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Neuroscience

ऑप्टिकल फ्रेक्चरेटर तकनीक, इलेक्ट्रोकोनिवल्सी थेरेपी के चूहा मॉडल में सेल नंबर का अनुमान लगाने के लिए

Published: July 9, 2017 doi: 10.3791/55737
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Research Laboratory for Stereology and Neuroscience, Bispebjerg-Frederiksberg Hospital, 2Institute of Clinical Medicine, Department of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

Summary

यहां, हम एक स्टेरिओलॉजिकल मेथड, ऑप्टिकल फूटेटर, जो कि न्यूरॉन्स के गठन का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जाता है, और उनके अस्तित्व को, इलेक्ट्रोकॉनविल्सिव उत्तेजना के बाद चूहे हिप्पोकैम्पस में प्रस्तुत करते हैं। जब सही ढंग से कार्यान्वित किया जाता है, स्टिरीओलॉजिकल तरीके की संवेदनशीलता और दक्षता एक निश्चित और पूर्वनिर्धारित परिशुद्धता के साथ सटीक अनुमान को सुनिश्चित करती है।

Abstract

स्तरीय तरीके से कोशिकाओं या संरचनाओं के आकार, आकार, अभिविन्यास और वितरण के बारे में धारणाएं किए बिना, मात्रात्मक मापदंडों का वर्णन करने के लिए तैयार किए गए हैं। ये तरीकों स्तनधारी मस्तिष्क के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए क्रांतिकारी रही हैं, जिसमें मात्रात्मक सेल आबादी स्वयं को गिनने में बहुत अधिक है, और त्रिविक्यता अब पसंद की तकनीक है, जब भी त्रि-आयामी मात्रा का अनुमान दो-आयामी पर माप से निकालने की आवश्यकता होती है वर्गों। सभी स्टिरियोलॉजिकल तरीके सिद्धांत में निष्पक्ष हैं; हालांकि, वे रुचि की संरचना और ऊतकों की विशेषताओं के बारे में उचित जानकारी पर भरोसा करते हैं। स्ट्रीयोलॉजी, व्यवस्थित समान रूप से यादृच्छिक नमूनाकरण (एसआरएस) पर आधारित है, जो सटीकता के संबंध में सबसे कुशल स्तर पर नमूने के समायोजन के साथ, ब्याज की पूरी संरचना के बारे में विश्वसनीय, मात्रात्मक जानकारी प्रदान करती है। यहां हम ब्र्डीयू इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री टी के साथ ऑप्टिकल फिक्टेटर पेश करते हैंO इलेक्ट्रोकाँवल्जेसिस उत्तेजना के बाद चूहे हिप्पोकैम्पस के ग्रेन्युल सेल परत (उप-दानेदार क्षेत्र सहित) में नवगठित न्यूरॉन्स के उत्पादन और अस्तित्व का अनुमान है, जो न्यूरोजेनेसिस के सबसे शक्तिशाली प्रेरक के बीच है। ऑप्टिकल फूटेटर तकनीक पूरी संरचना से नमूने मोटी भागों से कुल कोशिकाओं के अनुमानों को प्रदान करने के लिए डिज़ाइन की गई है। मोटे वर्ग अपने पूर्ण 3-डी हद तक कोशिकाओं का निरीक्षण करने का अवसर प्रदान करते हैं और इस प्रकार, रूपवाचक मानदंडों के आधार पर आसान और मजबूत सेल वर्गीकरण के लिए अनुमति देते हैं। जब सही ढंग से कार्यान्वित किया जाता है, ऑप्टिकल फूटेटर की संवेदनशीलता और दक्षता एक निश्चित और पूर्वनिर्धारित परिशुद्धता के साथ सटीक अनुमान प्रदान करता है।

Introduction

तीन-आयामी (3-डी) संरचना में कोशिकाओं की मात्रा को निष्पक्ष सिद्धांतों के आधार पर अनुमान प्राप्त करने की आवश्यकता हो सकती है। आज भी, अध्ययन अक्सर 3-डी संरचनाओं के डेटा की रिपोर्ट करने के लिए दो-आयामी (2-डी) तरीके का उपयोग करते हैं हालांकि, ये पद्धतियां संरचनात्मक संरचना की आकृति और वितरण के संदर्भ में संरचना की विषम प्रकृति पर विचार नहीं करती है जिसके परिणामस्वरूप प्रणालीगत सीमाएं होती हैं; वे ब्याज की 3-डी ढांचे के बारे में धारणा करते हैं और परिणाम पूरी संरचना का उल्लेख नहीं करते हैं। ये सीमाएं तरीकों की संवेदनशीलता और सटीकता को कम करती हैं और साथ ही साथ त्रुटियों के जोखिम को बढ़ाती हैं 1 ।

कोशिका की गिनती में पूर्वाग्रह डिजाइन-आधारित स्टिरिओलॉजी के आवेदन से बचा जा सकता है, जो किसी दिए गए ऊतक या संरचना में कोशिकाओं की संख्या के बारे में मात्रात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए सामान्य महत्व का है। हालांकि स्टिरियोलॉजी पूर्व में बहुत समय लेने वाली विधि रही है, प्रक्रियाओं में प्रगति, मुलायमबर्तन और इमेजिंग, यह बहुत अधिक कुशल और व्यापक रूप से लागू हो गया है। स्टिरियोलॉजी सांख्यिकीय नमूनाकरण सिद्धांतों और स्टोकेस्टिक जियोमेट्रिक सिद्धांत पर जोर देती है ताकि 2-डी खंड 2 में नमूनाकरण द्वारा 3 डी संरचना में मात्रा, सतह क्षेत्र, लंबाई, और वस्तुओं की संख्या के अनुमान के लिए कुशल उपकरण प्रदान किया जा सके। इस प्रकार, स्टिरियोलॉजी एक ऊतक वर्गों में संरचनात्मक परिवर्तनों पर निष्पक्ष मात्रात्मक आंकड़े प्राप्त करने की अनुमति देती है, जो संपूर्ण विश्लेषण के बिना औसत संख्याओं के औसत अनुमान देते हैं 1 । स्टिरियोलॉजी को नमूने वाली जानकारी से ज्यामितीय पैरामीटर के सांख्यिकीय अनुमान के रूप में परिभाषित किया गया है। यह निष्पक्ष नमूनाकरण द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, जो कि खंडों का व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना कहना है, साथ ही नियमों की गणना भी करता है जो यह सुनिश्चित करता है कि सभी वस्तुओं की समानताएं 3 की गणना की जा रही हैं जबकि स्टिरीओयोलॉजिकल परिणामों में त्रुटि की गुणांक (सीई) के संकेत के अनुसार सटीक डिग्री भिन्न हो सकते हैं, यह विज्ञापन हो सकता हैअपेक्षित 4 , 5 के अनुसार नमूनाकरण की मात्रा को समायोजित करके अंतर्निहित जैविक विचरण (भिन्नता का गुणांक (सीवी)) के अनुरूप होना चाहिए। कुछ पिछले स्टिरीओयोलॉजिकल अध्ययन ने 671 में कृन्तकों में हिप्पोकैम्पल प्लास्टिसिटी पर इलेक्ट्रोकोनिवल्सी उत्तेजना (ईसीएस) के अल्पावधि प्रभावों की जांच की है। इन अध्ययनों के डेटा में बार-बार ईसीएस के बाद न्यूरॉन्स की कुल संख्या और साथ ही ऊंचा synaptic भिन्नता में एक प्रारंभिक वृद्धि दिखाई देती है। हालांकि, ये अध्ययन न्यूरोजेनेसिस का अनुमान नहीं लगाते हैं, क्योंकि वे सेल प्रसार के लिए विशिष्ट मार्करों का उपयोग नहीं करते हैं।

यहां हम उप-दानेदार क्षेत्र (एसजीजेड) सहित चूहा हिप्पोकैम्पल ग्रेन्युल सेल परत (जीसीएल) में नवगठित न्यूरॉन्स की कुल संख्या को मापने के लिए, एक स्ट्राइकोलॉजिकल विधि, ऑप्टिकल फूटेटर तकनीक 8 , 9 की एक आवेदन पेश करते हैं अपने दीर्घकालिक एस के रूप मेंUrvival 10 , 11 हमने चूहों को ईसीएस (तीन हफ्ते के तीन हफ्ते में तीन बार) के एक नैदानिक ​​प्रासंगिक कार्यक्रम के अधीन किया, जो कि न्यूरोजेनेसिस 12 के सबसे शक्तिशाली उत्तेजक पदार्थों में से एक है। नियंत्रण जानवरों को उसी प्रक्रिया का उपयोग करने के लिए इलाज किया गया था, लेकिन वर्तमान से गुजरने के बिना। प्रयोग के 21 दिनों में से प्रत्येक पर, सभी चूहों को 5-ब्रोमो-2-डीनोकाउराइडिन (बीआरडीयू) के साथ इंट्राप्टरिटोनियल इंजेक्ट किया गया था जो कोशिका विभाजन 13 के दौरान थाइमिडीन की जगह डीएनए में शामिल होता है। प्रयोग के बाद, चूहों को चार अलग-अलग समय अवधि (24 घंटे, 3 महीने, 6 महीने और 12 महीने) के लिए बनाए रखा गया था अंशक सिद्धांत का प्रयोग करते हुए, हम हिप्पोकैम्पस के वर्गों के वर्दी यादृच्छिक नमूने के माध्यम से एक ज्ञात अंश प्राप्त कर चुके हैं, और नमूने और प्रतिरक्षी मोटी ऊतक वर्गों के लिए ऑप्टिकल डिस्क्टेक्टर (3-डी जांच) लगाए हैं। यह विशेष रूप से नोट किया जाता है कि प्रक्रिया के दौरान जमे हुए वर्ग आमतौर पर z-axis में गिर जाते हैंआईएनजी, और इस विशेष मामले 14 में संख्या-भारित माध्य खंड मोटाई के आधार पर ऑप्टिकल डिस्कार्स का इस्तेमाल किया जाना चाहिए। चूंकि ऑप्टिकल डिस्कोक्टरों के फोकल प्लेन को अनुभाग के माध्यम से एक ज्ञात दूरी को स्थानांतरित कर दिया गया था, जब ब्र्ड्यू-पॉजिटिव न्यूरॉन्स गिने गए थे, जब ब्याज की उनकी सुविधा स्पष्ट रूप से मान्यता प्राप्त थी। स्टिरियोलॉजी के क्षेत्र में कणों की कुल संख्या के बारे में कोई बहस है जो कि 15 गिना जानी चाहिए; आम तौर पर 150-200 न्यूरॉन्स को पर्याप्त सटीक यानी 7-8% 8 के गुणांक प्राप्त करने के लिए ब्याज की संरचना में गिना जाता है। कैमरे से लैस मानक माइक्रोस्कोप द्वारा इमेजिंग के साथ ब्रोड्यू-पॉजिटिव न्यूरोनल मायनेक्स का पूरा पूरा किया गया और निम्न उद्देश्य: 2 एक्स, 4 एक्स और 10 एक्स तथा साथ ही 100 एक्स ऑयल-विसर्जन उद्देश्य (संख्यात्मक एपर्चर = 1.40), और मोटर चालित चरण । जेड-दिशा में आंदोलनों को एक डिजिटल माइक्रोकेटर के साथ मापा गया। अंतिम बढ़ाईथा 3000X

Protocol

सभी जानवरों की प्रक्रिया डेनिश पशु प्रयोग निरीक्षणालय के दिशानिर्देशों के अनुसार की गई और प्रायोगिक पशुओं के लिए स्थानीय नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. ऊतक प्रसंस्करण

नोट: 4 डिग्री पैराफार्मिहाइड (पीएफए) में ट्रांसकार्डियल छिड़काव और पोस्ट फिक्सेशन के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात 0.2 एम फॉस्फेट बफर में पतला होता है, मस्तिष्क फॉस्फेट बफर किए गए खारा (पीबीएस) में 30% सूक्रोज को 4 डिग्री सेल्सियस पर तीन दिन के लिए स्थानांतरित कर दिया जाता है। इसके बाद, मस्तिष्क पाउडर सूखे बर्फ पर जमी हैं और सेक्शनिंग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होते हैं।

  1. एक स्केलपेल का उपयोग करके मस्तिष्क की मिडलाइन के साथ दाएं और बाएं गोलार्द्धों को अलग करें और फिर एक या दूसरे गोलार्ध को पहले मस्तिष्क में यादृच्छिक रूप से चुनें, इसके बाद सही और बाएं गोलार्ध के बीच व्यवस्थित रूप से बदलाव करें ( चित्रा 1 ए )। एक नमूना डिस्क पर नमूना गोलार्द्ध को लंबी अक्ष सीधा डिस्क के साथ माउंट करेंएक बढ़ते माध्यम का उपयोग करना
  2. क्रिस्टोस्ट में प्री-कूलिंग के लिए नंबरित बहुदीप कंटेनर रखें।
  3. नमूना डिस्क को क्रिस्टोस्ट में माउंट करें और क्रोनिक प्लेन ( चित्रा 1 बी ) में 80 माइक्रोन मोटे वाले हिस्सों में हिप्पोकैम्पस (बेंग्मा 1.80 से - 7.04 16 ) की संपूर्णता काटा।
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए कि वर्गों काटने के क्रम में रखा गया है, ठंडा मल्टीडिश कंटेनरों में लगातार सभी नमूने अनुभागों को रखें।
    2. आंशिक रूप से क्रियोप्रोटेक्टेंट के साथ कवर करें और अगले उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर कंटेनरों को पकड़ो।

2. Immunostaining

नोट: पूरे स्टैनिंग प्रक्रिया में व्यक्तिगत अनुभागों का ट्रैक रखने के लिए, 25-अच्छी तरह से स्टेनिंग जाल में नमूना वाले वर्गों को रखें। प्रत्येक 5 वें खंड का उपयोग करें, प्रति हिमपोकैम्पस के लिए 12 (8-16) वर्गों की अंतिम अंतिम संख्या और immunostaining और बाद में सेल की गिनती के लिए।

  1. अनुभाग 1 और खंड n ( चित्रा -1 सी ) के बीच एक यादृच्छिक शुरुआत के साथ हर एनए अनुभाग को सब्सम्पलिंग करने से पहले -20 डिग्री सेल्सियस से कमरे के तापमान (आरटी) के कंटेनरों को स्थानांतरित करें।
  2. पीबीएस से भरा पेट्री डिश में रखा 25-अच्छी तरह से धुंधला जाल के लिए संख्यात्मक क्रम में वर्गों को स्थानांतरित करने के लिए, उदाहरण के लिए एक पेंटब्रश का उपयोग करें।
    नोट: इस बिंदु से, वर्गों को स्टेनिंग जाल में रखें, जो एक कक्षीय प्रकार के बरतन (अनुभाग 2.3 से 2.9) पर बनाए गए ग्लास व्यंजनों में रखा गया है।
  3. मिलान किए गए गिलास के डिब्बे में धुंधला जाल को स्थानांतरित करें और दो मिनट के लिए आरटीएस पर पीबीएस में 10 मिनट में दो बार धो लें और 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच 2 ओ 2 ) में 20 मिनट के लिए डिस्टिल्ड वॉटर (डीएच 2 ओ) में पतला।
  4. हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) (1 एम 0 डिग्री सेल्सियस के लिए 10 मिनट, आरटी पर 10 मिनट में 2 एम, और 2 एम 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 20 मिनट) के तीन अलग-अलग समाधानों को 0.1 एम सोडियम टाट्राबोरेट एटीटी आरटी 20 मिनट के लिए
  5. पीबीएस (वॉशिंग बफर) में 1% ट्राइटॉन एक्स -100 में 3 × 10 मिनट की ऊष्मायन के बाद, आरटी पर 1 घंटे के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (अवरुद्ध समाधान) वाले वॉशिंग बफर के लिए वर्गों को स्थानांतरित करें।
  6. 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के लिए माउस-एंट्री-ब्रॉडयू में ब्लॉकिंग समाधान में 1: 100 पतला।
  7. धोने के बफर में 3 × 10 मिनट के वर्गों को धो लें, और घोड़े की मूली पेरोक्साइड में 48 घने धोने के बफर में 1:10 पतला।
  8. पीबीएस में 5 × 10 मिनट के लिए वर्गों को ट्रांसफर करें, और फिर पीबीएस में पतला 0.01% डायबिनेजैडिन (डीएबी) में 7 मिनट के लिए आरटी के 10 मिनट के लिए 0.02% एच 2 ओ 2 युक्त एक समान डीएबी समाधान में स्थानांतरित होने से पहले।
  9. धूसर की श्रृंखला (2 × 10 मिनट पीबीएस में और 2 × 10 मिनट में सोडियम क्लोराइड के बिना फॉस्फेट बफर में) को पूरा करें और सूक्ष्मदर्शी स्लाइड्स पर संख्यात्मक क्रम में वर्गों को माउंट करें।
  10. Cresyl के साथ counterstaining पहले लगभग 30 मिनट के लिए वर्गों सूखीबैंगनी।
  11. एक स्लाइड रैक में माइक्रोस्कोप स्लाइड रखें।
  12. डीएच 2 ओ युक्त स्लाइड स्टेनाइजिंग व्यंजनों में 10 मिनट के लिए वर्गों को फिर से विभाजित करें, और फिर स्लाइडों को डीएच 2 ओ में 0.02% सी्रेसल वायलेट में 15 मिनट के लिए स्थानांतरित करें।
  13. खंड 2.12 दोहराएँ इससे पहले कि वर्गों को इथेनॉल में तीन बार निर्जलित किया जाता है (5 मिनट के लिए 96% और 2 × 2 मिनट के लिए 99%)।
  14. 2 × 15 मिनट के लिए वर्गों को एक्सलीन में रखें और बढ़ते रहने के लिए एक तेज़ सुखाने वाले माध्यम का उपयोग करके स्लाइड्स को कवर करें।
  15. अंत में, माइक्रोस्कोपी के लिए उपयोग किए जाने से लगभग 24 घंटे पहले कवर-फिसल गए स्लाइड्स को छोड़ दें।

3. ऑप्टिकल फूटेटर का उपयोग करके ब्रोडू-लेबल न्यूरॉन्स की कुल संख्या का आकलन

नोट: इष्टतम सैंपलिंग मापदंडों को निर्धारित करने के लिए कुछ जानवरों सहित एक पायलट अध्ययन का संचालन करें, जैसे कि विश्लेषण किए जाने वाले अनुभागों की संख्या और नमूना वर्गों के भीतर ऑप्टिकल डिस्क्टर्स की संख्या। यह पायलट भी एक प्रदान करता हैप्रारंभिक सीवी (मानक विचलन / माध्य) और जांचकर्ता द्वारा निर्धारित अनुमानों की संतोषजनक परिशुद्धता प्राप्त करने के लिए सीई समायोजित करने की संभावना (देखें खंड 3. 9.3) (अधिक विवरण के लिए नीचे देखें) इसी तरह निम्नलिखित बिंदुओं को संबोधित करने के लिए एक z- वितरण विश्लेषण करें: ऊतक का संकुचन, पूरे खंड में धुंधला हो जाने की गुणवत्ता और जेड-अक्ष 14 में कोशिकाओं के वितरण।

  1. अनुभागों में ऊतक की मोटाई की जांच करने के लिए यह पुष्टि करें कि वे ऑप्टिकल फूटेटर के उपयोग के लिए उपयुक्त हैं, उदा। गार्ड जोन (नीचे देखें) सहित चुने गए वेक्टर ऊंचाई के लिए पर्याप्त मोटी है। नोट: ऊतक की मोटाई ब्याज के क्षेत्र में कई जगहों में उपायों है।
    1. स्लाइड्स को खुर्दबीन के मोटर के स्तर पर रखें और पसंदीदा स्तरीय सॉफ़्टवेयर चालू करें।
    2. 100X तेल-इम में बदलने से पहले कम-बढ़ाई उद्देश्य (2X या 4x) का उपयोग करके ब्याज के क्षेत्र को चित्रित करेंErsion उद्देश्य ( चित्र 2 ए देखें)।
    3. एक गिनती फ्रेम ( उदाहरण के लिए या एक कोने से आसन्न) का एक विशिष्ट बिंदु का उपयोग करना, फोकल प्लेन के साथ आगे बढ़कर अनुभाग के ऊपर की स्थिति का पता लगाएं, जब तक कि अनुभाग की कुछ विशेषता फोकस में नहीं दिखाई देती। इस z- स्थिति को 0 के रूप में पंजीकृत करें ( चित्र 2B देखें)।
    4. ऊतक के माध्यम से फोकल प्लेन को ले जाएं जब तक कि गिनती फ़्रेम का एक ही विशिष्ट बिंदु फोकस में पिछले z- स्तर पर नहीं है और इस स्थिति को चिह्नित करें। स्थानीय ऊतक मोटाई को 0 से इस समापन बिंदु पर परिभाषित किया गया है और इसे z- अक्ष पर पढ़ा जा सकता है। ऊतक मोटाई दर्ज करें ( चित्रा 2 बी देखें)
  2. खंड की पूर्ण मोटाई में कोशिकाओं के दाग और वितरण का पूर्ण प्रवेश दस्तावेज़ करें।
    नोट: BrdU- लेबल न्यूरॉन्स का वितरण आवश्यक गार्ड जोन निर्धारित करने के लिए एक गाइड के रूप में उपयोग किया जाता है। हालांकि कोशिकाओं का एक समान वितरण महत्वपूर्ण है, यहखंड की ऊपरी और निचले हिस्से के पास कम कोशिकाओं का निरीक्षण करना स्वीकार्य है, जो खोई टोपी के प्रभाव को दर्शाता है (अधिक जानकारी के लिए डॉर्फ-पीटरसन एट अल।, 2009 देखें)।
    1. नमूना ब्रडयू-लेबल न्यूरॉन्स और प्रत्येक ज़मीन फ्रेम के चयनित कोने में मापा जाने वाले स्थानीय अनुभाग मोटाई के साथ अपने z- स्थिति को पंजीकृत करें।
    2. अपने z- स्थिति के एक समारोह के रूप में ब्रोड-पॉजिटिव न्यूरॉन्स की संख्या का प्लॉट करें
  3. माध्य खंड मोटाई और कोशिकाओं के वितरण (3.1 और 3.2 देखें) के आधार पर वेक्टर और गार्ड क्षेत्र की ऊंचाई को ठीक करें।
    नोट: वेक्टर की ऊंचाई सतहों के करीब कलाकृतियों से बचने के लिए अनुभाग मोटाई से कम होनी चाहिए। इस जोखिम को खंड के ऊपरी और निचले भाग में गार्ड जोन सहित शामिल किया गया है।
  4. डिस्कोर्स के बीच की चरण की अवधि निर्धारित करें
    1. सभी वर्गों पर ब्याज के क्षेत्र का विश्लेषण करना और क्षेत्रों को दर्ज करना।
    2. इन क्षेत्रों का योग करें और फिर बी को विभाजित करेंवाई इस क्षेत्र के भीतर रखी जातियों की संख्या।
      नोट: पिछले अनुभव के आधार पर एक अच्छी शुरुआती बिंदु पर 75 जांच होनी चाहिए। यह क्षेत्र का एक सन्निकटन और संबंधित नमूनाकरण स्थिति प्रदान करेगा (एक कदम ) (अधिक जानकारी के लिए पश्चिम, 2012 देखें)
    3. एक कदम का वर्गमूल लो, जो एक्सआई-स्टेप आकार प्रदान करेगा।
  5. गणना फ़्रेम का आकार निर्धारित करें
    1. गिनती फ्रेम के आकार को एक मनमानी इकाई में सेट करें और धारा 3.3 और 3.4 में प्राप्त पैरामीटरों का उपयोग करके ब्रोड-पॉजिटिव न्यूरॉन्स के एक पायलट नमूनाकरण करें।
      नोट: आकार परीक्षण और त्रुटि से empirically निर्धारित किया जाना है, लेकिन यह अनुशंसा की जाती है कि प्रत्येक वेक्टर 8 में 2-3 कोशिकाओं के नमूने को सक्षम करने के लिए समायोजित किया गया।
  6. पायलट अध्ययन के इस अंतिम चरण के बाद सेल सैंपलिंग प्रारंभ करें
    नोट: प्राप्त नमूना पैरामीटर के परिणामस्वरूप लगभग 150-200 कोशिकाओं की गणना होनी चाहिए Iप्रत्येक पशु जो एक कुशल स्टिरीओलॉजिकल डिज़ाइन 8 प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है
  7. 100 × तेल-विसर्जन उद्देश्य और 2000-3000 × का अंतिम आवर्धन का उपयोग करके ब्रोड-पॉजिटिव न्यूरॉन्स को गिनाएं। प्रत्येक ऑप्टिकल वेक्टर में, किसी भी ब्रोडू-लेबल वाले न्यूरॉन्स की पहचान करें जो स्पष्ट रूप से ब्याज की सुविधा से पहचाने जाते हैं (वर्तमान अध्ययन में, मानदंड तब होता है जब ब्राडु-लेबल वाले न्यूरॉन के अग्रणी किनारे पहली बार ध्यान केंद्रित हो जाते हैं), स्थित हैं गिनती फ्रेम के अंदर या शामिल लाइनों को स्पर्श करें ( चित्रा 2 बी )। ब्रोड्यू-पॉजिटिव न्यूरॉन्स की गणना न करें, जब वेक्टर की ऊँचाई के अंदर ब्याज की सुविधा से स्पष्ट रूप से पहचाने जाते हैं, तो अपवर्जन लाइनों को स्पर्श करें यह पूरी तरह से पूरे स्टिरियोलॉजिकल मात्रा का ठहराव के दौरान इन गिनती के नियमों का पालन करने के लिए गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है।
    नोट: जैसा कि ब्रॉडयू को सभी विभाजित कोशिकाओं में शामिल किया गया है, आकारिकी का उपयोग न्यूरॉन्स और अन्य प्रकार के कोशिकाओं के बीच अंतर करने के लिए किया जाता है। Neuरॉन विशेषताओं एक स्पष्ट रूप से परिभाषित नाभिक एक तटस्थ cytoplasm और एक काले nucleolus के साथ हैं। ब्रॉडयू पॉजिटिव कोशिकाओं को ग्लियाल कोशिकाओं की तुलना में अपेक्षाकृत बड़े आकार के आधार पर नवगठित न्यूरॉन्स के रूप में मान्यता प्राप्त है। इसका उल्लेख किया जाना चाहिए कि अल्पकालिक प्रसार (जैसे <24 घंटे) के अध्ययन में अपरिपक्व न्यूरॉनल मार्करों का उपयोग करके दोहरे धुंधला एक शर्त 17 हो सकती है।
  8. पारस्परिक नमूना अंशों के साथ गिनती हुई कुल कोशिकाओं की संख्या (Σ क्यू ) को गुणा करके प्रत्येक मस्तिष्क में ब्रोड-पॉजिटिव न्यूरॉन्स की कुल संख्या का अनुमान लगाएं:
    समीकरण
    के लिये समीकरण
    कहा पे समीकरण क्यू- संख्या भारित माध्य अनुभाग मोटाई है, एच वेक्टर की ऊंचाई है, एएसएफ क्षेत्र का नमूना अंश है, एसएसएफ खंड हैएम्पललिंग फ्रैक्चर और टी I अनुभाग गेटिंग फ़्रेम में सेल गिनती के साथ अनुभाग मोटाई है I समीकरण वेक्टर 14 , 18 में
  9. त्रुटि (सीई) 8 के गुणांक की गणना करें जो कि व्यवस्थित एकरूप यादृच्छिक नमूने (एसआरएस) में ब्रॉडयू-पॉजिटिव न्यूरॉन्स का नमूना विचरण है।
    1. सबसे पहले, शोर की गणना करें, जो ब्रॉडयू पॉजिटिव न्यूरॉन्स की कुल संख्या के बराबर गिना जाता है:
      समीकरण
    2. आगे, सूअरों में भिन्नता की गणना करें:
      नोट: हमने हिप्पोकैम्पस में सेक्शन और सेक्शन में आसानी से बदलने के लिए क्षेत्र और सेल की गणना की है और परिणामस्वरूप "चिकनाई वर्ग" एम = 1 (1/240) 8 , 1 9 समीकरण
      कहा पे
      समीकरण
      समीकरण
      समीकरण
      पी I अंकों की संख्या है जो I वें खंड में वस्तु के लिए गिना जाता है और n खंड 4 , 20 की संख्या है।
    3. अंत में, अनुमान के सीई की गणना करें:
      नोट: सामान्य रूप से, इष्टतम परिशुद्धता आम तौर पर तब प्राप्त की जाती है जब सीई मान आरक्षित सीवी के आधे से कम, ओसीवी 2 = आईसीवी 2 + सीई 2 के रूप में , जहां ओसीवी मनाया सीवी होता है और आईसीवी निहित सीवी 4 है ।
      समीकरण

आकृति 1
एफIigure 1: वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल अंशक सिद्धांतों के अनुसार ऊतक प्रसंस्करण दिखाए योजनाबद्ध उदाहरण।
प्रयोग के बाद, गोलार्द्ध अलग होते हैं और सही या बाएं गोलार्द्ध व्यवस्थित और बेतरतीब ढंग से चुना जाता है (ए)। संपूर्ण हिप्पोकैम्पस पर विस्तार करने वाला पूरा मस्तिष्क 80-माइक्रोग्राम-मोटी कार्ोनल सेक्शन (बी) में कट जाता है, जिसमें हर 5 वें खंड को उप-नमूना दिया जाता है, अंतिम इम्यूनोस्टाईन और स्टेरिओलॉजिकल क्वालिफिकेशन (सी) के लिए धारा 1 से 5 के बीच बेतरतीब ढंग से शुरू होता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: चित्रण ऑप्टिकल डिस्कोर्स का प्रयोग करके स्टिरियोलॉजिकल नमूनाकरण प्रक्रिया दिखा रहा है।
(ए) निम्नलिखित histological प्रसंस्करण जिपोकैंपल जीसीएल / एसजीजेड को चित्रित किया गया था और ऑप्टिकल डिस्कोक्टर इस क्षेत्र पर समान रूप से और बेतरतीब ढंग से लागू होते हैं। (बी) ऑप्टिकल डिस्क्टेक्टर (बाएं) में, ब्रोड्यू पॉजिटिव न्यूरॉन्स को केवल तभी गिना जाता है जब ब्याज की उनकी सुविधा स्पष्ट रूप से वेक्टर की ऊंचाई के भीतर पहचानी जाती है, और गिनती फ्रेम के अंदर स्थित होती है या शामिल लाइन (दाएं) को छूती है। बहिष्कार रेखा को छूने वाले न्यूरॉन्स की गणना नहीं की गई थी स्केल सलाखों = 10 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Representative Results

नमूनाकरण पैरामीटर

पायलट अध्ययन ( चित्रा 3 ) में जेड-डिस्ट्रीब्यूशन का विश्लेषण करके, हमने वेक्टर ऊँचाई में ब्रोड्यू पॉजिटिव न्यूरॉन्स का एक समान वितरण पाया। वर्गों का संकुचन मापा गया; अंतिम मतलब मोटाई मूल रूप से 80 माइक्रोन में कटौती की धाराओं में 26.4 माइक्रोन (1 9.0-32.0 माइक्रोन) था। ब्रेशू लेबल न्यूरॉन्स के ऊतक मोटाई और वितरण के आधार पर वेक्टर की ऊंचाई 10 माइक्रोन तक निर्धारित की गई थी, और अनुभाग के ऊपर और नीचे स्थित गार्ड जोन क्रमशः 5-माइक्रोन और 4-17 माइक्रोन पर सेट किए गए थे। कोशिकाओं की घनत्व के आधार पर, गिनती फ़्रेम का क्षेत्र 1414 या 5210 माइक्रोन 2 था । स्पीड लम्बाई x और y दोनों दिशाओं में 220 माइक्रोन थी और कोशिका की गणना 12 जानवरों (श्रेणी 8-16) वर्गों के औसत में की गई थी। इन नमूना मानकों के परिणामस्वरूप 133 (रेंज 33-372) का मतलब ब्राडुप्रत्येक मस्तिष्क गोलार्ध में 173 (107-204) विच्छेद में गिने जाने वाले-कोशिकाएं

एक उदाहरण के रूप में, हमने ईसीएस उपचारित चूहों में बीआरडीयू-पॉजिटिव न्यूरोनल अनुमानों के लिए निम्नलिखित सीवी और सीई मूल्य प्राप्त किए: 24 घंटे: सीवी = 0.5 9, सीई = 0.11; 3 महीने: सीवी = 0.34, सीई = 0.12; 6 महीने: सीवी = 0.43, सीई = 0.0 9; 12 महीने: सीवी = 0.22, सीई = 0.0 9।

हमने ब्रॉडयू स्लेजिंग तकनीक 10 , 11 के साथ संयोजन के साथ ऑप्टिकल फूटेटर का उपयोग करते हुए ईसीएस के बाद चूहा हिप्पोकैम्पस में नवगठित न्यूरॉन्स की कुल संख्या और उनके दीर्घकालिक उत्तरजीविता की मात्रा निर्धारित की है। अंतिम परिणाम नियंत्रण जानवरों के चार समूहों में बेसल न्यूरोजेनेसिस दिखाते हैं, जो अस्तित्व के समय ( चित्रा 3 ) के फ़ंक्शन के रूप में काफी भिन्न नहीं थे। इसके अलावा, ईसीएस ने 24 पर ब्रोड्यू-पॉजिटिव न्यूरॉन्स की कुल संख्या में एक महत्वपूर्ण वृद्धि को प्रेरित कियानियंत्रण जानवरों की तुलना में घंटों (25 9%, पी <0.0001), 3 (22 9%, पी <0.001), 6 (152%, पी <0.05) और 12 महीने (162%, पी <0.05) का प्रयोग करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: चूहा हिप्पोकैम्पस 10 , 11 के जीसीएल / एसजीजेड में ब्रोड्यू-पॉजिटिव न्यूरॉन्स की कुल संख्या का मात्रात्मक डेटा।
क्षैतिज सलाखों के माध्य मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं संकेताक्षर: जीसीएल, ग्रेन्युल सेल परत; एसजीजेड, उप-दानेदार क्षेत्र; घंटे, घंटे; मी, महीनों **** p <0.0001, *** p <0.001 और * p <0.05 बनाम नियंत्रण (n = 11-12 प्रति समूह)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Discussion

न्यूरोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए एक पद्धति के रूप में ईसीएस का उपयोग करना, हम हिप्पोकैम्पस में नए ब्रोड्यू-पॉजिटिव न्यूरॉन्स के गठन में 260% की तत्काल वृद्धि पाते हैं। तीव्रता से उत्पन्न न्यूरॉन्स के इस पूल में हमें दिन 1 से तीन महीनों में 40% अतिक्रमण मिला, साथ ही नवगठित न्यूरॉन्स का लगभग 50% उपचार 10 , 11 के बाद कम से कम 12 महीने से जीवित रहे। ब्रॉडयू-लेबल न्यूरॉन्स की गिनती एक कठोर नमूनाकरण योजना का पालन करती है, जिसके तहत पूरे हिप्पोकैम्पस को प्रत्येक 5 वें खंड के उप-नमूना के बाद 80-माइक्रोग्राम-मोटे वर्गों में कटौती की गई थी, जिसमें खंड 1 और खंड पांच के बीच यादृच्छिक नमूना शुरू हो गया था। इन वर्गों को प्रदान करना एक व्यवस्थित यादृच्छिक तरीके से चुना जाता है, यह अंतिम रूप से भिन्न होने वाले गिनती के बिना अंतिम परिणाम के विचरण को कम करने का एक शानदार तरीका है। इस नमूनाकरण योजना ने हमें 12 (8-16) हिप्पोकैम्प की औसत में ब्रोड-पॉजिटिव न्यूरॉन्स को गिनने की अनुमति दीप्रत्येक चूहे मस्तिष्क में अल सेक्शन, 9-11% की अंतिम परिशुद्धता के साथ।

अंशक विधि का उपयोग करते समय, अनुभाग ऊँचाई के अंश का पता होना जरूरी है जिसमें गिनती की जाती है, क्योंकि ऊतक संकोचन और विकृति अक्सर हास्टोलॉजिकल प्रसंस्करण 14 के दौरान होती है दरअसल, हमने इस अध्ययन में मोटाई का पर्याप्त संकोचन देखा है। इसके अलावा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अंतर ऊतक संकोचन हो सकता है, जैसा कि Dorph-Petersen एट अल में प्रस्तुत किया गया है हालांकि, जब तक विश्लेषण के लिए ब्याज की पूरी संरचना उपलब्ध होती है, तब तक इन सीमाओं की कुल संख्या में कणों का पूर्वाग्रह नहीं होता है, अर्थात ईआरडीयू पॉजिटिव न्यूरॉन्स। अध्ययन में जहां ऊतक संकोचन एक विशेष मुद्दा है, यह हमेशा कहा जाना चाहिए कि परिणाम विकृत ऊतक में प्राप्त होते हैं। इस अध्ययन में, हम 10 माइक्रोन की एक वेक्टर की ऊंचाई में गिना। वर्तमान अध्ययन के अनुभागों में 26 माइक्रोन का एक अंतिम मतलब मोटाई, 5 माइक्रोन थाखंड के शीर्ष पर गार्ड क्षेत्र और 11-माइक्रोन (मध्य) गार्ड जोन। ये पैरामीटर स्वीकार्य हैं क्योंकि गार्ड जोन लगभग नमूनाकृत कणों का व्यास होना चाहिए।

जीसीएल / एसजीजेड के चित्रण के बाद, डिटेक्टरों को एक समान रूप से यादृच्छिक क्षेत्र में रखा गया। वेक्टर को एक निश्चित चरण लंबाई के साथ रखा जाना चाहिए, जो जांचकर्ता द्वारा निर्धारित परिशुद्धता के साथ अनुमान प्राप्त करने के लिए नमूनाकरण और गिनती का अनुकूलन करता है। इष्टतम परिशुद्धता आमतौर पर ब्याज 5 की प्रत्येक संरचना में 150-200 कोशिकाओं तक की गणना करके प्राप्त की जाती है। वर्तमान अध्ययन में, हमने प्रत्येक चूहा हिप्पोकैम्पस में 133 (श्रेणी 33-372) ब्रॉडयू पॉजिटिव न्यूरॉन्स का मतलब गिना। नियंत्रण जानवरों में से कुछ में कम सेल संख्या के कारण, ब्रोड्यू-पॉजिटिव न्यूरॉन्स की हमारी गिनती एक उचित परिशुद्धता प्राप्त करने के लिए आम तौर पर स्वीकार्य संख्याओं की संख्या से नीचे होती है, जिसके परिणामस्वरूप उन मामलों के लिए अपेक्षाकृत उच्च सीई मानों का परिणाम होता है। एचचूंकि हमने कम से कम सीवी-मूल्यों के सीई-वैल्यू प्राप्त की (प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें) अतिरिक्त नमूना और गिनती आवश्यक नहीं थी। उच्च सीवी-मान दर्शाते हैं कि मनाया भिन्नता के लिए सबसे बड़ा योगदानकर्ता जैविक भिन्नता से उत्पन्न होता है। दरअसल, हम यह कह सकते हैं कि वर्तमान अध्ययन में गिना जाने वाले ब्रॉडयू पॉजिटिव न्यूरॉन्स की औसत संख्या आवश्यक से अधिक थी। उदाहरण के लिए, चूहों के एक समूह में हमने 9% का सीई-वैल हासिल किया, और 43% का सीवी-मूल्य देखा। इस विशेष मामले में, हम लगभग 20% की एक सटीक लक्ष्य निर्धारित कर सकते थे संक्षेप में, वर्तमान अध्ययन में ब्रॉडयू-पॉजिटिव न्यूरॉन्स की कुल संख्या का सटीक पर्याप्त है, क्योंकि यह वास्तविक कणों की वास्तविक संख्या पर वास्तविक उपचार प्रभाव को पकड़ता है। प्रयासों के कम व्यय के बावजूद जानवरों के कुछ समूहों में होने वाले बड़े जैविक भिन्नता के कारण ही एक स्वीकार्य सटीकता के साथ ही अनुमान प्राप्त किया जा सकता था। समूहों के भीतर उच्च जैविक भिन्नताएं ही हो सकती हैंजानवरों की संख्या में वृद्धि करके मुआवजा दिया जाएगा

एक यह तर्क दे सकता है कि सटीक सेल संख्या प्राप्त करने के लिए सोने के मानक में रुचि की सभी वस्तुओं की संपूर्ण गणना होती है। हालांकि, मस्तिष्क के अधिकांश अध्ययनों में यह कोशिकाओं की विशाल संख्या के कारण संभावना नहीं है। संपूर्ण कोशिका की गिनती के मुकाबले अधिक कुशल होने के बावजूद, वैकल्पिक खंडक अपेक्षाकृत समय से सेल नंबरों में अंतर की सरल जांच के मुकाबले उपभोग करता है, जो कि अगर कोशिकाओं की सही संख्या आवश्यक नहीं है। यह हमारा अनुभव है कि 20-30% से अधिक के अंतर को स्क्रीनिंग प्रक्रियाओं द्वारा विशुद्ध रूप से पाया जा सकता है।

यदि सही ढंग से प्रदर्शन किया जाता है, तो डिजाइन-आधारित स्टिरिओलॉजी का उपयोग करने का नमूना एक कुशल तरीके से निष्पक्ष और सटीक अनुमान प्रदान करता है 1 । स्टिरिओलॉजी की निष्पक्ष संपत्ति का अनुमान है कि, जब दोहराया जाता है, सच्चा आबादी का अनुमान लगाया जाता है, और इसके पुनरुत्पादन को बढ़ाया जाता हैअनुमान 21 प्रारंभ में, ब्याज की संपूर्ण संरचना का एक प्रतिनिधि नमूना (इस अध्ययन में हिप्पोकैम्पल जीसीएल / एसजीजेड) प्राप्त होना चाहिए, जिसमें खंड 4 के सांख्यिक रूप से मान्य उपसमुच्चय में अनुमान लगाने की अनुमति दी जायेगी। किसी उपयुक्त वर्गों को प्राप्त करने के लिए और जांच की जा रही है कि हम एसआरएस को लागू करते हैं, जो यादृच्छिक नमूनाकरण 8 की तुलना में भिन्नता को कम करता है। इसके अलावा, शूर यह सुनिश्चित करता है कि संरचना के भीतर ब्याज के कणों की संरचना में उनके आकार, आकृति, अभिविन्यास और वितरण से अलग, एक ही संभावनाओं के साथ नमूने किए जाते हैं। जैसे कि सटीक और निष्पक्ष अनुमान प्राप्त करने पर इस तरह की स्टिरीओला को अत्यधिक अनुशंसित किया जाना है, परियोजना का एक केंद्रीय पहलू है।

Disclosures

लेखकों के पास प्रतिस्पर्धात्मक वित्तीय रुचियां नहीं हैं

Acknowledgments

कुशल तकनीकी सहायता के लिए हम सुज़ैन सोरेनसेन का शुक्रिया अदा करते हैं। यह काम द वेलक्स फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित था; जस्का फाउंडेशन; एसे और ईजनार डेनियलेंस फाउंडेशन; हार्टमैन ब्रदर्स फाउंडेशन; निर्देशक याकूब मैडसेन और पत्नी ओल्गा मैडेंस फाउंडेशन; डॉक्टर सोफस कार्ल एमिल फ़िरीस और डोरिस फ्रीस ट्रस्ट; 1870 की फाउंडेशन; Torben और ऐलिस Frimodts फाउंडेशन और न्यूरोलॉजिकल रिसर्च के लिए फाउंडेशन। इनगलवुड बायोमेडिकल एडिटिंग द्वारा पांडुलिपि संपादन किया गया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
5'-bromo-2'deoxyuridine - BrdU Sigma-Aldrich 19-160
Cresyl Violet Sigma-Aldrich C5042 Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water 
Cryoprotectant Capital Region Pharmacy, DK 861334 Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M);  ethylenglycol; demineralized water.
dH2O Capital Region Pharmacy, DK 817205
Diaminobenzidine – DAB Sigma-Aldrich D5637
Envision-HRP DAKO K4001 Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins
Ethanol - 70 % Plum A/S 201098
Ethanol - 96 % Plum A/S 201104
Ethanol - 99.9 % Plum A/S 201111
Fetal Bovine Serum In Vitro BI-04-003-1A
H2O2 30% Capital Region Pharmacy, DK 896456
HCl J. T. Baker 6081
Mounting medium Sakura 4583 Tissue Tek
Mouse-anti-BrdU Becton-Dickinson 347580
PBS buffer Capital Region Pharmacy, DK 853436 pH = 7.4
PFA VWR 28,794,295 pH = 7.4
Phosphate buffer  Capital Region Pharmacy, DK 866533 0.1 mol/l, pH 7.4
Rapid drying mounting medium Histolab Products AB 801 Pertex
Sodium Tetraborate Merck A/S 1,063,080,500
Sucrose Merck A/S 1,076,515,000
Triton X-100 Merck A/S 1,086,031,000
Xylene VWR 28,973,363
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Cover slips Menzel-Gläser 24x50 mm #0
Cryostat Leica  CM1860
Digital Microcator Heidenhain VRZ 401
Glass dishes Brain Resaerch Laboratories 1256
Microscope Nikon Eclipse 80i
Microscope camera Olympus DP72
Microscope slides VWR 48311-703 SuperFrost+
Motorized stage Prior H101A
Multidish Containers Sigma-Aldrich D6315-1CS  Nuclon 12-wells
New-Cast software Visiopharm ver. 4.5.6.440
Objective 2x Nikon CFI Plan UW 2X
Objective 4x Nikon CFI Plan Fluor 4X
Objective 10x Nikon CFI Plan Fluor 10X
Objective 100x oil immersion Nikon CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil Numerical aperture 1.40
Orbital shaker Gemini BV CM-9 Sarstedt
Slide rack Sakura 4465
Slide staining dishes Sakura 4457 Tissue-Tek
Specimen disc Leica 14037008637
Staining nets Brain Research Laboratories 2512 25-wells

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References

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Olesen, M. V., Needham, E. K., Pakkenberg, B. The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy. J. Vis. Exp. (125), e55737, doi:10.3791/55737 (2017).

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