Summary
Neste método, as células musculares primárias humanas são cultivadas in vitro para obter miotubos diferenciados e as taxas de absorção de glicose são medidas. Nós fornecemos um protocolo detalhado para quantificar taxas em estados basais e estimulados por insulina usando [ 3 H] 2-desoxi-D-Glucose radiomarcado.
Abstract
O músculo esquelético é o maior depósito de glicose em mamíferos e contribui em grande parte para a homeostase da glicose. A avaliação da sensibilidade à insulina das células musculares é de grande relevância para todos os estudos dedicados a explorar o metabolismo da glicose muscular e caracterizar alterações metabólicas. Nas células musculares, as proteínas do transportador de glicose 4 (GLUT4) translocam para a membrana plasmática em resposta à insulina, permitindo assim a entrada maciça de glicose na célula. A capacidade das células musculares para responder à insulina, aumentando a taxa de captação de glicose é uma das leituras padrão para quantificar a sensibilidade das células musculares à insulina. Os miotubos primários humanos são um modelo in vitro adequado, uma vez que as células mantêm muitas características do fenótipo do doador, incluindo a sensibilidade à insulina. Este modelo in vitro também é adequado para o teste de quaisquer compostos que possam impactar a capacidade de resposta da insulina. As medições da taxa de absorção de glicose em miotubos diferenciados refletemSensibilidade à insulina.
Neste método, as células musculares primárias humanas são cultivadas in vitro para obter miotubos diferenciados, e as taxas de absorção de glicose com e sem estimulação com insulina são medidas. Nós fornecemos um protocolo detalhado para quantificar as taxas de transporte de glicose passiva e ativa usando [ 3 H] 2-desoxi-D-Glucose radiomarcado ([3H] 2dG). Os métodos de cálculo são fornecidos para quantificar as taxas basais e estimuladas por insulina, bem como a dobra de estimulação.
Introduction
O músculo esquelético é o maior depósito de glicose em mamíferos e contribui em grande parte para a homeostase da glicose. Este tecido responsivo à insulina é o principal local de captação de glicose que é desencadeado pela estimulação de insulina 1 .
Na diabetes tipo 2, a resistência à insulina é observada em vários tecidos, incluindo o músculo esquelético, e conduz à concentração de glicose no sangue acima do normal. Assim, é de grande relevância para determinar o nível de sensibilidade à insulina deste tecido e suas células, quer seja para caracterizar um defeito em um sujeito, quer para avaliar a eficiência de um tratamento com o objetivo de melhorá-lo. Em indivíduos humanos ou animais, a técnica de padrão-ouro para avaliar a sensibilidade à insulina é o grampo hiperinsulinêmico-euglicêmico. Introduzido por DeFronzo em 1979 2 e modificado desde 3 , 4 então, o método permite quantificar todo o corpo aNd tecidos de resposta de insulina medida como a taxa de glicose a ser perfundida sob estimulação de insulina para manter a concentração normal de glicose no sangue.
A exploração da sensibilidade à insulina também pode ser realizada no nível celular usando modelos musculares in vitro e a medição das taxas de absorção de glicose continua sendo uma ferramenta eficiente e confiável para quantificar a resposta biológica da célula à estimulação de insulina 5 , 6 , 7 . De fato, a medida da absorção de glicose quantifica a resposta biológica celular à estimulação de insulina, desde a ligação da insulina ao seu receptor até a translocação de vesículas enriquecidas com GLUT4 e incluindo sinalização intracelular e cascatas de fosforilação 8 .
Isso é de grande interesse com amostras humanas, pois os miotubos diferenciados mantêm muitas características do fenótipo do doador, incluindo propriedades metabólicasIes e distúrbios observados no paciente 9 , 10 , 11 , 12 . Os miotubos apresentam semelhanças estruturais, metabólicas e fenotípicas com o músculo esquelético 13 , 14 , incluindo a expressão de transportadores de glicose 15 e a maquinaria de sinalização de insulina celular 16 . Assim, a medição da absorção de glicose em miotubos primários é relevante para caracterizar o fenótipo muscular de um doador, ou investigar o efeito de uma intervenção (medicamento, nutrição ou atividade física) na sensibilidade à insulina na célula muscular.
A medida da absorção de glicose em miotubos cultivados também é uma ferramenta confiável ao realizar experimentos que modificam a sensibilidade à insulina 17 , 18 . O in vitro 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
Aqui descrevemos um protocolo detalhado para a cultura e diferenciamos os miotubos humanos e medimos as taxas de absorção de glicose celular. O método é aplicável a qualquer fonte de células precursoras de músculo humano, sejam eles provenientes de preparações em laboratório, colaboração ou fornecedores comercialmente disponíveis. As linhas celulares musculares imortalizadas, como C2C12 e L6, respectivamente, de origem de rato e rato, também podem ser usadas para medição de absorção de glicose com este protocolo 7 .
Nós fornecemos um protocolo detalhado para quantificar as taxas em estados basais e estimulados por insulina usando [3H] 2dG radiomarcado. TO uso de um análogo de glicose rotulado permite uma determinação precisa da entrada de glicose com material de partida reduzido, uma condição comum ao trabalhar com células primárias. A molécula de glicose modificada é incapaz de entrar em caminhos metabólicos e, assim, se acumula dentro da célula, permitindo quantificação confiável através da radioatividade celular total. As condições experimentais incluem o uso de um inibidor do transporte de glicose (citocalasina B), e as medidas são realizadas com e sem insulina. Esta combinação permite a determinação das taxas de entrada ativa da glicose, bem como o cálculo da variação da dobra para o índice de resposta à insulina. O método é apresentado com uma dose de insulina durante um único tempo de incubação, mas o protocolo pode ser facilmente modificado para experiências de resposta a dose ou tempo 12 .
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Protocol
1. Preparação de meios e soluções de cultura de células
- Preparação de meios de cultura
- Prepare o meio de proliferação (PM), completando o meio F-10 de Ham com glutamina (2 mM), penicilina / estreptomicina (5 μg / mL final), 2% de soro de vitelo fetal (FCS) e 2% de suero.
- Prepare o meio de diferenciação (DM), completando o meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com glutamina (2 mM), penicilina / estreptomicina (5 μg / mL final) e FCS a 2%.
- Preparação de soluções de absorção de glicose
Cuidado: o manuseio de material radioativo só é permitido em uma área restrita e controlada por pessoal autorizado. Os materiais e os resíduos devem ser manuseados de acordo com os procedimentos adequados, diretrizes e legislação local.- Para preparar a solução salina tamponada com fosfato de X-Dulbecco (X-DPBS), faça uma solução de DPBS contendo 0,2% (p / v) (concentração final) de soro bovino albUmin (BSA). Filtra a solução através de um filtro de 0,2 μm. Armazenar a 4 ° C.
- Para preparar a solução fria de 2-desoxi-D-glicose (2dG), pesa 16,4 mg de 2dG e solubiliza-se em 10 mL de água destilada para se obter uma solução 10 mM. Armazenar a 4 ° C.
- Adicione 600 μL de 2dG frio e 6 μL de [3H] 2dG radiomarcado a 5400 μL de X-DPBS para obter a solução 2dG (2dG *) radiomarcada.
NOTA: A concentração final é 1 mM 2dG e rotulagem é 1 μCi / mL.- Coloque uma alíquota de 20 μL (TC20) de uma solução 2dG * radiomarcada.
- Preparação de misturas de incubação
- Para a mistura de citocalasina B, adicione 2 μL de citocalasina B 20 mM a 2 mL de solução 2dG * radiomarcada.
NOTA: A solução de reserva de citocalasina B é de 10 mg / mL em sulfóxido de dimetilo (DMSO). - Para a mistura DMSO, adicione 4 μL de DMSO aos restantes 4 mL de solução 2dG * radiomarcada.
2. Cultura das células musculares primárias humanas
- Semeadura de placas de 6 poços com células de células musculares humanas
NOTA: Use in-house (veja a referência 24 para detalhes) ou células de satélite musculares disponíveis comercialmente a partir de um frasco congelado (contendo 250,000 células). O seguinte procedimento é dado para 250.000 células, de modo a obter uma placa de 6 poços necessária para a medição da absorção de glicose em uma única condição.- Descongelar rapidamente os frascos congelados de 24 ou as preparações comerciais de células satélites de músculo humano em água pré-aquecida (37 ° C) até que apenas um pequeno bloco de gelo permaneça no frasco.
- Despeje diretamente em um tubo de plástico de 50 mL contendo 10 mL de pré-aquecido (37 ° C) PM.
- Centrifugar durante 5 min a 500 xg e descartar o sobrenadante.
- Ressuspenda gentilmente o sedimento celular com 18 mL de PM pré-aquecido (para obter 42.000 células por3 mL de meio). Distribua 3 mL em cada poço de uma placa de 6 poços (9,6 cm 2 ).
NOTA: Os seis poços individuais de uma placa são necessários para realizar uma medida duplicada da absorção de glicose nas seguintes condições: inibição do transporte passivo (poços 1 e 2), taxa basal (poços 3 e 4) e taxa estimulada pela insulina (poços 5 e 6). Repita tantas placas de seis poços como tratamentos distintos são necessários. - Incubar em condições de cultura padrão (37 ° C, 5% de CO 2 ) até as células atingir 90% de confluência.
NOTA: Esta etapa leva entre 48 e 72 h, dependendo do lote celular. Não mude o meio durante esta etapa.
- Diferenciação de células musculares
- Remova o PM (após 48-72 h) e substitua-o por DM pré-aquecido (3 mL por poço). Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 .
NOTA: A diferenciação leva cinco dias para alcançar um estado estável onde as células estão alinhadas e polinucleadas. Normalmente, o primárioOs miotubos são cultivados em um meio de glicose de 1 g / L. Portanto, para evitar a depleção de glicose durante a cultura, preencha a placa com 3 mL de meio para garantir que o substrato suficiente de glicose esteja disponível para as células em todos os momentos. - Substitua o DM médio a cada dois dias.
NOTA: A partir deste ponto, os miotubos são estáveis por até 7 dias sem alteração significativa e a medição da absorção de glicose pode ser realizada a qualquer momento.
- Remova o PM (após 48-72 h) e substitua-o por DM pré-aquecido (3 mL por poço). Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 .
- Tratamento de células musculares (opcional)
NOTA: Os miotubos primários podem ser tratados por vários dias para induzir modificação (teste de drogas, inibidores / ativadores da via de sinalização, etc. ) antes da estimulação de insulina e medidas de absorção de glicose. As células musculares podem ser submetidas a qualquer tratamento que possa ter um impacto na sensibilidade à insulina, e a medida da absorção de glicose irá quantificar esse impacto. Por exemplo, a incubação de células musculares com o palmitato de ácidos graxos saturados promove a resistência à insulina e as células apresentam redução de iNsulin estimulou a absorção de glicose.- Prepare 12 mL de DM suplementado com 10% de BSA (sem ácidos graxos) e palmitato de 0,5 mL (PALM). Prepare 12 mL de DM suplementado apenas com 10% de BSA (sem ácidos graxos).
- Prepare duas placas de 6 poços com miotubos primários humanos e cultive-os conforme descrito nas seções 2.1 e 2.2 (com 5 dias de diferenciação).
- No dia 5, lave cada poço com 2 mL de PBS. Em um prato, adicione 2 mL de DM contendo PALM. Para a outra placa, adicione 2 mL de BSA contendo apenas DM.
- Incubar durante 48 h a 37 ° C, 5% de CO 2 .
3. Estimulação da insulina
- Lavar as células musculares diferenciadas duas vezes com 2 mL de PBS.
- Remova PBS cuidadosamente e incuba com 3 mL de MS sem FCS durante 3 h (37 ° C, 5% de CO 2 ) para a depleção de soro.
- Substitua a mídia em todos os poços por 3 mL de DM sem FCS. Adicione insulina 100 nM aos poços 5 e 6.
- Incubar cultura de miotubos humanos para1 h (37 ° C, 5% de CO 2 ).
4. Captação de glicose
- Após 1 h de estimulação com insulina, lave os poços duas vezes com X-DPBS (1 mL por lavagem).
- Adicione 1 mL de mistura de citocalasina B aos poços 1 e 2 e 1 mL de mistura de DMSO aos poços 3 a 6. Incube durante 15 minutos (37 ° C, 5% de CO 2 ). No final da incubação, coloque imediatamente a placa no gelo.
5. Lise celular
- Lavar as células duas vezes com 1 mL de PBS gelado.
- Lyse as células em cada poço com 600 μL de 50 mM de NaOH. Incube no gelo durante 5 min e misture suavemente com rotação orbital lenta.
NOTA: Se o lisado for muito viscoso, diluir com 1,5 mL de NaOH. - Usando uma pipeta, ressuspenda e coleciona o lisado celular.
6. Determinação da glicose radiomarada
- Coloque 400 μL de cada lisado celular num frasco de contagem de cintilação líquida. Prepare um frasco de controle negativo com 400ΜL de NaOH 50 mM e um frasco de controlo positivo com 20 μL de TC20 (a partir do passo 1.2.3.1).
- Adicione 4 mL de solução de cintilação líquida a cada frasco para injectáveis. Feche a tampa e misture cada frasco completamente (1-2 s).
- Insira cada frasco em um contador de cintilação líquida e mida a radioatividade de acordo com as instruções do fabricante. Contagem de registros por minuto (CPM) para cada frasco de cintilação por 10 min.
NOTA: CPM = "desintegrações por minuto" x "eficiência de contagem".
7. Taxa de captação de glicose
- Use o restante lisado (200 μL, a partir do passo 5.2) para medir a concentração de proteína. Determine a concentração de proteína de cada lisado celular utilizando Bradford 25 ou um método equivalente. Calcule a quantidade total de proteína (Q) em mg para cada poço.
- Para obter TC1 (o valor para 1 μL de 2dG radiomarcado *), divida o valor de CPM de TC20 em 20.
- Para cada frasco, calcule tA taxa de absorção de glicose é a seguinte:
NOTA: R é medido em pmol / mg / min. A média de R para os poços 1 a 2 dá taxa de transporte passivo, R p . A média de R para poços 3-4 dá taxa de transporte total basal, R bt . A média de R para os poços 5-6 dá taxa de transporte total estimulada pela insulina, R it .- Calcule a taxa de transporte ativo basal (R ba ) da seguinte maneira:
- Calcule a taxa de transporte ativa estimulada pela insulina (R ia ) da seguinte maneira:
NOTA: Em células responsivas a insulina como miotubos, as taxas de absorção de glicose são geralmente representadas por três valores: R ba , R ia e a estimulação da dobra de insulina como R ia / R ba .
- Calcule a taxa de transporte ativo basal (R ba ) da seguinte maneira:
- Para a mistura de citocalasina B, adicione 2 μL de citocalasina B 20 mM a 2 mL de solução 2dG * radiomarcada.
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Representative Results
No dia 3, os mioblastos alcançam a confluência ( Figura 1A ). Os mioblastos nesta fase são tipicamente mononucleados. O meio foi alterado e no dia 8, a diferenciação foi completada ( Figura 1B ) (seção de protocolo 2). Após 5 dias de diferenciação, os miotubos são alinhados e tipicamente polinucleados. Os miotubos primários humanos foram submetidos a um tratamento com palmitato ou apenas com BSA antes da medição da taxa de absorção de glicose. As células foram incubadas durante 48 h com palmitato 0,5 mM em BSA (PALM) ou BSA sozinho (BSA). A estimulação da insulina foi realizada (seção de protocolo 3) e a captação de glicose foi medida (seção de protocolo 4). A Figura 2 mostra a taxa de absorção de glicose em uma condição de controle (BSA) e uma condição de tratamento (PALM). A absorção não específica é quantificada em miotubos incubados com citocalasina B. As taxas de absorção de glicose basal e estimulada por insulina podem ser comparadas em BSA e PAL M condições. A insulina aumenta significativamente o transporte de glicose na condição BSA (p <0,01). A taxa de absorção de glicose estimulada pela insulina é significativamente menor em miotubos tratados com PALM (p <0,05). Além disso, a resposta das células do miotubo humano à insulina também pode ser expressa como mudança de dobra. A Figura 3 demonstra que a resposta à insulina diminui em miotubos tratados com PALM quando comparados ao controle (p <0,05).
Apesar da expressão limitada da proteína GLUT4 em miotubos cultivados, as células musculares primárias são capazes de responder à insulina com um aumento na absorção de glicose ( Figura 2 ). A variação média da dobra observada é ~ 1,3, semelhante ao descrito por outros grupos com células musculares humanas 6 , 7 , 10 , 26 ,> 27. A indução de resistência à insulina em células musculares com ácido graxo saturado é comumente descrita em células de músculo de rato, rato e humano e demonstrou-se que reduz a captação de glicose das células musculares tratadas 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . Realizamos uma incubação de palmitato (0,5 mM) durante 48 h e observamos uma diminuição na taxa de captação de glicose estimulada basal e insulina e uma diminuição da alteração da dobra de insulina, refletindo o estado resistente à insulina. O tempo de incubação utilizado neste manuscrito foi escolhido para demonstrar completamente o efeito inibitório sobre a absorção de glicose. Os tempos de incubação mais curtos também podem produzir resistência à insulina e redução da absorção de glicose 31 , 32 , 33 , 34 . As concentrações inferiores e, portanto, mais fisiológicas podem ser utilizadas in vitro , bem como experiências de resposta à dose e / ou tempo, e comparação com o efeito de ácidos graxos insaturados como oleato 29 , 35 .
Figura 1: Myotubos humanos primários in vitro . São mostradas imagens de miotubos humanos em 2 estágios de cultura obtidos usando um microscópio óptico. ( A ) Dia 3 da cultura de mioblastos na confluência. ( B ) No dia 8 (5 dias de diferenciação), os miotubos estão alinhados. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 2: Efeito da estimulação da insulina na taxa de absorção de glicose em miotubos humanos sob condições BSA e PALM. Os miotubos foram tratados com BSA sozinho ou PALM 0,5 mM por 48 h. Após a mudança média e a depleção de soro de 3 h, a taxa específica de absorção de glicose (em pmol / mg / min) foi medida na ausência (-) ou na presença (+) de insulina (1 h, 100 nM). Os dados são médias ± sem de quatro experiências independentes utilizando miotubos de quatro doadores diferentes. #P <0,05 em comparação com o valor basal; * P <0,05 em comparação com o valor de estimulação de insulina BSA. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
Figura 3: Dobre euResposta nsulina nas condições de cultura BSA e PALM. Razão da insulina estimulada na taxa basal de transporte de glicose nas condições BSA e PALM. Esta proporção dá a taxa de absorção de glicose da dobra após a estimulação de insulina (100 nM). * P <0,05 em comparação com a condição BSA (n = 4). Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.
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Discussion
A absorção de glicose é uma medida biológica fundamental para testar ativadores ou inibidores na cultura celular e como eles afetam o uso de glicose e a capacidade da célula de responder à insulina. O método descrito aqui mostrou-se rápido e confiável e tem sido amplamente utilizado em muitos estudos usando miotubos primários de indivíduos saudáveis e / ou pacientes metabólicamente afetados 6 , 7 , 10 , 12 , 21 , 26 , 27 , 36 , 37 . Com apenas uma placa de 6 poços, as taxas podem ser obtidas em duplicados para transporte basal total, transporte ativo basal e transporte ativo estimulado pela insulina. Estes três valores descrevem completamente a sensibilidade à insulina das células musculares cultivadas in vitro .
A mistura 2dG pode ser adicionada a todos os poços testados. Para a lise celular, o volume de NaOH pode ser modificado de acordo com as características da célula. Quando se trabalha com células que contêm níveis elevados de ácidos gordos, ou seja, para lisados muito viscosa, o volume de NaOH pode ser aumentado até 1,5 mL.
O método utiliza material radiomarcado que melhora a sensibilidade da medida, mas requer que o protocolo seja realizado em áreas controladas. Os materiais e resíduos devem ser manuseados de acordo com as diretrizes de segurança locais. Para laboratórios não equipados, outros métodos de quantificação colorimétrica e de fluorescência estão disponíveis. Em ensaios não radioactivos, a intensidade de fluorescência pode ser medida após a incubação das células com um análogo de glucose D-glucose fluorescente de 2- [ N - (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il) amino] 2-desoxi-D-glucose (2-NBDG). Com este análogo, alguns grupos relatam que a insulina perdeu seus efeitos fisiológicos em células L6Culo = "xref"> 39, ao passo que outros grupos mostraram que a insulina ainda aumenta a absorção de glicose (nas células musculares primárias humanas) 38 . Devido à baixa expressão de GLUT4, a quantificação da absorção de glicose estimulada por insulina em células musculares cultivadas é reduzida em comparação com condições in vivo 6 , 16 . Portanto, é importante caracterizar ainda mais a capacidade de resposta da insulina das células musculares cultivadas através de outras abordagens. As medições do estado de fosforilação das proteínas-chave da via de sinalização de insulina (como Akt / PKB e / ou GSK3) usando imuno-detecção podem ser usadas 14 , 21 , 31 . No nível enzimático, a síntese de glicogênio, a oxidação de glicose e / ou lipídicas também podem ser avaliadas em condições com e sem insulina 14 , 26 , 31 . Qualquer outro cel Tipo de l (diga resposta à insulina ou não) teoricamente pode ser analisado, pois todas as células podem absorver ativamente ou passivamente a glicose. Os poços estimulados por insulina podem assim ser substituídos por qualquer outro tratamento adequado.
O uso do miotubo primário humano implica que as células musculares atingiram um estado de diferenciação consistente com a expressão suficiente da proteína GLUT4. Se a preparação contém células não musculares ou essencialmente mioblastos, os valores de absorção de glicose na condição de estimulação de insulina não serão diferentes do estado basal (R ia versus R ba ), principalmente devido à predominância do transportador GLUT1.
A insulina pode ser adicionada ao meio de cultura de células musculares primárias para promover e aumentar a proliferação e diferenciação de células musculares. No entanto, a insulina também demonstrou induzir resistência à insulina em estimulação crônica 40 , 41 ,Class = "xref"> 42. Em nossas experiências, as células musculares primárias humanas diferenciam-se adequadamente somente após a mudança média com soro reduzido. Portanto, preferimos não adicionar insulina externa durante a cultura para preservar as células da estimulação crônica antes da avaliação da capacidade de resposta da insulina. Finalmente, o método requer várias etapas de lavagem. Portanto, deve-se ter cuidado para não separar as células da placa, como pode acontecer com as células primárias.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem Anne Charrié no serviço de Radiobiologia (hospital Lyon-Sud) e Fond National Suisse (FNS) pelo apoio financeiro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human primary muscle cell | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | In house preparation from human skeletal muscle biopsies | If not available, use commercial source |
| Human primary muscle cell | Promocell | C-12530 | Should be cultured with associated media C23060 and C23061 |
| 6-well plate | Corning | 356400 | BioCoat Collagen I Multiwell Plates |
| Ham's F10 | Dutscher | L0145-500 | 1 g/L glucose |
| Glutamine | Dutscher | X0551-100 | |
| penicilin/streptomycin 100x | Thermo fisher scientific | 15140122 | |
| Serum substitute UltroserG | Pall France | 15950.017 | serum substitute in text |
| DMEM low glucose | Dutscher | L0064-500 | 1 g/L glucose |
| Fetal Calf Serum | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Dutscher | L0625-500 | Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM) |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| 2-deoxy-D-glucose | Sigma-Aldrich | D6134 | |
| Albumin bovine | euromedex | 04-100-812-E | |
| fatty acid-free BSA | Roche | 10,775,835,001 | |
| palmitate | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] | PerkinElmer | NET328A001MC | Specific Activity: 5 - 10 Ci (185-370GBq)/mmol, 1 mCi (37MBq |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | c2743 | |
| PICO PRIAS VIAL 6 mL | PerkinElmer | 6000192 | |
| ultima gold MW CA | PerkinElmer | 6013159 | scintillation liquid |
| bêta counter | PerkinElmer | 2900TR |
References
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