , 20 , а также адаптивное значение рисунков пигментации 15 , 21 , 22 . Таким образом, пигментация в D. melanogaster появилась как мощный, но простой mДля разработки и эволюции сложных фенотипов.

Пигментация у взрослых D. melanogaster характеризуется различными формами меланизации по всему телу, особенно на крыльях, спинной грудной клетке и животе. Это пигментация каждой кутикулярной пластины (тергита) на дорзальном животе, однако, которая получила наибольшее внимание для исследования. Значительные различия в этой пигментации ( рис. 1А- Ф) обусловлены как генетическими 17 , 23, так и экологическими 24 , 25 факторами. Кутикула брюшного тергита состоит из передних и задних отделов развития ( рис. 1G ), каждая из которых может быть дополнительно разделена в зависимости от пигментации и орнамента 26 . Передний отдел включает шесть кутикулы(A1-a6), а задний отсек включает три (p1-p3) ( рисунок 1G ). Из них кутикула p1, p2 и a1 обычно складывают под тергитом в невытянутых брюшных полотнах, так что они скрыты. Надежная видимая кутикула характеризуется полосой тяжелой пигментации, здесь называемой «пигментной лентой», состоящей из типов кутикулы a4 (волосатая с умеренными щетинками) и a5 (волосатая с большими щетинками), с задним краем полосы Более интенсивно пигментированный, чем передний край ( рис. 1G ). Перед этой полосой находится область слегка пигментированной волосатой кутикулы, которая имеет щетину назад (а3), но не вперед (а2). Изменение пигментации между мухами наблюдается как в интенсивности пигментации, так и в ширине пигментной полосы. В целом, самые большие изменения в большинстве задних сегментов (брюшные сегменты 5, 6 и 7) и ниже в более передних сегментах (брюшное сечениеПункты 3 и 4) 24 . Кроме того, в пигментации D. melanogaster существует половой диморфизм, причем самцы обычно имеют полностью пигментированные пятый и шестой брюшные тергиты ( рис. 4C ).

В большинстве исследований пигментации брюшной полости у D. melanogaster пигментация рассматривалась как категориальный или ординальный признак, при этом образец качественно измерялся 27 , 28 , 29 или полуколичественно по шкале 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . Эти методы неизбежно страдают от недостатка точности, и поскольку они полагаются на субъективную оценку пигментации, трудно сравнивать данные по исследованиям. Несколько авторов определили пространственные размеры пигментации 38 , 39 , интенсивность пигментации определенного типа кутикулы 23 , 25 , 39 , 40 или среднюю интенсивность пигментации по всему тергиту брюшной полости в целом 41 , 42 , 43 . Тем не менее, эти методы количественной оценки не измеряют как интенсивность, так и пространственное распределение брюшной пигментации одновременно и, следовательно, не фиксируют нюансов о том, как пигментация изменяется в зависимости от abdОминальный тергит. Кроме того, некоторые из этих способов 38 , 41 , 42 , 43 количественного определения требуют вскрытия и монтажа брюшной кутикулы. Это требует много времени и разрушает образец, что делает его недоступным для дополнительного морфологического анализа. По мере углубления понимания развития и развития абдоминальной пигментации потребуются более сложные инструменты для быстрого и точного измерения как пространственного распределения, так и интенсивности пигментации.

Общая цель этого метода заключается в использовании цифрового анализа изображений для получения реплицируемой и более точной меры брюшной пигментации в D. melanogaster . Методология включает три этапа. Во-первых, взрослая муха неразрушающе монтируется и берется цифровое изображение дорзального живота. Во-вторых, используя макрос ImageJ, пользовательОпределяет переднюю заднюю полосу пикселей, которая простирается от передней части кутикулы a2 до задней части кукурузы a5 (зеленая коробка, рисунок 1G ) как на третьем, так и на четвертом брюшных сегментах. Среднее значение пикселя по ширине этой полосы затем извлекается вдоль ее длинной оси, создавая профиль, который фиксирует пространственное распределение и интенсивность пигментации, когда он изменяется от передней к задней части тергита. В-третьих, сценарий R используется для описания профиля пигментации математически с использованием кубического сплайна. Сценарий R затем использует сплайн и его первую и вторую производные для извлечения ширины кутикулы a2-a5, ширины полосы пигмента и максимального и минимального уровней пигментации. Таким образом, этот метод количественно определяет как пространственные характеристики, так и глубину пигментации брюшной полости.

Эта методика количественно определяет пигментацию третьего и четвертого тергитов брюшной полости,Которые были в центре внимания многочисленных предыдущих исследований 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , либо исключительно, либо в сочетании с более поздними тергитами. Хотя и менее переменный, чем пятый и шестой тергиты брюшной полости, третий и четвертый тергиты не полностью пигментированы у самцов, поэтому этот протокол может применяться как для мужчин, так и для женщин. Тем не менее, как показано здесь, протокол может использоваться для измерения пигментации в пятом и шестом брюшных тергитах у женщин. Кроме того, незначительные модификации сценариев, используемых для извлечения характеристик профиля пигментации, должны позволять использовать этот метод для количественной оценки изменения пигментации в широком спектре другихорганизмы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Монтаж образцов

ПРИМЕЧАНИЕ. Хранить мертвые мухи в 70% этаноле в воде до получения изображений.

  1. Залить 10 мл 1,25% агара, растворенного в кипящей воде в чашке Петри 60 мм х 15 мм, и дать ему установить.
  2. Под рассекающим микроскопом используйте пару тонкопленочных щипцов, чтобы на поверхности геля нанести углубление шириной ~ 20 мм, шириной 2 мм и глубиной 1 мм. Используя тонкие щипцы, вставьте вентральную сторону взрослой мухи в канавке, с дорсальной стороной мушки, выступающей над гелем.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Слабость геля позволяет легко перемещать, не повреждая образец. Такая же канавка может использоваться для нескольких образцов, хотя она станет грязной, разрушенной и непригодной для использования со временем. Затем пользователь может сделать еще одну канавку в том же геле. Каждая пластина может использоваться для изображения ~ 200 мух.
  3. Полностью покрыть образец в 70% этаноле в воде, чтобы уменьшить любые отражения света от восковой кутикулы и предотвратить повреждение крыла durМанипуляции с образцом.

2. Настройка микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ. Изображения приобретаются с использованием области рассечения, передаваемой световой базы, цифровой камеры и источника холодного света в виде гусиной шеи, прикрепленной к компьютеру, управляющему программным обеспечением для получения изображений. Программные инструкции относятся к Micro-Manager v1.4.20 44 , который представляет собой программное обеспечение с открытым исходным кодом, которое включает ImageJ 45 .

  1. Включите микроскоп, цифровую камеру, источник холодного света с двойной головкой и компьютер.
  2. Запустите программу захвата изображений, чтобы открыть окно Micro-Manager и окно ImageJ. В окне ImageJ нажмите «Изображение»> «Тип»> «8-бит», чтобы установить все изображения как 8-битные. Нажмите «жить» в окне Micro-Manager, чтобы открыть окно «Snap / Live», показывающее предварительный просмотр в реальном времени с камеры.
    1. Увеличьте размер окна «Snap / Live», если necessary. Выберите «Оттенки серого» в раскрывающемся меню «Режим отображения» на вкладке «Контраст» окна «Микро-менеджер».
  3. Включите источник холодного света до максимальной интенсивности и расположите концы каждой гусиной шейки примерно на 120 мм от сцены, один слева и один справа.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Пользователи также могут использовать кольцевой иллюминатор, хотя это может вызвать кольцо отраженного света вокруг живота с мухой.
  4. Вручную установите увеличение микроскопа на 60X, чтобы поле зрения захватывало площадь около 3 мм в диаметре на сцене.
  5. Поместите микрометр ступени 2 мм на сцену (при необходимости переведите фон на белый). При просмотре предварительного просмотра, сосредоточьтесь на микрометре сцены и отрегулируйте экспозицию в окне Micro-Manager, введя время экспозиции в мс в поле «Экспозиция».
  6. Для пространственной калибровки камеры выберите инструмент «прямая линия» в tОн ImageJ и нарисуйте линию длиной микрометра сцены. В окне ImageJ нажмите «Analyze»> «Set Scale», чтобы открыть окно «Set Scale», введите длину микрометра в мкм в поле «Известное расстояние» и введите «μm» в «Единице длины», коробка.
    1. Посмотрите, что окно «Установить масштаб» отображает масштаб в «пикселях / мкм». Запишите масштаб и нажмите «ОК».
  7. В окне «Snap / Live» нажмите «Остановить», а затем «Привязать», чтобы захватить изображение микрометра сцены.
  8. Сохраните изображение как 8-битный TIFF в оттенках серого, чтобы обеспечить возможность пространственной калибровки изображений, если это необходимо. В окне ImageJ нажмите «Файл»> «Сохранить как»> «Tiff ...» Укажите, где сохранить файл в браузере файлов, назовите файл и нажмите «Сохранить».
  9. Переключите сцену на черный и установитеЧашку Петри с мухой, установленной на агаре (этапы 1.1-1.2) на сцене.
  10. Посмотрите на микроскоп и поместите муху, чтобы убедиться, что спинная средняя линия прямо вверх, чтобы лучше всего просмотреть рисунок пигментации. Переместите все крылья и придатки, чтобы обеспечить беспрепятственный просмотр живота. Если пигментированная кутикула (a2-a5) не видна, сжимайте живот в поперечном направлении до тех пор, пока он не будет (хотя живот мух, который хранится в 70% этаноле в воде, растягивается, так что это обычно не требуется).
    ПРИМЕЧАНИЕ. При позиционировании мухи пользователю может потребоваться меньшее увеличение (20X). Увеличение должно быть возвращено до 60X перед продолжением.
  11. Вручную сосредоточьтесь на дорзальном животе мухи. Вручную отрегулируйте кончики источника света, чтобы свести к минимуму тени и отражение на дорзальном животе.
  12. При просмотре предварительного просмотра на экране компьютера и использовании гистограммы значений пикселей на вкладке «Контраст» окна «Микро-менеджер»,Отрегулируйте экспозицию, как описано в шаге 2.4, чтобы максимизировать диапазон значений пикселей изображения предварительного просмотра.
  13. Снимите муху и чашку Петри и замените их светодиодом (спектральный выход 430-660 нм), подключенным к измерителю напряжения, с центром в поле зрения в том же положении, что и муха. Используйте светодиод и измеритель напряжения в качестве индикатора 46 света и записывайте напряжение, генерируемое светом, поражающим светодиод (~ 125 мВ).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Светодиод и измеритель напряжения используются для обеспечения постоянного уровня освещенности на нескольких сеансах визуализации в течение одного эксперимента.
  14. В течение всего эксперимента не изменяйте положение или интенсивность источника света, увеличение микроскопа или экспозицию камеры.

3. Образцы изображений

  1. Поместите чашку Петри с мухой, установленной на агаре (шаги 1.1-1.3) на стадии черного микроскопа. Отрегулируйте положение мухи так, чтобы третья и четвертаяH брюшные сегменты видны, а спинная средняя линия прямо вверх, как описано на шаге 2.9. Перед продолжением убедитесь, что увеличение составляет 60 раз.
  2. Вручную фокусируйте микроскоп таким образом, чтобы третья и четвертая дорзальные брюшные тергиты находились в фокусе. Используйте программное обеспечение для захвата изображения, чтобы получить изображение в виде 8-битного TIFF в оттенках серого, как описано в шаге 2.6.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Изображение можно записать в цвет и затем преобразовать в оттенки серого для анализа.
  3. Сохраните изображение как «SESH000_sampleID.tiff», как описано в шаге 2.7.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь [SESH] является константой, [000] является номером сеанса и является переменной, но должен иметь длину три цифры, а [sampleID] - то, что пожелает пользователь, хотя он не должен содержать никаких дополнительных символов подчеркивания (_) и Должна быть постоянной длины. [SampleID] должен содержать сведения о факторах, используемых при анализе данных пигментации ( например, температуры или линии), разделенных отличительным не-алфавитомCal, например, дефис (-). Это позволяет легко анализировать эти факторы из [sampleID] с использованием стандартного статистического программного обеспечения.
  4. Удалите чашку Петри со сцены и замените муху следующим образцом. Повторяйте шаги 3.1-3.3 до тех пор, пока все образцы не будут отображены, без дополнительной регулировки уровней освещения, увеличения или экспозиции.

4. Обработка изображений на нескольких сеансах

  1. Если изображения нужно снимать в течение нескольких сеансов, поддерживайте интенсивность света, экспозицию и увеличение в течение сеансов. В начале каждого сеанса проверьте пространственную калибровку камеры (шаг 2.4) и интенсивность света на каскаде (как измерено светодиодом / индикатором напряжения, шаг 2.12).
  2. Захватите и сохраните изображение микрометра сцены (шаги 2.5-2.7), чтобы обеспечить возможность пространственной калибровки изображений, если это необходимо.
  3. Используйте по крайней мере 15 контрольных образцов и произвольно перерисуйте их в каждой сессии для alloW для обнаружения и устранения эффектов сеанса. Убедитесь, что дублирующие контрольные образцы между сеансами имеют одинаковые [sampleID], но разные [SESH000].
    ПРИМЕЧАНИЕ. Контрольные образцы представляют собой мухи, собранные, хранящиеся и смонтированные идентично экспериментальным образцам, но повторно отображаемые на всех сеансах. Точное количество контрольных образцов будет зависеть от экспериментальной установки пользователя. См. Обсуждение для более подробной информации.

5. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ. Анализ изображения выполняется в ImageJ 45 и использует макрос «Измерение пигментации.ijm», предоставленный в качестве дополнительного файла.

  1. Поместите все изображения для анализа в одну и ту же папку.
  2. Запустите ImageJ и запустите макрос «Измерение пигментации.ijm», нажав «Плагины»> «Макро»> «Выполнить», выбрав «Измерение пигментации.ijm» в браузере файлов и нажав «открытый."
    ПРИМЕЧАНИЕ. Все последующие шаги находятся внутри макроса. Каждый шаг - это отдельная макрокоманда.
  3. Обратите внимание, что открывается диалоговое окно «Action Required», в котором указано «Выберите папку, в которой хранятся изображения». Нажмите «ОК» и используйте браузер файлов, чтобы выбрать папку, содержащую изображения, и нажмите «выбрать».
  4. Обратите внимание, что откроется диалоговое окно «Action Required», в котором указано «Выберите папку, в которой вы хотите сохранить данные». Нажмите «ОК» и используйте браузер файлов, чтобы выбрать нужную папку для сохранения профилей пигментации. Нажмите «выбрать».
  5. Обратите внимание, что откроется диалоговое окно с запросом «Сколько символов в вашем идентификаторе образца?» В поле ввода данных введите количество символов в [SampleID], как указано в шаге 3.3, и нажмите «ОК».
  6. Обратите внимание, что откроется диалоговое окно с вопросом: «Насколько широка ваша рентабельность?» В поле ввода данных введите ширину пикселя передней панели,Заднюю полосу, вдоль которой должен считываться профиль пигментации (зеленый прямоугольник, рисунок 1G , рисунок 2A и 2A '). Нажмите «ОК»; По умолчанию 20 пикселей.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Профиль пигментации считывается через полоску кутикулы, а не линию, чтобы уменьшить шум из-за волос и щетины. Ширина этой полосы будет зависеть от разрешения изображения, но она должна быть ~ 1/20 ширины живота в пикселях.
  7. Обратите внимание, что макрос откроет изображение первой мухи, и диалоговое окно спросит, следует ли измерять текущую муху (нажмите «Да»), чтобы перейти к следующей мухе (щелкните «Нет») или для выхода из Макрос (нажмите «Отмена»).
  8. Обратите внимание, что откроется диалоговое окно с надписью «Определить среднюю линию дорзального живота от ANTERIOR до POSTERIOR». Инструмент «Прямая линия» уже будет выбран. Нарисуйте линию от переднего к заднемуДля определения средней линии спинного живота. Нажмите «ОК»; См . Рис. 2A и 2A ', желтая линия.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Это используется для переориентации изображения так, что спинная средняя линия лежит горизонтально по экрану, а передняя часть - слева, что облегчает последующие шаги.
  9. Обратите внимание, что откроется диалоговое окно с надписью «Определить границу POSTERIOR Tergite 4 прямо за пигментной лентой». Инструмент «Прямая линия» уже будет выбран. Нарисуйте линию от заднего края средней линии до правого бокового края так, чтобы центр линии (обозначенный белым квадратом) сидел только сзади от заднего края пигментной полосы (кутикула a5). Нажмите «ОК». См . Рис. 2A и 2A ', пурпурная линия.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Сценарий R автоматически обнаружит задний край пигментной полосы из профиля пигментации.
  10. Обратите внимание, что диалогОткроется коробка с надписью «Определите передний край Тергита 4 на переднем краю пигментированной кутикулы (a2)». Инструмент «Прямая линия» уже будет выбран. Нарисуйте линию от переднего края средней линии до правого бокового края так, чтобы центр линии (обозначенный белым квадратом) сидел у переднего края пигментированной кутикулы (кутикула a2). Нажмите «ОК». См . Рис. 2A и 2A ' , голубая линия.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Сценарий R определит эту точку как передний край пигментированной кутикулы тергита. На изображении макрос покажет интересующую область (ROI), по которой считывается профиль пигментации (зеленый прямоугольник, рисунок 2A и 2A ', увеличенный на рис. 2B и 2B '). Макрос также откроет второе окно, показывающее профиль пигментации для ROI ( Figur E 2C и 2C '), где ось x представляет собой положение, выраженное как число пикселей от заднего края профиля, а ось y - среднее значение пикселя в каждой позиции.
  11. Просмотрите графики профиля пигментации, которые откроется макросом. При необходимости нажмите «Живой» в окне профиля, чтобы отрегулировать положение ROI, чтобы он не включал никаких структур ( например, щетинок), которые влияли бы на профиль пигментации. Как только профиль будет удовлетворительным, нажмите «ОК».
  12. Повторите шаги 5.8-5.11 для Тергита 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Затем макрос экспортирует профили пигментации в виде двух файлов CSV, каждый из которых называется «SESH000_samplename_TX_profile.csv», где [SESH000_samplename] - это имя изображения, а [TX] - T3 или T4 для третьего и четвертого тергитов соответственно.
  13. Обратите внимание, что макрос открывает следующее изображение. Повторяйте шаги 5.7-5.13 до тех пор, пока все изображения не будут проанализированы.
Jove_title "> 6. Предварительная обработка данных, анализ и коррекция сеанса

ПРИМЕЧАНИЕ. Весь анализ данных проводится в R 47 и используется сценарий «Анализ пигментации.R». Ниже «L ...» указывает, какие строки сценария запускаются для каждой части анализа. Дополнительную информацию о том, как проводится анализ, см. В дополнительной информации.

  1. Отредактируйте сценарий R , чтобы установить рабочий каталог (L6) и определить путь к файлу в папке, содержащей профили the.csv (L11).
  2. Запустите L13-15, чтобы создать список профилей пигментации, хранящихся в папке профиля.
  3. Загрузите и запустите функции «reader» и «addPrimaryKey» (L17-41), чтобы прочитать профили в один кадр данных.
  4. Измените сценарий на L43, чтобы указать пространственную калибровку изображений в мкм / пикселях, как определено на шаге 2.5.
  5. Загрузите и запустите «adjus»Tments "(L46-58), чтобы преобразовать положение профиля (ось x, рисунок 2C и 2C ') от пикселов от заднего края к ROI до μm-from-front-edge-of-ROI и (Ось y, рисунок 2C и 2C ') от значения пикселя (0 = черный, 255 = белый) до значения пигментации (0 = пигмент, 255 = максимальный пигмент).
  6. Загрузите и запустите функцию «spline.der.er» (L60-71) для генерации кубического сплайна профилей пигментации и его первой и второй производных ( рис. 2D -2F и 2D '- 2F ').
  7. Загрузите и запустите функции «coord» и «assmbly.coord» (L74-163), сначала извлеките положение задних (T 3 ) и передних (T 2 ) краев пигментной полосы ( рис. 2D и 2D );) И задний край кутикулы a2 (T 1 , рисунок 2D и 2D ), а затем для извлечения максимальных (P max ) и минимальных (P min ) пигментационных значений, взятых при T 3 и T 1 соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Передний край кутикулы a2 уже определен на шаге 5.9.
  8. Необязательно: загрузите и запустите функцию «chek» (L165-175), чтобы проверить, правильно ли функция «координирования» идентифицирует позиции T 1-3 для случайно выбранного профиля пигментации.
  9. Загрузите и запустите функции индексов и показателей (L178-193) для создания таблицы данных с заголовками «Сессия», «Образец», «Тергит», «Идентификатор» (конкатенация образца и тергита), «P max », «P min », «W band » (ширина полосы пигмента, = T3 - T 2 ) и «W тергит » (ширина пигментированного cUticles a2-a5, = T 3 ).
  10. Загрузите и запустите функцию коррекции (L196-234), чтобы создать таблицу данных, которая корректирует P max и P min для любых факторов неудобства, возникающих из-за эффектов сеанса. Используйте среднее увеличение (или уменьшение) в P max или P min из контрольных образцов, повторно отображаемых во временных смежных сеансах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Протокол использовался для изучения влияния температуры выращивания на брюшную пигментацию. Предыдущие исследования показали, что увеличение температуры развития приводит к уменьшению распространения брюшной пигментации у нескольких видов дрозофилы , включая D. melanogaster 30 , 32 . В частности, в брюшных тергитах 3 и 4 степень пигментации (ширина пигментной полосы) уменьшается от 17 ° С до 25 ° С и остается неизменной от 25 ° С до 28 ° С 24 , 36 . Эти исследования набрали степень пигментации в масштабе 1-10 (0: отсутствие пигментной полосы, полностью тергит, 5: пигментная полоса занимает 50% тергита, 10: тергит полностью темный). Чтобы определить, может ли количественная методология зафиксировать эту фенотипическую пластичность, пигментацию измеряли вТретий и четвертый тергиты брюшной полости изогенной линии якобы диких видов женских мух, выращенных от яйца до взрослых при 17 ° C (семь мух), 25 ° C (девять мух) и 28 ° C (девять мух). Чтобы определить эффективность процедуры коррекции при устранении факторов неудобства, введенных с помощью эффектов сеанса, пигментация тех же мух была повторно отображена и повторно измерена через один, два, четыре и восемь дней. Однако условия освещения и экспозиция между сеансами были намеренно изменены для обеспечения того, чтобы были устранены эффекты сеанса для процедуры исправления. Изображения размещены в цифровом репозитории Dryad.

Первый вопрос заключался в том, были ли систематические различия в показателях пигментации на всех сессиях. Это было рассмотрено с использованием пакета lme4 в R 48 для соответствия смешанным моделям M ijk = S i + A j +Ε ijk и M ij = A j + ε ij как для P max, так и для P min , где M - мера пигмента, S - сеанс (случайный эффект), A - измеряемый абдоминальный тергит (случайный эффект), а ε - Остаточная ошибка (индексы являются уровнями внутри переменных). Тест коэффициента логарифмического правдоподобия использовался для проверки того, что включение сеанса как случайного фактора значительно улучшило соответствие; ( Таблица 1 ). Как и ожидалось, рассмотрение компонентов дисперсии (генерируемых через REML 48 ) показало, что изменение из-за эффектов сеанса составляло 67% и 70% от общей дисперсии в P max и P min соответственно ( таблица 1 ).

Пятнадцать случайно выбранных контрольных тергитов (третий или четвертый, от мух reaКрасный при 17 ° C, 25 ° C или 28 ° C), а изменения их среднего P max и P min были использованы для коррекции показателей пигментации оставшихся тергитов через сеансы. Повторение анализа по корректированным мерам пигментации устранило эффекты сеанса ( таблица 1 ) и уменьшило процент от общей дисперсии из-за эффектов сеанса до нуля. Остаточная ошибка - это оценка, ошибка измерения после удаления эффектов сеанса и 22% и 27% для P max и P min соответственно ( таблица 1 )

Затем скорректированные данные использовались для определения того, можно ли определить влияние температуры на различные аспекты пигментации и размера. Смешанная модель M ijkm = T i * D j + X k + ε ijkm была привязана к данным, где T D - тергит (третий или четвертый), а X - индивидуальная муха (случайный фактор). Поскольку связь между пигментацией и температурой не является линейной 24 , 36 , Т рассматривался как категориальный фактор. Были испытаны максимальный и минимальный уровни пигментации ( P max и P min ), а также ширина пигментной полосы и тергита ( W- зона и W- тергит ). Было также проверено влияние температуры на относительную ширину пигментной полосы ( R- диапазон = W- полоса / W- тергит ). Данные показали, что абсолютная ширина полосы (W ) и относительная ( R- полоса ) полосы пигмента снизилась с 17 ° C до 25 ° C (пост-часовой тест Tukey, P <0,05 для всех) и существенно не изменился с 25 ° C до 28 ° C (Tukey post-hoc test, таблица 2 , рис. 3A и 3B ), что согласуется с предыдущими исследованиями 24 , 36 . Такая же картина наблюдалась для максимального и минимального уровня пигментации, P max и P min ( таблица 2 , рисунок 3C ). Влияние температуры на уровень пигментации ранее не описывалось, но первоначально оно согласуется с другими исследованиями, которые показывают, что минимальный уровень пигментации в четвертом абдоминальном тергите положительно коррелирует с шириной полосы пигмента в популяциях дикого типа 39 , Однако, хотя данные этого исследования показывают положительную связь между P max и W- полосой , они показывают отрицательную связь между P min и W- полосой( Таблица 3 ). Эта разница между текущими и предыдущими исследованиями может отражать различия в том, как генетические и экологические факторы влияют на корреляцию между уровнем и степенью пигментации брюшной полости. Тем не менее, эти репрезентативные результаты показывают, что протокол способен не только выявлять образцы пигментации, ранее установленные с помощью качественных методологий, но и выявлять новые, которые качественные методологии не могут обнаружить.

Влияние температуры на ширину тергита было более сложным. В D. melanogaster размер тела и органа уменьшается нелинейно с температурой 49 . Предыдущие исследования предполагают, что ширина пятого брюшного тергита уменьшается на 10% от 16,5 ° С до 25 ° С и еще 4% от 25 ° С до 29 ° С 50 . Несмотря на незначительное уменьшение шириныЧетвертый тергит брюшной полости от 17 ° С до 25 ° С, как третий, так и четвертый тергиты брюшной полости увеличивались по ширине от 25 ° С до 28 ° С ( табл. 2 , рис. 3D ). Поскольку ширина тергитов брюшной полости по существу определяется пользователем (шаги 5,9-5,10 в протоколе), несоответствие между текущими и предыдущими исследованиями вряд ли связано с тем, как сценарий R извлекает W- тергит из профиля пигментации. Скорее, это может отражать различия в том, как измеряется брюшной сегмент, генотипы мух и точные аспекты измеряемых брюшинных тергий.

Следующий вопрос заключался в том, может ли методология генерировать данные, сопоставимые с данными, собранными с использованием существующих оценок пигментации. Эти методы обычно просят наблюдателя субъективно назначить каждую муху одному из плавниковКоличество фенотипических классов, основанных на степени пигментации 15 , 30 , 32 , 33 , 34 и, следовательно, полагаться на способность наблюдателя оценивать ширину полосы пигмента. Чтобы проверить, насколько хорошо этот объективный метод сравнивается с субъективными методами, пять наблюдателей попросили оценить 45 изображений женских брюшных полостей на основе ширины пигментной полосы четвертого тербита брюшной полости. Средний рейтинг среди наблюдателей был сопоставлен с ранжированием по W- полосе , измеренным с использованием этой методологии. Существовала сильная корреляция между субъективным и объективным ранжированием ( Дополнительный рисунок 1 , Дополнительная информация.pdf), Spearmen's = 0.7342, P <0.0001).

Другой вопросКак этот метод извлекал полосу W из сплайсинга сплайна по сравнению с измерением ширины полосы пигмента вручную (визуальный метод) с использованием линейного измерительного инструмента в ImageJ . Опять же, была обнаружена сильная корреляция между данными, собранными с использованием двух методологий ( дополнительная диаграмма 2 , в дополнительной информации.pdf, OLS, r 2 = 0,49 , P <0,0001). Хотя вычислительный метод последовательно измерял пигментную полосу как более узкую, чем в «визуальном» методе, коэффициент регрессии не был существенно отличается от 1 ( P> 0,05).

Последний вопрос заключался в том, можно ли использовать эту методологию для измерения пигментации брюшной полости в других контекстах. Методология могла бы извлечь P max , P min , W band и W тергит для fЙ и шестого брюшных тергитов у самок и третьего и четвертого брюшных тергитов у самцов ( рис. 4 ). Кроме того, методология может быть использована для количественного определения увеличения P max и P min мух мута для эбеновых ( e 1 ), которые показывают увеличение кутикулярной пигментации по всему телу и определенное увеличение пигментации кутикулы перед пигментом Полоса 28 ( рисунок 4 ).

Рисунок 1
Рисунок 1: Пигментация брюшной полости у D. melanogaster . ( A - F ) Изменение пигментации брюшной полости у женщин двух генотипов, выращенных при трех температурах (17 ° C, 25 ° C и 28 ° C). А3 и А4 - третья и четвертая брюшные терги Tes, соответственно. ( G ) Дорзальный брюшной тергит включает переднее и заднее отделение, только части которых надежно видны в незатянутых брюшных полотнах. Отделения далее подразделяются на различные типы кутикулы: a1: непигментированные, без волосков; A2: слегка пигментированные и волосы; A3: слегка пигментированные, волоски и умеренная щетина; A4: темно-пигментированные, волоски и умеренная щетина; A5: темно-пигментированные, волосы и большая щетина; A6: непигментированные и волосы; P3: непигментированные и волосы; P2: непигментированные и без волосков; И p1: не пигментированные и тесселированные. Пигментная лента состоит из кутикулы a4 и a5. В анализе используются только пигментированные кутикулы (a2-a5, зеленый ящик). Шкала шкалы = 200 мкм в (AF). Контраст всех изображений был настроен так, чтобы выделить образец пигментации, и изображения являются иллюстративными. Неправильные изображения, используемые для создания репрезентативных результатов, депонируются в цифровом репозитории Dryad..com / files / ftp_upload / 55732 / 55732fig1large.jpg «target =" _ blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

фигура 2
Рисунок 2: Анализ изображений и данных для количественной оценки абдоминальной пигментации. ( A - F ) и ( A - F ) для разных образцов и показывают, как анализ имеет дело с изображениями различного качества. ( A ) Сначала пользователь определяет среднюю линию живота (желтая линия), передний край тергита (голубая линия) и линия, слегка расположенная сзади заднего края пигментной полосы (пурпурная линия). Маска ImageJ затем рисует линию из середины передней и задней линий (белая пунктирная линия), которая расширяется, чтобы сформировать ROI (черный ящик), увеличенный в ( B ). ( C ) Маска ImageJ затем exОбрабатывает среднее значение пикселя вдоль передней-задней оси ROI. Обратите внимание, что на этом этапе профиль читается от заднего к переднему. ( D - E ) Макрос R преобразует средние значения пикселей в пигментационное значение, меняет направление профиля пигментации, соответствует ему кубическим сплайном ( S (x) ) ( D ) и вычисляет первый ( S (x ) ) ( E ) и второй ( S (x) ) производной сплайна ( F ). Затем скрипт идентифицирует: T 3 , положение максимальной пигментации, где S (x) переходит от <0 до> 0, перемещаясь вперед от задней части сплайна; T 2 - положение, при котором пигментация снижается, а S (x) максимальна; И T 1 , положение, где пигментация тергита минимальна и S (x) переходит от> 0 до <0, перемещаясь вперед fRom T 2 ,. Передняя часть надежно видимого тергита (перед кутикулой a2) определяется пользователем. (AF) В тех случаях, когда первая производная не может быть использована для нахождения T 1 , как правило, поскольку S (x) не пересекает 0 впереди полосы пигмента, сценарий будет определять T 1 как положение, в котором S (x) переходит из> 0 до <0 при движении вперед от T 2 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3: Влияние температуры на различные аспекты брюшной пигментации у самки D. melanogaster . ( A ) Ширина полосы пигмента ( W- полоса , FФиг. 1). ( B ) Пигментная полоса как доля тергита ( R- диапазон ). ( C ) Максимум ( P max , верхние линии) и минимальная ( P min , нижняя линия) пигментация. ( D ) Ширина тергита ( W тергит ). Точки являются наименьшими квадратными средствами из линейных моделей смешанного эффекта (таблица 2). Таблицы ошибок представляют собой стандартную ошибку и могут быть скрыты маркерами. Черная линия - третий абдоминальный тергит. Серая линия - четвертый брюшной тергит. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4
Рисунок 4: Различия в пигментации между третьим и четвертым тергитами брюшной полости. Это показано в ( A черное дерево 1 самка, ( B ) самки дикого типа, ( C ) самцы дикого типа, и пятый и шестой брюги тергиты у самцов дикого типа. ( D ) Максимальная пигментация, P max . ( E) Минимальная пигментация, P мин . ( F ) Ширина полосы пигмента, W- полоса . ( G ) Относительная ширина полосы пигмента, R- диапазона . Бары с разными буквами существенно различаются (Tukey HSD post-hoc test, P <0,05). N = 6 для всех, кроме черных 1 , где N = 4. Шкала шкалы = 200 мкм ( A - C ). Шкала ошибок представляет собой стандартную ошибку. Контраст всех изображений был настроен так, чтобы выделить образец пигментации, и изображения являются иллюстративными. Пожалуйста, cliCk здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

<Td> 4,08 (78%)
Сравнение моделей Разностные компоненты (% от общего числа)
Пигментная черта Модель Д.Ф. Вход правдоподобия Уравнение (%) Уравнение (%) Уравнение (%)
P max Не скорректировано M ij = A i + ε ij 3 -678,28 1,94 (14%) 11,86 (86%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -457,95 440,66 *** 4,08 (26%) 10,71 (67%) 1,14 (7%)
P min Не скорректировано M ij = A i + ε ij 3 -875,03 6,05 (9%) 59,39 (91%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -664,58 420,91 *** 16,67 (22%) 53,08 (70%) 6,31 (8%)
P max Исправлено M ij = A i + ε ij 3 -445,05 1,15 (22%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -444,88 0,3378 4,08 (78%) 0,01 (<1%) 1,14 (22%)
P min Исправлено M ij = A i + ε ij 3 -649,9 16,67 (73%) 6,24 (27%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -649,9 0 16,67 (73%) 0 6,31 (27%)

Таблица 1: Линейные модели смешанного эффекта влияния тергита и сеанса. Линейные смешанные эффекты влияния тергита и сеанса наПигментация брюшной полости ( P max и P min ) 50 тергитов, повторно измеренная в течение пяти сеансов, с компонентами дисперсии, оцененными через REML. Модели были линейными смешанными эффектами. М : пигментная мера; A : Измеряется индивидуальный тергит; S : Сессия; Ε : Остаточная ошибка. Значительные X² выделены жирным шрифтом. * P <0,05. ** p <0,01. *** p <0,001.

Черта температура тергит температура
X Тергит
P max F -ratio 8,14 55,59 6,6
п 0,002 <0,001
P min F -ratio 4,41 66,11 6,36
п 0,026 <0,001 0,002
W полоса F -ratio 113,93 0,01 0,64
п <0,001 0,931 0,531
W тергит F -ratio 1,79 0,92 5,11
п 0,191 0,338 0,007
R- диапазон F -ratio 27,66 0,08 1,46
п <0,001 0,782 0,23

Таблица 2: Влияние температуры и идентичности тергита. Влияние температуры и идентичности тергита По различным аспектам абдоминальной пигментации в 50 тергитах, повторно измеренных в течение пяти сеансов. Модели были линейными модельми смешанного эффекта, причем индивидуальная муха включалась как случайный фактор. P max : максимальная пигментация (исправлено); P min : минимальная пигментация (исправлено); W диапазон : ширина пигментной полосы; W тергит : ширина тергита; R диапазон : относительная ширина пигментной полосы. Значительные фиксированные факторы выделены жирным шрифтом ( P < 0,05).

перехват W полоса температура тергит
17C 25˚C В третьих
P max β 234,35 0,069 0,063 -1,178 -0,588
F 29,93 5,97 54,82
п <0,001 0,008 <0,001
P min β 223,96 -0,137 3,931 -3,024 -1,54
F 19,33 диапазон = "2"> 9.66 62,02
п <0,001 0,001 <0,001

Таблица 3: Влияние ширины пигментной полосы, температуры и идентичности тергита на уровень пигментации. Влияние ширины пигментной полосы, температуры и идентичности тергита на уровень пигментации в 50 тергитах, повторно измеренных в течение пяти сеансов. Модели были линейными модельми смешанного эффекта, причем индивидуальная муха включалась как случайный фактор. P max : максимальная пигментация (исправлено); P min : минимальная пигментация (исправлено); W диапазон : ширина пигментной полосы; R диапазон : относительная ширина пигментной полосы.

Дополнительный файл 1. Дополнительная информация.Y_Information.pdf "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 2. Анализ сценария Pigmentation.R. Нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3. Измерение пигментации.ijm Нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Симуляция R Script. Нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эта методика позволяет получить точное, быстрое и повторяемое получение данных о пигментации в количественной форме, подходящей для нескольких последующих анализов. Этот метод был использован для получения данных о влиянии температуры на брюшную пигментацию в изогенной линии мух. Однако методология может быть использована в исследованиях прямой генетики для выявления генов, которые лежат в основе различий пигментации между индивидуумами, популяциями или видами, или реверс-генетических исследований для изучения эффектов конкретных генов на образцы пигментации. Хотя, как обсуждалось выше, было проведено множество исследований, которые исследовали развитие и эволюцию пигментации D. melanogaster, точность, с которой эта методология захватывает данные о пигментации в количественной форме, позволяет использовать более мощные статистические подходы. Это, в свою очередь, позволяет исследователям использовать меньшее количество образцов при анализе рисунков пигментации или позволяет им разъяснять более тонкиеАспекты пигментации. Кроме того, этот метод не требует вскрытия мухи, позволяя впоследствии использовать образец для дополнительных анализов, таких как морфологические измерения или генотипирование. Действительно, методология потенциально может быть использована на анестезированных мухах, которые затем можно выборочно размножать на основе их характеристик пигментации.

Одна из потенциальных проблем с измерением пигментации посредством анализа изображений заключается в том, что значения пигментации могут отражать условия экспозиции и освещения, при которых был сделан снимок, а не уровень пигментации. При использовании фиксированных уровней освещенности, положения света, увеличение и экспозиция помогают смягчить эти проблемы, вполне вероятно, что для каждого сеанса все равно потребуется сделать несколько изображений повторного управления, чтобы полностью контролировать эффекты сеанса. Этот метод включает в себя повторное изображение пятнадцати контрольных образцов каждой сессии и использование межсессионных изменений в P maX и P min для обнаружения и устранения эффектов сеанса. Однако точное количество контрольных образцов, которые должны быть повторно отображены, будет зависеть от используемого аппаратного и программного обеспечения изображения, аспекта пигментации, представляющего интерес для пользователя, и того, как переменная она находится между обработками, и сколько изображений принимается в каждом сессия. Проведение предварительного эксперимента, в котором одни и те же образцы повторно отображаются в течение пяти сеансов, позволит пользователю рассчитать дисперсию из-за эффектов сеанса, дисперсию из-за идентичности образца и остаточную дисперсию (которая является оценкой ошибки измерения после корректировки Для сеансовых эффектов) ( Таблица 1 ). Эти значения затем могут использоваться для оценки того, сколько контрольных изображений необходимо принимать в каждом сеансе для обнаружения и контроля эффектов сеанса. Простой сценарий R был написан и использует данные из такого предварительного эксперимента, чтобы имитировать пигментационные меры во время сеансов. Его можно использоватьЧтобы убедиться, что количество управляющих изображений за сеанс достаточно для удаления эффектов сеанса. Этот скрипт предоставляется как дополнительный файл.

Если пользователи обеспокоены тем, что в сеансах есть факторы неудобства, они могут повторно отображать один и тот же экземпляр несколько раз на протяжении всего сеанса, как описано в John et al., 2016 41 . В этом случае [sampleID] для одного контрольного образца должен быть изменен каждый раз, когда он повторно отображается в течение сеанса ( например , control1, control2, control3 и т. Д.); В противном случае программное обеспечение для создания изображений заменит предыдущее изображение на новое изображение с тем же именем. Функция коррекции основывает свою коррекцию на дублированных изображениях с тем же [sampleID] между временными смежными сеансами и будет корректировать, будет ли один и тот же образец повторно отображаться несколько раз внутри и между сеансами или будет отображаться один и тот же набор контрольных образцов между сеансами. Независимо от того, какПринимаются управляющие изображения, сеансы следует рассматривать как блоки, и, когда это возможно, пользователи должны использовать рандомизированный блок-проект, чтобы можно было статистически контролировать любые эффекты сеанса, которые остаются после коррекции. В противном случае образцы должны быть случайным образом назначены на сеансы, чтобы эффекты сеанса не смешивались с экспериментальными факторами.

Протокол основан на генерации профиля пигментации, который представляет изменение пигментации у каждого тергита. Одной из проблем с созданием этого профиля являются темные волосы, которые покрывают брюшную кутикулу, которые неизменно делят пополам любые передне-задние линии, пересекающие тергит. Протокол уменьшает шум, создаваемый этими волосками, за счет того, что профиль пигментации усредняется по полосе кутикулы. Тем не менее, пользователи могут установить ширину ROI на 1 пиксель на шаге 5.6, если они хотят генерировать профили, основанные на тонкой линии кутикулы. Кроме того, пользователи могут анализировать tОн один и тот же изображение несколько раз, изменяя поперечное положение профиля пигментации, чтобы фиксировать изменения ширины полосы пигмента в сегменте. В этом случае, однако, пользователям необходимо будет скопировать один и тот же образ несколько раз и предоставить каждой копии уникальное имя перед выполнением этапа 5.1, так как макрос ImageJ будет перезаписывать профили с тем же именем.

Второе важное соображение при создании профиля пигментации - это параметр сглаживания кубического сплайна, определенный в функции spline.der.er (L63) в сценарии Analysis of Pigmentation R. Соответствующий параметр сглаживания зависит от настройки и разрешения изображения. Сглаживание профиля может привести к потере характеристик сплайн-профиля, используемого для вычисления координат T 1 , T 2 и T 3 ( рисунок 2D и 2D ). И наоборот, недоглаживание увеличиваетШума профиля и, следовательно, точности координатных выделений. Функция chek дает графическое резюме сплайна и его производных и может использоваться как визуальный сигнал для выбора соответствующего параметра сглаживания.

Описанная здесь методика фокусируется на получении данных о пигментации третьего и четвертого брюшных тергитов у женщин и мужчин D. melanogaster . Однако репрезентативные результаты показывают, что его можно также использовать для измерения пигментации пятого и шестого брюшных сегментов самок. Кроме того, методология может обнаруживать различия в фенотипе, вызванные мутантами генов, которые влияют на пигментацию. Макросы ImageJ и R- скрипты могут быть легко модифицированы для измерения пигментации в брюшной полости различных видов D. melanogaster или даже пигментации других частей тела в других таксонах при условии, что шаблон пигментации является стереотипным. Наконец, методологияТакже может быть адаптирована для измерения аспектов цвета пигментации путем захвата изображений в RGB и анализа каждого канала отдельно.

В общем, эта методология является частью новой области феномики 51 , 52 . Цель феномена состоит в том, чтобы генерировать и анализировать большие многомерные фенотипические наборы данных для лучшего понимания генетических и экологических взаимодействий, которые влияют на фенотип, включая болезнь, и как эти взаимодействия развиваются, чтобы генерировать биологическое разнообразие. Однако для того, чтобы феномен мог реализовать свой потенциал, методологии для получения фенотипических данных должны быть простыми и легко адаптированными к различным фенотипам, а также свободно доступны. Используя программное обеспечение с открытым исходным кодом для анализа изображений, полученных с использованием стандартного оборудования, эта методология помогает достичь этой цели.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была профинансирована Национальным научным фондом и предоставила IOS-1256565 и IOS-1557638 AWS. Мы благодарим Патрицию Виткопп и трех анонимных рецензентов за их полезные комментарии к более ранней версии этого документа.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 Biology Forceps FST 11252-30
Agar Sigma-Aldrich 5040
Dissecting Scope Leica MZ16FA
Base Leica MDG41
Camera Leica DFC280
Gooseneck Cold Light Source Schott ACE 1
Image Acquisition Control Software Micro-Manager v1.3.20 https://micro-manager.org/
Image Analysis Software ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/
Data Analysis Software R 3.3.2 https://www.r-project.org/
LED Thor Labs LEDWE-15
Multimeter Fluke Fluke 75 Series II
60 mm x 15 mm Petri dish Celltreat Scientific Products 229663
Stage micrometer Klarman Rulings, Inc. KR-867

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wittkopp, P. J., Beldade, P. Development and evolution of insect pigmentation: Genetic mechanisms and the potential consequences of pleiotropy. Semin. Cell Dev. Biol. 20, (1), 65-71 (2009).
  2. Lindgren, J. Interpreting melanin-based coloration through deep time: a critical review. Proc Roy Soc B-Biol Sci. 282, (1813), (2015).
  3. Kronforst, M. R., Papa, R. The Functional Basis of Wing Patterning in Heliconius Butterflies: The Molecules Behind Mimicry. Genetics. 200, (1), 1-19 (2015).
  4. Albert, N. W., Davies, K. M., Schwinn, K. E. Gene regulation networks generate diverse pigmentation patterns in plants. Plant Signal Behav. 9, e29526 (2014).
  5. Monteiro, A. Origin, development, and evolution of butterfly eyespots. Annu Rev Entomol. 60, 253-271 (2015).
  6. Kronforst, M. R. Unraveling the thread of nature's tapestry: the genetics of diversity and convergence in animal pigmentation. Pigm Cell Melanoma Res. 25, (4), 411-433 (2012).
  7. Wright, T. R. The genetics of biogenic amine metabolism, sclerotization, and melanization in Drosophila melanogaster. Adv Genet. 24, 127-222 (1987).
  8. True, J. R. Insect melanism: the molecules matter. TREE. 18, (12), 640-647 (2003).
  9. Kopp, A., Duncan, I. Control of cell fate and polarity in the adult abdominal segments of Drosophila by optomotor-blind. Development. 124, (19), 3715-3726 (1997).
  10. Kopp, A., Muskavitch, M. A., Duncan, I. The roles of hedgehog and engrailed in patterning adult abdominal segments of Drosophila. Development. 124, (19), 3703-3714 (1997).
  11. Kopp, A., Blackman, R. K., Duncan, I. Wingless, decapentaplegic and EGF receptor signaling pathways interact to specify dorso-ventral pattern in the adult abdomen of Drosophila. Development. 126, (16), 3495-3507 (1999).
  12. Kopp, A., Duncan, I., Godt, D., Carroll, S. B. Genetic control and evolution of sexually dimorphic characters in Drosophila. Nature. 408, (6812), 553-559 (2000).
  13. Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134, (4), 610-623 (2008).
  14. Wittkopp, P. J., Williams, B. L., Selegue, J. E., Carroll, S. B. Drosophila pigmentation evolution: divergent genotypes underlying convergent phenotypes. Proc Natl Acad Sci Usa. 100, (4), 1808-1813 (2003).
  15. Brisson, J. A., De Toni, D. C., Duncan, I., Templeton, A. R. Abdominal pigmentation variation in drosophila polymorpha: geographic variation in the trait, and underlying phylogeography. Evolution. 59, (5), 1046-1059 (2005).
  16. Brisson, J. A., Templeton, A. R., Duncan, I. Population genetics of the developmental gene optomotor-blind (omb) in Drosophila polymorpha: evidence for a role in abdominal pigmentation variation. Genetics. 168, (4), 1999-2010 (2004).
  17. Dembeck, L. M. Genetic Architecture of Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 11, (5), e1005163 (2015).
  18. Drapeau, M. D., Radovic, A., Wittkopp, P. J., Long, A. D. A gene necessary for normal male courtship, yellow, acts downstream of fruitless in the Drosophila melanogaster larval brain. J Neurobiol. 55, (1), 53-72 (2003).
  19. Hodgetts, R. B., O'Keefe, S. L. Dopa decarboxylase: a model gene-enzyme system for studying development, behavior, and systematics. Annu Rev Entomol. 51, 259-284 (2006).
  20. Marmaras, V. J., Charalambidis, N. D., Zervas, C. G. Immune response in insects: the role of phenoloxidase in defense reactions in relation to melanization and sclerotization. Arch Insect Biochem Physiol. 31, (2), 119-133 (1996).
  21. Kalmus, H. The Resistance to Desiccation of Drosophila Mutants Affecting Body Colour. Proc Roy Soc London B. 130, (859), 185-201 (1941).
  22. Rajpurohit, S., Gibbs, A. G. Selection for abdominal tergite pigmentation and correlated responses in the trident: a case study in Drosophila melanogaster. Biol J Linn Soc. 106, (2), 287-294 (2012).
  23. Pool, J. E., Aquadro, C. F. The genetic basis of adaptive pigmentation variation in Drosophila melanogaster. Mol Ecol. 16, (14), 2844-2851 (2007).
  24. Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Developmental constraints on an adaptive plasticity: reaction norms of pigmentation in adult segments of Drosophila melanogaster. Evol Dev. 2, (5), 249-260 (2000).
  25. Shakhmantsir, I., Massad, N. L., Kennell, J. A. Regulation of cuticle pigmentation in drosophila by the nutrient sensing insulin and TOR signaling pathways. Dev Dyn. 243, (3), 393-401 (2014).
  26. Struhl, G., Barbash, D. A., Lawrence, P. A. Hedgehog organises the pattern and polarity of epidermal cells in the Drosophila abdomen. Development. 124, (11), 2143-2154 (1997).
  27. Jeong, S., Rokas, A., Carroll, S. B. Regulation of body pigmentation by the Abdominal-B Hox protein and its gain and loss in Drosophila evolution. Cell. 125, (7), 1387-1399 (2006).
  28. Wittkopp, P. J., True, J. R., Carroll, S. B. Reciprocal functions of the Drosophila yellow and ebony proteins in the development and evolution of pigment patterns. Development. 129, (8), 1849-1858 (2002).
  29. True, J. R. Drosophila tan encodes a novel hydrolase required in pigmentation and vision. PLoS Genet. 1, (5), e63 (2005).
  30. David, J. R., Capy, P., Gauthier, J. P. Abdominal pigmentation and growth temperature in Drosophila melanogaster: Similarities and differences in the norms of reaction of successive segments. J Evol Biol. 3, (5-6), (1990).
  31. Gibert, J. M., Peronnet, F., Schlotterer, C. Phenotypic plasticity in Drosophila pigmentation caused by temperature sensitivity of a chromatin regulator network . PLoS Genet. 3, (2), e30 (2007).
  32. Gibert, P., Moreteau, B., Scheiner, S. M. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila: correlated variations between segments. Genet Sel Evol. 30, (2), 181 (1998).
  33. Matute, D. R., Harris, A. The influence of abdominal pigmentation on desiccation and ultraviolet resistance in two species of Drosophila. Evolution. 67, (8), 2451-2460 (2013).
  34. Das, A., Mohanty, S., Parida, B. Abdominal pigmentation and growth temperature in Indian Drosophila melanogaster: Evidence for genotype-environment interaction. J Biosci. 19, (2), 267-275 (1994).
  35. Hollocher, H., Hatcher, J. L., Dyreson, E. G. Evolution of abdominal pigmentation differences across species in the Drosophila dunni subgroup. Evolution. 54, (6), 2046-2056 (2000).
  36. Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila melanogaster: genetic repeatability of quantitative parameters in two successive generations. Heredity. 92, (6), 499-507 (2004).
  37. Carbone, M. A., Llopart, A., deAngelis, M., Coyne, J. A., Mackay, T. F. Quantitative trait loci affecting the difference in pigmentation between Drosophila yakuba and D. santomea. Genetics. 171, 211-225 (2005).
  38. Kopp, A., Graze, R. M., Xu, S., Carroll, S. B., Nuzhdin, S. V. Quantitative trait loci responsible for variation in sexually dimorphic traits in Drosophila melanogaster. Genetics. 163, (2), 771-787 (2003).
  39. Bastide, H., Yassin, A., Johanning, E. J., Pool, J. E. Pigmentation in Drosophila melanogaster reaches its maximum in Ethiopia and correlates most strongly with ultra-violet radiation in sub-Saharan Africa. BMC Evol Biol. 14, 179 (2014).
  40. Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326, (5960), 1663-1667 (2009).
  41. John, A. V., Sramkoski, L. L., Walker, E. A., Cooley, A. M., Wittkopp, P. J. Sensitivity of Allelic Divergence to Genomic Position: Lessons from the Drosophila tan Gene. G3. 6, (9), 2955-2962 (2016).
  42. Wittkopp, P. J. Local adaptation for body color in Drosophila americana. Heredity. 106, (4), 592-602 (2011).
  43. Wittkopp, P. J. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326, (5952), 540-544 (2009).
  44. Edelstein, A. D. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1, (2), e10 (2014).
  45. U. S. National Institutes of Health. ImageJ v.1.50i. Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2016).
  46. Mims, F. M. How to Use LEDs to Detect Light. Make:. 36, 136-138 (2013).
  47. R: Language and Environment for Statistical Computing v.3.3.2. R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: https://www.r-project.org/ (2016).
  48. Bates, D., Machler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting Linear Mixed-Effects Models Using lme4. Journal of Statistical Software. 67, (1), 1-48 (2015).
  49. Shingleton, A. W., Estep, C. M., Driscoll, M. V., Dworkin, I. Many ways to be small: different environmental regulators of size generate distinct scaling relationships in Drosophila melanogaster. Proc Roy Soc Lond B Biol Sci. 276, (1667), 2625-2633 (2009).
  50. French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44, (11), 1081-1089 (1998).
  51. Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nat Rev Genet. 11, (12), 855-866 (2010).
  52. Kültz, D. New frontiers for organismal biology. BioSci. 63, (6), 464-471 (2013).
Количественное определение пигментации брюшной полости в<em&gt; Drosophila melanogaster</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saleh Ziabari, O., Shingleton, A. W. Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (124), e55732, doi:10.3791/55732 (2017).More

Saleh Ziabari, O., Shingleton, A. W. Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (124), e55732, doi:10.3791/55732 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter