Summary
Ici, nous présentons une méthode stéréologique, le fractionneur optique, utilisé pour quantifier la formation de nouveaux neurones et leur survie, dans l'hippocampe du rat après une stimulation électroconvulsive. Lorsqu'il est correctement implémenté, la sensibilité et l'efficacité des méthodes stéréologiques garantissent des estimations précises avec une précision fixe et prédéterminée.
Abstract
Les méthodes stéréologiques sont conçues pour décrire les paramètres quantitatifs sans faire d'hypothèses concernant la taille, la forme, l'orientation et la répartition des cellules ou des structures. Ces méthodes ont été révolutionnaires pour l'analyse quantitative du cerveau des mammifères, dans lequel les populations de cellules volumétriques sont trop élevées pour compter manuellement, et la stéréologie est maintenant la technique de choix chaque fois que des estimations de quantités tridimensionnelles doivent être extraites des mesures à deux dimensions sections. Toutes les méthodes stéréologiques sont en principe impartiales; Cependant, ils s'appuient sur une connaissance appropriée de la structure d'intérêt et des caractéristiques du tissu. La stéréologie est basée sur l'échantillonnage homogène systématiquement aléatoire (SURS), avec un ajustement de l'échantillonnage au niveau le plus efficace en matière de précision, fournissant des informations quantitatives et fiables sur toute la structure d'intérêt. Ici, nous présentons le fractionneur optique en conjonction avec l'immunohistochimie BrdU tO estiment la production et la survie des neurones nouvellement formés dans la couche de cellules granulaires (y compris la zone sous-granulaire) de l'hippocampe de rat après stimulation électroconvulsive, qui est parmi les stimulateurs les plus puissants de la neurogenèse. La technique du fractionneur optique est conçue pour fournir des estimations du nombre total de cellules provenant de sections épaisses échantillonnées à partir de la structure complète. Les sections épaisses offrent l'opportunité d'observer les cellules dans leur totalité en 3-D, ce qui permet une classification cellulaire simple et robuste basée sur des critères morphologiques. Lorsqu'il est correctement implémenté, la sensibilité et l'efficacité du fractionneur optique fournissent des estimations précises avec une précision fixe et prédéterminée.
Introduction
La quantification des cellules dans une structure tridimensionnelle (3-D) peut nécessiter l'obtention d'estimations basées sur des principes impartiaux. Même aujourd'hui, les études utilisent fréquemment des méthodes bidimensionnelles (2-D) pour signaler les données des structures 3-D. Cependant, ces méthodes ne considèrent pas la nature hétérogène de la structure en termes de forme et de distribution des cellules, ce qui entraîne des limites méthodiques; Ils font des hypothèses au sujet de la structure d'intérêt 3-D et les résultats ne font pas référence à la structure complète. Ces limitations réduisent la sensibilité et la précision des méthodes et augmentent le risque d'erreurs 1 .
Le biais dans le comptage des cellules peut être évité par l'application de la stéréologie basée sur le design, qui est d'une importance générale pour obtenir des informations quantitatives sur le nombre de cellules dans un tissu ou une structure donné. Alors que la stéréologie était autrefois une méthode très longue, les progrès dans les procédures, les doucesWare et l'imagerie, l'a rendu plus efficace et largement applicable. La stéréologie implique des principes d'échantillonnage statistique et une théorie géométrique stochastique pour fournir des outils efficaces pour l'estimation du volume, de la surface, de la longueur et du nombre d'objets dans une structure 3-D par échantillonnage dans les sections 2 -D 2 . Ainsi, la stéréologie permet d'obtenir des données quantitatives impartiales sur les changements structurels dans les sections de tissus, ce qui donne des estimations moyennes du nombre réel, sans analyse exhaustive 1 . La stéréologie est définie comme l'inférence statistique des paramètres géométriques à partir des informations échantillonnées. Cela peut être réalisé par un échantillonnage impartial, c'est-à-dire un échantillonnage aléatoire systématique, des sections ainsi que des règles de comptage qui garantissent que tous les objets ont des probabilités égales d'être comptés 3 . Bien que les résultats stéréologiques puissent avoir des degrés de précision différents, comme indiqué par le coefficient d'erreur (CE), cela peut être une publicitéEn fonction de la variance biologique inhérente (coefficient de variance (CV)) en ajustant la quantité d'échantillonnage requise 4 , 5 . Quelques études stéréologiques antérieures ont examiné les effets à court terme de la stimulation électroconvulsive (ECS) sur la plasticité de l'hippocampe chez les rongeurs 6,7 . Les données de ces études montrent une augmentation initiale du nombre total de neurones ainsi qu'une différenciation synaptique élevée suite à une ECS répétée. Cependant, ces études n'examinent pas directement la neurogénèse, car elles n'utilisent pas de marqueurs spécifiques pour la prolifération cellulaire.
Nous présentons ici une application d'une méthode stéréologique, la technique du fractionneur optique 8 , 9 , pour quantifier le nombre total de neurones nouvellement formés dans la couche de cellules granulaires d'hippocampe de rat (GCL), y compris la zone sous-granulaire (SGZ) Comme leur long termeUrvival 10 , 11 . Nous avons soumis les rats à un calendrier clinique pertinent de ECS (trois fois par semaine pendant 3 semaines), qui est l'un des stimulants les plus puissants de la neurogénèse 12 . Les animaux de contrôle ont été traités en utilisant la même procédure, mais sans passage de courant. Sur chacun des 21 jours d'expérimentation, tous les rats ont été injectés par voie intrapéritonéale avec 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU) qui incorpore dans l'ADN à la place de la thymidine pendant la division cellulaire 13 . Après l'expérimentation, les rats ont été maintenus pendant quatre périodes différentes (24 heures, 3 mois, 6 mois et 12 mois). En utilisant le principe du fractionneur, nous avons obtenu une fraction connue de l'hippocampe à l'aide d'un échantillonnage aléatoire uniforme des sections et des disques optiques appliqués (sondes 3-D) aux sections de tissu épais échantillonnées et immunostained. Il est particulièrement remarqué que les sections congelées s'effondrent habituellement dans l'axe z pendant le processusIng, et que les disques optiques basés sur l'épaisseur moyenne pondérée en nombre de la section devraient être utilisés dans ce cas particulier 14 . Comme le plan focal des disecteurs optiques a été déplacé une distance connue vers le bas à travers la section, les neurones BrdU-positifs ont été comptés quand leur caractéristique d'intérêt était clairement reconnue. Dans le domaine de la stéréologie, il y a un certain débat sur le nombre total de particules qui doivent être comptées 15 ; Typiquement 150-200 neurones sont comptés dans la structure d'intérêt pour obtenir une précision adéquate, c'est -à- dire un coefficient de 7-8% 8 . Les comptes neuronaux positifs pour BrdU ont été complétés en utilisant un logiciel stéréologique avec imagerie par un microscope standard équipé d'une caméra et les objectifs suivants: 2X, 4X et 10X, ainsi qu'un objectif 100X d'immersion en huile (ouverture numérique = 1.40) et un étage motorisé . Les mouvements dans la direction z ont été mesurés avec un microcateur numérique. Le grossissement finalÉtait 3000X.
Protocol
Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément aux directives de l'Inspection danoise de l'expérimentation animale et approuvées par le comité local d'éthique pour les animaux expérimentaux.
1. Traitement des tissus
NOTE: Après perfusion transcardiale et post fixation dans 4% de paraformaldéhyde (PFA) dilué dans du tampon phosphate 0,2 M pendant une nuit à 4 ° C, les cerveaux sont transférés à 30% de saccharose dans une solution salée tamponnée au phosphate (PBS) pendant trois jours à 4 ° C. Par la suite, les cerveaux sont congelés sur de la glace sèche en poudre et conservés à -80 ° C jusqu'à la section.
- Séparez les hémisphères droit et gauche le long de la ligne médiane du cerveau en utilisant un scalpel, puis choisissez un ou l'autre hémisphère au hasard dans le premier cerveau, puis décale systématiquement entre l'hémisphère droit et l'hémisphère gauche ( figure 1A ). Monter l'hémisphère échantillonné sur un disque d'échantillon avec l'axe long perpendiculaire au disqueEn utilisant un support de montage.
- Placez les conteneurs multidiseurs numérotés pour pré-refroidissement dans le cryostat.
- Montez le disque dans le cryostat et coupez l'intégralité de l'hippocampe (Bregma 1,80 à - 7,04 16 ) dans des sections de 80 μm d'épaisseur dans le plan coronal ( Figure 1B ).
- Placez toutes les sections échantillonnées consécutivement dans les récipients multidis refroidis, afin de s'assurer que les sections sont maintenues en coupe.
- Couvrez complètement les sections avec cryoprotecteur et maintenez les récipients à -20 ° C jusqu'à l'utilisation ultérieure.
2. Immunomarquage
REMARQUE: Pour suivre les sections individuelles tout au long de la procédure de coloration, placez les sections échantillonnées dans des filets de coloration à 25 puits. Utilisez chaque 5 e section, en donnant un nombre final moyen de 12 (8-16) sections par hippocampe pour l'immunocoloration et le comptage de cellules ultérieur.
- Avant le sous-échantillonnage de chaque nième section avec un démarrage aléatoire entre la section 1 et la section n ( Figure 1C ), transférez les conteneurs de -20 ° C à la température ambiante (RT).
- Utilisez par exemple un pinceau, pour transférer les sections dans l'ordre numérique vers les filets de coloration à 25 puits placés dans des boîtes de Petri remplies de PBS.
REMARQUE: à partir de ce point, conservez les sections dans les filets de coloration qui sont placés dans des assiettes en verre assorties sur un agitateur orbital (section 2.3 à 2.9). - Transférer les filets de coloration aux plats de verre correspondants et laver les sections deux fois pendant 10 minutes dans du PBS à TA avant incubation dans du peroxyde d'hydrogène à 3% (H 2 O 2 ) dilué dans de l'eau distillée (dH 2 O) pendant 20 minutes.
- Transférer les sections à trois solutions différentes d'acide chlorhydrique (HCl) (1 M à 0 ° C pendant 10 min, 2 M à la RT pendant 10 min et 2 M à 37 ° C pendant 20 min) avant neutralisation dans du tétraborate de sodium 0,1 M uneT RT pendant 20 min.
- Après 3 x 10 minutes d'incubation dans du Triton X-100 à 1% dilué dans du PBS (tampon de lavage), transférer les sections dans un tampon de lavage contenant 10% de sérum bovin fœtal (solution bloquant) pendant 1 heure à la RT.
- Incuber les sections pendant 48 h à 4 ° C dans une solution de blocage diluée à la souris anti-BrdU diluée à 1: 100.
- Laver les sections 3 x 10 min dans un tampon de lavage et incuber pendant 48 h dans de la peroxydase de raifort raide dilué 1:10 dans un tampon de lavage.
- Transférer les sections en PBS pendant 5 × 10 min, puis pendant 7 minutes dans 0,01% de diaminobenzidine (DAB) diluée dans du PBS avant qu'elles ne soient transférées dans une solution DAB similaire contenant 0,02% de H 2 O 2 pendant 10 minutes à la RT.
- Compléter une série de lavages (2 × 10 min dans PBS et 2 × 10 min dans un tampon phosphate sans chlorure de sodium ajouté) et monter les sections en ordre numérique sur des lames de microscope.
- Séchez les sections pendant environ 30 minutes avant le contre-colorant avec du crésyleviolet.
- Placez les lames du microscope dans une crémaillère.
- Réhydratez les sections pendant 10 min dans des boîtes de coloration par glissement contenant de la dH 2 O, puis transférez les diapositives à 0,02% de violette de crêle dans du dH 2 O pendant 15 min.
- Répétez l'étape 2.12 avant que les sections ne soient déshydratées trois fois dans de l'éthanol (96% pendant 5 min et 99% pendant 2 × 2 min).
- Placez les sections en xylène pendant 2 × 15 min et glissez les glissières à l'aide d'un milieu de séchage rapide pour le montage.
- Enfin, laissez les glissières glissées pendant environ 24 h avant qu'elles puissent être utilisées pour la microscopie.
3. Estimation du nombre total de neurones marqués par BrdU en utilisant le fractionneur optique
NOTE: Effectuer une étude pilote comprenant quelques animaux pour déterminer les paramètres d'échantillonnage optimaux, tels que le nombre de sections à analyser et le nombre de disecteurs optiques dans les sections échantillonnées. Ce pilote fournit également unCV préliminaire (écart type / moyenne) et la possibilité d'ajuster la CE (voir la section 3.9.3) pour obtenir une précision satisfaisante des estimations déterminées par l'enquêteur (pour plus de détails, voir ci-dessous). De même, effectuez une analyse de distribution z pour traiter les points suivants: rétrécissement du tissu, qualité de la coloration dans la section et répartition des cellules dans l'axe z 14 .
- Vérifiez l'épaisseur du tissu dans les sections pour confirmer qu'ils sont adaptés à l'utilisation du fractionneur optique, par exemple, il est assez épais pour la hauteur du capteur choisie, y compris les zones de protection (voir ci-dessous). NOTE: L'épaisseur du tissu est une mesure dans plusieurs endroits dans la région d'intérêt.
- Placez les diapositives sur la phase motorisée du microscope et allumez le logiciel stéréologique préféré.
- Déterminez la zone d'intérêt en utilisant un objectif de faible grossissement (2X ou 4X) avant de passer à un 100X huile-immErsion objective (voir figure 2A ).
- À l'aide d'un point spécifique d'un cadre de comptage ( p. Ex. Au niveau ou à côté d'un coin), localisez le haut de la section en vous déplaçant le long du plan focal jusqu'à ce que certaines fonctions de la section apparaissent en mise au point. Enregistrez cette position z en 0 (voir la figure 2B ).
- Déplacez le plan focal vers le bas à travers le tissu jusqu'à ce que le même point spécifique du cadre de comptage soit au dernier niveau z de tissu en mise au point et marquez cette position. L'épaisseur locale du tissu est définie de 0 à ce point final et peut être lue sur l'axe z. Enregistrez l'épaisseur du tissu (voir Figure 2B ).
- Documenter la pénétration complète de la tache et la répartition des cellules dans l'épaisseur totale de la section.
NOTE: La distribution des neurones marqués par BrdU sert de guide pour déterminer les zones de garde requises. Bien qu'une distribution uniforme des cellules soit critique, elleEst acceptable d'observer moins de cellules près du haut et du bas de la section, ce qui indique l'effet des capuchons perdus (pour plus de détails, voir Dorph-Petersen et al., 2009).- Énumérer les neurones marqués par BrdU et enregistrer leur position z avec l'épaisseur de la section locale mesurée dans l'angle sélectionné de chaque cadre de comptage.
- Tracer le nombre de neurones BrdU positifs en fonction de leur position z.
- Fixer la hauteur des zones de protection et de protection en fonction de l'épaisseur moyenne de la section et de la répartition des cellules (voir 3.1 et 3.2).
REMARQUE: la hauteur du disector doit être inférieure à l'épaisseur de la section pour éviter les artefacts proches des surfaces. Ce risque est contourné en incluant des zones de garde en haut et en bas de la section. - Déterminez la longueur d'étape entre les disecteurs.
- Déterminez la région d'intérêt sur toutes les sections à analyser et enregistrez les zones.
- Additionnez ces zones, puis divisez bY le nombre de disecteurs à placer dans cette zone.
NOTE: Selon l'expérience précédente, un bon point de départ implique 75 sondes. Cela fournira une approximation de la zone et des positions d'échantillonnage correspondantes (une étape ) (pour plus de détails, voir West, 2012). - Prenez la racine carrée d'une étape , qui fournira la taille xy-step.
- Déterminez la taille du cadre de comptage.
- Définissez la taille du cadre de comptage sur une unité arbitraire et effectuez un échantillonnage pilote de neurones BrdU positifs en utilisant les paramètres obtenus aux sections 3.3 et 3.4.
REMARQUE: la taille doit être déterminée de manière empirique par essai et erreur, mais il est recommandé de l'ajuster pour permettre l'échantillonnage de 2 à 3 cellules par disector 8 .
- Définissez la taille du cadre de comptage sur une unité arbitraire et effectuez un échantillonnage pilote de neurones BrdU positifs en utilisant les paramètres obtenus aux sections 3.3 et 3.4.
- À la suite de cette étape finale de l'étude pilote, commencer l'échantillonnage cellulaire.
NOTE: Les paramètres d'échantillonnage obtenus devraient donner lieu à des chiffres d'environ 150-200 cellules iN chaque animal qui est suffisant pour obtenir un design stéréologique efficace 8 . - Comptez les neurones BrdU-positifs en utilisant un objectif d'immersion à l'huile 100 × et un grossissement final de 2000-3000 ×. Dans chaque désecteur optique, identifiez les neurones marqués par BrdU qui sont clairement reconnus par la caractéristique d'intérêt (dans la présente étude, le critère est celui où se situe le bord d'attaque du neurone marqué par BrdU pour la première fois) Dans le cadre de comptage ou touchez les lignes d'inclusion ( Figure 2B ). Ne comptez pas les neurones positifs pour BrdU qui, lorsqu'ils sont clairement reconnus par la caractéristique d'intérêt à l'intérieur de la hauteur du conducteur, touchent les lignes d'exclusion. Il est essentiel de suivre scrupuleusement ces règles de comptage tout au long de la totalité de la quantification stéréologique.
NOTE: Au fur et à mesure que BrdU incorpore dans toutes les cellules séparatrices, la morphologie est utilisée pour distinguer les neurones et les autres types de cellules. NeuLes caractéristiques RON sont un noyau clairement défini avec un cytoplasme neutre et un nucléolus sombre. Les cellules positives à BrdU sont reconnues comme des neurones nouvellement formés en fonction de leur taille relativement plus grande par rapport aux cellules gliales. Il convient de mentionner que dans les études de prolifération à court terme (par exemple <24 h), la double coloration utilisant des marqueurs neuronaux immatures peut être une condition préalable 17 . - Estimez le nombre total de neurones BrdU positifs dans chaque cerveau en multipliant le nombre total de cellules comptées (Σ Q - ) avec les fractions d'échantillonnage réciproques:
pour
où
Q- est l'épaisseur moyenne de la section pondérée en nombre, h est la hauteur du disector, étant donné que la fraction d'échantillonnage de la zone, ssf est la section sLa fraction d'amplification et t i est l'épaisseur de la section dans la ième zone de comptage avec un nombre de cellules de 
Dans le désisteur 14 , 18 . - Calculer le coefficient d'erreur (CE) 8 qui est la variance d'échantillonnage des neurones BrdU positifs dans un échantillonnage systématiquement aléatoire uniforme (SURS).
- Tout d'abord, calculer le bruit , qui est égal au nombre total de neurones BrdU-positifs comptés:
- Ensuite, calculez la variance dans SURS:
NOTE: Nous avons jugé la superficie et le nombre de cellules dans l'hippocampe pour changer en douceur d'une section à l'autre et par conséquent utilisé "classe de lissage" m = 1 (1/240) 8 , 19
où
P i est le nombre de points comptés pour l'objet dans la ième section et n est le nombre de sections 4 , 20 . - Enfin, calculez le CE de l'estimation:
REMARQUE: En général, une précision optimale est généralement obtenue lorsque la valeur CE est inférieure à la moitié du CV observé, comme OCV 2 = ICV 2 + CE 2 , où OCV est le CV observé et ICV est le CV 4 inhérent.
- Tout d'abord, calculer le bruit , qui est égal au nombre total de neurones BrdU-positifs comptés:
Q- est l'épaisseur moyenne de la section pondérée en nombre, h est la hauteur du disector, étant donné que la fraction d'échantillonnage de la zone, ssf est la section sLa fraction d'amplification et t i est l'épaisseur de la section dans la ième zone de comptage avec un nombre de cellules de 
Dans le désisteur 14 , 18 . 
FFigure 1: Illustration schématique montrant le traitement des tissus selon les principes du fractionneur utilisés dans la présente étude.
Après l'expérimentation, les hémisphères sont séparés et l'hémisphère droit ou gauche est choisi systématiquement et aléatoirement (A). Le cerveau complet s'étendant sur tout l'hippocampe est coupé en sections coronales de 80 μm d'épaisseur (B), après quoi chaque 5ème section est sous-échantillonnée, commençant de façon aléatoire entre les sections 1 à 5, pour l'immunocoloration finale et la quantification stéréologique (C). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Illustration montrant la procédure d'échantillonnage stéréologique à l'aide de disecteurs optiques.
(A) Après traitement histologique, le hIppocampal GCL / SGZ a été délimité et les disecteurs optiques appliqués de manière uniforme et aléatoire sur la région. (B) Dans les disecteurs optiques (à gauche), les neurones BrdU-positifs ont été comptés seulement si leur caractéristique d'intérêt était clairement reconnue dans la hauteur du conducteur et située à l'intérieur du cadre de comptage ou en touchant la ligne d'inclusion (à droite). Les neurones touchant la ligne d'exclusion n'ont pas été comptés. Barres d'échelle = 10 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Representative Results
Paramètres d'échantillonnage
En analysant la distribution z dans une étude pilote ( Figure 3 ), nous avons trouvé une répartition uniforme des neurones BrdU positifs dans la hauteur du conducteur. Le rétrécissement des sections a été mesuré; L'épaisseur moyenne finale était de 26,4 μm (19,0-32,0 μm) dans les coupes coupées à l'origine à 80 μm. Sur la base de l'épaisseur du tissu et de la distribution des neurones marqués par BrdU, la hauteur du capteur a été fixée à 10 μm, et les zones de protection en haut et en bas de la section ont été fixées à 5 μm et 4-17 μm respectivement. Selon la densité des cellules, la surface des cadres de comptage était de 1414 ou 5210 μm 2 . La longueur de l'étape était de 220 μm dans les directions x et y et le comptage cellulaire a été effectué en moyenne 12 (gamme 8-16) par animal. Ces paramètres d'échantillonnage ont donné une moyenne de 133 (gamme 33-372) BrdU- cellules positives comptées dans 173 (107-204) des disecteurs dans chaque hémisphère du cerveau.
Par exemple, nous avons obtenu les valeurs CV et CE suivantes pour les estimations neuronales positives de BrdU chez les rats traités ECS: 24 heures: CV = 0,59, CE = 0,11; 3 mois: CV = 0,34, CE = 0,12; 6 mois: CV = 0,43, CE = 0,09; 12 mois: CV = 0,22, CE = 0,09.
Nous avons quantifié le nombre total de neurones nouvellement formés et leur survie à long terme dans l'hippocampe de rat après ECS en utilisant le fractionneur optique en conjonction avec une technique de coloration BrdU 10 , 11 . Les résultats finaux ont montré une neurogénèse basale dans les quatre groupes d'animaux témoins, qui ne différait pas significativement en fonction du temps de survie ( figure 3 ). En outre, ECS a induit une augmentation significative du nombre total de neurones BrdU positifs à 24Heures (259%, p <0,0001), 3 (229%, p <0,001), 6 (152%, p <0,05) et 12 mois (162%, p <0,05) suite à l'expérimentation, par rapport aux animaux témoins.
Figure 3: Données quantitatives du nombre total de neurones BrdU positifs dans le GCL / SGZ de l'hippocampe de rat 10 , 11 .
Les barres horizontales représentent les valeurs moyennes. Abréviations: GCL, couche de granules; SGZ, zone sous-granulaire; H, heures; M, mois. **** p <0,0001, *** p <0,001 et * p <0,05 par rapport au contrôle (n = 11-12 par groupe). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
En utilisant ECS comme une méthodologie pour induire la neurogénèse, on trouve une augmentation immédiate de 260% dans la formation de nouveaux neurones BrdU positives dans l'hippocampe. Dans ce bassin de neurones générés de façon aiguë, nous avons trouvé 40% d'attrition du 1er au trois mois, avec près de 50% des neurones nouvellement formés survivent au moins 12 mois après le traitement 10 , 11 . Le comptage des neurones marqués par BrdU a suivi un schéma d'échantillonnage strict, dans lequel l'ensemble de l'hippocampe a été coupé dans des sections de 80 μm d'épaisseur suivies d'un sous-échantillonnage de chaque 5ème section avec un départ d'échantillonnage aléatoire entre la section un et la section cinq. La fourniture de ces sections est choisie d'une manière aléatoire systématique, ceci est manifestement une excellente méthode pour réduire la variance du résultat final, sans comptage exhaustif 1 . Ce schéma d'échantillonnage nous a permis de compter les neurones BrdU-positifs en moyenne de 12 (8-16) hippocampAl dans chaque cerveau de rat, avec une précision finale de 9 à 11%.
Lors de l'utilisation de la méthode du fractionneur, il est essentiel de connaître la fraction de la hauteur de section dans laquelle le comptage est effectué, car le retrait et la déformation des tissus se produisent fréquemment lors du traitement histologique 14 . En effet, nous avons constaté un important retrait de l'épaisseur dans cette étude. En outre, il convient de noter que le retrait différentiel du tissu peut se produire, tel que présenté dans Dorph-Petersen et al. 2001. Cependant, tant que la structure d'intérêt complète est disponible pour l'analyse, ces limitations n'entraînent pas une polarisation du nombre total de particules, c'est -à- dire des neurones positifs pour BrdU. Dans les études où le retrait des tissus est un problème particulier, il faut toujours dire que les résultats sont obtenus dans des tissus déformés. Dans cette étude, nous avons compté une hauteur de 10 μm. Les sections de la présente étude avaient une épaisseur moyenne finale de 26 μm, un 5 μmZone de protection en haut et une zone de protection de 11 μm (moyenne) au bas de la section. Ces paramètres sont acceptables car les zones de protection devraient être approximativement du diamètre des particules échantillonnées.
Après la délimitation de la GCL / SGZ, les disecteurs ont été répartis de manière uniforme au hasard dans la zone délimitée. Les disecteurs doivent être positionnés avec une longueur d'étape fixe qui optimise l'échantillonnage et le comptage pour obtenir des estimations efficacement avec une précision déterminée par l'enquêteur. La précision optimale est habituellement atteinte en comptant jusqu'à 150-200 cellules dans chaque structure d'intérêt 5 . Dans la présente étude, nous avons compté un moyen de 133 (gamme 33-372) de neurones BrdU positives dans chaque hippocampe de rat. En raison d'un faible nombre de cellules chez certains des animaux de contrôle, nos comptages de neurones BrdU positifs sont tombés en dessous du nombre généralement acceptable de cellules nécessaires pour obtenir une précision appropriée, ce qui a entraîné des valeurs CE relativement élevées pour ces cas. HCependant, comme nous avons obtenu des valeurs CE de moins de la moitié des valeurs CV (voir la section de résultats représentatifs), l'échantillonnage et le comptage supplémentaires n'étaient pas nécessaires. Les valeurs CV élevées montrent que la plus grande contribution à la variation observée provient de la variation biologique. En effet, nous pourrions affirmer que le nombre moyen de neurones BrdU positifs dans la présente étude était plus élevé que nécessaire. Par exemple, dans un groupe de rats, nous avons atteint une valeur CE de 9% et avons observé une valeur CV de 43%. Dans ce cas particulier, nous aurions pu viser une précision d'environ 20%. En résumé, la précision du nombre total de neurones BrdU positifs dans la présente étude est suffisante en ce sens qu'elle capture des effets de traitement réels sur le nombre réel de particules. En raison de la variation biologique assez importante dans certains groupes d'animaux, les mêmes estimations auraient pu être obtenues avec une précision acceptable, en dépit de moins de dépenses d'effort. Les écarts biologiques élevés au sein des groupes ne peuvent queÊtre compensé par l'augmentation du nombre d'animaux.
On pourrait soutenir que l'étalon-or pour l'obtention de nombres de cellules exactes implique un comptage exhaustif de tous les objets d'intérêt. Cependant, dans la plupart des études du cerveau, ce n'est pas une possibilité en raison du grand nombre de cellules. Bien que beaucoup plus efficace que le comptage exhaustif des cellules, le fractionneur optionnel prend beaucoup de temps par rapport au dépistage simple des différences dans le nombre de cellules, ce qui est préférable si le nombre précis de cellules n'est pas essentiel. Notre expérience montre que des différences de plus de 20 à 30% peuvent être détectées uniquement par des procédures de dépistage.
Si elle est effectuée correctement, l'échantillonnage utilisant une stéréologie basée sur le design fournit des estimations impartiales et précises de manière efficace 1 . La propriété impartiale de la stéréologie produit des estimations qui, lorsqu'elles sont répliquées, s'approchent de la vraie population, et améliorent la reproductibilité de laEstimation 21 . Dans un premier temps, un échantillon représentatif de l'ensemble de la structure d'intérêt (dans cette étude, GCL / SGZ hippocampique) doit être obtenu, ce qui permet d'estimer dans un sous-ensemble statistiquement valide des sections 4 . Pour obtenir un nombre approprié de sections et de sondes de comptage, nous appliquons SURS, ce qui réduit la variance par rapport à l'échantillonnage aléatoire 8 . En outre, SURS garantit que les particules d'intérêt dans la structure sont échantillonnées avec les mêmes probabilités, indépendamment de leur taille, leur forme, leur orientation et leur répartition dans la structure. En tant que telle, la stéréologie doit être fortement recommandée lorsque l'on obtient des estimations précises et impartiales est un aspect central du projet.
Disclosures
Les auteurs n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions Susanne Sørensen pour l'assistance technique habile. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Velux; La fondation Jascha; Fondation Aase et Ejnar Danielsens; Hartmann Brothers Foundation; Directeur Jacob Madsen et Fondation Olga Madsens; Docteur Sofus Carl Emil Friis et femme Doris Friis 'Trust; La fondation de 1870; Fondation Torben et Alice Frimodts et Fondation pour la recherche neurologique. L'édition de manuscrit a été effectuée par Inglewood Biomedical Editing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 5'-bromo-2'deoxyuridine - BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
| Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
| Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
| dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
| Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
| Ethanol - 70 % | Plum A/S | 201098 | |
| Ethanol - 96 % | Plum A/S | 201104 | |
| Ethanol - 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
| Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
| H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
| HCl | J. T. Baker | 6081 | |
| Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
| Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
| PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
| PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
| Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
| Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
| Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
| Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
| Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
| Xylene | VWR | 28,973,363 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cover slips | Menzel-Gläser | 24x50 mm #0 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
| Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Microscope camera | Olympus | DP72 | |
| Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
| Motorized stage | Prior | H101A | |
| Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
| New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
| Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
| Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
| Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
| Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
| Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
| Slide rack | Sakura | 4465 | |
| Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
| Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
| Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |
References
- Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. Design-based stereology: Introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number. Toxicol. Pathol. 38 (7), 1011-1025 (2010).
- West, M. J. Introduction to stereology. 2012 (8), Cold Spring Harb. Protoc. 843-851 (2012).
- West, M. J. Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: issues of precision and bias. Trends Neurosci. 22 (2), 51-61 (1999).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J. Microsc. 147 (Pt 3), 229-263 (1987).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat. Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kaae, S. S., Chen, F., Wegener, G., Madsen, T. M., Nyengaard, J. R. Quantitative hippocampal structural changes following electroconvulsive seizure treatment in a rat model of depression. Synapse. 66 (8), 667-676 (2012).
- Chen, F., Madsen, T. M., Wegener, G., Nyengaard, J. R. Repeated electroconvulsive seizures increase the total number of synapses in adult male rat hippocampus. Eur Neuropsychopharmacol. 19 (5), 329-338 (2009).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. V., Kiëu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology - reconsidered. J.Microsc. 193 (3), 199-211 (1999).
- West, M. J. Design based stereological methods for estimating the total number of objects in histological material. Folia Morphol.(Warsz). 60 (1), 11-19 (2001).
- Olesen, M. V., Wörtwein, G., Pakkenberg, B. Electroconvulsive stimulation, but not chronic restraint stress, causes structural alterations in adult rat hippocampus - a stereological study. Hippocampus. 25 (1), 72-80 (2015).
- Olesen, M. V., Wortwein, G., Folke, J., Pakkenberg, B. Electroconvulsive stimulation results in long-term survival of newly generated hippocampal neurons in rats. Hippocampus. 27 (1), 52-60 (2017).
- Madsen, T. M., et al. Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy. Biol Psychiat. 47 (12), 1043-1049 (2000).
- Cameron, H. A., Mckay, R. D. G. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J.Comp. Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
- Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size. J.Microsc. 204 (3), 232-246 (2001).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Recommendations for straightforward and rigorous methods of counting neurons based on a computer simulation approach. J Chem. Neuroanat. 20 (1), 93-114 (2000).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 2nd edn, Academic Press. Sydney. (1986).
- Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice. Development. 130 (2), 391-399 (2003).
- Fabricius, K., Wortwein, G., Pakkenberg, B. The impact of maternal separation on adult mouse behaviour and on the total neuron number in the mouse hippocampus. Brain Struct. Funct. 212 (5), 403-416 (2008).
- Dorph-Petersen, K. A., et al. Volume and neuron number of the lateral geniculate nucleus in schizophrenia and mood disorders. Acta neuropathologica. 117 (4), 369-384 (2009).
- Eriksen, N., et al. Application of stereological estimates in patients with severe head injuries using CT and MR scanning images. Br. J. Radiol. 83 (988), 307-317 (2010).
- Gundersen, H. J. Stereology: the fast lane between neuroanatomy and brain function--or still only a tightrope? Acta Neurol. Scand. Suppl. 137, 8-13 (1992).
