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Biochemistry

Analyse des supercomplexes de la chaîne de transport d'électrons mitochondriaux avec électrophorèse native, essais en gel et électroélution

Published: June 1, 2017 doi: 10.3791/55738
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

Summary

Ce protocole décrit la séparation des complexes fonctionnels de la chaîne de transport d'électrons mitochondriaux (Cx) IV et des supercomplexes de ceux-ci en utilisant une électrophorèse native pour révéler des informations sur leur assemblage et leur structure. Le gel natif peut être soumis à un immunoblot, des essais en gel et une purification par électroélution pour caractériser davantage les complexes individuels.

Abstract

La chaîne de transport d'électrons mitochondriaux (ETC) transduit l'énergie dérivée de la décomposition de divers combustibles dans la monnaie bioénergétique de la cellule, l'ATP. L'ETC est composé de 5 complexes de protéines massives, qui s'ajoutent également aux supercomplexes appelés respirasomes (CI, C-III et C-IV) et synthasomes (CV) qui augmentent l'efficacité du transport d'électrons et de la production d'ATP. Diverses méthodes ont été utilisées depuis plus de 50 ans pour mesurer la fonction ETC, mais ces protocoles ne fournissent pas d'informations sur l'assemblage de complexes individuels et de supercomplexes. Ce protocole décrit la technique de l'électrophorèse sur gel de gel de polyacrylamide (PAGE), méthode qui a été modifiée il y a plus de 20 ans pour étudier la structure du complexe ETC. L'électrophorèse native permet la séparation des complexes ETC dans leurs formes actives, et ces complexes peuvent ensuite être étudiés à l'aide d'immunoblot, d'essais en gel (IGA) et de purification par électroélution. En combinant le reLes résultats de la PAGE de gel native avec ceux d'autres essais mitochondriaux, il est possible d'obtenir une image complète de l'activité ETC, son assemblage et démontage dynamique, et comment cela régule la structure et la fonction mitochondriales. Ce travail traitera également des limites de ces techniques. En résumé, la technique de la PAGE native, suivie de l'immunoblot, de l'IGA et de l'électroélution, présentée ci-dessous, est un moyen puissant d'étudier la fonctionnalité et la composition des supercomplexes ETC mitochondriales.

Introduction

L'énergie mitochondriale sous forme d'ATP n'est pas seulement essentielle pour la survie cellulaire, mais aussi pour la régulation de la mort cellulaire. La génération d'ATP par phosphorylation oxydante nécessite une chaîne fonctionnelle de transport d'électrons (ETC, Cx-I à IV) et une ATP synthase mitochondriale (Cx-V). Des études récentes ont montré que ces grands complexes de protéines sont organisés en supercomplexes, appelés respirasomes et synthasomes 1 , 2 . Il est difficile d'analyser l'assemblage, la dynamique et la régulation de l'activité de ces complexes et supercomplexes massifs. Alors que les mesures de consommation d'oxygène prises avec une électrode d'oxygène et des dosages enzymatiques menés à l'aide d'un spectrophotomètre peuvent donner des informations précieuses sur l'activité du complexe ETC, ces analyses ne peuvent pas fournir d'informations concernant la présence, la taille et la composition de sous-unité du complexe de protéines ou des supercomplexes impliqués. Cependant, le développement de natif bleu et clair (BN et CN, respectivement) PAGE 3 a créé un outil puissant pour révéler des informations importantes sur la composition complexe et le montage / démontage et sur la régulation dynamique de l'organisation supramoléculaire de ces complexes respiratoires vitaux dans des conditions physiologiques et pathologiques 4 .

L'assemblage de ces complexes en supercomplexes d'ordre supérieur semble réguler la structure et la fonction 5 mitochondriales. Par exemple, l'assemblage respirasome augmente l'efficacité du transfert d'électrons et la génération de la force motrice du proton à travers la membrane interne mitochondriale 5 . En outre, l'assemblage des synthasomes augmente non seulement l'efficacité de la production d'ATP et le transfert d'équivalents d'énergie dans le cytoplasme 2 , mais il forme également la membrane interne mitochondriale dans les crêtes tubulaires 6 , </ Sup> 7 . Les études d'assemblage de supercomplexes lors d'un développement cardiaque dans des embryons de souris montrent que la génération de supercomplexes contenant du Cx-I dans le cœur commence à environ le jour embryonnaire 13,5 8 . D'autres ont montré que la quantité de supercomplexes contenant du Cx-I diminue dans le cœur en raison du vieillissement ou des blessures par ischémie / reperfusion 9 , 10 ou peut jouer un rôle dans la progression des maladies neurodégénératives 11 .

Ce protocole décrit des méthodes pour le gel natif PAGE qui peuvent être utilisées pour étudier l'assemblage et l'activité des complexes ETC et des supercomplexes. Le poids moléculaire approximatif des supercomplexes mitochondriaux peut être évalué en séparant les complexes de protéines dans des gels de polyacrylamide CN ou BN. La PAGE CN permet également la visualisation de l'activité enzymatique de tous les complexes mitochondriaux directement dans le gel (dosage en gel;IGA) 12 . Ce travail démontre l'activité des respirasomes en soulignant la capacité du Cx-I à oxyder le NADH par IGA et la présence de synthasomes en raison de l'activité d'hydrolyse ATP de Cx-V par IGA. Les complexes multiples et les supercomplexes contenant Cx-I et Cx-V peuvent également être démontrés en transférant les protéines sur des membranes de nitrocellulose et en effectuant un immunoblot. L'avantage de cette approche est que BN ou CN PAGE sépare généralement les complexes de protéines en fonction de leur taille et de leur composition physiologiques; Le transfert vers une membrane préserve ce motif de bandes. L'analyse de complexes de protéines dans une PAGE BN ou CN peut également être effectuée en utilisant 2D-PAGE (voir Fiala et al 13 pour une démonstration) ou par centrifugation 14 , 15 de densité de saccharose. Pour analyser plus avant une bande spécifique, elle peut être excisée de la BN PAGE, et les protéines de ce complexe protéinique peuvent être purifiéesD en les électroelutant dans des conditions natives. L'électroélution native peut être effectuée en quelques heures, ce qui pourrait faire une différence significative pour la diffusion passive (telle qu'utilisée dans la référence 16) des protéines d'un gel dans le tampon environnant.

En résumé, ces méthodes décrivent plusieurs approches qui permettent de caractériser davantage les supercomplexes de poids moléculaire élevé des membranes mitochondriales.

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Protocol

Toutes les expériences ont été effectuées en utilisant des coeurs à partir de souris C57BL / 6N (type sauvage). Les souris ont été anesthésiées avec du CO 2 avant la dislocation cervicale et toutes les procédures ont été effectuées en stricte conformité avec la Division de la médecine animale de laboratoire de l'Université de Rochester et conformément à la loi de l'État, à la loi fédérale et à la politique des NIH. Le protocole a été approuvé par le Comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux de l'Université de Rochester (Comité universitaire sur les ressources animales).

1. CN et BN PAGE

REMARQUE: Tous les équipements utilisés pour BN et CN PAGE doivent être exempts de détergent. Pour ce faire, lavez tous les équipements avec de l'acide chlorhydrique 0,1 M, puis rincez abondamment avec de l'H 2 O désionisé.

  1. Préparation
    1. Préparer un tampon anodique constitué de 25 mM d'imidazole, pH 7,0, à 4 ° C; Conserver à 4 ° C.
    2. Préparez un tampon cathodique pour CN ou BN PAGE.
      1. Pour le CN PAGE, utiliser 7,5 mM d'imidazole et 50 mM de tricine; Ajouter 0,5 g de désoxycholate de sodium et 0,2 g de lauryl maltoside par litre de tampon. Ajuster le pH à 7,0 à 4 ° C et conserver à 4 ° C.
      2. Pour BN PAGE, utiliser 7,5 mM d'imidazole et 50 mM de tricine et ajuster le pH à 7,0 à 4 ° C. Conserver à 4 ° C.
      3. Pour le tampon cathodique BN bleu clair, utiliser de l'imidazole 7,5 mM et de la tricine 50 mM. Ajuster le pH à 7,0 à 4 ° C et ajouter 20 mg de Coomassie par litre de tampon. Conserver à 4 ° C.
    3. Préparer le tampon d'extraction (EB) avec 50 mM de NaCl, 50 mM d'imidazole, 2 mM d'acide aminocaproïque et 1 mM d'EDTA. Ajuster le pH à 7,0 à 4 ° C et conserver à 4 ° C.
    4. Préparez un tampon de gel 3x (utilisé pour les gels BN et CN) avec 75 mM d'imidazole et 1,5 M d'acide aminocaproïque. Ajuster le pH à 7,0 à 4 ° C et conserver à 4 ° C.
    5. Préparer un tampon de chargement (LB) de 0,01 g de Ponceau S, 5 g de glycerol et 5 mL de H 2 O. Entreposer dans la piècetempérature.
    6. Préparez le bleu de Coomassie en ajoutant 50 mg de Coomassie à 1 mL d'acide 6-aminohexanoïque 500 mM. Ajuster le pH à 7,0 à 4 ° C et conserver à 4 ° C.
    7. Préparer 20 mM et 200 mM de lauryl maltoside dans H 2 O. Faire des aliquotes de 200 μL et les conserver congelées. Décongeler le détergent avant utilisation.
3% à 8% (mini) 4% à 10% (maxi)
0,5 gels (lumière) 0,5 gels (lourds) 0,5 gels (lumière) 0,5 gels (lourds)
AAB (ml) 0,42 1.3 2.5 7.7
Tampon CN / BN (mL) 1.6 1.6 8.5 8.5
H 2 O (ml) 2,7 1.4 14 6.3
Glycérol (g) 0 0,47 0 2.5
Volume (ml) 4.72 4.77 25 25
APS (μL) 27 27 65 65
TEMED (μL) 4 4 dix dix

Tableau 1: Quantités d'ingrédients nécessaires pour verser 1 mini- ou Maxi-PAGE. Les volumes utilisés dans ce tableau sont calculés pour 1 mini- ou 1 maxi-gel, 1,5 mm d'épaisseur. Le volume d'AAB repose sur une solution stock de 40%. Light et heavy se réfèrent au concentratDe AAB. APS et TEMED sont ajoutés après chaque colonne du mélangeur gradient est rempli avec une solution AAB.

  1. Verser et geler des gels
    REMARQUE: Utilisez un gradient de 3-8% ou 4-10% d'acrylamide / bisacrylamide (AAB) pour les gels CN ou BN, respectivement. Le tableau 1 résume les quantités de tampon, AAB, H 2 O, le glycérol, le sulfate d'ammonium (APS) et la tétraméthyléthylènediamine (TEMED) utilisé pour un mini-gel (85 mm de large x 73 mm de haut x 1,5 mm d'épaisseur) ou maxi-gel (160 Mm large x 200 mm de haut x 1,5 mm d'épaisseur). Les assemblages de plaques de verre avec des gels CN ou BN peuvent être réfrigérés dans un sac avec quelques ml de 1x tampon de gel ou enveloppés dans une serviette en papier mouillée avec 1x tampon de gel pour stockage. Les gels sont stables pour une utilisation jusqu'à une semaine.
    1. Pour verser le gel, placez le mélangeur à gradient sur une plaque d'agitation élevée pour s'assurer que le gel s'écoule par gravité dans la chambre de gel préparée.
    2. Remplir la chambre de sortie du mélangeur gradient avec 4,77 / 25 mL (Mini / maxi) de la solution lourde (avec une concentration accrue d'AAB).
    3. Ouvrez délicatement la connexion de la bague d'arrêt entre la chambre lourde et légère et permettez une goutte de solution de passer de l'autre côté.
      REMARQUE: ceci entraîne des bulles d'air du tube de raccordement et du robinet, ce qui empêchera l'écoulement entre les deux chambres. Cela ne peut pas être fait si les deux côtés ont déjà été remplis, car la pression égale empêchera la bulle de se déplacer.
    4. Remplissez l'autre chambre du mélangeur gradient avec 4,72 / 25 ml (mini / maxi) de la solution légère.
    5. Placez une barre d'agitation dans la chambre de sortie avec la solution lourde et commencez à remuer. Utilisez une vitesse de barre d'agitation qui ne provoque pas de bouillonnement.
    6. Ajoutez rapidement APS et TEMED à chaque chambre pour lancer la polymérisation.
    7. Ouvrez la connexion entre les deux chambres du mélangeur gradient et permettez le mélange pendant quelques secondes avant d'ouvrir la chambre de sortie pour verser le gel.
      REMARQUE: gravité avecIl enverra les deux chambres également, et le mélange de la lumière dans la solution lourde diminuera lentement la densité d'acrylamide du fond vers le haut du gel. Utilisez le contenu entier qui se trouve dans le mélangeur gradient pour verser le gel.
      1. À la fin, montez soigneusement le peigne, avec les puits à l'intérieur du gel pour éviter le mélange de bulles et de couches.
    8. Laver immédiatement le mélangeur à gradient avec de l'éthanol pour rincer tout gel. Rincer à l'eau et verser le second gel. Laissez les gels polymériser (généralement moins de 20 min est nécessaire pour les mini-gels).
    9. Pour faire fonctionner les gels, montez-les dans la pince de l'assemblage de l'électrode et remplissez la chambre centrale / supérieure avec un tampon cathodique CN ou bleu clair. Attendez quelques minutes pour vérifier les fuites avant d'ajouter un tampon d'anode à la chambre extérieure / inférieure.
      1. Retirez délicatement les peignes et lavez les puits avec un tampon cathodique à l'aide d'une seringue ou d'une pipette.
      2. Faites fonctionner les gels dans une chambre froide (4 ° C) ou complètement emballés dans de la glace.
        1. Pour la mini-PAGE du CN, utilisez 100 V pour la première heure et 200 V jusqu'à fin, habituellement 1 h 1-1. Sinon, exécutez la mini-PAGE du CN à 30-40 V pendant la nuit.
          NOTE: L'accent est mis ici sur les complexes de protéines de poids moléculaire élevé, de sorte que les complexes de protéines avec un poids moléculaire inférieur à 140 kDa seront éliminés du gel. Des temps de fonctionnement plus courts pour l'électrophorèse peuvent être utilisés pour conserver des complexes de faible masse moléculaire.
        2. Pour BN maxi-PAGE, utilisez 100 V et exécutez les gels pendant la nuit (environ 18 h).
          REMARQUE: le courant sera très faible (<15 mA), donc une alimentation électrique capable de gérer ces conditions est nécessaire. À ce stade, les gels peuvent être utilisés pour l'IGA ou l'immunoblot. Dans certains cas, des bandes ou des voies peuvent être découpées des gels à l'aide d'une lame de rasoir sur une plaque de verre pour une électroélution.
  2. La préparation des échantillons
    REMARQUE: les supercomplexes mitochondriaux liés à la membrane doivent être extraits deE membrane interne mitochondriale. Pour préserver les supercomplexes mitochondriales, utiliser des mitochondries fraîchement isolées ou des échantillons qui ont été congelés et décongelés une seule fois. Les calculs / volumes ci-dessous sont donnés pour les mini-gels (le puit d'un peigne de 10 po dans un gel d'une épaisseur de 1,5 mm peut contenir jusqu'à 35-40 μL) et des maxi-gels (le puit d'un peigne de 15 po jusqu'à 200 μL). En outre, sauvegardez une aliquote de chaque échantillon (habituellement 10 μl), à exécuter sur un gel SDS dénaturant pour la détection du canal anion dépendant de la tension (VDAC), en tant que commande de chargement.
    1. Placez une quantité appropriée ( par exemple, 10 à 50 μg de protéines pour les mini-gels et 50 à 200 μg pour les maxi-gels) de mitochondries isolées ou d'homogénéisation tissulaire dans des microtubges et centrifugez à 17 000 xg pendant 10 à 15 minutes à 4 ° C.
      REMARQUE: Cette étape supprime certaines des protéines mitochondriales solubles et / ou cytosoliques.
    2. Aspirer et jeter le surnageant et ajouter le tampon d'extraction à la quantité désiréePour charger sur le gel. Ressusciter doucement le sédiment sur la glace. Si désiré, ajouter un mélange général d'inhibiteur de protéase à ce stade.
      NOTE: Selon l'équipement utilisé ici, 30 μL ont été utilisés pour un mini-gel et 100 μL pour un maxi-gel, limitant le rapport protéine / tampon à pas plus de 2 μg de protéines à 1 μL de tampon.
    3. Ajouter un détergent ( p. Ex., 2 μg de lauryl maltoside / 1 μg de protéines, voir les résultats et les discussions des représentants pour plus d'informations).
      NOTE: Généralement, lauryl maltoside est utilisé, mais le digitonin peut également être utilisé.
    4. Incuber sur de la glace pendant 20 min. Mélanger doucement au début et de temps en temps pendant l'incubation en triturant et / ou en agitant le tube.
    5. Centrifuger à 17 000 xg pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les fragments de membrane et de tissu.
    6. Transférer le surnageant dans un nouveau tube. Pour les échantillons du CN, ajouter 1 μL de LB pour chaque 10 μL de volume d'échantillon; Le volume total de l'échantillon devrait être une applicationEnviron 40 μL pour un mini-gel et 130 μl pour un maxi-gel. Pour les échantillons de BN, ajouter Coomassie aux échantillons afin que le rapport du colorant au détergent soit de 1: 4 (p / p).
    7. Chargez 30 et 120 μL des échantillons dans les puits du mini- ou maxi-gel, respectivement. Utilisez les 10 μL restants de chaque échantillon pour le gel SDS dénaturant pour détecter VDAC comme un contrôle de chargement.
    8. Pour préparer les marqueurs de poids moléculaire, dissolvez 1 flacon d'un mélange d'étalonnage de poids moléculaire élevé (voir la Table des matériaux pour plus d'informations) dans 60 μL de tampon de gel BN / CN et ajouter 120 μL de H 2 0 et 20 μL de KG. Chargez 15 μL par voie.
    9. Exécutez les gels comme indiqué à l'étape 1.2.9.2.

2. Dosages en gel pour Cx-I et Cx-V

NOTE: Les tests sont effectués à température ambiante. Prenez des photos, des analyses ou des images des bandes en développement pour obtenir de la documentation. (Important) Les protéines ne peuvent pas être transféréesO membranes de nitrocellulose après avoir complété une IGA.

  1. Test Cx-I
    1. Préparation.
      1. Préparer un tampon de dosage de Tris 5 mM dans H 2 O, avec un pH de 7,4; ranger à température ambiante.
      2. Dissoudre 10 mg de NADH dans 1 ml de tampon de dosage. Conserver en parties aliquotes de 100 μL à -20 ° C jusqu'à l'utilisation; Éviter le gel et la décongélation.
      3. Peser 25 mg de Nitroblue tetrazolium dans un microtube.
      4. Préparer le fixateur en diluant 5 mL d'acide acétique dans 95 mL de H 2 O; ranger à température ambiante.
    2. Effectuer l'analyse.
      1. Mélanger 10 ml de tampon de dosage avec 25 mg de Nitroblue tetrazolium (concentration finale: 2,5 mg / mL) et 100 μL de 10 mg / mL de NADH (0,1 mg / mL). Ajoutez ceci à l'ensemble du gel, d'une voie ou d'une zone d'intérêt excisée à partir d'un gel CN.
        REMARQUE: ceci peut se faire dans un contenant transparent en plastique ou en verre. Veuillez noter que ce test ne peut pas être effectué après BN PAGE.
      2. Suivez le développement de bandes bleues après une agitation douce (rocker) pendant> 3 min.
      3. Fixer le gel dans 10 à 20 ml de solution d'acide acétique ou laver dans du Tris 5 mM, pH 7,4 pour arrêter la réaction. Prenez des photos pour la documentation (voir la table des matières).
  2. Test Cx-V
    REMARQUE: Le dosage de Cx-V doit être effectué en utilisant des gels de CN ou de BN additionnels, où l'on incube avec 5 μg / mL d'oligomycine (un inhibiteur de Cx-V) pour démontrer une activité indépendante de Cx-V.
    1. Préparation.
      1. Préparer un tampon de dosage avec Tris 35 mM et glycine 270 mM; Ajustez le pH à 8,3 à température ambiante. Stocker le tampon congelé dans des aliquotes de 50 ml, mais vérifier le pH après la congélation et la décongélation.
      2. Préparer MgSO4 1 M dans H 2 O; Conserver à 4 ° C jusqu'à l'utilisation.
      3. Peser 27,28 mg de Pb (NO 3 ) 2 dans un microtube.
      4. Pesez 60 mg d'ATP dans un microtube.
      5. Dissoudre 1 mg de oLigomycine dans 1 mL d'éthanol. Conserver à -20 ° C jusqu'à l'utilisation.
      6. Préparer un fixateur en mélangeant 50 ml de methanol avec 50 ml de H 2 O; ranger à température ambiante.
    2. Effectuer l'analyse.
      1. Incuber un gel, une voie ou une zone d'intérêt d'un gel BN ou CN pendant 2 h avec une agitation douce (rocker) dans 10-20 ml de tampon d'essai ± 5 μg / mL d'oligomycine (50-100 μL de 1 mg / Ml dans l'éthanol) à température ambiante.
      2. Après l'incubation, remplacer le tampon avec 14 mL de tampon de dosage frais et ajouter, dans l'ordre, 190 μL de MgSO4 1 M (14 mM), 27,28 mg de Pb (NO 3 ) 2 (5 mM), 60 mg d'ATP ( 8 mM) et 75 uL d'oligomycine (le cas échéant).
      3. Incuber avec une agitation douce (rocker) et regarder un précipité blanc, car les bandes sur les gels traités à l'oligomycine donneront des bandes non dépendantes de Cx-V.
        REMARQUE: L'apparition du précipité peut prendre plusieurs heures.
      4. Fixer le gel dans le methanol-( Par exemple, 50% de méthanol), car les solutions acides dissolvent le précipité de plomb. Photographiez les résultats.
        REMARQUE: Le précipité de plomb n'interfère pas avec la coloration de Coomassie des gels.

3. Transfert de protéines vers des membranes de nitrocellulose ou de difluorure de polyvinylidène (PVDF)

  1. Préparer un tampon de transfert de Tris 25 mM et de glycine 200 mM. Ajuster le pH à 8,3 et ajouter 0,0005 g / L de SDS et 200 ml / L de méthanol. Ranger à température ambiante.
    1. Couper une membrane de nitrocellulose ou de PVDF (taille des pores: 0,45 μm) avec une lame de rasoir ou des ciseaux à une taille légèrement supérieure à celle du gel.
      NOTE: Les membranes de nitrocellulose permettent la coloration de Ponceau S pour évaluer le chargement des protéines, tandis que les membranes PVDF produisent des bandes plus nettement définies.
  2. Protocole.
    1. Faire tremper la membrane de nitrocellulose, le papier filtre et les éponges pour unAu moins 10 minutes en mémoire tampon de transfert. Placez la membrane PVDF dans du methanol à 100% pendant 15 s ou selon la recommandation du fabricant avant de la placer dans un tampon de transfert. Placez la cassette ouverte du kit de transfert dans un bol plat avec tampon de transfert.
    2. Placez l'éponge et 1 à 2 couches de papier filtre à l'arrière de la cassette. Retirez les bulles.
    3. Placez le gel sur le papier filtre. Indiquez l'orientation du gel en coupant un coin du gel et / ou de la membrane.
    4. Placez la membrane sur le dessus du gel. Supprimez toutes les bulles.
    5. Placez le papier filtre et une éponge sur le dessus de la membrane. Retirez toutes les bulles dans ce sandwich.
    6. Fermez la cassette et placez-la dans le support de cassette du kit de transfert.
    7. Transférer les protéines à 25 V pendant environ 12-18 h.

4. Immunoblot

  1. Préparation.
    1. Préparer une tache de Ponceau (500 mL) en ajoutant 25 mLD'acide acétique et 0,5 g de Ponceau S à 475 ml d'H 2 O; Conserver à température ambiante (peut être réutilisé).
    2. Préparer une solution saline tamponnée au Tris (TBS) avec 200 mM de NaCl, 25 mM de Tris-Base et 2,7 mM de KCl. Réglez le pH à 8,0 et conservez à la température ambiante.
    3. Préparez TBS-tween (TBST) en ajoutant 0,5 mL / L Tween 20 à TBS; ranger à température ambiante.
    4. Préparer des solides au lait / TBST en dissolvant 5 g de solides de lait dans 100 mL de TBST. Conserver à 4 ° C et utiliser dans les 3 jours.
    5. Préparer BSA / TBST en dissolvant 3 g de sérum albumine bovine (BSA, fraction V) dans 100 mL de TBST. Conserver à 4 ° C et utiliser dans les 3 jours.
  2. Protocole.
    1. Lorsque le transfert est terminé, placez la membrane dans la solution Ponceau S pour visualiser toutes les protéines transférées. Étiqueter la position des marqueurs sur la membrane avec un crayon et documenter la membrane colorée Ponceau-S par une photographie ou un balayage.
    2. Laver la membrane 3 fois pendant 10 min chacune wiTh TBS sous une agitation douce.
    3. Bloquer la membrane avec des solides au lait / TBST pendant 1-2 h à température ambiante ou pendant une nuit dans une chambre froide avec une agitation douce.
    4. Laver la membrane pendant 10 minutes avec TBST sous agitation douce.
    5. Incuber avec un anticorps primaire pendant la nuit dans la chambre froide sous agitation douce. Diluer l'anticorps ( par exemple 1: 1 000 pour anti-ATP5A et -NDUFB6) dans BSA / TBST.
      NOTE: La plupart des anticorps donnent un meilleur signal sur les membranes à partir de gels indigènes lorsqu'ils sont incubés pendant une nuit.
    6. Laver la membrane pendant 10 minutes avec TBST sous agitation douce.
    7. Incuber avec un anticorps secondaire pendant au moins 60 minutes à température ambiante pour une agitation douce. Diluer l'anticorps (1: 5000 à 1: 50 000) dans du solide de lait / TBST.
    8. Laver la membrane 3 fois pendant 10 min à température ambiante avec du TBST sans agitation douce.
    9. Pendant le dernier lavage, préparer le substrat de chimioluminescence améliorée (ECL) selon les instructions de la manufaCturer.
    10. Incuber la membrane avec un substrat ECL en utilisant les instructions fournies par le fabricant.
    11. Détecter le signal sur le film en utilisant les instructions fournies par le fabricant du substrat ECL.

5. Electroélution

  1. Préparation.
    1. Préparer un tampon d'élution de 25 mM de tricine, 3,75 mM d'imidazole (pH 7,0 à 4 ° C) et 5 mM d'acide 6-aminohexanoïque.
      REMARQUE: Portez des gants en tout temps lors de la manipulation des électro-neutrons et des capuchons de membrane pour éviter toute contamination par des protéines externes.
  2. Le jour avant l'utilisation de l'électro-neutre pour l'électroélution native, procédez comme suit:
    1. Trempez les bouchons de membrane (coupure: 3,5 kDa) dans le tampon d'élution pendant 1 h à 60 ° C. Transférez les bouchons sur un tampon d'élution neuf et trempez pendant 12 h ou plus dans le réfrigérateur.
      REMARQUE: un poids moléculaire de coupure de 3,5 kDa empêche la perte de petit pLes rotéines qui peuvent facilement se dissocier du complexe protéique d'intérêt.
    2. Lavez le module électroeluter, les tubes en verre, le réservoir et le couvercle à fond avec de l'éthanol. Rincer à l'eau et laisser sécher l'équipement.
  3. Le jour de l'électroélution native, procédez comme suit.
    1. Placez une fritte dans le fond (givré) de chaque tube de verre à utiliser. Si nécessaire, placez le tube de verre dans le tampon d'élution et enfoncez la fritte de l'intérieur vers le bas du tube.
    2. Poussez le tube de verre avec la fritte dans le module de l'électro-neutre. Mouiller le passe-fils avec un tampon d'élution et faire glisser le tube de verre en place. Assurez-vous que le sommet des tubes en verre soit même avec le passe-fils.
    3. Fermez les oeillets vides avec des bouchons.
    4. Placez un capuchon de membrane humide au fond de l'adaptateur de silicone et remplissez l'adaptateur avec un tampon d'élution. Pipeter lentement le tampon dans l'adaptateur vers le haut et vers le bas pour éliminer les bulles d'air autour de la membrane de dialyse. </ Li>
    5. Faites glisser l'adaptateur tampon vers le bas du tube de verre. Retirez toutes les bulles qui apparaissent sur la fritte dans le tube de verre.
    6. Remplir chaque tube de verre avec un tampon d'élution.
    7. Placez les bandes excisées de BN PAGE dans les tubes en verre (voir l'étape 1.2.9.3). Couper les gros morceaux en petits morceaux. Assurez-vous que la hauteur de remplissage dans le tube de verre est d'environ 1 cm.
    8. Placez l'ensemble du module dans le réservoir.
    9. Ajouter environ 600 ml de tampon d'élution à froid dans le réservoir. Assurez-vous que les capuchons d'adaptateur en silicone sont dans le tampon pour éviter les bulles à la membrane de dialyse.
    10. Placez une barre d'agression au fond du réservoir.
      REMARQUE: l'agitation empêchera les bulles de coller au fond de la membrane de dialyse.
    11. Eluisez les protéines pendant 4 h à 350 V dans une chambre froide.
    12. Une fois l'élution terminée, retirez le module électroeluter du réservoir tampon et placez-le dans un évier ou un bol.
    13. Si un bouchon a été utilisé, retirez-leDans la chambre tampon supérieure. Sinon, utilisez une grande pipette pour retirer le tampon.
    14. Retirez le tampon de chaque tube de verre et jeter. Assurez-vous que l'adaptateur en silicone reste en place et que le liquide sous la fritte ne soit pas perturbé ou secoué.
    15. Retirez délicatement l'adaptateur en silicone, ainsi que le capuchon de membrane du fond du tube de verre. Pipettez le contenu (environ 400 μl) du capuchon en silicone dans un microtube. Avec 200 μL de tampon d'élution, rincer le capuchon de silicone et ajouter au microtube. Répétez pour tous les tubes en verre.
    16. Comme les bouchons de membrane peuvent être réutilisés, conserver les bouchons de membrane en les plaçant dans un tampon d'élution contenant 0,5 mg / ml d'azoture de sodium. Réfrigérez-les.
      NOTE: L'éluat a une faible concentration en protéines et peut être concentré à l'aide d'un filtre centrifuge.

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Representative Results

Pour visualiser les supercomplexes mitochondriales, des mitochondries fraîchement isolées de souris ont été utilisées 17 , 18 . Les supercomplexes mitochondriales sont sensibles aux cycles répétés de congélation et de décongélation, ce qui entraîne leur désintégration, bien que cela puisse être tolérable pour certains chercheurs. Si le gel est nécessaire pour le stockage, afin d'assurer les meilleurs résultats, les échantillons ne doivent pas subir plus d'un cycle de congélation et de décongélation.

Pour visualiser les complexes ETC mitochondriaux avec BN PAGE, 100 μg de protéines provenant de mitochondries de coeur isolées ont été chargés sur un gel de 4-10% ( figure 1A ). La tache de Coomassie dans le tampon de chargement et de cathode est suffisante pour étiqueter les complexes protéiques pendant la course. Les supercomplexes apparaissent après avoir augmenté le contraste digitalement (non affiché). Pour CN PAGE, deux échantillons de 20 μg oF de protéines provenant de mitochondries isolées ont été chargées sur un gel CN ​​de 3 à 8% et séparées ( figure 1B ). Le CN PAGE a été coloré avec Coomassie et a permis de visualiser les complexes protéiques. Après avoir augmenté le contraste digitalement, plusieurs complexes de protéines avec un poids moléculaire supérieur au monomère de Cx-I apparurent ( figure 1B , à droite). Les concentrations d'AAB utilisées ont permis aux plus grands supercomplexes d'entrer simplement dans le gel du puits. Cependant, un gel se terminant par un gradient d'AAB inférieur à 3% n'est pas assez stable pour manipuler le transfert ou pour exciser une bande ou une voie. En outre, la faible concentration d'AAB dans les parties supérieures des gels du CN de 3 à 8% maintient une certaine mobilité des complexes de protéines, ce qui est important si l'on considère l'électroélution native 19 .

Des monomères et des supercomplexes de Cx-I et des monomères, des dimères et des supercomplexes de CXV sont enzymatiquement actifs et peuvent être visualisés par IGA ( figure 1C- F ). Les tests montrent que, dans les mitochondries isolées du cœur, Cx-I et Cx-V sont présents dans des complexes de protéines supérieurs à leurs monomères respectifs. Dans le test IGA pour Cx-I, le NADH est oxydé et les électrons sont transférés pour réduire le nitroblue tetrazolium. Il en résulte une couleur bleue localisée au poids moléculaire des monomères Cx-I et des respirasomes / supercomplexes contenant la Cx-I ( figure 1C ). L'activité de Cx-V est évaluée à partir de la capacité de la sous-unité F 1 à hydrolyser l'ATP et peut être réalisée en utilisant des gels CN ou BN ( Figure 1D- F ). L'ADP généré à partir de cette réaction interagit avec le plomb et aboutit à un précipité blanc au niveau des monomères Cx-V, des dimères, des synthasomes et des sous-complexes (probablement la partie F 1 non assemblée de Cx-V). Notez que l'oligomycine élimine le lAbaissant ces bandes, confirmant qu'elles contiennent Cx-V ( Figure 1E ).

Pour toutes les expériences décrites ici, le détergent zwitterionique, le lauryl maltoside, a été utilisé à une concentration de 2 μg / 1 μg de protéine, qui est la concentration la plus élevée possible qui préserve les supercomplexes tout en fournissant des résultats cohérents et reproductibles ( figure 1F ). Cependant, l'efficacité du lauryl maltoside dépend du nombre de lot, des conditions de stockage et de l'âge. Ainsi, la concentration exacte utilisée dans un laboratoire n'est pas nécessairement la même que celle indiquée dans les manuscrits. La concentration appropriée de détergent solubilise les membranes mais conserve les complexes et les supercomplexes intactes et doit être déterminée en utilisant une variété de concentrations de lauryl maltoside ( figure 1F ). Pour CN PAGE, un volume d'échantillon total de 40 μL par puits était préparé, Ce qui donne un rapport protéine / détergent de 1 μg / 2 μg ou un rapport détergent / tampon de 1 μg / 1 μL (égal à 1,9 mM). A partir des 40 μL, 30 μL ont été appliqués par puits du mini-gel; Le reste a été utilisé comme aliquote pour la détection de VDAC, un contrôle de chargement ( Figure 2D ).

Pour l'immunoblot, le CN est préféré à BN PAGE car les protéines ne sont pas chargées avec Coomassie, ce qui peut entraver la détection par des anticorps. La figure 2 montre la détection de supercomplexes contenant les protéines Cx-I et Cx-V NDUFB6 et ATP5A provenant de mitochondries isolées du cœur, du foie et du cerveau. L'étiquetage de Ponceau S après le transfert et avant l'immunoblot peut être utilisé pour marquer les marqueurs de poids moléculaire et pour contrôler le chargement de protéines ( Figure 2A ). Cela permettra de visualiser les monomères des complexes protéiques de l'ETC sur le nitrocellulLes membranes ose, mais le marquage Ponceau S n'est pas toujours suffisant pour la visualisation des supercomplexes mitochondriaux ( figure 2A ), ce qui peut être réalisé par immunoblot.

Cx-I ne se monte pas en dimères et en tétramères, en soi, mais forme des supercomplexes de poids moléculaire de plus en plus grand avec Cx-III et Cx-IV 14 , 20 , 21 . Ici, l'utilisation d'un anticorps contre NDUFB6 montre que l'échantillon du cœur contenait plus de monomères Cx-I et supercomplexes de poids moléculaire élevé (bandes supérieures) que les mitochondries du foie ou du cerveau ( figure 2B ). La quantité de supercomplexes respirasome moyen était également beaucoup plus élevée dans le cœur que dans les autres tissus ( figure 2B ).

En utilisant des anticorps anti-ATP5A,Les monomères de Cx-V sont détectables dans les mitochondries de tous les tissus, tandis qu'un motif distinct de bandes représentatives des dimères (D) et des supercomplexes plus grands (SC), clairement visibles dans les mitochondries du cœur, ne sont pas aussi importants dans les mitochondries du foie et du cerveau ( Figure 2C ). La surexposition (1 min contre 20 s) de l'immunoffile montre plusieurs supercomplexes contenant Cx-V, qui pourraient représenter des tétramères et des synthasomes ( figure 2C ). Ces modèles de complexes de protéines contenant du Cx-V dans les mitochondries du coeur, du foie et du cerveau montrent des différences qui peuvent être spécifiques aux tissus et n'ont pas encore été explorées.

Le chargement des protéines de ces transferts peut être suivi par une coloration Ponceau S et une détection VDAC de l'aliquote mentionnée ci-dessus par SDS PAGE, comme le montre la figure 2D .

Tous les antiboLes matrices sont appropriées pour détecter une protéine dans la structure quaternaire ou tertiaire d'un complexe protéique après PAGE native. Pour surmonter ce problème, des voies entières et partielles du gel natif peuvent être montées sur un gel dénaturant pour une seconde dimension (gels 2D, voir référence 13 pour une démonstration). L'électrophorèse 2D est un outil précieux pour visualiser les protéines dans un complexe supramoléculaire. Cependant, comme le montre la figure 2 , les supercomplexes sont présents en quantités variables, et le signal des protéines individuelles des supercomplexes peut être difficile à visualiser dans la seconde dimension dénaturante. Pour surmonter ce problème, on a utilisé ici l'électroélution de complexes de protéines à partir de gels indigènes. Cela isole les bandes supercomplexes de plusieurs voies pour produire plus de matériel pour une étude plus approfondie.

Lors de l'utilisation de l'électroélution, seule la bande d'intérêt, qui a été identifiée par IGA et / ou visualisée sur une BN PAGE, est excIsed; Les protéines de ce morceau de gel sont encore purifiées par élution à partir du gel. La figure 3A montre une voie d'une BN PAGE à partir de laquelle des bandes représentant le monomère ont été excisées pour une électroélution. Pour évaluer l'activité de Cx-V du monomère après électroélution, l'éluat a été appliqué à une seconde PAGE CN. L'éluat du monomère contient encore du Cx-V actif enzymatiquement, mais des sous-complexes apparaissent également ( figure 3B ). La coloration d'argent de l'éluat après la CN PAGE native ( Figure 3C ) ou la SDS PAGE dénaturante ( Figure 3D ) indique la présence de protéines dans l'éluat et l'immunoblot contre ATP5A indique la présence de Cx-V dans les deux échantillons ( Figure 3D ).

Figure 1
Figure 1: Visualisation de MitochSupercomplexes ondulatoires. ( A ) Deux voies d'un maxi-gel de 4 à 10%, avec des échantillons de mitochondries du cœur isolées. Des aliquotes du même échantillon ont été conduites dans les deux voies, à 100 μg de protéines par puits. Les monomères des complexes de protéines I, II, III, IV et V de l'ETC sont clairement visibles et sont étiquetés à droite du gel. ( B ) Deux échantillons de mitochondries du cœur (1 et 2, 20 μg de protéine / voie) ont été séparés sur un CN PAGE et visualisés par coloration au Coomassie. SC indique la position des supercomplexes après agrandissement et amélioration numérique de la partie supérieure du gel (la zone est indiquée par des flèches rouges). ( C ) 20 pg de protéine mitochondriale ont été séparés sur une PAGE CN à 3-8% et ont été traités pour l'IGA Cx-I. Des images magnifiées et numérisées augmentent les bandes du produit de réaction Cx-I. ( D ) 20 μg de protéine mitochondriale ont été séparés sur une PAGE BN de 3 à 8% et traités pour CGA-V IGA. Magnifi Les images numériques et améliorées illustrent les bandes du produit de réaction Cx-V. ( E ) 50 μg de protéine mitochondriale ont été séparés sur une PAGE CN à 5-15% et traités pour CGA-V IGA sans (-) et avec (+) 5 μg / mL d'oligomycine (Oligo). ( F ) La protéine mitochondriale (20 μg / lane) a été solubilisée avec 2 à 6 μg de lauryl maltoside / 1 μg de protéine, comme indiqué au sommet du gel, et séparé sur un gel CN ​​3-8% suivi de Cx- V IGA. Toutes les images ont été photographiées en utilisant soit une table de lumière ( A - C ) soit une surface noire ( D - F ). Les spécifications de l'appareil photo figurent dans la table des matières. L'emplacement des marqueurs de poids moléculaire (MW) est indiqué sur le côté gauche de tous les panneaux. Abréviations: D = dimères; F 1 * = sous-complexe de Cx-V; LM = lauryl maltoside; M = marqueur de poids moléculaire; M = monomères; SC = supercomplexes.G1large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2: Détection des supercomplexes mitochondriales par immunoblot. 20 μg de protéines du coeur (H), du foie (Li) et des mitochondries du cerveau (B) ont été séparées sur une PAGE CN à 3-8% et transférées sur une membrane de nitrocellulose. ( A ) La coloration de Ponceau S de la membrane indique la présence de complexes de protéines et de marqueurs de poids moléculaire (m). La flèche bleue pointe vers le haut du gel. ( B ) La protéine Cx-I, NDUFB6, a été immunomarquée sur la tache indiquée dans (A) (1 minute d'exposition). ( C ) Le Cx-V a été visualisé avec un anticorps anti-ATP5A (20 s et 1 minute d'exposition, comme indiqué). Les flèches rouges dans (B) et (C) indiquent la zone magnifiée et augmentée numériquement pour la visuaLisation des supercomplexes contenant Cx-I et Cx-V, et la flèche bleue pointe vers le haut du gel. ( D ) Ponceau S et immunomarquage de l'aliquote VDAC de chaque extrait utilisé dans (A), (B) et (C), qui ont été séparés par SDS PAGE et transférés à la nitrocellulose. Abréviations: M = monomères de Cx-I ou Cx-V, D = dimères de Cx-V, SC = supercomplexes contenant Cx-I ou Cx-V. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure 3
Figure 3: Electroélution de Cx-V. ( A ) BN PAGE d'un échantillon mitochondrial. La bande en boîte représente le monomère de Cx-V qui a été excisé et électro-éclairé. ( B ) L'éluat a été soumis à CN PAGE, et l'IGA subséquente pour Cx-V démontre des monomères (M)Et sous-complexes contenant F 1 de Cx-V. ( C ) La coloration d'argent du CN PAGE de l'éluat démontre des monomères (M). ( D ) La coloration d'argent (panneau de gauche) et l'immunoffile pour ATP5A (panneau droit) d'un dodécylsulfate de sodium dénaturant (SDS) PAGE de l'éluat indique la présence de Cx-V. Pour SDS PAGE, veuillez consulter les protocoles publiés ailleurs. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Un ETC fonctionnel est nécessaire pour la génération d'ATP mitochondriale. Les complexes de l'ETC peuvent former deux types de supercomplexes: les respirasomes (Cx-I, -III et -IV) 1 et les synthasomes (Cx-V) 2 . L'assemblage de chaque complexe est nécessaire pour un ETC intact, alors que l'organisation de l'ETC en supercomplexes est censée augmenter l'efficacité générale ETC 5 , 22 . La façon dont ces supercomplexes assemblent et désassemblent n'est pas bien comprise, mais les protocoles présentés ici peuvent permettre une meilleure compréhension de ces processus.

Le principal défi de l'étude de l'assemblage ETC est la taille de ces complexes protéiques. Par exemple, les respirasomes mitochondriaux peuvent consister en Cx-I (environ 880 kDa) et une ou plusieurs molécules de Cx-III (460 kDa) et Cx-IV (200 kDa, actif en tant que dimère), ce qui se traduit par un supercomplexe à base de molécules Poids d'environ2 000 kDa. En outre, Cx-V a un poids moléculaire d'environ 600 kDa, mais il a été démontré qu'il s'ajoute dans des dimères, des tétramères, des oligomères et des rubans de dimères 7 , 23 , ce qui entraîne des supercomplexes avec un poids moléculaire d'au moins 2 000 kDa. Compte tenu de la taille énorme de ces supercomplexes, plusieurs approches partiellement liées ont traditionnellement été utilisées pour identifier et caractériser ces supercomplexes, par ce laboratoire et par d'autres 8 , 14 , 24 .

Ce travail a démontré la technique du gel natif PAGE, où les complexes de protéines actives sont extraits doucement de la membrane mitochondriale à l'aide de détergents doux. Les complexes migrent dans les gels principalement en raison de leur taille et de leur charge intrinsèque (CN PAGE) ou en raison de la taille et de la charge négative du bleu de Coomassie lié aux protéines (BN PAGE). Ces gels peuvent être colorés en utilisant CBleu d'oomassie ( p. Ex., Dans des gels du CN) ou une tache d'argent ( par exemple, dans BN et CN PAGE) pour révéler des bandes de protéines.

Le lauryl maltoside a été utilisé pour les expériences démontrées ici parce que ce détergent a travaillé de manière plus fiable. Alternativement, la digitonine peut être utilisée pour extraire des complexes de protéines 12 . Les données des mitochondries isolées des cœurs adultes, des foies et des cerveaux ont été montrées ici, mais ces techniques ont été réalisées sur des homogénéats de coeur embryonnaires et adultes 8 . D'autres ont effectué cette technique en utilisant des mitochondries isolées à partir de cellules cultivées 24 . Cependant, lorsque l'on utilise des homogénats de tissus ou des cellules cultivées avec une forte teneur en ADN, il peut être utile d'ajouter une nuclease pour éviter les rayures pendant l'électrophorèse 25 .

L'activité des différents complexes peut être testée directement dans le gel, comme cela a été démontré ici pour Cx-I et Cx-V, et tecDes techniques sont également disponibles pour examiner les activités de Cx-II, -III et -IV 12 . Cependant, l'analyse de ces IGA doit être effectuée avec attention. Tout d'abord, la réaction enzymatique pourrait être due à des enzymes non-ETC ou à des complexes incomplètement assemblés. Par exemple, il est courant d'effectuer l'IGA Cx-V avec un gel parallèle qui a été traité avec de l'oligomycine pour inhiber le Cx-V intact ( Figure 3 ). En outre, d'autres oxydases NADH peuvent expliquer l'activité en gel Cx-1. On pourrait effectuer une IGA parallèle en présence d'un inhibiteur de Cx-I, comme la rotenone. Cependant, sur la figure 1 , on utilisait des mitochondries isolées, de sorte que les oxydases de NADH cytoplasmiques n'étaient pas présentes; Ainsi, les données représentent probablement des monomères et des supercomplexes contenant Cx-I. En outre, la quantification de ces résultats est possible en mesurant l'intensité du signal des bandes sur des photographies ou des scans. Les inconvénients de cette approche comprennent les différences entreÀ l'intérieur des gels, la mobilité du produit de réaction, l'incapacité de quantifier adéquatement le produit tout au long de la profondeur du gel et la non-linéarité potentielle de la réaction 27 . Pour surmonter ces derniers, certains ont suggéré d'obtenir des taux de réactions à l'aide de photographies en série, mais cela n'a pas été essayé ici.

La protéine dans les gels indigènes peut également être transférée aux membranes et la composition protéique des bandes peut être examinée par immunoblot (démontré ici) ou 2D PAGE (démontré dans la référence 13 ). Les monomères des complexes ETC ont traditionnellement été identifiés par leur abondance dans les gels indigènes de mitochondries isolées, leur emplacement dans le gel et leur position par rapport à la protéine marqueur moléculaire ( figure 1 ). En outre, l'étiquetage des immuno-transferts ultérieurs avec des anticorps spécifiques des sous-unités de différents complexes contribue à identifier le complexe et la compositionDe supercomplexes. Par conséquent, anti-NDUFB6 et -ATP5A identifient les monomères et les supercomplexes contenant Cx-1 et Cx-V, respectivement, comme cela a été démontré ici. Les anticorps de Cx-II à IV peuvent être utilisés dans le même but. Dans certains cas, les anticorps qui fonctionnent bien dans les gels dénaturants peuvent ne pas fonctionner bien dans les gels indigènes en raison du fait que certains anticorps sont spécifiques à la protéine dénaturée ou qu'un épitope peut être masqué par d'autres protéines dans un complexe indigène.

La détermination exacte du poids moléculaire de ces supercomplexes est difficile car la plupart des marqueurs de poids moléculaire disponibles sont inférieurs à la taille des monomères Cx-V. La migration des complexes de protéines dans un gel natif dépend de la taille, de la charge intrinsèque et du détergent utilisé 28 . Dans les exemples ici, les monomères des complexes ont été identifiés à base de gels, de marqueurs et d'immunoblot. Les dimères de Cx-V ont été identifiés en fonction de la migration relative par rapport aux monomères de Cx-I et -V et d'immunoBlotting. Tout le reste au-dessus des monomères et des dimères dans les gels, les IGA et les immunoblots sont considérés comme des supercomplexes.

Les immunoblots indigènes peuvent également être quantifiés pour des supercomplexes en analysant la densité de bande en utilisant des techniques standard. Cette méthode n'a pas été présentée ici, mais une publication récente démontre cette technique 8 . La normalisation du chargement des protéines peut être effectuée en utilisant la coloration rouge Ponceau de la voie ou en sauvegardant un échantillon de l'extrait mitochondrial pour mesurer la densité de la bande VDAC sur un immunoblot dénaturant ( Figure 2A et D ). En outre, l'examen du rapport des supercomplexes aux monomères dans le même immuno-transfert est une autre façon de quantifier la densité de la bande, mais il faut prendre soin de prendre des photos à des moments différents pendant le développement du blot afin que les bandes ne soient pas trop exposées.

Enfin, des bandes de gels indigènes peuvent être électroélérées pour générer du purifieD, complexes de protéines actives qui peuvent être assemblés dans des complexes d'ordre supérieur et peuvent être utilisés pour d'autres études de fonction complexe. Par exemple, les monomères Cx-V ont été préalablement électroélérés et reconstitués dans des liposomes pour démontrer la fonctionnalité électrique 29 . Une approche alternative de l'électroélution native est l'élution par diffusion passive dans le tampon environnant 16 , mais ceci est lent par rapport à l'électroélution native. Enfin, un problème majeur avec l'électroélution est de maintenir la fonction enzymatique du complexe de protéines électro-éclairé, car le complexe peut se dissocier pendant la purification. Par conséquent, tout essai de fonction après isolement par cette technique devrait être rigoureusement testé.

En combinant ces protocoles avec des analyses enzymatiques et des mesures de consommation d'oxygène, qui sondent la fonction des complexes ETC individuels et l'activité de l'ETC 30 complet et d'autres méthactérieOds, tels que l'évaluation cristallographique 31 et électronique microscopique de la structure des complexes et des supercomplexes, une image complète du fonctionnement interne de l'ETC peut et a émergé. Nous sommes plus près de comprendre comment les complexes sont assemblés, comment les électrons coulent vers le bas de la chaîne et comment les protons sont pompés à travers la membrane pour générer le gradient, puis retourner à la matrice via Cx-V pour générer de l'ATP. Sans aucun doute, ces techniques seront affinées pour fournir des détails supplémentaires sur la structure, la fonction et la régulation dynamique de l'ETC.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions de l'American Heart Association Founder's Affiliate [12GRNT12060233] et le Strong Children's Research Centre de l'Université de Rochester.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protean II mini-gel chamber Biorad 1658004 Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis
Protean XL maxi-gel Biorad 1653189 Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis
Gradient maker, Hoefer SG15 VWR 95044-704 Pouring mini-gel gradients
Gradient maker, maxi-gel VWR GM-100 Pouring maxi-gel gradients
Transfer kit Biorad 1703930 Complete set to wet transfer of proteins onto membranes
Electroeluter model 422 Biorad 1652976 Electroelution of proteins from native or SDS PAGES
Glass plates Biorad 1653308 Short plates
Glass plates Biorad 1653312 Spacer plates
Glass plates Biorad 1651823 Inner plates
Glass plates Biorad 1651824 Outer Plates
Power supply Biorad 1645070 Power supply suitable for native electrophoresis
ECL-Western  Thermo Scientific 32209 Chemolumniscense substrate
SuperSignal-West Dura Thermo Scientific 34075 Enhanced chemolumniscense substrate
Film/autoradiography film GE Health care 28906845 Documentation of Western blots
Film processor CP1000 Agfa NC0872640
Canon Power Shot 640  Canon NA Taking photos to document gels, membranes and blots.
Canon Power Shot 640 Camera hood  Canon shielding camera for photos being taken on a light table
Acrylamide/bisacrylamide Biorad 1610148 40% pre-mixed solution
Glycine Sigma G7403
SDS (sodium dodecyl sulfate) Invitrogen 15525-017
Tris-base Sigma T1503 Buffer
Tricine Sigma T0377
Sodium deoxychelate Sigma D66750 Detergent
EDTA Sigma E5134
Sucrose Sigma S9378
MOPS Sigma M1254 Buffer
Imidazole Sigma I15513 Buffer
Lauryl maltoside Sigma D4641 Detergent
Coomassie G250 Biorad 161-0406
Aminohexanoic acid Sigma O7260
Native  molecular weight kit GE Health care  17-0445-01 High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis.
Name Company Catalog Number Comments
NADH Sigma N4505
Nitroblue tetrazolium Sigma N6639
Tris HCl Sigma T3253
ATP   Sigma A2383
Name Company Catalog Number Comments
Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): Sigma 228621
Oligomycin Sigma O4876
Name Company Catalog Number Comments
Ponceau S Sigma P3504
anti-ATP5A Abcam ab14748 antibody to ATP synthase subunit ATP5A
anti-NDUFB6 Abcam ab110244 antibody to Cx-1 subunit NDUFB6
anti-VDAC Calbiochem 529534 antibody to VDAC
ECL HRP linked antibody GE Health Care NA931V secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC
Blocking reagent Biorad 170-6404
BSA
sodium chloride Sigma S9888
potassium chloride Sigma P9541
EGTA Sigma E3889
Name Company Catalog Number Comments
Silver staining Kit Invitrogen LC6070

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References

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Biochimie Numéro 124 Mitochondrie chaîne de transport d'électrons respirasomes synthasomes électrophorèse native claire tests en gel électroélution
Analyse des supercomplexes de la chaîne de transport d&#39;électrons mitochondriaux avec électrophorèse native, essais en gel et électroélution
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Beutner, G., Porter Jr., G. A.… More

Beutner, G., Porter Jr., G. A. Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution. J. Vis. Exp. (124), e55738, doi:10.3791/55738 (2017).

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