Summary
Hier presenteren we een stereologische methode, de optische fractionator, gebruikt om de vorming van nieuwe neuronen te kwantificeren, en hun overleving, in de rathippocampus na elektroconvulsieve stimulatie. Bij correcte implementatie zorgt de gevoeligheid en efficiëntie van stereologische methoden voor een nauwkeurige schatting met een vaste en vooraf bepaalde precisie.
Abstract
Stereologische methoden zijn ontworpen om kwantitatieve parameters te beschrijven zonder aannames te maken over grootte, vorm, oriëntatie en verspreiding van cellen of structuren. Deze methoden zijn revolutionair voor kwantitatieve analyse van de zoogdierbrein waarin volumetrische celpopulaties te hoog zijn om handmatig te tellen. Stereologie is nu de techniek van keuze wanneer schattingen van driedimensionale hoeveelheden moeten worden geëxtraheerd uit metingen op tweedimensionale secties. Alle stereologische methoden zijn in principe onbevooroordeeld; Zij vertrouwen echter op goede kennis over de structuur van belang en de eigenschappen van het weefsel. Stereologie is gebaseerd op Systematische Uniform Random Sampling (SURS), met aanpassing van de steekproef naar het meest efficiënte niveau met betrekking tot precisie, waardoor betrouwbare, kwantitatieve informatie over de gehele structuur van belang wordt verstrekt. Hier presenteren wij de optische fractionator in combinatie met BrdU immunohistochemie tO schatten de productie en overleving van nieuw gevormde neuronen in de granulaircellaag (inclusief de subgranulêre zone) van de rathippocampus na elektroconvulsieve stimulatie, die een van de meest krachtige stimulanten van neurogenese is. De optische fractioneringstechniek is ontworpen om schattingen van het totale aantal cellen te geven uit dikke secties die uit de volledige structuur worden bemonsterd. Dikke secties bieden de mogelijkheid om cellen in hun volledige 3-D-mate te waarnemen en zorgen dus voor een eenvoudige en robuuste celclassificatie op basis van morfologische criteria. Wanneer het correct geïmplementeerd is, biedt de gevoeligheid en efficiëntie van de optische fractionator nauwkeurige schattingen met een vaste en vooraf bepaalde precisie.
Introduction
Kwantificering van cellen in een driedimensionale (3-D) structuur kan nodig hebben om schattingen op basis van onpartijdige principes te verkrijgen. Tegenwoordig gebruiken studies vaak tweedimensionale (2-D) methoden om gegevens van 3-D structuren te melden. Deze methoden beschouwen echter niet de heterogene aard van de structuur in termen van vorm en verspreiding van cellen, wat resulteert in methodische beperkingen; Ze maken aannames over de 3-D-structuur van belang en de resultaten verwijzen niet naar de volledige structuur. Deze beperkingen verminderen de gevoeligheid en nauwkeurigheid van de methoden en verhogen het risico op fouten 1 .
Bias in celtelling kan vermeden worden door toepassing van design-gebaseerde stereologie, die van algemeen belang is voor het verkrijgen van kwantitatieve informatie over het aantal cellen in een gegeven weefsel of structuur. Terwijl stereologie eerder een zeer tijdrovende methode is geweest, is de vooruitgang in procedures zachtWare en beeldvorming, heeft het veel efficiënter en veel toepasbaar geworden. Stereologie houdt in dat statistische bemonsteringsprincipes en stochastische geometrische theorie efficiënt zijn voor het schatten van volume, oppervlakte, lengte en aantal objecten in een 3-D structuur door middel van steekproeven in 2-D secties 2 . Zo laat stereologie toe om onbevooroordeelde kwantitatieve gegevens te verkrijgen over structurele veranderingen in weefselafdelingen, die gemiddelde schattingen van de echte getallen geven, zonder uitputtende analyse 1 . Stereologie wordt gedefinieerd als de statistische inferentie van geometrische parameters uit bemonsterde informatie. Dit kan bereikt worden door middel van onbevooroordeelde bemonstering, dat wil zeggen systematische willekeurige steekproeven, van secties en tellen regels die ervoor zorgen dat alle objecten gelijke waarschijnlijkheden hebben om te worden geteld 3 . Terwijl stereologische resultaten verschillende mate van nauwkeurigheid kunnen hebben, zoals aangegeven door de foutfactor (CE), kan dit ad zijnAangepast aan de inherente biologische variantie (variabele coëfficiënt) (CV)) door de hoeveelheid monsterneming aan te passen zoals vereist 4 , 5 . Enkele eerdere stereologische studies hebben de korte effecten van elektroconvulsieve stimulatie (ECS) op hippocampale plasticiteit bij knaagdieren 6,7 onderzocht. Gegevens uit deze studies tonen een initiële toename in het totale aantal neuronen, evenals verhoogde synaptische differentiatie na herhaalde ECS. Deze studies schatten echter geen directe neurogenese aan, aangezien zij geen specifieke markers voor cel proliferatie gebruiken.
Hier presenteren we een toepassing van een stereologische methode, de optische fractioneringstechniek 8 , 9 , voor het kwantificeren van het totaal aantal nieuw gevormde neuronen in de rat-hippocampale granulaatcellaag (GCL), inclusief de subgranulêre zone (SGZ) Als hun lange termijn sUrvival 10 , 11 . Wij hebben ratten onderworpen aan een klinisch relevant schema van ECS (driemaal per week gedurende 3 weken), die een van de meest krachtige stimulanten van neurogenese 12 is . Controle dieren werden behandeld onder toepassing van dezelfde procedure, maar zonder stroom door te geven. Op elk van de 21 dagen van de proefneming werden alle ratten intraperitoneaal geïnjecteerd met 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU) die in DNA in plaats van thymidine in celdeling 13 omvat . Na het experimenteren werden de ratten gehandhaafd voor vier verschillende perioden (24 uur, 3 maanden, 6 maanden en 12 maanden). Met behulp van het fractionatorprincipe kregen we een bekende fractie van de hippocampus door middel van uniforme willekeurige steekproeven van secties, en toegepaste optische disectors (3-D probes) aan de bemonsterde en immunostained dikke weefselsecties. Het is vooral opgemerkt dat bevroren delen meestal in de z-as tijdens het proces vallenEn dat optische disectors gebaseerd op de getalgewogen gemiddelde doorsnede dikte in dit specifieke geval 14 dienen te worden gebruikt. Aangezien het brandpuntsvlak van de optische disectors een bekende afstand door de sectie werd verplaatst, werden BrdU-positieve neuronen geteld toen hun kenmerk van belang duidelijk werd herkend. Op het gebied van stereologie is er een debat over het totale aantal deeltjes dat moet worden geteld 15 ; Typisch 150-200 neuronen worden geteld in de structuur van belang om voldoende precisie te verkrijgen, dwz een coëfficiënt van 7-8% 8 . De BrdU-positieve neuronale tellingen werden afgerond met behulp van stereologische software met beeldvorming door middel van een standaardmicroscoop uitgerust met camera en de volgende doelstellingen: 2X, 4X en 10X, evenals een 100x olie-onderdompeling (numerieke diafragma = 1,40) en een gemotoriseerde fase . Bewegingen in de z-richting werden gemeten met een digitale microcator. De laatste vergrotingWas 3000X.
Protocol
Alle dierprocedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Deense dierproefinspectie en goedgekeurd door de lokale ethische commissie voor experimentele dieren.
1. Weefselverwerking
OPMERKING: Na transcardiale perfusie en postfixatie in 4% paraformaldehyde (PFA), verdund in 0,2 M fosfaatbuffer 's nachts bij 4 ° C, worden de hersenen gedurende 3 dagen bij 4 ° C overgedragen naar 30% sucrose in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Daarna worden de hersenen bevroren op poedervormig droogijs en opgeslagen bij -80 ° C tot afsnijden.
- Scheid de rechter- en linkerhelftes langs de middelste lijn van de hersenen met behulp van een scalpel en kies dan een of ander halfrond willekeurig in de eerste hersening, daarna systematisch verschuiven tussen rechts en linker halfrond ( Figuur 1A ). Monteer het bemonsterde halfrond op een voorbeeldschijf met de lange as loodrecht op de schijfGebruik maken van een montage medium.
- Plaats genummerde multidish containers voor voorkoeling in de cryostat.
- Monteer de monsterplaat in de cryostat en snijd het geheel van de hippocampus (Bregma 1,80 tot - 7.04 16 ) in 80 μm dikke delen in het koronale vlak ( Figuur 1B ).
- Plaats alle gesampliceerde afdelingen achtereenvolgens in de gekoelde multidish-containers, om ervoor te zorgen dat de secties in de snijbestand worden gehouden.
- Dek de secties volledig af met cryoprotectant en hou de containers bij -20 ° C tot verder gebruik.
2. Immunostaining
OPMERKING: Om de afzonderlijke secties door de kleurprocedure te bewaren, plaats de gesampliceerde secties in 25-vlek-vlekkennetwerken. Gebruik elke 5de sectie, waarbij een gemiddeld eindpunt van 12 (8-16) secties per hippocampus wordt gegeven voor immunostaining en daaropvolgende celtelling.
- Voor elke subsampling elke nde sectie met een willekeurige start tussen sectie 1 en sectie n ( Figuur 1C ), de containers overbrengen van -20 ° C naar kamertemperatuur (RT).
- Gebruik bijvoorbeeld een penseel, om de secties in numerieke volgorde over te brengen naar de 25-vlekjes vlekkennetjes in petrischalen die met PBS zijn gevuld.
OPMERKING: Houd vanaf dit punt de secties in de vleknetjes die in de bijpassende glazen schotels geplaatst zijn op een orbitale shaker (sectie 2.3 tot 2.9). - Breng de vlekgarnetten over op de bijpassende glazen schotels en wrijf de afdelingen tweemaal gedurende 10 minuten in PBS bij RT voor incubatie in 3% waterstofperoxide (H2O2) gedurende 25 minuten in gedistilleerd water (dH20).
- Breng de secties over naar drie verschillende oplossingen van zoutzuur (HCl) (1 M bij 0 ° C gedurende 10 minuten, 2 M bij RT gedurende 10 minuten en 2 M bij 37 ° C gedurende 20 minuten) voordat neutralisatie in 0,1 M natriumtetraboraat eenT RT gedurende 20 minuten.
- Na 3 × 10 min incubaties in 1% Triton X-100 verdund in PBS (wasbuffer), overdragen de secties naar wasbuffer die 10% foetaal runder serum (blokkerende oplossing) gedurende 1 uur bij RT bevat.
- Incubeer de secties gedurende 48 uur bij 4 ° C in muis-anti-BrdU verdund 1: 100 in blokkerende oplossing.
- Was de afdelingen 3 × 10 min in wasbuffer en incubeer gedurende 48 uur in perderijdeperoxidase verdund 1:10 in wasbuffer.
- Vervolgens de secties aan PBS gedurende 5 x 10 minuten en vervolgens gedurende 7 minuten in 0,01% diaminobenzidine (DAB) verdund in PBS voordat ze over 10 minuten bij RT worden overgebracht naar een soortgelijke DAB oplossing die 0,02% H20 bevat.
- Vul een reeks wasjes (2 × 10 min in PBS en 2 × 10 min in fosfaatbuffer zonder toegevoegde natriumchloride) en plaats de secties in numerieke volgorde op microscoopschuiven.
- Droog de secties gedurende ongeveer 30 minuten voordat het met cresyl tegenstrijkenviolet.
- Plaats de microscoopschuiven in een glijbaan.
- Rehydrateer de secties gedurende 10 minuten in dia's met kleurschalen, die dH20 bevatten, en verplaats dan de glijbanen tot 0,02% cresylviolet in dH20 gedurende 15 minuten.
- Herhaal stap 2.12 voordat de secties drie keer in ethanol worden gedroogd (96% gedurende 5 minuten en 99% gedurende 2 × 2 minuten).
- Plaats de secties in xyleen gedurende 2 x 15 min en dek de glijbanen af met een snel droogmedium voor montage.
- Eindelijk laat de omslagen glijbanen ongeveer 24 uur achter, voordat ze kunnen worden gebruikt voor microscopie.
3. Schatting van het totale aantal BrdU-gemerkte neuronen met behulp van de optische fractionator
OPMERKING: Doe een proefstudie met een paar dieren om de optimale bemonsteringsparameters te bepalen, zoals het aantal te analyseren secties en het aantal optische disectors binnen de gesampliceerde secties. Deze piloot biedt ook eenVoorlopige CV (standaardafwijking / gemiddelde) en de mogelijkheid om de CE aan te passen (zie sectie 3.9.3) om een bevredigende nauwkeurigheid van de door de onderzoeker vastgestelde ramingen te verkrijgen (voor meer details zie hieronder). Voer ook een z-distributieanalyse uit om de volgende punten aan te pakken: krimp van het weefsel, kwaliteit van het vlekken door het hele gedeelte en verdeling van de cellen in de z-as 14 .
- Controleer de dikte van het weefsel in de secties om te bevestigen dat ze geschikt zijn voor het gebruik van de optische fractie, bijv. Is dik genoeg voor de gekozen disectorhoogte inclusief beschermzones (zie hieronder). OPMERKING: De weefdikte is op verschillende plaatsen in de omgeving van belang.
- Plaats de glijbanen op het gemotoriseerde stadium van de microscoop en zet de gewenste stereologische software aan.
- Bepaal het gebied van belang met behulp van een lage vergrotingsdoelstelling (2X of 4X) voordat u overbrengt naar een 100X olie-immVervangingsdoelstelling (zie figuur 2A ).
- Met behulp van een specifiek punt van een telram ( bijv. Bij of naast een hoek), zoek de bovenkant van de sectie door te bewegen langs het brandpuntsvlak totdat een gedeelte van de sectie in focus verschijnt. Registreer deze z-positie als 0 (zie figuur 2B ).
- Verplaats het brandpuntsvlak naar beneden door het weefsel tot hetzelfde specifieke punt van het telram is op het laatste z-niveau van weefsel in focus en markeer deze positie. De lokale weefseldikte wordt gedefinieerd van 0 tot dit eindpunt en kan op de z-as gelezen worden. Registreer de weefseldikte (zie figuur 2B ).
- Document de volledige penetratie van de vlek en de verspreiding van de cellen in de volledige dikte van de sectie.
OPMERKING: De verdeling van BrdU-gemerkte neuronen wordt gebruikt als handleiding voor het bepalen van de vereiste beveiligingszones. Hoewel een uniforme verdeling van cellen kritisch is, is hetIs aanvaardbaar om minder cellen in de buurt van de boven- en onderkant van de sectie te observeren, wat het effect van verloren caps aangeeft (zie verder Dorph-Petersen et al., 2009).- Sample BrdU-gemerkte neuronen en registreer hun z-positie samen met de lokale sectie dikte gemeten in de geselecteerde hoek van elk telram.
- Bepaal het aantal BrdU-positieve neuronen als functie van hun z-positie.
- Bevestig de hoogte van de disector- en beschermingszones op basis van de gemiddelde sectiedikte en de verdeling van de cellen (zie 3.1 en 3.2).
OPMERKING: De hoogte van de disector moet minder zijn dan de sectie dikte om artefacten dichtbij de oppervlakken te vermijden. Dit risico wordt omzeild door bewakingszones in de boven- en onderkant van de sectie op te nemen. - Bepaal de staplengte tussen de disectors.
- Bepaal de regio van interesse op alle te analyseren secties en registreer de gebieden.
- Som deze gebieden op en verdeel dan bY het aantal disectors dat in dit gebied wordt geplaatst.
OPMERKING: Op basis van eerdere ervaring behelst een goed uitgangspunt 75 probes. Dit geeft een benadering van het gebied en de bijbehorende steekproefposities (een stap ) (voor verdere details zie West, 2012). - Neem de vierkantswortel van een stap , die de xy-stapsgrootte geeft.
- Bepaal de grootte van het tellenframe.
- Stel de grootte van het tellerframe in een willekeurige eenheid en voer een proefproefneming uit van BrdU-positieve neuronen met behulp van de parameters die zijn verkregen in sectie 3.3 en 3.4.
OPMERKING: De grootte moet empirisch worden bepaald door proef en fout, maar het wordt aangeraden om het aan te passen om monsters van 2-3 cellen per disector 8 in staat te stellen.
- Stel de grootte van het tellerframe in een willekeurige eenheid en voer een proefproefneming uit van BrdU-positieve neuronen met behulp van de parameters die zijn verkregen in sectie 3.3 en 3.4.
- Volg deze laatste stap van het proefonderzoek met het starten van de cel.
OPMERKING: De verkregen bemonsteringsparameters zouden resulteren in tellingen van ongeveer 150-200 cellen iN elk dier dat voldoende is om een efficiënt stereologisch ontwerp te verkrijgen 8 . - Tel de BrdU-positieve neuronen met behulp van een 100 × olie-onderdompeling doel en een uiteindelijke vergroting van 2000-3000 ×. Identificeer in elke optische disector alle BrdU-gemerkte neuronen die duidelijk herkenbaar zijn door het kenmerk van belang (in het onderhavige onderzoek is het criterium wanneer de voornaamste rand van de BrdU-gemarkeerde neuron voor het eerst in focus komt) Binnen het tellen frame of raak de inclusielijnen ( Figuur 2B ). Tel niet de BrdU-positieve neuronen die, wanneer duidelijk herkend worden door het kenmerk van belang in de hoogte van de disector, de uitsluiterlijnen aanraken. Het is van groot belang om deze telregels nauwkeurig te volgen tijdens de gehele stereologische kwantificering.
OPMERKING: Omdat BrdU in alle verdelende cellen bestaat, wordt morfologie gebruikt om onderscheid te maken tussen neuronen en andere typen cellen. NeuRon eigenschappen zijn een duidelijk gedefinieerde kern met een neutrale cytoplasma en een donkere nucleolus. BrdU-positieve cellen worden herkend als nieuw gevormde neuronen op basis van hun relatief grotere grootte in vergelijking met glialcellen. Er dient te worden vermeld dat in studies van kortlopende proliferatie (bijv. <24 uur) dubbele kleuring met onvolwassen neuronale markers een voorwaarde zijn 17 . - Schat het totale aantal BrdU-positieve neuronen in elke hersenen door het totale aantal getelde cellen te vermenigvuldigen (Σ Q - ) met de reciproke bemonsteringsfracties:
voor
waar
Q- is de getalgewogen gemiddelde sectie dikte, h is de hoogte van de disector, als is de gebiedsteekproeffractie, ssf is de sectie sAmple fractie en t i is de sectie dikte in het Ie tellen frame met een celtelling van 
In de disector 14 , 18 . - Bereken de foutfactor (CE) 8, die de steekproefvariantie van BrdU-positieve neuronen is in systematisch uniform random sample (SURS).
- Bereken eerst het geluid , dat is gelijk aan het totaal aantal BrdU-positieve neuronen die geteld worden:
- Bereken vervolgens de variantie in SURS:
OPMERKING: We hebben het gebied en de celcijfers in de hippocampus beoordeeld om van sectie naar sectie vlot te veranderen en gebruikt daarom "gladheidsklasse" m = 1 (1/240) 8 , 19
waar
P i is het aantal punten dat geteld wordt voor het object in de ide sectie en n is het aantal secties 4 , 20 . - Eindelijk, bereken de CE van de schatting:
OPMERKING: In het algemeen wordt optimaal precisie bereikt wanneer de CE-waarde minder is dan de helft van het waargenomen CV, aangezien OCV 2 = ICV 2 + CE 2 , waar OCV het waargenomen CV is en ICV de inherente CV 4 is .
- Bereken eerst het geluid , dat is gelijk aan het totaal aantal BrdU-positieve neuronen die geteld worden:
Q- is de getalgewogen gemiddelde sectie dikte, h is de hoogte van de disector, als is de gebiedsteekproeffractie, ssf is de sectie sAmple fractie en t i is de sectie dikte in het Ie tellen frame met een celtelling van 
In de disector 14 , 18 . 
FIguur 1: Schematische illustratie die weefselverwerking laat zien volgens de fractieprincipes die in de huidige studie zijn gebruikt.
Na het experimenteren worden de hemisfeer gescheiden en rechts of linker halfrond gekozen systematisch en willekeurig (A). De volledige brein die zich uitstrekt over het gehele hippocampus wordt gesneden in 80 μm dikke koronale delen (B), waarna elke 5e sectie wordt gesampliceerd, willekeurig tussen de 1 tot en met 5 begint, voor de definitieve immunostaining en stereologische kwantificering (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Illustratie die de stereologische bemonsteringsprocedure toont met behulp van optische disectors.
(A) Na histologische verwerking de hIppocampal GCL / SGZ was afgebakend en optische disectors werden uniform en willekeurig toegepast in de regio. (B) In de optische disectors (links) werden de BrdU-positieve neuronen alleen geteld als hun kenmerkende interesse duidelijk herkend werd binnen de disectorhoogte en zich in het telframe bevonden of de inclusielijn (rechts) raakte. Neuronen die de uitsluiting lijn raken werden niet geteld. Schaalstaven = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Representative Results
Steekproefparameters
Door de z-distributie te analyseren in een proefstudie ( Figuur 3 ), vonden we een uniforme verdeling van BrdU-positieve neuronen op de disectorhoogte. Krimp van de secties werd gemeten; De uiteindelijke gemiddelde dikte was 26,4 μm (19,0-32,0 μm) in secties die oorspronkelijk bij 80 μm werden gesneden. Op basis van de weefseldikte en verdeling van BrdU-genoteerde neuronen was de disectorhoogte ingesteld op 10 μm, en de bewakingszones aan de boven- en onderkant van de sectie werden ingesteld op respectievelijk 5 μm en 4-17 μm. Afhankelijk van de dichtheid van de cellen was het gebied van de telramen 1414 of 5210 μm 2 . De staplengte was 220 μm in zowel de x- als y-richtingen en de celtelling werd uitgevoerd in een gemiddelde van 12 (reeks 8-16) secties per dier. Deze bemonsteringsparameters resulteerden in een gemiddelde van 133 (bereik 33-372) BrdUPositieve cellen geteld in 173 (107-204) disectoren in elk hersenhelft.
Als voorbeeld kregen we de volgende CV- en CE-waarden voor BrdU-positieve neuronale schattingen in ECS-behandelde ratten: 24 uur: CV = 0,59, CE = 0,11; 3 maanden: CV = 0,34, CE = 0,12; 6 maanden: CV = 0,43, CE = 0,09; 12 maanden: CV = 0,22, CE = 0,09.
We kwantificeren het totale aantal nieuw gevormde neuronen en hun langetermijnoverleving in de rathippocampus na ECS met gebruikmaking van de optische fractie in combinatie met een BrdU-kleuringstechniek 10 , 11 . De eindresultaten lieten een basale neurogenese zien in de vier groepen controle dieren, die niet significant verschilden als een functie van de overlevingstijd ( Figuur 3 ). Voorts induceerde ECS een significante toename van het totale aantal BrdU-positieve neuronen bij 24Uren (259%, p <0,0001), 3 (229%, p <0,001), 6 (152%, p <0,05) en 12 maanden (162%, p <0,05) volgende experimenten, in vergelijking met controles van dieren.
Figuur 3: Kwantitatieve gegevens van het totale aantal BrdU-positieve neuronen in de GCL / SGZ van de rathippocampus 10 , 11 .
Horizontale staafjes vertegenwoordigen de gemiddelde waarden. Afkortingen: GCL, granule cel laag; SGZ, sub-granulaire zone; H, uren; M, maanden. **** p <0,0001, *** p <0,001 en * p <0,05 versus controle (n = 11-12 per groep). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Met behulp van ECS als een methode om neurogenese te veroorzaken, vinden we een onmiddellijke toename van 260% bij de vorming van nieuwe BrdU-positieve neuronen in de hippocampus. In dit pool van acuut gegenereerde neuronen vonden we 40% afvoer van dag 1 tot 3 maanden, waarbij bijna 50% van de nieuw gevormde neuronen over 12 maanden na de behandeling 10 , 11 overleefden. Het tellen van BrdU-gemerkte neuronen volgde een strikte bemonsteringsschema, waarbij de gehele hippocampus werd gesneden in 80 μm dikke secties gevolgd door subsampling van elke 5de sectie met een willekeurig bemonsteringsstart tussen sectie een en sectie vijf. Het verschaffen van deze secties wordt op systematische willekeurige wijze gekozen, dit is aantoonbaar een uitstekende methode om de variantie van het eindresultaat te verminderen, zonder uitputtend tellen 1 . Met dit bemonsteringsschema kunnen we BrdU-positieve neuronen tellen in gemiddeld 12 (8-16) hippocampenAl secties in elke ratbrein, met een laatste precisie van 9-11%.
Bij het gebruik van de fractioneringsmethode is het essentieel om de fractie van de sectiehoogte te kennen waarin tellen worden uitgevoerd, aangezien weefselkrimp en vervorming vaak voorkomt tijdens histologische verwerking 14 . Inderdaad zagen we in deze studie een aanzienlijke daling van de dikte. Verder dient te worden opgemerkt dat verschil- lende weefselkrimp kan optreden, zoals gepresenteerd in Dorph-Petersen et al. 2001. Zolang de volledige structuur van belang voor analyse beschikbaar is, resulteren deze beperkingen niet in een vooroordeel van het totale aantal deeltjes, dwz BrdU-positieve neuronen. In studies waarbij weefselkrimping een bepaald probleem is, moet er altijd worden gezegd dat de resultaten verkregen worden in vervormd weefsel. In deze studie tellen we in een disectorhoogte van 10 μm. De secties van de huidige studie hadden een uiteindelijke gemiddelde dikte van 26 μm, een 5 μmBeschermzone aan de bovenkant en een 11 μm (gemiddelde) bewakingszone onderaan het gedeelte. Deze parameters zijn aanvaardbaar, aangezien de bewakingszones ongeveer de diameter van de bemonsterde deeltjes moeten zijn.
Na afbakening van de GCL / SGZ werden disectors uniform willekeurig in het afgebakende gebied geplaatst. De disectors moeten gepositioneerd worden met een vaste staplengte die de bemonstering en het tellen optimaliseert om efficiënt schattingen te verkrijgen met een nauwkeurigheid die door de onderzoeker is vastgesteld. Optimale precisie wordt typisch bereikt door tot 150-200 cellen in elke structuur van belang 5 te tellen. In de huidige studie telden we een gemiddelde van 133 (bereik 33-372) BrdU-positieve neuronen in elke rathippocampus. Door een lage cijfers in sommige controledieren viel onze tellingen van BrdU-positieve neuronen onder het algemeen aanvaardbare aantal cellen dat nodig was om een geschikte precisie te verkrijgen, wat resulteerde in relatief hoge CE-waarden voor die gevallen. HOwever, aangezien we CE-waarden van minder dan de helft van de CV-waarden behaald hebben (zie representatieve resultaat sectie) was aanvullende bemonstering en tellen niet nodig. De hoge cv-waarden laten zien dat de grootste bijdrage aan de waargenomen variatie afkomstig is van de biologische variatie. In feite kunnen we stellen dat het gemiddelde aantal BrdU-positieve neuronen die in de huidige studie werd geteld, hoger was dan nodig was. Bijvoorbeeld, in een groep ratten behaalden we een CE-waarde van 9% en viel een cv-waarde van 43% op. In dit specifieke geval zouden we kunnen richten op een precisie van ongeveer 20%. Samengevat is de precisie van het totale aantal BrdU-positieve neuronen in de huidige studie voldoende omdat het echte behandelingseffecten op het echte aantal deeltjes vastlegt. Vanwege de vrij grote biologische variatie in bepaalde groepen dieren kunnen dezelfde schattingen zijn verkregen met een aanvaardbare precisie, ondanks minder inspanningen. Hoge biologische afwijkingen binnen groepen kunnen alleenGecompenseerd door het aantal dieren te verhogen.
Men zou kunnen stellen dat de gouden standaard voor het verkrijgen van exacte cijfers een uitputtende telling van alle voorwerpen van belang inhoudt. In de meeste studies van de hersenen is dit echter niet mogelijk door het grote aantal cellen. Hoewel veel efficiënter dan uitputtende celtelling is, is de optionele fractionator relatief tijdrovend in vergelijking met simpel screening van verschillen in cijfers die de voorkeur hebben als het nauwkeurige aantal cellen niet essentieel is. Het is onze ervaring dat verschillen van meer dan 20-30% alleen door middel van screeningsprocedures kunnen worden gedetecteerd.
Als correct uitgevoerd, biedt bemonsteren met behulp van design-gebaseerde stereologie onbevooroordeelde en nauwkeurige schattingen op een efficiënte manier 1 . De onbevooroordeelde eigenschap van stereologie produceert schattingen die, wanneer gerepliceerd, het ware populatiegemiddelde benaderen en de reproduceerbaarheid van deSchatting 21 . In eerste instantie moet een representatieve steekproef van de gehele structuur van belang (in deze studie de hippocampale GCL / SGZ) worden verkregen, zodat schatting mogelijk is in een statistisch geldige subset van secties 4 . Om een passend aantal secties te verkrijgen en probes te tellen, passen we SURS toe, die de variantie verlaagt in vergelijking met willekeurige steekproefneming 8 . Bovendien zorgt SURS ervoor dat de deeltjes van belang in de structuur met dezelfde waarschijnlijkheden worden bemonsterd, onafhankelijk van hun grootte, vorm, oriëntatie en verdeling in de structuur. Als zodanig is stereologie sterk aanbevolen bij het verkrijgen van nauwkeurige en onpartijdige schattingen is een centraal onderdeel van het project.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken Susanne Sørensen voor de technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door subsidies van The Velux Foundation; De Jascha Foundation; Aase en Ejnar Danielsens Stichting; Hartmann Brothers Foundation; Directeur Jacob Madsen en vrouw Olga Madsens Foundation; Dokter Sofus Carl Emil Friis en vrouw Doris Friis 'Trust; De stichting van 1870; Torben en Alice Frimodts Foundation en de Stichting voor Neurologisch Onderzoek. Manuscript editing werd uitgevoerd door Inglewood Biomedical Editing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 5'-bromo-2'deoxyuridine - BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
| Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
| Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
| dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
| Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
| Ethanol - 70 % | Plum A/S | 201098 | |
| Ethanol - 96 % | Plum A/S | 201104 | |
| Ethanol - 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
| Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
| H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
| HCl | J. T. Baker | 6081 | |
| Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
| Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
| PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
| PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
| Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
| Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
| Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
| Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
| Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
| Xylene | VWR | 28,973,363 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cover slips | Menzel-Gläser | 24x50 mm #0 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
| Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Microscope camera | Olympus | DP72 | |
| Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
| Motorized stage | Prior | H101A | |
| Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
| New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
| Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
| Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
| Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
| Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
| Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
| Slide rack | Sakura | 4465 | |
| Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
| Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
| Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |
References
- Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. Design-based stereology: Introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number. Toxicol. Pathol. 38 (7), 1011-1025 (2010).
- West, M. J. Introduction to stereology. 2012 (8), Cold Spring Harb. Protoc. 843-851 (2012).
- West, M. J. Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: issues of precision and bias. Trends Neurosci. 22 (2), 51-61 (1999).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J. Microsc. 147 (Pt 3), 229-263 (1987).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat. Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kaae, S. S., Chen, F., Wegener, G., Madsen, T. M., Nyengaard, J. R. Quantitative hippocampal structural changes following electroconvulsive seizure treatment in a rat model of depression. Synapse. 66 (8), 667-676 (2012).
- Chen, F., Madsen, T. M., Wegener, G., Nyengaard, J. R. Repeated electroconvulsive seizures increase the total number of synapses in adult male rat hippocampus. Eur Neuropsychopharmacol. 19 (5), 329-338 (2009).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. V., Kiëu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology - reconsidered. J.Microsc. 193 (3), 199-211 (1999).
- West, M. J. Design based stereological methods for estimating the total number of objects in histological material. Folia Morphol.(Warsz). 60 (1), 11-19 (2001).
- Olesen, M. V., Wörtwein, G., Pakkenberg, B. Electroconvulsive stimulation, but not chronic restraint stress, causes structural alterations in adult rat hippocampus - a stereological study. Hippocampus. 25 (1), 72-80 (2015).
- Olesen, M. V., Wortwein, G., Folke, J., Pakkenberg, B. Electroconvulsive stimulation results in long-term survival of newly generated hippocampal neurons in rats. Hippocampus. 27 (1), 52-60 (2017).
- Madsen, T. M., et al. Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy. Biol Psychiat. 47 (12), 1043-1049 (2000).
- Cameron, H. A., Mckay, R. D. G. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J.Comp. Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
- Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size. J.Microsc. 204 (3), 232-246 (2001).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Recommendations for straightforward and rigorous methods of counting neurons based on a computer simulation approach. J Chem. Neuroanat. 20 (1), 93-114 (2000).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 2nd edn, Academic Press. Sydney. (1986).
- Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice. Development. 130 (2), 391-399 (2003).
- Fabricius, K., Wortwein, G., Pakkenberg, B. The impact of maternal separation on adult mouse behaviour and on the total neuron number in the mouse hippocampus. Brain Struct. Funct. 212 (5), 403-416 (2008).
- Dorph-Petersen, K. A., et al. Volume and neuron number of the lateral geniculate nucleus in schizophrenia and mood disorders. Acta neuropathologica. 117 (4), 369-384 (2009).
- Eriksen, N., et al. Application of stereological estimates in patients with severe head injuries using CT and MR scanning images. Br. J. Radiol. 83 (988), 307-317 (2010).
- Gundersen, H. J. Stereology: the fast lane between neuroanatomy and brain function--or still only a tightrope? Acta Neurol. Scand. Suppl. 137, 8-13 (1992).
