Summary
여기, 우리는 electroconvulsive 자극 후 쥐 해마에 새로운 뉴런의 형성과 그 생존을 계량하는 데 사용되는 stereological 방법, 광학 fractionator을 제시한다. 정확한 구현이 이루어질 때, 입체파 방법의 민감도와 효율성은 고정 된 미리 정해진 정밀도로 정확한 추정을 보장합니다.
Abstract
Stereological 방법은 세포 또는 구조의 크기, 모양, 방향 및 분포에 대한 가정을하지 않고 정량적 매개 변수를 설명하도록 설계되었습니다. 이 방법은 포유류 뇌의 정량 분석에 혁명적인데, 체적 세포 집단이 너무 많아 수동으로 계산할 수 없으며, 입체 사진은 3 차원 양의 추정이 2 차원 측정에서 추출되어야 할 때마다 항상 선택 기술입니다 섹션. 모든 입체파 방법은 원칙적으로 편파적이다; 그러나 그들은 관심 구조와 조직의 특성에 대한 적절한 지식에 의존합니다. Stereology는 SURS (Systematic Uniformly Random Sampling)를 기반으로하며 정밀도 측면에서 가장 효율적인 수준으로 샘플링을 조정하여 전체 관심 구조에 대한 신뢰할 수있는 정량 정보를 제공합니다. 여기 우리는 BrdU 면역 조직 화학 t와 함께 광학 분별기를 제시o 신경 흥분제의 가장 강력한 자극제 중 하나 인 전기 경련 자극 후에 쥐 해마의 과립 세포층 (세립립 구역 포함)에서 새로 형성된 뉴런의 생성 및 생존을 평가한다. 광학 분별 기 기술은 전체 구조에서 샘플링 한 두꺼운 섹션의 총 셀 수를 추정 할 수 있도록 설계되었습니다. 두꺼운 섹션은 전체 3 차원 범위에서 세포를 관찰 할 수있는 기회를 제공하므로 형태 학적 기준에 따라 쉽고 강력한 세포 분류가 가능합니다. 정확하게 구현되면, 광학 분별 기의 감도 및 효율은 고정 된 사전 결정된 정확도로 정확한 추정치를 제공합니다.
Introduction
3 차원 (3-D) 구조의 세포를 정량화하기 위해서는 편향되지 않은 원리에 기초하여 추정치를 얻어야 할 수도 있습니다. 오늘날에도 연구에서는 3 차원 구조의 데이터를보고하기 위해 2 차원 (2 차원) 방법을 자주 사용합니다. 그러나,이 방법들은 구조적 제한을 야기하는 세포의 모양 및 분포의 관점에서 구조의 이종 성질을 고려하지 않는다; 그들은 3D 관심 구조에 대한 가정을하고 결과는 완전한 구조를 언급하지 않는다. 이러한 제한은 오류의 위험을 증가시킬뿐만 아니라 방법의 민감도와 정확성을 감소시킵니다 1 .
세포 계수의 편차는 주어진 조직이나 구조에서 세포의 수에 대한 정량적 인 정보를 얻는 데 일반적으로 중요한 디자인 기반의 입체학의 적용으로 피할 수 있습니다. 입체파는 이전에는 매우 시간이 많이 걸리는 방법 이었지만, 절차의 진보, 부드러운도자기 및 이미징은 훨씬 더 효율적이고 광범위하게 적용될 수있게 만들었습니다. Stereology는 통계적 샘플링 원리와 확률 론적 기하학 이론을 사용하여 2 차원 섹션에서 샘플링하여 3 차원 구조의 물체, 표면적, 길이 및 객체 수를 추정하는 효율적인 도구를 제공합니다 2 . 따라서 입체 음향학은 철저한 분석없이 실제 수치의 평균 추정치를 제공하는 조직 절편의 구조적 변화에 대해 불편한 정량적 데이터를 얻을 수있게합니다 1 . Stereology는 샘플링 된 정보의 기하학적 매개 변수에 대한 통계적 추론으로 정의됩니다. 이것은 편파적 인 표본 추출, 즉 섹션의 체계적 무작위 표본 추출과 모든 물체가 동등한 확률을 갖도록하는 계수 규칙에 의해 달성 될 수 있습니다 3 . 입체 결과는 오류 계수 (CE)로 표시된 것과 같이 다양한 정도의 정밀도를 가질 수 있지만, 이는 광고 일 수 있습니다필요에 따라 샘플링 양을 조정하여 내재 된 생물학적 분산 (CV)에 맞게 조정할 수 있습니다. 이전의 몇몇 입체적인 연구에서 설치류 6, 7의 해마 가소성에 대한 전기 충격 자극 (electroconvulsive stimulation, ECS)의 단기 효과를 조사했습니다. 이들 연구의 데이터는 반복 된 ECS 후 상승 된 시냅스 분화뿐만 아니라 뉴런의 총 수의 초기 증가를 나타낸다. 그러나,이 연구는 세포 증식에 특정 마커를 사용하지 않기 때문에 신경 발생을 직접적으로 추정하지 못합니다.
여기에 입체적 방법의 응용, 광학 세분화 기술 8,9 , 하위 낟알 영역 (SGZ)을 포함하여 쥐의 hippocampal 과립 세포 레이어 (GCL)에 새로 형성된 뉴런의 총 수뿐만 아니라 장기적으로우화 10 , 11 . 우리는 쥐에게 신경 발생의 가장 강력한 자극제 중 하나 인 ECS의 임상 관련 일정 (3 주 동안 일주일에 3 번)을 실시했습니다 12 . 대조군 동물을 동일한 절차를 사용하여 처리하였으나, 전류는 통과시키지 않았다. 실험 21 일 째, 모든 쥐에게 세포 분열 동안 티미 딘 대신에 DNA에 통합 된 5- 브로 모 -2'- 데 옥시 우리 딘 (BrdU)을 복강 내 주사 하였다. 실험 후, 래트를 4 개의 상이한 기간 (24 시간, 3 달, 6 달 및 12 달) 동안 유지시켰다. 분별 기 원리를 사용하여 섹션의 균일 무작위 샘플링을 통해 해마의 알려진 분획을 얻었으며 표본 추출 및 면역 염색 된 두꺼운 조직 섹션에 광학 장애 (3-D 프로브)를 적용했습니다. 고정 된 섹션은 일반적으로 프로세스 중에 z 축에서 축소됩니다가중 평균 단면 두께에 기초한 광학적 장애가이 특별한 경우에 사용되어야한다고 주장했다. 광학적 장애물의 초점 평면이 단면을 통해 알려진 거리만큼 아래로 이동함에 따라, BrdU 양성 뉴런은 관심 대상의 특징이 명확하게 인식 될 때 계산됩니다. 입체 음향학의 분야에서 계수되어야하는 총 입자 수에 관한 몇 가지 논쟁이있다. 일반적으로 150-200 개의 신경 세포가 적절한 정밀도, 즉 7-8 %의 계수를 얻기 위해 관심 구조에 포함됩니다. BrdU 양성 뉴런 카운트는 카메라가 장착 된 표준 현미경 및 2 배, 4 배 및 10 배뿐만 아니라 100 배 오일 침지 대물 렌즈 (개구 수 = 1.40) 및 동력 스테이지 . z 방향의 움직임은 디지털 마이크로 케이 터로 측정되었습니다. 최종 배율3000X였습니다.
Protocol
모든 동물 실험은 덴마크 동물 실험 감독관 (Danish Animal Experimentation Inspectorate)의 가이드 라인에 따라 수행되었으며 지역 실험 동물 실험 윤리위원회 (Committee for Experimental Animals)의 승인을 받았습니다.
1. 조직 처리
참고 : 4 ° C에서 밤새 0.2M 인산 완충액으로 희석 한 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에서 심근 관류 및 고정 후, 뇌를 4 일 동안 3 일 동안 인산 완충 식염수 (PBS)에서 30 % 수크로오스로 옮긴다. 그 후, 뇌는 분말 드라이 아이스로 동결되고 절편 될 때까지 -80 ° C에서 보관됩니다.
- 메스를 사용하여 뇌의 정중선을 따라 오른쪽과 왼쪽 반구를 분리 한 다음 첫 번째 뇌에서 무작위로 하나 또는 다른 반구를 선택한 다음 오른쪽과 왼쪽 반구 사이에서 체계적으로 이동하십시오 ( 그림 1A ). 샘플 된 반구를 디스크에 수직 인 장축을 가진 시편 디스크에 마운트하십시오장착 매체를 사용하여.
- 프리온 냉각을 위해 번호가 매겨진 다중 용기를 저온 유지 장치에 놓습니다.
- 표본 디스크를 저온 유지 장치에 장착하고 해마 (Bregma 1.80 - 7.04 16 ) 전체를 코로 날 평면 ( 그림 1B )의 80 μm 두께 섹션으로 자릅니다.
- 절편을 절삭 순서로 보관하려면 모든 시료 채취 섹션을 냉각 된 다 중 용기에 연속적으로 놓으십시오.
- cryoprotectant로 섹션을 완전히 커버하고 추가 사용까지 -20 ° C에서 컨테이너를 쥐고.
2. 면역 염색
참고 : 염색 절차 전반에 걸쳐 개별 섹션을 추적하려면 샘플 섹션을 25-well staining nets에 두십시오. 매 5 번째 섹션을 사용하여 면역 염색 및 후속 세포 카운팅을위한 해마 당 12 (8-16) 섹션의 평균 최종 번호를 부여하십시오.
- 섹션 1과 섹션 n ( 그림 1C ) 사이의 랜덤 스타트로 n 번째 섹션을 서브 샘플링하기 전에 컨테이너를 -20 ° C에서 실온 (RT)으로 옮깁니다.
- 예를 들어 붓을 사용하여 PBS로 채워진 페트리 접시에 놓인 25-well staining 그물을 번호순으로 옮깁니다.
참고 :이 시점부터 궤도 진탕 기 (2.3 ~ 2.9 절)에 놓인 일치하는 유리 접시에 놓인 얼룩 그물 부분을 보관하십시오. - 일치하는 유리 접시에 얼룩 그물을 전송하고 20 분 동안 증류수 (DH 2 O)에 희석 3 % 과산화수소 (H 2 O 2 )에서 부화하기 전에 RT에서 PBS에 10 분 동안 섹션을 두 번 씻으십시오.
- 0.1M 소듐 테트라 보레이트 중화 전에 세 가지 다른 염산 용액 (HCl (10 분 동안 0 ℃에서 1M, 10 분 동안 2M, 20 분 동안 37 ℃에서 2M)에 상기 절편을 옮긴다. 에이t RT 20 분.
- PBS (세척 버퍼)에 희석 1 % Triton X - 100 3 × 10 분 incubations 후, RT에서 1 시간 동안 10 % 태아 소 혈청 (차단 솔루션)를 포함하는 세척 버퍼로 섹션을 전송하십시오.
- 4 시간 48 분 동안 섹션을 품어 ° 차단 솔루션에 희석 마우스 - 안티 - BrdU에 1 : 100.
- 세척 버퍼에서 3 × 10 분 섹션을 씻고, 세척 버퍼에서 1:10 희석 말 무거운 과산화 효소에서 48 시간 품어.
- RT에서 10 분 동안 0.02 % H 2 O 2 를 포함하는 유사한 DAB 용액으로 옮겨지기 전에 PBS로 희석 한 후 PBS로 희석 한 0.01 % 디아 미노 벤지딘 (DAB)에서 7 분 동안 5 × 10 분 동안 PBS로 절편을 옮긴다.
- 일련의 세척 (PBS로 2 × 10 분 및 염화나트륨을 첨가하지 않은 인산염 완충액에서 2 × 10 분)을 완료하고 절편을 현미경 슬라이드에 번호 순서대로 장착하십시오.
- cresyl로 counterstaining하기 전에 약 30 분 동안 섹션을 건조제비꽃.
- 슬라이드 랙에 현미경 슬라이드를 놓습니다.
- dH 2 O를 포함하는 슬라이드 얼룩 접시에 10 분 동안 섹션을 rehydrate하고 15 분 DH 2 O에서 0.02 % cresyl 바이올렛으로 슬라이드를 전송할 수 있습니다.
- 에탄올 (3 분 동안 96 %, 2 × 2 분 동안 99 %)에서 절편을 3 번 탈수시키기 전에 2.12 단계를 반복한다.
- 2 × 15 분 동안 자일 렌에 섹션을 배치하고 장착을위한 빠른 건조 매체를 사용하여 슬라이드를 커버 슬립.
- 마지막으로 현미경 검사에 사용하기 전에 커버 슬립 슬라이드를 약 24 시간 동안 그대로 두십시오.
3. 광학 분별기를 이용한 BrdU 표지 뉴런의 총 수의 추정
참고 : 분석 할 섹션 수와 샘플 섹션 내의 광학 치료기 수와 같은 최적의 샘플링 매개 변수를 결정하기 위해 몇 마리의 동물을 포함한 시험 연구를 실시하십시오. 이 조종사는 또한조사자가 결정한 추정치의 만족할만한 정밀도를 얻기 위해 예비 CV (표준 편차 / 평균)와 CE (3.9.3 절 참조)를 조정할 수있는 가능성 (자세한 내용은 아래 참조). 마찬가지로 다음의 사항을 다루기 위해 z- 분포 분석을 수행하십시오 : 조직의 수축, z 축에서 세포의 분포 및 구역 전체의 염색 품질 14 .
- 섹션에서 조직의 두께를 확인하여 광학 분별 기의 사용에 적합하다는 것을 확인하십시오. 예를 들어 보호 구역을 포함하여 선택한 장애물 높이에 충분히 두껍습니다 (아래 참조). 참고 : 조직 두께는 관심 영역 내의 몇 군데에서의 측정입니다.
- 현미경의 동력 단계에 슬라이드를 놓고 선호하는 입체 소프트웨어를 켭니다.
- 저배율 대물 렌즈 (2X 또는 4X)를 사용하여 관심 영역을 윤곽을 그어 100X 오일 - 임( 그림 2A 참조).
- 계수 프레임의 특정 점 ( 예 : 모서리 또는 모서리 근처)을 사용하여 단면의 일부 피쳐가 초점에 나타날 때까지 초점 평면을 따라 이동하여 단면의 상단을 찾습니다. 이 z 위치를 0으로 등록하십시오 ( 그림 2B 참조).
- 계수면의 동일한 특정 점이 초점에있는 조직의 마지막 z 수준에 올 때까지 초점 평면을 조직을 따라 아래로 이동하고이 위치를 표시합니다. 국소 조직의 두께는 0에서이 끝점까지 정의되며 z 축에서 읽을 수 있습니다. 조직 두께를 등록하십시오 ( 그림 2B 참조).
- 섹션의 전체 두께에서 세포의 얼룩과 분포를 문서화하십시오.
참고 : BrdU로 표시된 뉴런의 분포는 필수 가드 존을 결정하기위한 지침으로 사용됩니다. 균일 한 세포 분포가 중요하지만,섹션의 상단과 하단 가까이에 더 적은 셀을 관찰 할 수 있으며, 이는 손실 된 캡의 영향을 나타낸다 (더 자세한 내용은 Dorph-Petersen et al., 2009 참조).- 샘플 BrdU로 표시된 뉴런과 각 계산 프레임의 선택한 모서리에서 측정 된 국부 섹션 두께와 함께 그들의 z 위치를 등록하십시오.
- BrdU 양성 뉴런의 수를 z 위치의 함수로 플롯합니다.
- 평균 단면 두께 및 세포 분포 (3.1 및 3.2 참조)를 토대로 장애물 및 보호 구역의 높이를 고정합니다.
참고 : 표면에 가까운 인공물을 피하기 위해 장애물 높이는 단면 두께보다 작아야합니다. 이 위험은 섹션의 상단과 하단에 가드 존을 포함시킴으로써 우회됩니다. - 장애물 사이의 간격을 결정하십시오.
- 분석 할 모든 섹션에서 관심 영역을 정하고 해당 영역을 등록하십시오.
- 이 영역을 합친 다음 b를 나눕니다.y는이 구역 내에 놓일 질병의 수.
참고 : 이전 경험을 바탕으로 75 개의 프로브가 필요합니다. 이것은 면적 및 해당 샘플링 위치의 근사치를 제공합니다 (A 단계 ) (자세한 내용은 West, 2012 참조). - xy 단계 크기를 제공하는 A 단계의 제곱근을 가져옵니다.
- 계산 프레임의 크기를 결정하십시오.
- 계수 프레임의 크기를 임의의 단위로 설정하고 섹션 3.3 및 3.4에서 얻은 매개 변수를 사용하여 BrdU 양성 뉴런의 파일럿 샘플링을 수행합니다.
참고 : 크기는 시행 착오에 의해 경험적으로 결정되어야하지만, 의사당 2-3 셀을 샘플링 할 수 있도록 조정하는 것이 좋습니다.
- 계수 프레임의 크기를 임의의 단위로 설정하고 섹션 3.3 및 3.4에서 얻은 매개 변수를 사용하여 BrdU 양성 뉴런의 파일럿 샘플링을 수행합니다.
- 파일럿 연구의 마지막 단계에 이어 세포 샘플링을 시작합니다.
참고 : 얻은 샘플링 매개 변수는 대략 150-200 셀 수를 초래합니다.효율적인 동물의 입체적인 디자인을 얻기에 충분한 각 동물 8 . - 100 × 오일 - 침지 목표와 2000-3000 × 최종 배율을 사용하여 BrdU 양성 뉴런을 계산합니다. 각 광학 disector에서 관심의 특징에 의해 명확하게 인식되는 BrdU 표시 뉴런을 식별 (현재 연구에서 기준은 BrdU 라벨 뉴런의 선두 가장자리가 처음으로 초점에 올 때입니다) ( 그림 2B ). BrdU 양성 뉴런을 세지 마십시오. 장애물 높이 내에서 관심의 특징으로 명확하게 인식되면 제외 선을 터치하십시오. 전체 입체파 정량화에 걸쳐 이러한 계산 규칙을 철저히 따라야하는 것이 매우 중요합니다.
참고 : BrdU가 모든 분열하는 세포에 통합되므로 형태는 뉴런과 다른 유형의 세포를 구별하는 데 사용됩니다. 노이론 특성은 중성 세포질과 어두운 nucleolus가있는 명확하게 정의 된 핵이다. BrdU 양성 세포는 glial 세포에 비해 상대적으로 더 큰 크기를 기반으로 새로 형성된 뉴런으로 인식됩니다. 단기간의 증식 (예 : 24 시간 미만)에 대한 연구에서 미성숙 신경 마커를 사용하는 이중 염색이 전제 조건 일 수 있음을 언급해야한다. - 셀의 총 수 (Σ Q - )에 역 샘플링 분율을 곱하여 각 뇌의 BrdU 양성 뉴런의 총 수를 예측하십시오.
...에 대한
어디에
Q- 는 가중 된 평균 단면 두께, h 는 이격 자의 높이, asf 는 면적 샘플링 분율, ssf 는 단면 st는 셀 카운트와 함께 i 번째 계산 프레임의 단면 두께입니다. 
( 14 , 18)에서 발생한다 . - 체계적으로 균일 무작위 표본 추출 (SURS)에서 BrdU 양성 뉴런의 샘플링 차이 인 오차 계수 (CE) 8 을 계산합니다.
- 먼저, 계산 된 BrdU 양성 뉴런의 총 수와 동일한 잡음을 계산합니다 :
- 다음으로 SURS의 분산을 계산합니다.
참고 : 우리는 해마의 면적과 세포 수를 섹션별로 원활하게 변화시킬 것으로 판단하여 결과적으로 "부드러움 등급"m = 1 (1/240) 8 , 19를 사용했습니다
어디에
P i 는 i 번째 섹션에서 객체에 대해 계산 된 포인트의 수이고 n은 섹션 4 , 20의 수 입니다. - 마지막으로 추정치를 계산합니다.
참고 : OCV 2 = ICV 2 + CE 2 와 같이 CE 값이 관측 된 CV의 절반보다 작 으면 일반적으로 최적의 정밀도가 달성됩니다. 여기서 OCV는 관측 된 CV이고 ICV는 CV 4 입니다.
- 먼저, 계산 된 BrdU 양성 뉴런의 총 수와 동일한 잡음을 계산합니다 :
Q- 는 가중 된 평균 단면 두께, h 는 이격 자의 높이, asf 는 면적 샘플링 분율, ssf 는 단면 st는 셀 카운트와 함께 i 번째 계산 프레임의 단면 두께입니다. 
( 14 , 18)에서 발생한다 . 
에프도 1 : 본 연구에서 사용 된 분별 기 원리에 따른 조직 처리를 나타내는 개략도.
실험에 이어 반구가 분리되고 오른쪽 또는 왼쪽 반구가 체계적으로 무작위로 선택됩니다 (A). 전체 해마에 걸쳐 완전한 두뇌는 80 μm의 두께의 코로나 섹션 (B)로 절단, 마지막 5 분의 섹션은 최종 immunostaining 및 stereological 부량 (C)에 대한 섹션 1 ~ 5 사이 무작위로 시작 하위 샘플링됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 광학 disectectors를 사용하여 stereological 샘플링 절차를 보여주는 그림.
(A) 조직학 처리 후, h해마 GCL / SGZ는 윤곽을 그리며 광학 디스 테리어는이 영역에 걸쳐 균일하고 무작위 적으로 적용됩니다. (B) 광학 장애 (왼쪽)에서 BrdU 양성 뉴런은 관심 대상의 특징이 의사 높이 내에서 명확하게 인식되고 계수 프레임 내부 또는 포함 라인 (오른쪽)에있는 경우에만 계산되었습니다. 제외 선을 만진 뉴런은 계산되지 않았습니다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Representative Results
샘플링 매개 변수
파일럿 연구 ( 그림 3 )에서 z 분포를 분석함으로써, 우리는 disector 높이에서 BrdU 양성 뉴런의 균일 한 분포를 발견했습니다. 섹션의 수축을 측정했습니다. 최종 평균 두께는 원래 80 ㎛로 절단 된 단면에서 26.4 ㎛ (19.0-32.0 ㎛)이었다. BrdU로 표지 된 뉴런의 조직 두께와 분포에 기초하여, 디 시터 높이는 10 ㎛로 설정되었고, 섹션의 상부 및 하부의 가드 존은 각각 5 ㎛ 및 4-17 ㎛로 설정되었다. 셀의 밀도에 따라 계수 프레임의 면적은 1414 또는 5210 μm 2 입니다. 계단 길이는 x 및 y 방향 모두에서 220 ㎛ 였고, 세포 카운팅은 동물 당 평균 12 (범위 8-16) 개의 섹션으로 수행되었다. 이러한 샘플링 매개 변수는 평균 133 (범위 33-372)의 BrdU- 양성 세포는 각 뇌 반구에서 173 개 (107-204 개)의 장애가있다.
예를 들어, 우리는 ECS 처리 된 래트에서 BrdU 양성 연결 추정을 위해 다음의 CV 및 CE 값을 얻었다 : 24 시간 : CV = 0.59, CE = 0.11; 3 개월 : CV = 0.34, CE = 0.12; 6 개월 : CV = 0.43, CE = 0.09; 12 개월 : CV = 0.22, CE = 0.09.
우리는 BrdU 얼룩 기법 10,11 와 함께 광학 fractionator를 사용하여 ECS 다음에 쥐 해마에서 새로 형성 뉴런의 총 개수와 그들의 장기 생존을 계량했다. 최종 결과는 대조군 동물의 네 그룹에서 기저 신경 발생을 나타내 었으며 생존 시간에 따라 유의 한 차이가 없었다 ( 그림 3 ). 또한, ECS는 24 시간에 BrdU 양성 뉴런의 총 수를 유의하게 증가시켰다대조 동물과 비교하여 실험 후 12 시간 (259 %, p <0.0001), 3 회 (229 %, p <0.001), 6 회 (152 %, p <0.05) 및 12 개월 (162 %, p <0.05)
그림 3 : 쥐 해마 GCL / SGZ에서 BrdU 양성 뉴런의 총 수의 정량 데이터 10 , 11 .
가로 막대는 평균값을 나타냅니다. 약어 : GCL, 과립 세포층; SGZ, 세분 영역; h, 시간; 개월. **** p <0.0001, *** p <0.001 및 * p <0.05 대 대조군 (n = 그룹 당 11-12). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
neurogenesis를 유도하는 방법론으로 ECS를 사용하여 우리는 해마에 새로운 BrdU 양성 뉴런의 형성에 즉각적인 260 %의 증가를 발견했습니다. 이 급격하게 생성 된 뉴런 풀에서 우리는 1 일에서 3 개월 사이에 40 %의 마비를 발견했으며, 새로 형성된 뉴런의 거의 50 %가 치료 후 최소 12 개월 생존했다. BrdU로 표지 된 뉴런의 계수는 엄격한 표본 추출 방식을 따랐으며, 전체 해마는 80μm 두께로 자른 다음 매 5 번째 섹션의 하위 샘플링을 한 후 섹션 1과 섹션 5 사이에서 무작위 추출을 시작했습니다. 이 섹션을 제공하는 것은 체계적으로 무작위로 선택됩니다. 이것은 철저한 계산없이 최종 결과의 분산을 줄이는 데 훌륭한 방법입니다. 이 표본 추출 방법을 통해 BrdU 양성 뉴런을 평균 12 (8-16) 마리의 해마각 쥐 두뇌의 알 섹션, 9-11 %의 최종 정밀도.
분별 기법을 사용할 때는 조직 수축 및 변형이 조직 학적 과정에서 자주 발생하기 때문에 계수를 수행하는 단면 높이의 분율을 알아야합니다. 사실,이 연구에서 두께의 상당한 축소를 보았습니다. 또한, Dorph-Petersen et al.에서 제시된 것처럼, 상이한 조직 수축이 발생할 수 있음을 주목해야한다. 그러나 완전한 구조의 분석이 가능하다면, 이러한 제한은 총 입자 수 즉 BrdU 양성 뉴런의 편향을 초래하지는 않는다. 조직 수축이 특별한 문제인 연구에서, 결과는 변형 된 조직에서 얻어지는 것이 항상 언급되어야합니다. 이 연구에서, 우리는 10 μm의 분열기 높이에서 세었다. 본 연구의 섹션은 최종 평균 두께가 26 μm, 5 μm가드 구역과 섹션 하단의 11-μm (평균) 가드 구역으로 구성됩니다. 가드 존은 대략 샘플링 된 입자의 직경이어야하기 때문에 이러한 매개 변수를 사용할 수 있습니다.
GCL / SGZ의 묘사에 따라, 장애물은 묘사 된 영역 내에 균일하게 무작위로 배치되었습니다. 장애가는 조사자가 결정한 정확도로 견적을 효율적으로 얻기 위해 표본 추출 및 계산을 최적화하는 고정 된 단계 길이로 배치되어야합니다. 최적의 정확도는 일반적으로 각 관심 구조의 셀을 150-200 셀까지 계산하여 얻을 수 있습니다 5 . 현재 연구에서, 우리는 각각의 쥐 해마에 BrdU 양성 뉴런 133 개 (범위 33-372)의 평균을 세었다. 일부 동물에서는 세포 수가 적기 때문에 BrdU 양성 뉴런의 수는 적절한 정밀도를 얻기 위해 필요한 일반적으로 수용 가능한 세포 수보다 낮아져 이러한 경우에 대해 상대적으로 높은 CE 값을 나타냈다. H그러나 우리가 CV 값의 절반보다 적은 CE 값을 얻었을 때 (대표 결과 섹션 참조) 추가 샘플링 및 계산이 필요하지 않았습니다. CV 값이 높으면 관찰 된 편차에 가장 큰 기여를하는 것은 생물학적 변이에 기인 한 것으로 나타났다. 사실, 우리는 현재 연구에서 계산 된 BrdU 양성 뉴런의 평균 수가 필요 이상으로 높았다 고 주장 할 수있다. 예를 들어, 한 그룹의 래트에서 우리는 9 %의 CE 값을 얻었으며, 43 %의 CV 값을 보았습니다. 이 특별한 경우에, 우리는 약 20 %의 정밀도를 목표로 할 수있었습니다. 요약하면, 현재 연구에서 BrdU 양성 뉴런의 총 수의 정확성은 입자의 실제 수에 대한 실제 치료 효과를 포착하기에 충분합니다. 특정 동물 군에서 다소 큰 생물학적 다양성으로 인해, 노력의 지출은 적더라도 동일한 견적을 허용 가능한 정밀도로 얻을 수있었습니다. 그룹 내의 높은 생물학적 차이는동물의 수를 늘림으로써 보상을 받는다.
정확한 세포 수를 얻기위한 황금 표준은 관심있는 모든 대상의 철저한 계산을 수반한다고 주장 할 수도 있습니다. 그러나 뇌의 대부분의 연구에서 이것은 방대한 수의 세포 때문에 가능하지 않습니다. 철저한 세포 계수보다 훨씬 효율적이지만 선택적 분별 기는 정확한 세포 수가 필수적이지 않은 경우 선호되는 세포 수의 차이를 간단히 스크리닝하는 것과 비교할 때 비교적 시간이 많이 소요됩니다. 20-30 % 이상의 차이점을 순차적으로 스크리닝 절차를 통해 감지 할 수있는 것은 우리의 경험입니다.
올바르게 수행 된 경우, 설계 기반의 입체 시학을 사용한 샘플링은 효율적인 방법으로 비 편향적이고 정확한 추정을 제공합니다 1 . 입체 시학의 불편한 성질은 복제 될 때, 실제 모집단 평균을 근사하고,견적 21 . 처음에는 관심있는 전체 구조 (이 연구에서는 해마 GCL / SGZ)의 대표 표본을 얻어야 통계적으로 유효한 섹션 4의 하위 집합에서 추정이 가능합니다. 적절한 수의 섹션 및 카운팅 프로브를 얻으려면 SURS를 적용하면 무작위 샘플링에 비해 편차가 줄어 듭니다 8 . 또한, SURS는 구조 내의 대상 입자가 구조의 크기, 모양, 방향 및 분포와 관계없이 동일한 확률로 샘플링되도록합니다. 정확하고 편견없는 추정치를 얻는 것이 프로젝트의 중심적인 측면 인 경우 이러한 입체 시학을 적극 권장합니다.
Disclosures
저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
숙련 된 기술 지원에 대해 Susanne Sørensen에게 감사드립니다. 이 작품은 Velux 재단의 보조금으로 지원되었습니다. 재샤 재단; Aase 및 Ejnar Danielsens 재단; 하트만 형제 재단; Jacob Madsen 감독과 아내 Olga Madsens 재단 박사 Sofus Carl Emil Friis와 아내 Doris Friis 'Trust; 1870 년의 기초; Torben과 Alice Frimodts Foundation 및 신경학 연구 재단. 원고 편집은 Inglewood Biomedical Editing에 의해 수행되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 5'-bromo-2'deoxyuridine - BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
| Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
| Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
| dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
| Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
| Ethanol - 70 % | Plum A/S | 201098 | |
| Ethanol - 96 % | Plum A/S | 201104 | |
| Ethanol - 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
| Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
| H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
| HCl | J. T. Baker | 6081 | |
| Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
| Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
| PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
| PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
| Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
| Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
| Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
| Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
| Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
| Xylene | VWR | 28,973,363 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cover slips | Menzel-Gläser | 24x50 mm #0 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
| Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Microscope camera | Olympus | DP72 | |
| Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
| Motorized stage | Prior | H101A | |
| Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
| New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
| Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
| Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
| Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
| Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
| Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
| Slide rack | Sakura | 4465 | |
| Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
| Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
| Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |
References
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