Summary
Hier stellen wir eine stereologische Methode vor, die optische Fraktionierung, die zur Quantifizierung der Bildung neuer Neuronen und ihres Überlebens im Rattenhippocampus nach der elektrokonvulsiven Stimulation verwendet wird. Bei korrekter Umsetzung gewährleistet die Empfindlichkeit und Effizienz von stereologischen Methoden genaue Schätzungen mit einer festen und vorgegebenen Präzision.
Abstract
Stereologische Methoden sind entworfen, um quantitative Parameter zu beschreiben, ohne Annahmen über Größe, Form, Orientierung und Verteilung von Zellen oder Strukturen zu machen. Diese Methoden sind revolutionär für die quantitative Analyse des Säugetier-Gehirns, in denen volumetrische Zellpopulationen zu hoch sind, um manuell zu zählen, und Stereologie ist nun die Technik der Wahl, wenn Schätzungen von dreidimensionalen Mengen aus Messungen auf zweidimensionalen extrahiert werden müssen Abschnitte Alle stereologischen Methoden sind grundsätzlich unvoreingenommen; Sie beruhen jedoch auf dem richtigen Wissen über die Struktur des Interesses und die Eigenschaften des Gewebes. Stereologie basiert auf systematischer gleichmäßiger Stichprobe (SURS), mit der Anpassung der Probenahme auf das effizienteste Niveau in Bezug auf Präzision und liefert zuverlässige, quantitative Informationen über die gesamte Struktur von Interesse. Hier stellen wir den optischen Fraktionierer in Verbindung mit der BrdU Immunhistochemie t vorO schätzen die Produktion und das Überleben von neu gebildeten Neuronen in der Körnchenzellschicht (einschließlich der subkörnigen Zone) des Rattenhippocampus nach der elektrokonvulsiven Stimulation, die zu den stärksten Stimulatoren der Neurogenese gehört. Die optische Fraktionierungstechnik ist so ausgelegt, dass sie Schätzungen der Gesamtzahl der Zellen aus dicken Abschnitten liefert, die aus der Vollstruktur abgetastet wurden. Dichte Abschnitte bieten die Möglichkeit, Zellen in ihrer vollen 3-D-Ausdehnung zu beobachten und somit eine einfache und robuste Zellklassifizierung auf der Grundlage morphologischer Kriterien zu ermöglichen. Bei korrekter Umsetzung liefert die Empfindlichkeit und Effizienz des optischen Fraktionators genaue Schätzungen mit einer festen und vorgegebenen Präzision.
Introduction
Die Quantifizierung von Zellen in einer dreidimensionalen (3-D) -Struktur kann das Erhalten von Schätzungen auf der Grundlage von unvoreingenommenen Prinzipien erfordern. Noch heute verwenden Studien häufig zweidimensionale (2-D) Methoden, um Daten von 3-D-Strukturen zu melden. Diese Verfahren berücksichtigen jedoch nicht die heterogene Natur der Struktur hinsichtlich der Form und Verteilung der Zellen, was zu methodischen Einschränkungen führt; Sie nehmen Annahmen über die 3-D-Struktur von Interesse und die Ergebnisse beziehen sich nicht auf die gesamte Struktur. Diese Einschränkungen reduzieren die Empfindlichkeit und Genauigkeit der Methoden sowie erhöhen das Risiko von Fehlern 1 .
Bias in der Zellzählung kann durch die Anwendung der designbasierten Stereologie vermieden werden, was von allgemeiner Bedeutung ist, um quantitative Informationen über die Anzahl der Zellen in einem gegebenen Gewebe oder einer Struktur zu erhalten. Während Stereologie früher eine sehr zeitaufwändige Methode war, Fortschritte in Prozeduren, weichWare und Imaging, hat es viel effizienter und weit verbreitet. Stereologie beinhaltet statistische Stichprobenprinzipien und stochastische geometrische Theorie, um effiziente Werkzeuge zur Schätzung von Volumen, Fläche, Länge und Anzahl von Objekten in einer 3D-Struktur durch Probenahme in 2-D-Abschnitten 2 bereitzustellen. So erlaubt die Stereologie, objektive, quantitative Daten über strukturelle Veränderungen in Gewebeschnitten zu erhalten, die durchschnittliche Schätzungen der wahren Zahlen ohne erschöpfende Analyse ergeben. Stereologie ist definiert als die statistische Schlussfolgerung von geometrischen Parametern aus abgetasteten Informationen. Dies kann durch eine unvoreingenommene Abtastung, dh systematische Stichproben, von Abschnitten sowie Zählregeln erreicht werden, die sicherstellen, dass alle Objekte gleiche Wahrscheinlichkeiten haben, gezählt zu werden 3 . Während stereologische Ergebnisse unterschiedliche Grade der Genauigkeit haben können, wie durch den Fehlerkoeffizienten (CE) angegeben, kann dies ad seinUm die inhärente biologische Varianz (Variationskoeffizient (CV)) anzupassen, indem man die Menge der Probenahme nach Bedarf 4 , 5 anpasst. Einige frühere stereologische Studien haben die kurzfristigen Effekte der elektrokonvulsiven Stimulation (ECS) auf die hippocampale Plastizität bei Nagetieren 6,7 untersucht . Daten aus diesen Studien zeigen eine anfängliche Zunahme der Gesamtzahl der Neuronen sowie erhöhte synaptische Differenzierung nach wiederholtem ECS. Allerdings schätzen diese Studien die Neurogenese nicht direkt, da sie keine spezifischen Marker für die Zellproliferation verwenden.
Hier stellen wir eine Anwendung eines stereologischen Verfahrens, der optischen Fraktionatortechnik 8 , 9 , zur Quantifizierung der Gesamtzahl der neu gebildeten Neuronen in der Ratten-Hippocampus-Granulatzellschicht (GCL) einschließlich der Subkörnchenzone (SGZ) vor Als ihre langfristigen sUrvival 10 , 11 Wir haben Ratten einem klinisch relevanten Zeitplan von ECS (dreimal pro Woche für 3 Wochen) unterzogen, was einer der stärksten Stimulatoren der Neurogenese ist 12 . Kontrolltiere wurden nach dem gleichen Verfahren behandelt, aber ohne Strom zu überschreiten. Bei jedem der 21 Tage des Experimentierens wurden alle Ratten intraperitoneal mit 5-Brom-2-deoxyuridin (BrdU) injiziert, das anstelle von Thymidin während der Zellteilung 13 in die DNA eindringt. Nach dem Experimentieren wurden die Ratten für vier verschiedene Zeiträume (24 Stunden, 3 Monate, 6 Monate und 12 Monate) aufrechterhalten. Unter Verwendung des Fraktionierprinzips erhielten wir eine bekannte Fraktion des Hippocampus durch eine gleichmäßige Zufallsabtastung von Abschnitten und applizierte optische Sektoren (3-D-Sonden) an die abgetasteten und immunfärbten dicken Gewebeschnitten. Es wird besonders darauf hingewiesen, dass gefrorene Abschnitte in der z-Achse während des Prozesses üblicherweise zusammenfallenUnd dass optische Sektoren, die auf der nummergewichteten mittleren Schnittdicke basieren, in diesem speziellen Fall verwendet werden sollten 14 . Als die Brennebene der optischen Erkrankungen eine bekannte Distanz durch den Abschnitt verschoben wurde, wurden BrdU-positive Neuronen gezählt, als ihr Merkmal von Interesse deutlich erkannt wurde. Auf dem Gebiet der Stereologie gibt es eine Debatte über die Gesamtzahl der Teilchen, die gezählt werden sollten 15 ; Typischerweise werden 150-200 Neuronen in der Struktur von Interesse gezählt, um eine ausreichende Genauigkeit zu erhalten, dh einen Koeffizienten von 7-8% 8 . Die BrdU-positiven neuronalen Zählungen wurden mit stereologischer Software mit Imaging durch ein mit der Kamera ausgerüstetes Standardmikroskop und die folgenden Ziele vervollständigt: 2X, 4X und 10X sowie ein 100faches Öl-Immersions-Objektiv (numerische Blende = 1,40) und eine motorisierte Bühne . Bewegungen in der z-Richtung wurden mit einem digitalen Mikrocator gemessen. Die endgültige VergrößerungWar 3000x.
Protocol
Alle Tierverfahren wurden nach den Richtlinien der dänischen Tierversuchsinspektion durchgeführt und vom örtlichen Ethikausschuss für Experimentelle Tiere genehmigt.
1. Gewebeverarbeitung
ANMERKUNG: Nach der transkardialen Perfusion und nach der Fixierung in 4% Paraformaldehyd (PFA), verdünnt in 0,2 M Phosphatpuffer über Nacht bei 4 ° C, werden die Gehirne für 30 Tage bei 4 ° C auf 30% Saccharose in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) überführt. Danach werden die Gehirne auf pulverisiertem Trockeneis eingefroren und bei -80 ° C bis zum Schneiden gelagert.
- Trennen Sie die rechten und linken Hemisphären entlang der Mittellinie des Gehirns mit einem Skalpell und wählen Sie dann eine oder andere Hemisphäre zufällig im ersten Gehirn, danach verschieben Sie systematisch zwischen der rechten und linken Hemisphäre ( Abbildung 1A ). Montieren Sie die abgetastete Halbkugel auf eine Probenscheibe mit der langen Achse senkrecht zur ScheibeMit einem Montagemedium.
- Platzieren Sie Multidish-Container für die Vorkühlung im Kryostaten.
- Montieren Sie die Probenscheibe in den Kryostaten und schneiden Sie die Gesamtheit des Hippocampus (Bregma 1.80 bis - 7.04 16 ) in 80 μm dicke Abschnitte in der koronalen Ebene ( Abbildung 1B ).
- Legen Sie alle abgetasteten Abschnitte nacheinander in die gekühlten Multidish-Behälter, um sicherzustellen, dass die Abschnitte in Schneidreihen gehalten werden.
- Decken Sie die Abschnitte vollständig mit Kryoschutzmittel ab und halten Sie die Behälter bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung.
2. Immunfärbung
HINWEIS: Um die einzelnen Abschnitte während des gesamten Färbeverfahrens zu verfolgen, legen Sie die abgetasteten Abschnitte in 25-Well-Färbungsnetze. Verwenden Sie jeden 5. Abschnitt, wobei eine mittlere Endzahl von 12 (8-16) Abschnitten pro Hippocampus für die Immunfärbung und die anschließende Zellzählung gegeben wird.
- Vor der Unterabtastung jedes n- ten Abschnitts mit einem zufälligen Start zwischen Abschnitt 1 und Abschnitt n ( Bild 1C ) die Behälter von -20 ° C auf Raumtemperatur (RT) übertragen.
- Benutzen Sie zB einen Pinsel, um die Abschnitte in numerischer Reihenfolge auf die 25-Well-Färbnetze zu übertragen, die in mit PBS gefüllten Petrischalen platziert wurden.
HINWEIS: Von diesem Punkt aus halten Sie die Abschnitte in den Färbungsnetzen, die in passende Glasschalen auf einem Orbitalschüttler platziert sind (Abschnitt 2.3 bis 2.9). - Übertragen Sie die Färbnetze auf die passenden Glasschalen und waschen Sie die Abschnitte zweimal für 10 min in PBS bei RT vor der Inkubation in 3% Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ), verdünnt in destilliertem Wasser (dH 2 O) für 20 min.
- Übertragen Sie die Abschnitte auf 10 verschiedene Lösungen von Salzsäure (HCl) (1 M bei 0 ° C für 10 min, 2 M bei RT für 10 min und 2 M bei 37 ° C für 20 min) vor der Neutralisation in 0,1 M Natriumtetraborat einT RT für 20 min.
- Nach 3 x 10 min Inkubationen in 1% Triton X-100, verdünnt in PBS (Waschpuffer), übergeben Sie die Sektionen auf Waschpuffer mit 10% fötalem Rinderserum (Blockierungslösung) für 1 h bei RT.
- Inkubieren Sie die Sektionen für 48 h bei 4 ° C in Maus-anti-BrdU verdünnt 1: 100 in Blockierungslösung.
- Die Abschnitte 3 × 10 min in Waschpuffer waschen und 48 h in Rettich-Peroxidase inkubieren, die 1:10 in Waschpuffer verdünnt ist.
- Übertragen Sie die Abschnitte auf PBS für 5 × 10 min und dann für 7 min in 0,01% Diamininobenzidin (DAB), verdünnt in PBS, bevor sie auf eine ähnliche DAB-Lösung, die 0,02% H 2 O 2 enthält, für 10 min bei RT übertragen wird.
- Füllen Sie eine Reihe von Waschungen (2 × 10 min in PBS und 2 × 10 min in Phosphatpuffer ohne Zusatz von Natriumchlorid) und montieren Sie die Abschnitte in numerischer Reihenfolge auf Objektträgern.
- Die Abschnitte für ca. 30 min vor der Gegenfärbung mit Cresyl abtrocknenviolett.
- Legen Sie die Objektträger in einen Dia-Rack.
- Rehydrieren Sie die Abschnitte für 10 min in Gleitfärbebecher, die dH 2 O enthalten, und überführen Sie dann die Folien auf 0,02% Cresylviolett in dH 2 O für 15 min.
- Wiederholen Sie Schritt 2.12, bevor die Abschnitte dreimal in Ethanol dehydratisiert werden (96% für 5 min und 99% für 2 × 2 min).
- Legen Sie die Abschnitte in Xylol für 2 × 15 min und decken Sie die Folien mit einem schnell trocknenden Medium für die Montage.
- Schließlich lassen Sie die Deckelschieber für ca. 24 Stunden, bevor sie für die Mikroskopie verwendet werden können.
3. Schätzung der Gesamtzahl der BrdU-markierten Neuronen mit dem optischen Fraktionierer
HINWEIS: Eine Pilotstudie mit wenigen Tieren durchführen, um die optimalen Probenahmeparameter zu bestimmen, wie die Anzahl der zu analysierenden Sektionen und die Anzahl der optischen Sektoren in den abgetasteten Abschnitten. Dieser Pilot bietet auch eineVorläufiger Lebenslauf (Standardabweichung / Mittelwert) und die Möglichkeit, das CE einzustellen (siehe Abschnitt 3.9.3), um eine zufriedenstellende Genauigkeit der vom Ermittler ermittelten Schätzungen zu erhalten (nähere Einzelheiten siehe unten). Ebenso führen wir eine z-Verteilungsanalyse durch, um die folgenden Punkte zu adressieren: Schrumpfen des Gewebes, Qualität der Färbung im gesamten Schnitt und Verteilung der Zellen in der z-Achse 14 .
- Überprüfen Sie die Dicke des Gewebes in den Abschnitten, um zu bestätigen, dass sie für die Verwendung des optischen Fraktionators geeignet sind, z. B. ist dick genug für die gewählte Schnarchenhöhe einschließlich Schutzzonen (siehe unten). ANMERKUNG: Die Gewebedicke ist an mehreren Stellen innerhalb des interessierenden Bereichs.
- Legen Sie die Folien auf die motorisierte Bühne des Mikroskops und schalten Sie die bevorzugte stereologische Software ein.
- Abgrenzung des Bereichs von Interesse mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung (2X oder 4X) vor dem Wechsel zu einem 100X-Öl-ImmErsion Ziel (siehe Abbildung 2A ).
- Wenn Sie einen bestimmten Punkt eines Zählrahmens ( z. B. an oder neben einer Ecke) verwenden, suchen Sie die Oberseite des Abschnitts, indem Sie sich entlang der Brennebene bewegen, bis ein Merkmal des Abschnitts im Fokus erscheint. Registrieren Sie diese z-Position als 0 (siehe Abbildung 2B ).
- Bewegen Sie die Brennebene nach unten durch das Gewebe, bis der gleiche spezifische Punkt des Zählrahmens auf dem letzten Z-Niveau des Gewebes im Fokus ist und markieren Sie diese Position. Die lokale Gewebedicke ist von 0 bis zu diesem Endpunkt definiert und kann auf der z-Achse gelesen werden. Registrieren Sie die Gewebedicke (siehe Abbildung 2B ).
- Dokument volle Penetration der Fleck und Verteilung der Zellen in der vollen Dicke des Abschnitts.
HINWEIS: Die Verteilung von BrdU-markierten Neuronen dient als Leitfaden zur Bestimmung der erforderlichen Schutzzonen. Obwohl eine gleichmäßige Verteilung der Zellen kritisch ist, ist esIst akzeptabel, um weniger Zellen in der Nähe von Ober- und Unterseite des Abschnitts zu beobachten, was die Wirkung von verlorenen Kappen anzeigt (weitere Details siehe Dorph-Petersen et al., 2009).- Probe BrdU-markierte Neuronen und registrieren ihre z-Position zusammen mit der lokalen Schnittdicke, die in der ausgewählten Ecke jedes Zählrahmens gemessen wird.
- Zeichnen Sie die Anzahl der BrdU-positiven Neuronen als Funktion ihrer z-Position auf.
- Fixieren Sie die Höhe der Sektoren und Schutzzonen auf der Grundlage der mittleren Schnittdicke und der Zellverteilung (siehe 3.1 und 3.2).
HINWEIS: Die Höhe des Schwures sollte kleiner sein als die Schnittdicke, um Artefakte in der Nähe der Oberflächen zu vermeiden. Dieses Risiko wird umgangen, indem Schutzzonen an der Oberseite und Unterseite des Abschnitts angebracht werden. - Bestimmen Sie die Schrittlänge zwischen den Krankheiten.
- Abgrenzung der Region von Interesse auf alle zu analysierenden Abschnitte und registrieren die Bereiche.
- Summe diese Bereiche und teile dann bY die Zahl der in diesem Bereich zu platzierenden Krankheiten
ANMERKUNG: Basierend auf früheren Erfahrungen bringt ein guter Ausgangspunkt 75 Sonden mit sich. Dies wird eine Annäherung der Fläche und der entsprechenden Stichprobenpositionen (ein Schritt ) (für weitere Details siehe Westen, 2012). - Nimm die Quadratwurzel von A Schritt , die die Xy-Schritt-Größe zur Verfügung stellt.
- Bestimmen Sie die Größe des Zählrahmens.
- Stellen Sie die Größe des Zählrahmens auf eine beliebige Einheit ein und führen Sie eine Pilotprobe von BrdU-positiven Neuronen mit den in Abschnitt 3.3 und 3.4 erhaltenen Parametern durch.
ANMERKUNG: Die Größe muss empirisch durch Versuch und Irrtum bestimmt werden, aber es wird empfohlen, dass es angepasst wird, um die Probenahme von 2-3 Zellen pro Krankheiten 8 zu ermöglichen .
- Stellen Sie die Größe des Zählrahmens auf eine beliebige Einheit ein und führen Sie eine Pilotprobe von BrdU-positiven Neuronen mit den in Abschnitt 3.3 und 3.4 erhaltenen Parametern durch.
- Nach diesem letzten Schritt der Pilotstudie beginnen die Zellproben
HINWEIS: Die erhaltenen Stichprobenparameter sollten zu Zählungen von etwa 150-200 Zellen führenN jedes Tieres, das ausreicht, um ein effizientes stereologisches Design zu erhalten 8 . - Zählen Sie die BrdU-positiven Neuronen mit einem 100 × Öl-Immersion Ziel und eine endgültige Vergrößerung von 2000-3000 ×. In jedem optischen Krankheiten identifizieren Sie alle BrdU-markierten Neuronen, die eindeutig durch das Merkmal von Interesse erkannt werden (in der vorliegenden Studie ist das Kriterium, wenn die Vorderkante des BrdU-markierten Neurons zum ersten Mal in den Fokus kommt) Innerhalb des Zählrahmens oder berühren die Einschlusslinien ( Bild 2B ). Zählen Sie nicht die BrdU-positiven Neuronen, die, wenn sie durch das Merkmal des Interesses innerhalb der Schwerehöhe deutlich erkannt werden, die Ausschlusslinien berühren. Es ist von entscheidender Bedeutung, diese Zählregeln während der gesamten stereologischen Quantifizierung sorgfältig zu verfolgen.
HINWEIS: Da BrdU in alle teilenden Zellen integriert ist, wird die Morphologie verwendet, um zwischen Neuronen und anderen Zelltypen zu unterscheiden. NeuRon Eigenschaften sind ein klar definierter Kern mit einem neutralen Zytoplasma und einem dunklen Nukleolus. BrdU-positive Zellen werden als neugebildete Neuronen aufgrund ihrer relativ größeren Größe im Vergleich zu Gliazellen erkannt. Es sollte erwähnt werden, dass bei Studien mit kurzfristiger Proliferation (zB <24 h) eine Doppelfärbung mit unreifen neuronalen Markern eine Voraussetzung sein kann. - Schätzen Sie die Gesamtzahl der BrdU-positiven Neuronen in jedem Gehirn durch Multiplikation der Gesamtzahl der gezählten Zellen (Σ Q - ) mit den reziproken Stichprobenfraktionen:
zum
woher
Q- ist die nummergewichtete mittlere Schnittdicke, h ist die Höhe des Sektors, asf ist die Flächenmusterfraktion, ssf ist der Abschnitt sAmplitudenfraktion und t i ist die Schnittdicke im i- ten Zählrahmen mit einer Zellzahl von 
Im Schwarzen 14 , 18 . - Berechnen Sie den Fehlerkoeffizienten (CE) 8, der die Stichprobenabweichung von BrdU-positiven Neuronen in systematischer gleichmäßiger Stichprobe (SURS) ist.
- Zuerst berechnen Sie das Rauschen , das gleich der Gesamtzahl der BrdU-positiven Neuronen ist:
- Als nächstes berechnen Sie die Varianz in SURS:
HINWEIS: Wir haben beurteilt, dass die Fläche und die Zelle im Hippocampus reibungslos von Abschnitt zu Abschnitt und folglich verwendet "Glätte Klasse" m = 1 (1/240) 8 , 19
woher
P i ist die Anzahl der Punkte, die für das Objekt im i- ten Abschnitt gezählt werden, und n die Anzahl der Abschnitte 4 , 20 ist . - Schließlich berechnen Sie das CE der Schätzung:
HINWEIS: Im Allgemeinen wird eine optimale Präzision typischerweise erreicht, wenn der CE-Wert weniger als die Hälfte des beobachteten CV beträgt, da OCV 2 = ICV 2 + CE 2 , wobei OCV der beobachtete CV ist und ICV der inhärente CV 4 ist .
- Zuerst berechnen Sie das Rauschen , das gleich der Gesamtzahl der BrdU-positiven Neuronen ist:
Q- ist die nummergewichtete mittlere Schnittdicke, h ist die Höhe des Sektors, asf ist die Flächenmusterfraktion, ssf ist der Abschnitt sAmplitudenfraktion und t i ist die Schnittdicke im i- ten Zählrahmen mit einer Zellzahl von 
Im Schwarzen 14 , 18 . 
FIgure 1: Schematische Darstellung der Gewebeverarbeitung nach den in der vorliegenden Studie verwendeten Fraktionierprinzipien.
Nach dem Experimentieren werden die Hemisphären getrennt und die rechte oder linke Halbkugel systematisch und zufällig (A) ausgewählt. Das gesamte Hirn, das sich über den gesamten Hippocampus erstreckt, wird in 80-μm-dicke koronale Abschnitte (B) geschnitten, woraufhin jeder 5. Abschnitt unterabgetastet wird, beginnend zufällig zwischen Abschnitt 1 bis 5, zur endgültigen Immunfärbung und stereologischen Quantifizierung (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Abbildung, die das stereologische Probenahmeverfahren mit optischen Krankheiten zeigt.
(A) Nach der histologischen Verarbeitung der hIppocampal GCL / SGZ wurde abgegrenzt und optische Krankheiten angewendet gleichmäßig und zufällig über die Region. (B) Bei den optischen Krankheiten (links) wurden die BrdU-positiven Neuronen nur gezählt, wenn ihr Merkmal von Interesse innerhalb der Grabhöhe deutlich erkannt und innerhalb des Zählrahmens angeordnet war oder die Einschlusslinie (rechts) berührte. Neuronen, die die Ausschlusslinie berührten, wurden nicht gezählt. Maßstäbe = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Representative Results
Probenahmeparameter
Durch die Analyse der z-Verteilung in einer Pilotstudie ( Abbildung 3 ) fanden wir eine einheitliche Verteilung der BrdU-positiven Neuronen in der Grausamkeitshöhe. Die Schrumpfung der Sektionen wurde gemessen; Die endgültige mittlere Dicke betrug 26,4 μm (19,0-32,0 μm) in Abschnitten, die ursprünglich bei 80 μm geschnitten wurden. Basierend auf der Gewebedicke und der Verteilung von BrdU-markierten Neuronen wurde die Grabhöhe auf 10 & mgr; m eingestellt, und die Schutzzonen am oberen und unteren Ende des Abschnitts wurden auf 5 & mgr; m bzw. 4 & ndash; 17 & mgr; m eingestellt. Abhängig von der Dichte der Zellen betrug die Fläche der Zählrahmen 1414 oder 5210 μm 2 . Die Schrittlänge betrug 220 & mgr; m sowohl in der x- als auch in der y-Richtung, und die Zellzählung wurde in einem Durchschnitt von 12 (Bereich 8-16) Abschnitten pro Tier durchgeführt. Diese Abtastparameter führten zu einem Mittelwert von 133 (Bereich 33-372) BrdU-positive Zellen, die in 173 (107-204) Krankheiten in jeder Hirnhemisphäre gezählt wurden.
Als Beispiel erhielten wir die folgenden CV- und CE-Werte für BrdU-positive neuronale Schätzungen bei ECS-behandelten Ratten: 24 Stunden: CV = 0,59, CE = 0,11; 3 Monate: CV = 0,34, CE = 0,12; 6 Monate: CV = 0,43, CE = 0,09; 12 Monate: CV = 0,22, CE = 0,09.
Wir quantifizierten die Gesamtzahl der neu gebildeten Neuronen und deren Langzeitüberleben im Rattenhippocampus nach ECS unter Verwendung des optischen Fraktionators in Verbindung mit einer BrdU-Färbetechnik 10 , 11 . Die endgültigen Ergebnisse zeigten eine basale Neurogenese in den vier Gruppen von Kontrolltieren, die sich nicht signifikant in Abhängigkeit von der Überlebenszeit unterscheiden ( Abbildung 3 ). Darüber hinaus induzierte die ECS eine signifikante Erhöhung der Gesamtzahl der BrdU-positiven Neuronen bei 24Stunden (259%, p <0,0001), 3 (229%, p <0,001), 6 (152%, p <0,05) und 12 Monate (162%, p <0,05) nach dem Experimentieren im Vergleich zu Kontrolltieren.
Abbildung 3: Quantitative Daten der Gesamtzahl der BrdU-positiven Neuronen im GCL / SGZ des Ratten-Hippocampus 10 , 11 .
Horizontale Balken stellen die Mittelwerte dar. Abkürzungen: GCL, Granulatzellschicht; SGZ, subkörnige Zone; H, stunden; M, Monate. **** p <0,0001, *** p <0,001 und * p <0,05 gegenüber der Kontrolle (n = 11-12 pro Gruppe). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
Mit ECS als Methodik zur Neurogenese zu induzieren, finden wir einen sofortigen Anstieg von 260% bei der Bildung neuer BrdU-positiver Neuronen im Hippocampus. In diesem Pool von akut erzeugten Neuronen fanden wir 40% Abrieb von Tag 1 bis drei Monaten, wobei fast 50% der neu gebildeten Neuronen mindestens 12 Monate nach der Behandlung 10 , 11 überleben. Das Zählen von BrdU-markierten Neuronen folgte einem strengen Probenahme-Schema, wobei der gesamte Hippocampus in 80-μm-dicke Abschnitte geschnitten wurde, gefolgt von einer Unterabtastung jedes fünften Abschnitts mit einem zufälligen Stichprobenanfang zwischen dem ersten und dem fünften Abschnitt. Die Bereitstellung dieser Abschnitte wird systematisch zufällig gewählt, dies ist nachweislich eine hervorragende Methode, um die Varianz des Endergebnisses ohne erschöpfendes Zählen zu reduzieren. Dieses Stichprobenverfahren erlaubte uns, BrdU-positive Neuronen in einem Durchschnitt von 12 (8-16) Hippocamp zu zählenAl Abschnitte in jedem Rattenhirn, mit einer endgültigen Präzision von 9-11%.
Bei der Verwendung des Fraktionierverfahrens ist es notwendig, den Bruchteil der Querschnittshöhe zu kennen, in der das Zählen durchgeführt wird, da während der histologischen Verarbeitung häufig Gewebeschrumpfung und -verformung auftreten. In der Tat sahen wir in dieser Studie erhebliche Schrumpfung der Dicke. Weiterhin ist anzumerken, dass eine differentielle Gewebeschrumpfung auftreten kann, wie sie in Dorph-Petersen et al. 2001. Solange jedoch die vollständige Struktur von Interesse für die Analyse zur Verfügung steht, führen diese Einschränkungen nicht zu einer Vorspannung der Gesamtzahl der Teilchen, dh BrdU-positiven Neuronen. In Studien, in denen Gewebeschrumpfung ein besonderes Thema ist, sollte immer gesagt werden, dass die Ergebnisse in deformiertem Gewebe erhalten werden. In dieser Studie zählten wir in einer Störungshöhe von 10 μm. Die Abschnitte der vorliegenden Studie hatten eine endgültige mittlere Dicke von 26 μm, eine 5 μmSchutzzone an der Oberseite und eine 11 μm (mittlere) Schutzzone am Boden des Abschnitts. Diese Parameter sind akzeptabel, da die Schutzzonen etwa der Durchmesser der abgetasteten Partikel sein sollten.
Nach der Abgrenzung des GCL / SGZ wurden die Ärzte gleichmäßig zufällig in den abgegrenzten Bereich versetzt. Die Schmerzen sollten mit einer festen Schrittlänge positioniert werden, die die Probenahme und das Zählen optimiert, um Schätzungen mit einer vom Forscher bestimmten Präzision effizient zu erhalten. Eine optimale Präzision wird typischerweise durch Zählen von bis zu 150-200 Zellen in jeder interessierenden Struktur 5 erreicht . In der vorliegenden Studie zählten wir einen Mittelwert von 133 (Bereich 33-372) BrdU-positiven Neuronen in jedem Ratten-Hippocampus. Aufgrund einer niedrigen Zellzahl in einigen der Kontrolltiere fielen unsere Zählungen von BrdU-positiven Neuronen unter die allgemein akzeptable Anzahl von Zellen, die erforderlich waren, um eine geeignete Präzision zu erhalten, was zu relativ hohen CE-Werten für diese Fälle führte. HOwever, da wir CE-Werte von weniger als der Hälfte der CV-Werte erhielten (siehe repräsentative Ergebnis-Sektion), wurden zusätzliche Probenahme und Zählung nicht benötigt. Die hohen CV-Werte zeigen, dass der größte Beitrag zur beobachteten Variation aus der biologischen Variation entspringt. In der Tat könnten wir behaupten, dass die durchschnittliche Anzahl der BrdU-positiven Neuronen, die in der vorliegenden Studie gezählt wurden, höher war als notwendig. Zum Beispiel erreichten wir in einer Gruppe von Ratten einen CE-Wert von 9% und beobachteten einen CV-Wert von 43%. In diesem speziellen Fall hätten wir eine Präzision von etwa 20% anstreben können. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Genauigkeit der Gesamtzahl der BrdU-positiven Neuronen in der vorliegenden Studie ausreichend ist, da sie reale Behandlungswirkungen auf die wahre Anzahl von Partikeln einfängt. Wegen der ziemlich großen biologischen Variation bei bestimmten Gruppen von Tieren konnten die gleichen Schätzungen mit einer akzeptablen Präzision erhalten werden, trotz weniger Aufwand an Aufwand. Hohe biologische Abweichungen innerhalb der Gruppen können nurDurch die Erhöhung der Zahl der Tiere kompensiert werden.
Man könnte argumentieren, dass der Goldstandard für die Erlangung genauer Zellzahlen eine abschließende Zählung aller interessanten Objekte mit sich bringt. Allerdings ist in den meisten Studien des Gehirns dies keine Möglichkeit aufgrund der großen Anzahl von Zellen. Obwohl viel effizienter als eine abschließende Zellzählung ist, ist der optionale Fraktionierer relativ zeitaufwendig im Vergleich zu einem einfachen Screening von Unterschieden in Zellzahlen, was bevorzugt ist, wenn die genaue Anzahl von Zellen nicht wesentlich ist. Es ist unsere Erfahrung, dass Unterschiede von mehr als 20-30% nur durch Screening-Verfahren erkannt werden können.
Wenn sie korrekt durchgeführt wird, liefert die Probenahme mit der designbasierten Stereologie in einer effizienten Weise unvoreingenommene und präzise Schätzungen. Die objektive Eigenschaft der Stereologie erzeugt Schätzungen, die, wenn sie repliziert werden, die wahren Populationsmittel annähern und die Reproduzierbarkeit derSchätzung 21 Zunächst muss eine repräsentative Stichprobe der gesamten interessierenden Struktur (in dieser Studie der Hippocampal GCL / SGZ) erhalten werden, die eine Schätzung in einer statistisch gültigen Teilmenge der Abschnitte 4 ermöglicht . Um eine entsprechende Anzahl von Abschnitten und Zählsonden zu erhalten, wenden wir SURS an, was die Varianz im Vergleich zur Stichprobe 8 reduziert. Darüber hinaus sorgt SURS dafür, dass die interessierenden Partikel innerhalb der Struktur mit den gleichen Wahrscheinlichkeiten unabhängig von ihrer Größe, Form, Orientierung und Verteilung in der Struktur abgetastet werden. Als solche Stereologie ist sehr zu empfehlen, wenn genaue und unvoreingenommene Schätzungen ist ein zentraler Aspekt des Projekts.
Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Wir danken Susanne Sørensen für die geschickte technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Velux-Stiftung unterstützt; Die Jascha-Stiftung; Aase und Ejnar Danielsens Stiftung; Hartmann-Brüder-Stiftung; Direktor Jacob Madsen und Frau Olga Madsens Stiftung; Doktor Sofus Carl Emil Friis und Frau Doris Friis 'Vertrauen; Die Stiftung von 1870; Torben und Alice Frimodts Foundation und die Stiftung für Neurologische Forschung. Manuskriptbearbeitung wurde von Inglewood Biomedical Editing durchgeführt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 5'-bromo-2'deoxyuridine - BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
| Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
| Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
| dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
| Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
| Ethanol - 70 % | Plum A/S | 201098 | |
| Ethanol - 96 % | Plum A/S | 201104 | |
| Ethanol - 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
| Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
| H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
| HCl | J. T. Baker | 6081 | |
| Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
| Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
| PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
| PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
| Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
| Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
| Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
| Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
| Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
| Xylene | VWR | 28,973,363 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cover slips | Menzel-Gläser | 24x50 mm #0 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
| Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Microscope camera | Olympus | DP72 | |
| Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
| Motorized stage | Prior | H101A | |
| Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
| New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
| Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
| Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
| Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
| Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
| Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
| Slide rack | Sakura | 4465 | |
| Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
| Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
| Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |
References
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