Summary
כאן, אנו מציגים שיטה סטריאולוגית, fractionator אופטי, המשמש לכימות היווצרות של נוירונים חדשים, ואת ההישרדות שלהם, בהיפוקמפוס חולדה בעקבות גירוי electroconvulsive. כאשר מיושמים כראוי, את הרגישות והיעילות של שיטות stereological מבטיח הערכות מדויקות עם קבוע מראש קבוע מראש.
Abstract
שיטות סטריאולוגיות נועדו לתאר פרמטרים כמותיים מבלי לבצע הנחות לגבי גודל, צורה, כיוון והפצה של תאים או מבנים. שיטות אלה היו מהפכניות עבור ניתוח כמותי של המוח היונקים, שבו אוכלוסיות תאים volumetric גבוהים מדי כדי לספור באופן ידני, ו stereology עכשיו את הטכניקה של בחירה בכל פעם הערכות של כמויות תלת מימדיות צריך להיות מופק מדידות על דו מימדי סעיפים. כל השיטות הסטריאולוגיות אינן משוחדות כלל; עם זאת, הם מסתמכים על הידע הנכון על מבנה העניין ואת המאפיינים של הרקמה. הסטריאולוגיה מבוססת על דגימה אקראית אחידה שיטתית (SURS), תוך התאמה של הדגימה לרמה היעילה ביותר ביחס לדיוק, תוך מתן מידע אמין וכמותי על כל מבנה העניין. כאן אנו מציגים את fractionator אופטי בשיתוף עם אימונוהיסטוכימיה BrdU לאO להעריך את הייצור ואת ההישרדות של נוירונים שזה עתה נוצרו בשכבת התא גרגר (כולל אזור משנה גרגרי) של היפוקמפוס חולדה בעקבות גירוי אלקטרו, אשר הוא בין הממריצים החזקים ביותר של neurogenesis. הטכניקה Fractator אופטי נועד לספק הערכות של המספר הכולל של תאים מקטעים עבים שנדגמו מן המבנה המלא. חלקים עבים מספקים את ההזדמנות כדי לצפות בתאים שלהם מלא 3-D היקף ובכך, לאפשר סיווג תא קל וחזק מבוסס על קריטריונים מורפולוגיים. כאשר מיושם כראוי, את הרגישות והיעילות של Fractator אופטי מספק הערכות מדויקות עם דיוק קבוע מראש.
Introduction
כימות תאים במבנה תלת מימדי (3-D) עשוי לדרוש קבלת אומדנים המבוססים על עקרונות בלתי מוטים. גם כיום, מחקרים לעיתים קרובות להשתמש דו מימדי (2-D) שיטות לדווח על נתונים של מבנים 3-D. עם זאת, שיטות אלה לא רואים את האופי הטרוגני של המבנה במונחים של צורה והפצה של תאים וכתוצאה מכך מגבלות שיטתי; הם עושים הנחות על מבנה 3-D של עניין והתוצאות לא מתייחסים המבנה המלא. מגבלות אלה מקטינות את הרגישות והדיוק של השיטות וכן מגבירות את הסיכון לטעויות 1 .
הטיה בספירת תאים ניתן להימנע על ידי יישום של עיצוב מבוסס stereology, אשר הוא בעל חשיבות כללית לקבלת מידע כמותי על מספר התאים ברקמות או מבנה נתון. בעוד stereology בעבר היה מאוד זמן רב, ההתקדמות נהלים, רךו הדמיה, הפך אותו להיות הרבה יותר יעיל ויישומי נרחב. הסטריאולוגיה כרוכה בעקרונות הדגימה הסטטיסטיים ובתאוריה הגיאומטרית הסטוכסטית על מנת לספק כלים יעילים להערכת נפח, שטח פני השטח, אורך ומספר אובייקטים במבנה תלת-ממדי על ידי דגימה בסעיפים 2-D. לפיכך, stereology מאפשר אחד כדי לקבל נתונים כמותיים משוחדת על שינויים מבניים בסעיפים רקמות, אשר נותנים הערכות הממוצע של המספרים האמיתיים, ללא ניתוח ממצה 1 . הסטריאולוגיה מוגדרת כהפרש סטטיסטי של פרמטרים גיאומטריים ממידע שנדגם. זה יכול להיות מושגת על ידי הדגימה משוחדת, כלומר דגימה אקראית שיטתית, של סעיפים, כמו גם ספירת כללים להבטיח כי לכל האובייקטים יש הסתברויות שוות להיות נספר 3 . בעוד תוצאות סטריאולוגיות יכולות להיות דרגות שונות של דיוק כפי שצוין על ידי מקדם השגיאה (CE), זה יכול להיות המודעהרק כדי להתאים את השונות הביולוגית הטבועה (מקדם השונות (CV)) על ידי התאמת כמות הדגימה כנדרש 4 , 5 . כמה מחקרים קודמים בסטריאולוגיה בחנו את ההשפעות קצרות הטווח של גירוי אלקטרו-פולסיבי (ECS) על הפלסטיות בהיפוקמפוס במכרסמים 6,7 . נתונים ממחקרים אלה מראים עלייה ראשונית במספר הכולל של נוירונים, כמו גם בידול סינפטי מוגבר בעקבות ECS חוזרת. עם זאת, מחקרים אלה לא מעריכים neurogenesis ישירות, שכן הם אינם משתמשים סמנים ספציפיים עבור התפשטות תאים.
כאן אנו מציגים יישום של שיטה סטריאולוגית, הטכניקה Fractator אופטי 8 , 9 , לכימות המספר הכולל של נוירונים שנוצרו לאחרונה בשכבת התא גזענית בהיפוקמפוס תא (GCL), כולל אזור משנה גרגרי (SGZ), כמו גם כמו שלהם לטווח ארוך sאורוויה 10 , 11 . ערכנו חולדות על לוח זמנים קליני רלוונטי של ECS (שלוש פעמים בשבוע במשך 3 שבועות), שהוא אחד הגירויים החזקים ביותר של neurogenesis 12 . בעלי חיים בקרה טופלו באמצעות אותו הליך, אך ללא עובר הנוכחי. בכל אחד מ -21 ימי הניסויים, כל החולדות הוזרקו intraperitoneally עם 5-bromo-2 '-deoxyuridine (BrdU) המשלבת לתוך DNA במקום תימידין במהלך חלוקת התא 13 . לאחר הניסוי נשמרו החולדות במשך ארבע תקופות זמן שונות (24 שעות, 3 חודשים, 6 חודשים ו -12 חודשים). באמצעות עקרון fractionator, השגנו חלק ידוע של ההיפוקמפוס באמצעות דגימה אקראית אחידה של סעיפים, והשתמש דיקטורים אופטיים (בדיקות 3-D) על דגימות רקמות עבה samosted ו immunostained. זה ציין במיוחד כי חלקים קפואים בדרך כלל להתמוטט ציר z במהלך התהליךIng, וכי דיקטורים אופטיים המבוססים על מספר משוקלל מתכוון מספר עובי יש להשתמש במקרה זה 14 . כאשר מטוס המוקד של הדיסקטורים האופטיים הועבר מרחק ידוע דרך החלק, נוירונים חיוביים BrdU נספרו כאשר התכונה שלהם עניין היה מוכר בבירור. בתחום הסטריאולוגיה יש ויכוח על המספר הכולל של חלקיקים שיש לספור 15 ; בדרך כלל 150-200 נוירונים נספרים במבנה של עניין כדי להשיג דיוק נאותה כלומר מקדם של 7-8% 8 . הספירות הנוירונאליות החיוביות של BrdU הושלמו באמצעות תוכנה סטריאולוגית עם הדמיה במיקרוסקופ סטנדרטי המצויד במצלמה ובמטרות הבאות: 2X, 4X ו- 10X וכן אובייקט טבילה של שמן 100X (צמצם מספרי = 1.40) ושלב ממונע . תנועות בכיוון z נמדדו בעזרת מיקרו-מקליט דיגיטלי. ההגדלה הסופיתהיה 3000X.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות של הפיקוח על ניסויים בבעלי חיים בדנמרק ואושרו על ידי הוועדה האתית המקומית לבעלי חיים ניסיוניים.
1. עיבוד רקמות
הערה: בעקבות זלוף transcardial וקיבוע הודעה ב paraformaldehyde 4% (PFA) מדולל במאגר 0.2 M פוספט לילה ב 4 מעלות צלזיוס, המוח מועברים סוכרוז 30% ב פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) במשך שלושה ימים על 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, המוח הם קפואים על אבקת קרח יבש מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד חתך.
- להפריד את ההמיספרה ימין ושמאל לאורך קו האמצע של המוח באמצעות אזמל ואז לבחור אחד או את חצי הכדור השני באופן אקראי במוח הראשון, לאחר מכן משמרת באופן שיטתי בין חצי ימין ושמאל ( איור 1 א ). הר את חצי הכדור שנדגמו על גבי דיסק טיפוסי עם הציר הארוך בניצב לדיסקבאמצעות המדיום הרכבה.
- מקום מכולות מרובות מראש עבור קירור מראש ב cryostat.
- הר דיסק את הדגימה לתוך cryostat וחתך את כולו של ההיפוקמפוס (Bregma 1.80 ל - 7.04 16 ) לתוך 80 חלקים מיקרומטר עבה במישור העטרה ( איור 1 ב ).
- מניחים את כל החלקים שנדגמו ברצף במיכלים המרופדים, כדי לוודא שהקטעים נשמרים בסדר חיתוך.
- מכסים את החלקים לחלוטין עם cryoprotectant והחזק את המכלים ב -20 ° C עד לשימוש נוסף.
2. Immunostaining
הערה: כדי לעקוב אחר סעיפים בודדים לאורך הליך מכתים, במקום את המדורים שנדגמו 25-היטב מכתים רשתות. השתמש בכל החלק ה -5, נותן מספר סופי ממוצע של 12 (8-16) סעיפים לכל היפוקמפוס עבור immunostaining וספירת תא שלאחר מכן.
- לפני subampling כל פרק נ 'עם התחלה אקראית בין סעיף 1 ו סעיף n ( איור 1C ) להעביר את המכלים מ -20 מעלות צלזיוס לטמפרטורת החדר (RT).
- השתמש למשל מכחול, להעביר את הסעיפים בסדר מספרי כדי 25 רשתות היטב מכתים להציב צלחות פטרי מלא PBS.
הערה: מנקודה זו, לשמור את הסעיפים ברשתות מכתים אשר ממוקמים כלי זכוכית תואמים ממוקם על שייקר מסלולית (סעיף 2.3 ל 2.9). - העברת רשתות מכתים את הכלים זכוכית תואמת לשטוף את הסעיפים פעמיים במשך 10 דקות PBS ב RT לפני דגירה של מי חמצן 3% (H 2 O 2 ) מדולל במים מזוקקים (dH 2 O) במשך 20 דקות.
- מעבירים את החלקים לשלושה פתרונות שונים של חומצה הידרוכלורית (HCl) (1 M ב 0 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 2 M ב RT במשך 10 דקות, ו 2 M ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות) לפני ניטרול 0.1 M tetraborate נתרן אT RT במשך 20 דקות.
- לאחר הדגירות 3 × 10 דקות ב 1% Triton X-100 בדילול של PBS (חיץ כביסה), להעביר את הסעיפים למאגר כביסה המכיל 10% בסרום שור עוברית (פתרון חסימה) עבור 1 שעה ב RT.
- לדגור את הקטעים במשך 48 שעות ב 4 מעלות צלזיוס העכבר נגד BrdU מדולל 1: 100 ב חסימה פתרון.
- לשטוף את הסעיפים 3 × 10 דקות חיץ כביסה, ו דגירה על 48 שעות ב צנון סוס peroxidase בדילול 1:10 ב חיץ כביסה.
- מעבירים את הקטעים PBS עבור 5 × 10 דקות, ולאחר מכן במשך 7 דקות ב 0.01% diaminobenzidine (DAB) מדולל PBS לפני שהם מועברים לפתרון DAB דומה המכיל 0.02% H 2 O 2 במשך 10 דקות ב RT.
- השלם סדרה של שוטף (2 × 10 דקות PBS ו 2 × 10 דקות במאגר פוספט ללא תוספת נתרן כלורי) ואת הר סעיפים בסדר מספרי על שקופיות מיקרוסקופ.
- יבש את הסעיפים במשך כ 30 דקות לפני counterstaining עם cresylסָגוֹל.
- מניחים את השקופיות מיקרוסקופ במעמד שקופיות.
- Rehydrate את הקטעים במשך 10 דקות מכתים מכתים המכילים dH 2 O, ולאחר מכן להעביר את השקופיות כדי 0.02% סגול cresyl ב dH 2 O במשך 15 דקות.
- חזור על שלב 2.12 לפני הסעיפים מיובשים שלוש פעמים באתנול (96% במשך 5 דקות ו 99% עבור 2 דקות 2 דקות).
- מניחים את הסעיפים ב xylene עבור 2 × 15 דקות לכסות להחליק את השקופיות באמצעות בינוני ייבוש מהיר הרכבה.
- לבסוף, להשאיר את הכיסוי החליק שקופיות עבור כ 24 שעות לפני שהם יכולים לשמש עבור מיקרוסקופ.
3. אומדן של המספר הכולל של נוירונים BrdU שכותרתו באמצעות Fractator אופטי
הערה: לערוך מחקר פיילוט כולל כמה בעלי חיים כדי לקבוע את הפרמטרים הדגימה אופטימלית, כגון מספר סעיפים להיות מנותח ומספר של דיסקים אופטיים בתוך המדורים שנדגמו. טייס זה גם מספקקורות חיים ראשוניים (סטיית תקן / ממוצע) ואפשרות להתאים את CE (ראה סעיף 3.9.3) לקבלת דיוק משביע רצון של האומדנים שנקבעו על ידי החוקר (לפרטים נוספים ראה להלן). כמו כן לבצע ניתוח הפצה z כדי לטפל בנקודות הבאות: הצטמקות של הרקמה, איכות מכתים לאורך כל החלק והפצה של התאים בציר z 14 .
- בדוק את עובי הרקמה בסעיפים כדי לוודא כי הם מתאימים לשימוש של Fractator אופטי, למשל הוא עבה מספיק גובה גובה הנבחר כולל אזורי שמירה (ראה להלן). הערה: עובי רקמות הוא צעדים בכמה מקומות באזור של עניין.
- מניחים את השקופיות על הבמה ממונע של המיקרוסקופ ולהפעיל את התוכנה סטריאולוגית המועדפת.
- הגדר את אזור העניין באמצעות מטרה הגדלה נמוכה (2X או 4X) לפני שינוי 100-שמן 100X(ראה איור 2 א ).
- באמצעות נקודה ספציפית של מסגרת ספירה ( למשל בפינה או בצמוד אליה), אתר את החלק העליון של החלק על ידי זז לאורך המטוס המוקד עד שתכונה כלשהי של הקטע מופיעה בפוקוס. רישום זה z- מיקום כמו 0 (ראה איור 2 ב ).
- להזיז את המטוס המוקד למטה דרך הרקמה עד אותה נקודה ספציפית של מסגרת הספירה הוא ברמה האחרונה של רקמת להתמקד להתמקד זה המיקום. עובי הרקמה המקומית מוגדרת מ -0 לנקודת קצה זו וניתן לקרוא אותה על ציר ה- z. לרשום את עובי רקמות (ראה איור 2 ב ).
- מסמך מלא חדירה של הכתם והפצה של תאים בעובי מלא של הקטע.
הערה: ההתפלגות של נוירונים שכותרתו BrdU משמשת כמדריך לקביעת אזורי השמירה הנדרשים. למרות התפלגות אחידה של תאים הוא קריטי, זהמקובל להתבונן בתאים פחות ליד החלק העליון והתחתון של הקטע, מה שמעיד על ההשפעה של כובעים אבודים (לפרטים נוספים ראה Dorph-Petersen et al., 2009).- לדוגמה BrdU שכותרתו נוירונים לרשום את המיקום z שלהם יחד עם עובי סעיף המקומי נמדד בפינה שנבחרה של כל מסגרת ספירה.
- מגרש את מספר נוירונים חיוביים BrdU כפונקציה של המיקום z שלהם.
- תקן את הגובה של הדיסק ואת אזורי השמירה על פי עובי סעיף ממוצע ואת התפלגות של תאים (ראה 3.1 ו -3.2).
הערה: גובה הגלאי צריך להיות פחות מעובי הקטע, כדי למנוע חפצים הקרובים למשטחים. סיכון זה הוא עקף על ידי כולל אזורי שמירה על החלק העליון והתחתון של החלק. - לקבוע את אורך הצעד בין disectors.
- תאר את האזור של עניין על כל הסעיפים להיות מנותח לרשום את האזורים.
- סכום אלה אזורים ואז לחלק בY מספר disectors להיות ממוקם בתוך אזור זה.
הערה: בהתבסס על ניסיון קודם נקודת התחלה טובה כרוכה 75 בדיקות. זה יספק קירוב של האזור ואת עמדות הדגימה המקביל ( צעד ) (לפרטים נוספים ראה West, 2012). - קח את השורש הריבועי של צעד , אשר יספק את גודל xy צעד.
- קבע את גודל מסגרת הספירה.
- הגדר את גודל מסגרת הספירה ליחידה שרירותית ולבצע דגימה טייס של נוירונים חיובי BrdU באמצעות הפרמטרים שהתקבלו בסעיף 3.3 ו -3.4.
הערה: הגודל צריך להיקבע באופן אמפירי על ידי ניסוי וטעייה, אך מומלץ כי הוא מותאם כדי לאפשר דגימה של 2-3 תאים לכל דיקטור 8 .
- הגדר את גודל מסגרת הספירה ליחידה שרירותית ולבצע דגימה טייס של נוירונים חיובי BrdU באמצעות הפרמטרים שהתקבלו בסעיף 3.3 ו -3.4.
- בעקבות זה השלב הסופי של המחקר פיילוט להתחיל דגימה התא.
הערה: פרמטרים הדגימה שהתקבלו אמור לגרום ספירות של כ 150-200 תאים iN כל חיה אשר מספיק כדי להשיג עיצוב יעיל stereological 8 . - ספירת הנוירונים חיובי BrdU באמצעות 100 × שמן טבילה המטרה ואת ההגדלה הסופית של 2000-3000 ×. בכל דיכאון אופטי, לזהות כל הנוירונים שכותרתו BrdU כי הם מוכרים בבירור על ידי התכונה של עניין (במחקר הנוכחי, הקריטריון הוא כאשר הקצה המוביל של נוירון BrdU שכותרתו נכנס להתמקד בפעם הראשונה), ממוקמים בתוך מסגרת הספירה או לגעת בקווים הכללה ( איור 2 ב ). אל תספרו את הנוירונים החיוביים של BrdU, שכאשר הם מכירים היטב בתכונת העניין בתוך גובה הגלאי, געו בקווי ההדרה. זה קריטי חשוב לעקוב בקפדנות אלה כללי סריקה לאורך כימות סטריאולוגי כולו.
הערה: כמו BrdU משלבת לתוך כל התאים מחלקים, מורפולוגיה משמש כדי להבחין בין נוירונים וסוגים אחרים של תאים. NeuRon הם גרעין מוגדר בבירור עם ציטופלסמה נייטרלי נוקלאוס כהה. תאים חיוביים BrdU מוכרים נוירונים שנוצרו לאחרונה על בסיס גודל גדול יחסית שלהם לתאי גלייה. יש לציין כי במחקרים של התפשטות לטווח קצר (למשל <24 שעות) מכתים פעמיים באמצעות סמנים עצביים בשלים עשוי להיות תנאי מוקדם 17 . - להעריך את המספר הכולל של נוירונים חיוביים BrdU בכל מוח על ידי הכפלת המספר הכולל של תאים שנספרו (Σ Q - ) עם שברים הדגימה הדדית:
ל
איפה
Q - היא עובי סעיף ממוצע משוקלל, h הוא גובה של הדיסקטור, ASF הוא חלק הדגימה שטח, ssf הוא סעיף sשבר ampling ו- t i הוא עובי הקטע במסגרת ספירה i עם ספירת תאים 
ב 14 , 18 . - חישוב מקדם השגיאה (CE) 8 המהווה את השונות הדגימה של נוירונים חיוביים BrdU בדגימה אקראית אחידה שיטתית (SURS).
- ראשית, לחשב את הרעש , אשר שווה למספר הכולל של נוירונים BrdU חיובי נספר:
- לאחר מכן, לחשב את השונות ב- SURS:
הערה: יש לנו לשפוט את האזור ספירת תאים בהיפוקמפוס כדי לשנות בצורה חלקה מקטע לקטע וכתוצאה מכך נעשה שימוש "מחלקה חלק" מ = 1 (1/2) 8 , 19
איפה
P i הוא מספר הנקודות שנספרו עבור האובייקט בקטע ה i ו - n הוא מספר הסעיפים 4 , 20 . - לבסוף, לחשב את CE של האומדן:
הערה: בדרך כלל, הדיוק האופטימלי מושג בדרך כלל כאשר ערך CE נמוך ממחצית הקורות הנבדקים, כמו OCV 2 = ICV 2 + CE 2 , כאשר OCV הוא קורות חיים שנצפו ו- ICV הוא קורות חיים מובנים 4 .
- ראשית, לחשב את הרעש , אשר שווה למספר הכולל של נוירונים BrdU חיובי נספר:
Q - היא עובי סעיף ממוצע משוקלל, h הוא גובה של הדיסקטור, ASF הוא חלק הדגימה שטח, ssf הוא סעיף sשבר ampling ו- t i הוא עובי הקטע במסגרת ספירה i עם ספירת תאים 
ב 14 , 18 . 
FIgure 1: איור סכמטי מראה עיבוד רקמות על פי עקרונות fractionator המשמשים במחקר הנוכחי.
לאחר הניסוי, ההמיספרות מופרדות ובחצי הכדור הימני או השמאלי נבחר באופן שיטתי ואקראי (A). המוח השלם המשתרע על כל ההיפוקמפוס נחתך לקטרים העבריים 80 מיקרומטר (B), ולאחר מכן כל קטע 5 הוא subpled משנה, החל באופן אקראי בין סעיף 1 עד 5, עבור immunostaining הסופי וכימות סטריאולוגי (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: איור המציג את הליך הדגימה הסטריאולוגית באמצעות דיקטורים אופטיים.
(א) לאחר עיבוד היסטולוגית hהגליקופוקל GCC / SGZ היה delineate ו disectors אופטי להחיל אחיד באופן אקראי על פני האזור. (ב) דיקטטורים אופטיים (משמאל), הנוירונים החיוביים BrdU נמנו רק אם התכונה שלהם עניין היו מוכרים בבירור בתוך גובה גלאי, והוא ממוקם בתוך מסגרת ספירה או נוגע קו הכללה (מימין). נוירונים הנוגעים לקו ההדרה לא נספרים. סולם ברים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Representative Results
פרמטרים דגימה
על ידי ניתוח הפצה z במחקר פיילוט ( איור 3 ), מצאנו התפלגות אחידה של נוירונים חיוביים BrdU בגובה גובה. הצטמקות המדורים נמדדה; עובי ממוצע הסופי היה 26.4 מיקרומטר (19.0-32.0 מיקרומטר) בקטעים במקור לחתוך ב 80 מיקרומטר. בהתבסס על עובי רקמות והפצה של נוירונים שכותרתו BrdU גובה הגובה נקבע 10 מיקרומטר, אזורי השמירה בחלק העליון והתחתון של החלק נקבע 5 מיקרומטר ו 4-17 מיקרומטר בהתאמה. בהתאם הצפיפות של התאים, השטח של מסגרות הספירה היה 1414 או 5210 מיקרומטר 2 . אורך הצעד היה 220 מיקרומטר בשני הכיוונים x ו- y וספירה התא בוצעה בממוצע של 12 (טווח 8-16) סעיפים לכל חיה. פרמטרים אלה הדגימה הביא ממוצע של 133 (טווח 33-372) BrdUתאים אופציונליים נספרים ב- 173 (107-204) disectors בכל חצי כדור המוח.
לדוגמה, השגנו את קורות החיים הבאים וערכי CE לאמירות נוירונים חיוביות של BrdU בחולדות עם ECS: 24 שעות: CV = 0.59, CE = 0.11; 3 חודשים: CV = 0.34, CE = 0.12; 6 חודשים: CV = 0.43, CE = 0.09; 12 חודשים: CV = 0.22, CE = 0.09.
אנחנו לכמת את המספר הכולל של נוירונים שנוצר לאחרונה הישרדות לטווח ארוך שלהם בהיפוקמפוס חולדה בעקבות ECS באמצעות fractionator אופטי בשילוב עם BrdU מכתים טכניקה 10 , 11 . התוצאות הסופיות הראו נוירוגנזה בסיסית בארבע קבוצות של בעלי חיים שליטה, אשר לא שונה באופן משמעותי כפונקציה של זמן ההישרדות ( איור 3 ). יתר על כן, ECS גרמה לעלייה משמעותית במספר הכולל של נוירונים חיובי BrdU ב 24(259%, p <0.0001), 3 (229%, p <0.001), 6 (152%, p <0.05) ו -12 חודשים (162%, p <0.05), בהשוואה לבקרת בעלי חיים.
איור 3: נתונים כמותיים של המספר הכולל של נוירונים חיובי BrdU ב GCL / SGZ של היפוקמפוס חולדה 10 , 11 .
ברים אופקיים מייצגים את הערכים הממוצעים. קיצורים: GCL, גרגר תא שכבת; SGZ, אזור משנה גרגרי; שעות, שעות; מ ', חודשים. **** p <0.0001, *** p <0.001 ו- p <0.05 לעומת שליטה (n = 11-12 לקבוצה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
באמצעות ECS כמתודולוגיה כדי לגרום neurogenesis, אנו מוצאים עלייה מיידית של 260% היווצרות של נוירונים חדשים BrdU חיובי בהיפוקמפוס. בבריכה זו של נוירונים שנוצר בחריפות מצאנו 40% שחיקה מיום 1 עד 3 חודשים, עם כמעט 50% של נוירונים שזה עתה נוצרו שורדים לפחות 12 חודשים לאחר הטיפול 10 , 11 . הספירה של נוירונים שכותרתו BrdU בעקבות ערכת הדגימה קפדנית, לפיה את כל ההיפוקמפוס נחתך לתוך חלקים עבה 80 מיקרומטר ואחריו תת דגימה של כל סעיף 5 עם התחלה דגימה אקראית בין סעיף 1 לבין סעיף 5. בחירת החלקים הללו נבחרת באופן אקראי ושיטתי, זוהי דרך מצוינת להפחתת השונות של התוצאה הסופית, ללא ספירה ממצה 1 . זו ערכת הדגימה אפשרה לנו לספור נוירונים BrdU חיובי בממוצע של 12 (8-16) hippocampאל חלקים בכל מוח חולדה, עם דיוק סופי של 9-11%.
בעת שימוש בשיטה fractionator, חשוב לדעת את החלק של גובה הסעיף שבו ספירת מתבצע, מאז התכווצות רקמה דפורמציה מתרחשת לעתים קרובות במהלך עיבוד היסטולוגית 14 . ואכן, ראינו התכווצות ניכרת של עובי במחקר זה. יתר על כן, יש לציין כי הצטמקות רקמה דיפרנציאלית עשויה להתרחש, כפי שהוצג Dorph-Petersen et al. 2001. עם זאת, כל עוד המבנה המלא של הריבית זמין לניתוח, מגבלות אלה לא לגרום הטיה של המספר הכולל של חלקיקים, כלומר נוירונים BrdU חיובי. במחקרים בהם הצטמקות רקמות היא בעיה מסוימת, יש תמיד לציין כי התוצאות מתקבלות ברקמות מעוותות. במחקר זה, ספרנו בגובה של 10 מיקרומטר. לקטעים של המחקר הנוכחי היה עובי ממוצע סופי של 26 מיקרומטר, 5 מיקרומטראזור השמירה בחלק העליון ואת אזור 11 מיקרומטר (מתכוון) השומר בחלק התחתון של הקטע. פרמטרים אלה מקובלים מאז אזורי השמירה צריך להיות בערך קוטר של החלקיקים שנדגמו.
לאחר התיחום של GCL / SGZ, דיקטורים היו ממוקמים באופן אקראי באופן אקראי בתוך השטח המסומן. יש להציב את הדיסקטורים באורך קבוע, הממטב את הדגימה והספירה כדי להשיג ביעילות אומדנים בדיוק כפי שנקבע על ידי החוקר. דיוק אופטימלי מושגת בדרך כלל על ידי ספירת עד 150-200 תאים בכל מבנה של עניין 5 . במחקר הנוכחי, ספרנו ממוצע של 133 (טווח 33-372) נוירונים חיוביים BrdU בכל היפוקמפוס חולדה. בשל מספר תאים נמוך בחלק מחיות הבקרה, הספירות של נוירונים חיוביים של BrdU נפלו מתחת למספר המקובל של התאים הנדרשים כדי להשיג דיוק מתאים, וכתוצאה מכך ערכי CE גבוהים יחסית עבור מקרים אלה. חעם זאת, כפי שקיבלנו ערכים CE של פחות ממחצית ערכי CV (ראה סעיף תוצאה נציג) דגימה נוספת לספור לא היה נדרש. ערכי CV הגבוהים מראים כי התורם הגדול ביותר לשינויים שנצפו מקורו בשינוי הביולוגי. ואכן, אנו עשויים לטעון כי המספר הממוצע של נוירונים חיוביים BrdU שנספרו במחקר הנוכחי היה גבוה מהנדרש. לדוגמה, בקבוצה אחת של חולדות השגנו ערך CE של 9%, וצפתה ערך CV של 43%. במקרה זה, היינו יכולים לכוון דיוק של כ 20%. לסיכום, הדיוק של המספר הכולל של נוירונים חיוביים BrdU במחקר הנוכחי הוא מספיק בכך שהוא לוכד השפעות טיפול אמיתי על המספרים האמיתיים של חלקיקים. בשל השונות הביולוגית הגדולה יחסית בקבוצות מסוימות של בעלי חיים, ניתן היה לקבל את אותן אומדנים בדייקנות מקובלת, למרות ההוצאות הנמוכות של מאמץ. שונות ביולוגית גבוהה בתוך הקבוצות יכולה רקלקבל פיצוי על ידי הגדלת מספר בעלי חיים.
אפשר לטעון כי תקן הזהב לקבלת מספרי תאים מדויקים כרוך בספירה ממצה של כל האובייקטים של עניין. עם זאת, ברוב המחקרים של המוח זה לא אפשרי בשל המספרים העצומים של תאים. למרות יעילות הרבה יותר מאשר ספירת תאים ממצה, Fractator אופציונלי הוא זמן רב יחסית בהשוואה להקרנה פשוטה של הבדלים במספרי תאים אשר העדיף אם המספר המדויק של תאים אינו חיוני. זה הניסיון שלנו כי הבדלים של יותר מ 20-30% ניתן לאתר אך ורק על ידי הליכי ההקרנה.
אם נעשה בצורה נכונה, דגימה באמצעות stereology מבוסס עיצוב מספק הערכות משוחדת ומדויקת בצורה יעילה 1 . המאפיין הבלתי מוטה של הסטריאולוגיה מייצר הערכות, שכאשר משוכפלים, מקורב לאוכלוסייה האמיתית, ומשפר את יכולת ההחזר שלאומדן 21 . בתחילה יש לקבל מדגם מייצג של כל מבנה העניין (במחקר זה את ה- GCL / SGZ בהיפוקמפוס), דבר המאפשר הערכה בתת-קבוצה תקפה מבחינה סטטיסטית של סעיפים 4 . כדי להשיג מספר מתאים של סעיפים וספירת בדיקות אנו מיישמים את SURS, דבר המקטין את השונות בהשוואה לדגימה אקראית 8 . יתר על כן, SURS מבטיח כי חלקיקים של עניין בתוך המבנה נדגמים עם הסתברויות אותו, ללא קשר לגודל שלהם, צורה, כיוון והפצה במבנה. כמו סטראולוגיה כזו היא להיות מומלץ מאוד כאשר קבלת הערכות מדויקות ולא משוחדות היא היבט מרכזי של הפרויקט.
Disclosures
למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים לסוזאן סורנסן על סיוע טכני מיומן. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מן הקרן ולוקס; קרן יאשה; קרן Aase ו Ejnar Danielsens; קרן האחים הרטמן; הבמאי יעקב מדסן ואשתו אולגה מאדנס קרן; דוקטור סופוס קרל אמיל פריס ואשתו דוריס פריס 'אמון; קרן 1870; קרן Torben ו- Alice Frimodts והקרן למחקר נוירולוגי. עריכה של כתב היד בוצעה על ידי Inglewood Biomedical Editing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 5'-bromo-2'deoxyuridine - BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
| Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
| Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
| dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
| Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
| Ethanol - 70 % | Plum A/S | 201098 | |
| Ethanol - 96 % | Plum A/S | 201104 | |
| Ethanol - 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
| Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
| H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
| HCl | J. T. Baker | 6081 | |
| Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
| Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
| PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
| PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
| Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
| Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
| Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
| Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
| Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
| Xylene | VWR | 28,973,363 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cover slips | Menzel-Gläser | 24x50 mm #0 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
| Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Microscope camera | Olympus | DP72 | |
| Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
| Motorized stage | Prior | H101A | |
| Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
| New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
| Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
| Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
| Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
| Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
| Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
| Slide rack | Sakura | 4465 | |
| Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
| Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
| Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |
References
- Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. Design-based stereology: Introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number. Toxicol. Pathol. 38 (7), 1011-1025 (2010).
- West, M. J. Introduction to stereology. 2012 (8), Cold Spring Harb. Protoc. 843-851 (2012).
- West, M. J. Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: issues of precision and bias. Trends Neurosci. 22 (2), 51-61 (1999).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J. Microsc. 147 (Pt 3), 229-263 (1987).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat. Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kaae, S. S., Chen, F., Wegener, G., Madsen, T. M., Nyengaard, J. R. Quantitative hippocampal structural changes following electroconvulsive seizure treatment in a rat model of depression. Synapse. 66 (8), 667-676 (2012).
- Chen, F., Madsen, T. M., Wegener, G., Nyengaard, J. R. Repeated electroconvulsive seizures increase the total number of synapses in adult male rat hippocampus. Eur Neuropsychopharmacol. 19 (5), 329-338 (2009).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. V., Kiëu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology - reconsidered. J.Microsc. 193 (3), 199-211 (1999).
- West, M. J. Design based stereological methods for estimating the total number of objects in histological material. Folia Morphol.(Warsz). 60 (1), 11-19 (2001).
- Olesen, M. V., Wörtwein, G., Pakkenberg, B. Electroconvulsive stimulation, but not chronic restraint stress, causes structural alterations in adult rat hippocampus - a stereological study. Hippocampus. 25 (1), 72-80 (2015).
- Olesen, M. V., Wortwein, G., Folke, J., Pakkenberg, B. Electroconvulsive stimulation results in long-term survival of newly generated hippocampal neurons in rats. Hippocampus. 27 (1), 52-60 (2017).
- Madsen, T. M., et al. Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy. Biol Psychiat. 47 (12), 1043-1049 (2000).
- Cameron, H. A., Mckay, R. D. G. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J.Comp. Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
- Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size. J.Microsc. 204 (3), 232-246 (2001).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Recommendations for straightforward and rigorous methods of counting neurons based on a computer simulation approach. J Chem. Neuroanat. 20 (1), 93-114 (2000).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 2nd edn, Academic Press. Sydney. (1986).
- Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice. Development. 130 (2), 391-399 (2003).
- Fabricius, K., Wortwein, G., Pakkenberg, B. The impact of maternal separation on adult mouse behaviour and on the total neuron number in the mouse hippocampus. Brain Struct. Funct. 212 (5), 403-416 (2008).
- Dorph-Petersen, K. A., et al. Volume and neuron number of the lateral geniculate nucleus in schizophrenia and mood disorders. Acta neuropathologica. 117 (4), 369-384 (2009).
- Eriksen, N., et al. Application of stereological estimates in patients with severe head injuries using CT and MR scanning images. Br. J. Radiol. 83 (988), 307-317 (2010).
- Gundersen, H. J. Stereology: the fast lane between neuroanatomy and brain function--or still only a tightrope? Acta Neurol. Scand. Suppl. 137, 8-13 (1992).
