Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Måling af glukoseoptagelse og reaktion på insulinstimulering i doi: 10.3791/55743 Published: June 25, 2017

Summary

Ved denne metode dyrkes humane primære muskelceller in vitro for at opnå differentierede myotuber, og glukoseoptagelseshastigheder måles. Vi giver en detaljeret protokol til kvantificering af satser i basale og insulinstimulerede tilstande ved brug af radioaktivt mærket [3H] 2-deoxy-D-glucose.

Abstract

Skeletmuskulatur er den største glukosepapir hos pattedyr og bidrager i vid udstrækning til glucosehomeostase. Vurdering af insulinfølsomhed i muskelceller er af stor betydning for alle undersøgelser dedikeret til at udforske muskel glucose metabolisme og karakteriserende metaboliske ændringer. I muskelceller translaterer glucosetransportør type 4 (GLUT4) proteiner til plasmamembranen som reaktion på insulin, hvilket tillader massiv indtræden af ​​glucose i cellen. Muskelcellernes evne til at reagere på insulin ved at øge graden af ​​glukoseoptagelse er en af ​​standardudlæsningerne for at kvantificere muskelcellefølsomhed overfor insulin. Humane primære myotuber er en egnet in vitro- model, da cellerne opretholder mange funktioner i donorfænotypen, herunder insulinfølsomhed. Denne in vitro- model er også velegnet til test af forbindelser, der kan påvirke insulinresponsiviteten. Målinger af glukoseoptagelseshastigheden i differentierede myotubes afspejlerInsulinfølsomhed.

Ved denne metode dyrkes humane primære muskelceller in vitro for at opnå differentierede myotuber, og glukoseoptagelseshastigheder med og uden insulinstimulering måles. Vi giver en detaljeret protokol til kvantificering af passive og aktive glucosetransporthastigheder ved brug af radioaktivt mærket [3H] 2-deoxy-D-glucose ([ 3 H] 2dG). Beregningsmetoder tilvejebringes for at kvantificere aktive basale og insulinstimulerede satser, såvel som stimuleringsfold.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Skeletmuskulatur er den største glukosepapir hos pattedyr og bidrager i vid udstrækning til glucosehomeostase. Dette insulinresponsive væv er det primære sted for glukoseoptagelsen, der udløses af insulinstimulering 1 .

I type 2 diabetes observeres insulinresistens i flere væv, herunder skeletmuskel, og fører til over normal blodglukosekoncentration. Det er således af stor betydning at bestemme niveauet af insulinfølsomhed i dette væv og dets celler, hvad enten målet er at karakterisere en defekt i et individ eller at vurdere effektiviteten af ​​en behandling, der har til formål at forbedre den. Hos mennesker eller dyr er guldstandardteknikken til at vurdere insulinfølsomhed den hyperinsulinemiske-euglykæmiske klemme. Indført af DeFronzo i 1979 2 og modificeret siden 3 , 4, så tillader metoden at kvantificere hele kroppen aNd væv insulinresponsivitet målt som den mængde glucose, der skal perfuseres under insulinstimulering for at opretholde normal blodglukosekoncentration.

Insulinsensitivitetsudforskning kan også udføres på celleplan ved hjælp af in vitro muskelmodeller, og måling af glucoseoptagelseshastigheder forbliver et effektivt og pålideligt værktøj til kvantificering af cellens biologiske respons til insulinstimulering 5 , 6 , 7 . Faktisk kvantificerer glukoseoptagsmåling det cellebiologiske respons på insulinstimulering fra bindingen af ​​insulin til dets receptor til translokation af GLUT4 berigede vesikler og inklusiv intracellulære signal- og fosforyleringskaskader 8 .

Dette er af stor interesse med humane prøver, da differentierede myotubes opretholder mange træk af donorfænotypen, herunder metabolisk egenskabIer og lidelser observeret i patienten 9 , 10 , 11 , 12 . Myotuberne viser strukturelle, metaboliske og fænotypiske ligheder med skelettmuskel 13 , 14 , herunder ekspressionen af ​​glucosetransportere 15 og det cellulære insulin-signaleringsmaskineri 16 . Måling af glukoseoptagelsen i primære myotuber er således relevant for at karakterisere en donors muskelfænotype eller undersøge effekten af ​​en intervention (medicin, ernæring eller fysisk aktivitet) på insulinfølsomheden i muskelcellen.

Måling af glukoseoptagelse på dyrkede myotubes er også et pålideligt værktøj ved udførelse af forsøg, der ændrer insulinfølsomheden 17 , 18 . In vitro 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .

Her beskriver vi en detaljeret protokol til kultur og differentierer humane myotubes og måler celle glukose optagelseshastigheder. Metoden er anvendelig for enhver kilde til menneskelige muskelprecursorceller, uanset om de kommer fra in-lab-præparater, samarbejde eller kommercielt tilgængelige leverandører. Immortaliserede muskelcellelinjer, som henholdsvis C2C12 og L6, fra henholdsvis mus og rotte, kan også anvendes til glukosoptagsmåling med denne protokol 7 .

Vi giver en detaljeret protokol til kvantificering af satser i basale og insulinstimulerede tilstande ved brug af radiomærkede [ 3 H] 2dG. THan bruger en mærket glucoseanalog giver mulighed for nøjagtig bestemmelse af glucoseindgang med reduceret udgangsmateriale, en fælles tilstand, når man arbejder med primære celler. Det modificerede glucosemolekyle er ude af stand til at komme ind i metaboliske veje og akkumuleres således i cellen, hvilket tillader pålidelig kvantificering via total celleradioaktivitet. Eksperimentelle tilstande omfatter anvendelse af en glukose transportinhibitor (cytochalasin B), og målinger udføres med og uden insulin. Denne kombination gør det muligt at bestemme glukose aktive indtastningsfrekvenser samt beregning af foldeskift for insulinresponsindekset. Metoden præsenteres med en dosis insulin under en enkelt inkubationstid, men protokollen kan let modificeres til dosisrespons eller tidskursforsøg 12 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Fremstilling af cellekulturmedier og -løsninger

  1. Fremstilling af kulturmedier
    1. Forbered proliferationsmedium (PM) ved at supplere Ham's F-10-medium med glutamin (2 mM), penicillin / streptomycin (5 μg / mL endelige), 2% føtalt kalvserum (FCS) og 2% serumsubstitut.
    2. Klargør differentieringsmedium (DM) ved at supplere Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med glutamin (2 mM), penicillin / streptomycin (5 μg / mL endelig) og 2% FCS.
  2. Fremstilling af glucoseoptagelsesopløsninger
    Forsigtig: Håndtering af radioaktivt materiale er kun tilladt i et begrænset og kontrolleret område af autoriseret personale. Materiale og affald skal håndteres i henhold til relevante procedurer, retningslinjer og lokal lovgivning.
    1. For at fremstille X-Dulbecco's fosfatbufret saltvand (X-DPBS) fremstilles en opløsning af DPBS indeholdende 0,2% (vægt / volumen) (slutkoncentration) bovint serum albUmin (BSA). Filtrer opløsningen gennem et 0,2 μm filter. Opbevares ved 4 ° C.
    2. Til fremstilling af kold 2-deoxy-D-glucose (2dG) opløsning vejes 16,4 mg 2dG og opløses i 10 ml destilleret vand for at opnå en 10 mM opløsning. Opbevares ved 4 ° C.
    3. Tilsæt 600 μL kold 2dG og 6 μl radioaktivt mærket [ 3 H] 2dG til 5400 μl X-DPBS for at opnå den radioaktivt mærkede 2dG (2dG *) opløsning.
      BEMÆRK: Den endelige koncentration er 1 mM 2dG, og mærkning er 1 μCi / mL.
      1. Sæt en 20 μl alikvot (TC20) af radioaktivt mærket 2dG * opløsning til side.
  3. Fremstilling af inkubationsblandinger
    1. Til cytochalasin B-blandingen tilsættes 2 μl 20 mM cytochalasin B til 2 ml radioaktivt mærket 2dG * opløsning.
      BEMÆRK: Stamopløsning af cytochalasin B er ved 10 mg / ml i dimethylsulfoxid (DMSO).
    2. Til DMSO-blandingen tilsættes 4 μl DMSO til de resterende 4 ml radiomærkede 2dG * -opløsning.

    2. Kultur af humane primære muskelceller

    1. Sædning af 6-brøndsplader med humane muskel-satellitceller
      BEMÆRK: Brug internt (se reference 24 for detaljer) eller kommercielt tilgængelige humane muskelceller fra et frosset hætteglas (indeholdende 250.000 celler). Den følgende procedure gives for 250.000 celler for at opnå en 6-brønds plade, der er nødvendig til måling af glucoseoptagelse i en enkelt tilstand.
      1. Tør hurtigt frosne hætteglas af internt 24 eller kommercielle præparater af humane muskelceller i forvarmet vand (37 ° C), indtil kun en lille isblok forbliver i hætteglasset.
      2. Hæld direkte i et 50 ml plastrør indeholdende 10 ml forvarmet (37 ° C) PM.
      3. Centrifuger i 5 minutter ved 500 xg og kasserer supernatanten.
      4. Resuspender cellepellet forsigtigt med 18 ml forvarmet PM (for at opnå 42.000 celler pr3 ml medium). Fordel 3 ml i hver brønd i en 6-brønds plade (9,6 cm 2 ).
        BEMÆRK: De seks individuelle brønde på en plade er nødvendige for at udføre en dobbelt måling af glukoseoptagelse under følgende betingelser: passiv transporthæmning (brønd 1 og 2), basalhastighed (brønd 3 og 4) og insulinstimuleret hastighed (brønde 5 og 6). Gentag så mange 6-brøndsplader, som der er behov for forskellige behandlinger.
      5. Inkuber i standardkulturbetingelser (37 ° C, 5% CO 2 ) indtil celler når 90% sammenflydelse.
        BEMÆRK: Dette trin tager mellem 48 og 72 timer afhængigt af cellebatchet. Udskift ikke medium under dette trin.
    2. Differentiering af muskelceller
      1. Fjern PM (efter 48-72 timer) og erstat med forvarmet DM (3 ml pr. Brønd). Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2.
        BEMÆRK: Differentiering tager fem dage at nå en stabil tilstand, hvor cellerne er justeret og polynukleeret. Typisk er den primæreMyotubes dyrkes i et 1 g / l glucose medium. For at undgå glukosedbrydning under kulturen skal du fylde pladen med 3 ml medium for at sikre, at der er tilstrækkeligt glucosesubstrat til rådighed for cellerne hele tiden.
      2. Udskift DM-medium hver anden dag.
        BEMÆRK: Fra dette tidspunkt er myotubes stabile i op til 7 dage uden nogen væsentlig ændring og glukoseoptagsmåling kan udføres til enhver tid.
    3. Behandling af muskelceller (valgfri)
      BEMÆRK: Primære myotubes kan behandles i flere dage for at fremkalde modifikation (lægemiddelprøve, inhibitorer / aktivatorer af signalvej osv. ) Inden insulinstimulering og glukoseoptagelsesmålinger. Muskelceller kan indgives til enhver behandling, der kan påvirke insulinfølsomheden, og måling af glukoseoptagelsen vil kvantificere denne virkning. For eksempel fremmer incubation af muskelceller med det mættede fedtsyrepalmitat insulinresistens, og cellerne reduceres iNsulin stimuleret glucoseoptagelse.
      1. Forbered 12 ml DM suppleret med 10% BSA (fedtsyrefri) og 0,5 mL palmitat (PALM). Klargør 12 ml DM suppleret med 10% BSA (fedtsyrefri).
      2. Forbered to 6-brøndsplader med humane primære myotubes og dyrk dem som beskrevet i afsnit 2.1 og 2.2 (med 5 dages differentiering).
      3. På dag 5 vaskes hver brønd med 2 ml PBS. Til en plade tilsættes 2 ml DM, der indeholder PALM. Til den anden plade tilsættes 2 ml BSA, der kun indeholder DM.
      4. Inkuber i 48 timer ved 37 ° C, 5% C02.

    3. Insulinstimulering

    1. Vask differentierede muskelceller to gange med 2 ml PBS.
    2. Fjern PBS omhyggeligt og inkuber med 3 ml DM uden FCS i 3 timer (37 ° C, 5% CO2) til serumudtømning.
    3. Udskift medie i alle brønde med 3 ml DM uden FCS. Tilsæt 100 nM insulin til brønde 5 og 6.
    4. Inkubér human myotubes kultur for1 time (37 ° C, 5% CO2).

    4. Glukoseoptagelse

    1. Efter 1 timers insulinstimulering skal du brøndes to gange med X-DPBS (1 ml pr. Vask).
    2. Tilsæt 1 ml cytochalasin B-blanding til brøndene 1 og 2 og 1 ml DMSO-blanding til brønde 3-6. Inkuber i 15 minutter (37 ° C, 5% CO2). I slutningen af ​​inkubationen skal du straks placere pladen på is.

    5. Cell Lysis

    1. Vask cellerne to gange med 1 ml iskold PBS.
    2. Lyse cellerne i hver brønd med 600 μl 50 mM NaOH. Inkubér på is i 5 minutter og bland forsigtigt med langsom omdrejningshastighed.
      BEMÆRK: Hvis lysatet er for viskøst, fortyndes med op til 1,5 ml NaOH.
    3. Anvend en pipette, resuspender og saml cellelysatet.

    6. Bestemmelse af radiomærkede glukose

    1. Sæt 400 μl af hvert cellelysat i et væskescintillationstælling hætteglas. Klargør et hætteglas med negativt kontrol med 400ΜL 50 mM NaOH og et positivt kontrol hætteglas med 20 μl TC20 (fra trin 1.2.3.1).
    2. Tilsæt 4 ml væskescintillationsopløsning til hvert hætteglas. Luk hætten og bland hvert hætteglas grundigt (1-2 s).
    3. Indsæt hvert hætteglas i en væskescintillationstæller og måler radioaktiviteten i henhold til producentens anvisninger. Optagelsestællinger pr. Minut (CPM) for hvert scintillationsflaske i 10 minutter.
      BEMÆRK: CPM = "disintegrations pr. Minut" x "tæller effektivitet".

    7. Optagelse af glucoseopløsning

    1. Brug det resterende lysat (200 μL, fra trin 5.2) til måling af proteinkoncentrationen. Bestem proteinkoncentrationen af ​​hvert cellelysat under anvendelse af Bradford 25 eller en ækvivalent metode. Beregn total proteinmængde (Q) i mg for hver brønd.
    2. For at opnå TC1 (værdien for 1 μl radioaktivt mærket 2dG *), divider CPM værdien af ​​TC20 med 20.
    3. For hvert hætteglas beregnes tHan optager glukoseoptagelsen som følger:
      ligning
      BEMÆRK: R måles i pmol / mg / min. Middelværdien af ​​R for brønde 1 - 2 giver passiv transporthastighed, R p . Middelværdien af ​​R for brønde 3-4 giver basaltallet transporthastighed, R bt . Middel for R for brønde 5-6 giver insulinstimuleret total transporthastighed, R det .
      1. Beregn den basale aktive transporthastighed (R ba ) som følger:
        ligning
      2. Beregn den insulinstimulerede aktive transporthastighed (R ia ) som følger:
        ligning
        BEMÆRK: I insulinreaktive celler som myotuber er glukoseoptagelseshastigheder normalt repræsenteret af tre værdier: R ba , R ia og den foldede insulinstimulering som R ia / R ba .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

På dag 3 når myoblaster sammenløbet ( figur 1A ). Myoblasterne på dette trin er typisk mononucleerede. Medium blev ændret, og på dag 8 blev differentiering afsluttet ( figur 1B ) (protokol afsnit 2). Efter 5 dages differentiering er myotubes lineært og typisk polynukleeret. Humane primære myotuber blev underkastet en palmitat eller en BSA-eneste behandling før glucoseoptagelseshastighedsmåling. Celler blev inkuberet i 48 timer med palmitat 0,5 mM i BSA (PALM) eller BSA alene (BSA). Insulinstimulering blev udført (protokol afsnit 3), og glucoseoptagelse blev målt (protokol afsnit 4). Figur 2 viser glucoseoptagelseshastigheden i en kontroltilstand (BSA) og en behandlingsbetingelse (PALM). Ikke-specifik optagelse kvantificeres i myotuber inkuberet med cytochalasin B. Basal- og insulinstimulerede glucoseoptagelseshastigheder kan sammenlignes i BSA og PAL M betingelser. Insulin øger signifikant glucosetransporten i BSA-tilstanden (p <0,01). Den insulinstimulerede glucoseoptagelseshastighed er signifikant lavere i myotubes behandlet med PALM (p <0,05). Desuden kan den humane myotube celle respons på insulin også udtrykkes som fold ændring. Figur 3 viser, at responsen på insulin er nedsat i myotubes behandlet med PALM, når det sammenlignes med kontrol (p <0,05).

På trods af begrænset ekspression af GLUT4-protein i dyrkede myotubes kan primære muskelceller reagere på insulin med en stigning i glukoseoptagelse ( figur 2 ). Den gennemsnitlige fold-ændring, der observeres, er ~ 1,3, svarende til det, der blev beskrevet af andre grupper med humane muskelceller 6 , 7 , 10 , 26 ,> 27. Induktion af insulinresistens i muskelceller med mættet fedtsyre beskrives almindeligvis i mus-, rotte- og humane muskelceller og har vist sig at reducere glukoseoptagelsen af ​​behandlede muskelceller 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . Vi udførte palmitat (0,5 mM) inkubation i 48 timer og observerede et fald i hastigheden af ​​basal og insulinstimuleret glucoseoptagelse og et fald i insulinfoldsændringen, hvilket afspejler insulinresistent tilstand. Den inkubationstid, der anvendes i dette manuskript, er blevet valgt for fuldt ud at demonstrere den inhiberende virkning på glukoseoptagelse. Kortere inkubationstider kan også producere insulinresistens og reduceret glucoseoptagelse 31 , 32 , 33 34 . Lavere og dermed flere fysiologiske koncentrationer kan anvendes in vitro , såvel som dosisrespons og / eller tidskursforsøg og sammenligning med virkningen af ​​umættede fedtsyrer som oleat 29 , 35 .

figur 1
Figur 1: In Vitro Primary Human Myotubes. Billeder af humane myotubes ved 2 stadier af kultur opnået ved anvendelse af et optisk mikroskop er vist. ( A ) Dag 3 af myoblastkultur ved sammenløbet. ( B ) På dag 8 (5 dages differentiering) er myotubes justeret. Skalestang = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.


Figur 2: Effekt af insulinstimulering på optagelse af glucose i humane myotuber under BSA og PALM betingelser. Myotubes blev behandlet med BSA alene eller 0,5 mM PALM i 48 timer. Efter mellemlang forandring og 3 h serumudtømning blev specifik glucoseoptagelseshastighed (i pmol / mg / min) målt i fraværet (-) eller i insulinets tilstedeværelse (+) (1 time, 100 nM). Data er gennemsnitlige ± som af fire uafhængige forsøg med anvendelse af myotubes fra fire forskellige donorer. #P <0,05 sammenlignet med basalværdien; * P <0,05 sammenlignet med BSA insulin stimuleringsværdi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: Fold INsulin respons i BSA og PALM kultur betingelser. Forholdet mellem insulin stimuleret på basal glucosetransporthastighed i BSA- og PALM-forhold. Dette forhold giver foldens glukoseoptagelseshastighed på insulinstimulering (100 nM). * P <0,05 sammenlignet med BSA tilstand (n = 4). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Glukoseoptagelse er en vigtig biologisk måling til testning af aktivatorer eller inhibitorer på cellekultur og hvordan de påvirker glukoseanvendelsen og cellens evne til at reagere på insulin. Den her beskrevne metode har vist sig at være hurtig og pålidelig og har været udbredt i mange undersøgelser ved anvendelse af primære myotuber fra raske forsøgspersoner og / eller metabolisk ramte patienter 6 , 7 , 10 , 12 , 21 , 26 , 27 , 36 , 37 . Med kun en 6-brønds plade kan priser opnås i duplikater til total basal transport, basal aktiv transport og insulinstimuleret aktiv transport. Disse tre værdier beskriver fuldstændigt insulinfølsomheden af ​​de in vitro dyrkede muskelceller.

2dG blanding kan tilsættes til alle testede brønde. Til cellelys kan volumenet af NaOH modificeres i overensstemmelse med celleegenskaberne. Når man arbejder med celler, der indeholder høje fedtsyrer, dvs. til meget viskose lysater, kan volumenet af NaOH øges op til 1,5 ml.

Metoden anvender radioaktivt mærket materiale, som øger målingens følsomhed, men kræver, at protokollen udføres i kontrollerede områder. Materialer og affald skal håndteres i henhold til de lokale sikkerhedsretningslinjer. For ikke-udstyrede laboratorier er andre farvemetriske og fluorescens kvantificering 38 metoder tilgængelige. I ikke-radioaktive analyser kan fluorescensintensitet måles efter inkubation af cellerne med en fluorescerende D-glucoseanalog 2- [ N- (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino] - 2-deoxy-D-glucose (2-NBDG). Med denne analog rapporterer nogle grupper, at insulin har mistet sine fysiologiske effekter i L6-cellerAss = "xref"> 39, mens andre grupper viste, at insulin stadig øger glukoseoptagelsen (i humane primære muskelceller) 38 . På grund af lav GLUT4-ekspression reduceres kvantificering af insulinstimuleret glucoseoptagelse i dyrkede muskelceller sammenlignet med in vivo betingelser 6 , 16 . Det er således vigtigt at yderligere karakterisere insulinresponsiviteten hos de dyrkede muskelceller gennem andre fremgangsmåder. Målinger af phosphoryleringsstatus for nøgleproteiner fra insulinsignalvejen (som Akt / PKB og / eller GSK3) ved hjælp af immundetektion kan anvendes 14 , 21 , 31 . På det enzymatiske niveau kan glycogensyntese, glucose ogleller lipidoxidering også vurderes under betingelser med og uden insulin 14 , 26 , 31 . Enhver anden celle L-typen (uanset om den reagerer på insulin eller ej) kan teoretisk analyseres, da alle celler aktivt eller passivt optager glucose. De insulinstimulerede brønde kan således erstattes af enhver anden passende behandling.

Anvendelsen af ​​human primær myotube indebærer, at muskelceller har nået en differentieringsstatus i overensstemmelse med tilstrækkelig ekspression af GLUT4-protein. Hvis præparatet indeholder ikke-muskelceller eller i det væsentlige myoblaster, vil glucoseoptagelsesværdierne i insulinstimuleringstilstanden ikke afvige fra basal tilstanden (R ia versus R ba ), hovedsagelig på grund af GLUT1-transportørens overvejende betydning.

Insulin kan tilsættes til det primære muskelcellekulturmedium for at fremme og forbedre muskelcelleproliferation og differentiering. Ikke desto mindre har insulin også vist sig at inducere insulinresistens ved kronisk stimulering 40 , 41 ,Class = "xref"> 42. I vores eksperimenter differentierer menneskelige primære muskelceller kun ved medium ændring med reduceret serum. Vi foretrækker således ikke at tilføje eksternt insulin under dyrkning for at bevare cellerne fra kronisk stimulering før vurdering af insulinresponsivitet. Endelig kræver metoden adskillige vaske trin. Derfor skal man sørge for ikke at løsne celler fra pladen, da det kan ske med primære celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender Anne Charrié på Radiobiology-tjenesten (Lyon-Sud hospitalet) og Fond National Suisse (FNS) for deres økonomiske støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human primary muscle cell In house preparation from human skeletal muscle biopsies In house preparation from human skeletal muscle biopsies If not available, use commercial source
Human primary muscle cell Promocell C-12530 Should be cultured with associated media C23060 and C23061
6-well plate Corning 356400 BioCoat Collagen I Multiwell Plates
Ham's F10 Dutscher L0145-500 1 g/L glucose
Glutamine Dutscher X0551-100
penicilin/streptomycin 100x Thermo fisher scientific 15140122
Serum substitute UltroserG Pall France 15950.017 serum substitute in text
DMEM low glucose Dutscher L0064-500 1 g/L glucose
Fetal Calf Serum Eurobio CVFSVF00-01
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Dutscher L0625-500 Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278
2-deoxy-D-glucose  Sigma-Aldrich D6134
Albumin bovine euromedex 04-100-812-E
fatty acid-free BSA Roche 10,775,835,001
palmitate Sigma-Aldrich P0500
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] PerkinElmer NET328A001MC Specific Activity: 5 - 10 Ci (185-370GBq)/mmol, 1 mCi (37MBq
Cytochalasin B Sigma-Aldrich c2743
PICO PRIAS VIAL 6 mL PerkinElmer 6000192
ultima gold MW CA  PerkinElmer 6013159 scintillation liquid
bêta counter  PerkinElmer 2900TR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stump, C. S., Henriksen, E. J., Wei, Y., Sowers, J. R. The metabolic syndrome: role of skeletal muscle metabolism. Ann Med. 38, (6), 389-402 (2006).
  2. DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. Am J Physiol. 237, (3), E214-E223 (1979).
  3. Fossum, E., Hoieggen, A., Moan, A., Nordby, G., Kjeldsen, S. E. Insulin sensitivity relates to other cardiovascular risk factors in young men: validation of some modifications of the hyperinsulinaemic, isoglycaemic glucose clamp technique. Blood Press Suppl. 2, 113-119 (1997).
  4. Heise, T., et al. Euglycaemic glucose clamp: what it can and cannot do, and how to do it. Diabetes Obes Metab. 18, (10), 962-972 (2016).
  5. Sell, H., Jensen, J., Eckel, J. Measurement of insulin sensitivity in skeletal muscle in vitro. Methods Mol Biol. 933, 255-263 (2012).
  6. Sarabia, V., Lam, L., Burdett, E., Leiter, L. A., Klip, A. Glucose transport in human skeletal muscle cells in culture. Stimulation by insulin and metformin. J Clin Invest. 90, (4), 1386-1395 (1992).
  7. Sarabia, V., Ramlal, T., Klip, A. Glucose uptake in human and animal muscle cells in culture. Biochem Cell Biol. 68, (2), 536-542 (1990).
  8. Richter, E. A., Hargreaves, M. Exercise, GLUT4, and skeletal muscle glucose uptake. Physiol Rev. 93, (3), 993-1017 (2013).
  9. Gaster, M., Kristensen, S. R., Beck-Nielsen, H., Schroder, H. D. A cellular model system of differentiated human myotubes. Apmis. 109, (11), 735-744 (2001).
  10. Bouzakri, K., et al. Reduced activation of phosphatidylinositol-3 kinase and increased serine 636 phosphorylation of insulin receptor substrate-1 in primary culture of skeletal muscle cells from patients with type 2 diabetes. Diabetes. 52, (6), 1319-1325 (2003).
  11. Scheele, C., et al. Satellite cells derived from obese humans with type 2 diabetes and differentiated into myocytes in vitro exhibit abnormal response to IL-6. PLoS One. 7, (6), e39657 (2012).
  12. Jackson, S., et al. Decreased insulin responsiveness of glucose uptake in cultured human skeletal muscle cells from insulin-resistant nondiabetic relatives of type 2 diabetic families. Diabetes. 49, (7), 1169-1177 (2000).
  13. Aas, V., et al. Are cultured human myotubes far from home? Cell Tissue Res. 354, (3), 671-682 (2013).
  14. Bakke, S. S., et al. Myotubes from severely obese type 2 diabetic subjects accumulate less lipids and show higher lipolytic rate than myotubes from severely obese non-diabetic subjects. PLoS One. 10, (3), e0119556 (2015).
  15. Stuart, C. A., et al. Hexose transporter mRNAs for GLUT4, GLUT5, and GLUT12 predominate in human muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 291, (5), E1067-E1073 (2006).
  16. Al-Khalili, L., et al. Insulin action in cultured human skeletal muscle cells during differentiation: assessment of cell surface GLUT4 and GLUT1 content. Cell Mol Life Sci. 60, (5), 991-998 (2003).
  17. Tsuka, S., et al. Promotion of insulin-induced glucose uptake in C2C12 myotubes by osteocalcin. Biochem Biophys Res Commun. 459, (3), 437-442 (2015).
  18. Gorbunov, E. A., Nicoll, J., Myslivets, A. A., Kachaeva, E. V., Tarasov, S. A. Subetta Enhances Sensitivity of Human Muscle Cells to Insulin. Bull Exp Biol Med. 159, (4), 463-465 (2015).
  19. Breen, D. M., Sanli, T., Giacca, A., Tsiani, E. Stimulation of muscle cell glucose uptake by resveratrol through sirtuins and AMPK. Biochem Biophys Res Commun. 374, (1), 117-122 (2008).
  20. Pinnamaneni, S. K., Southgate, R. J., Febbraio, M. A., Watt, M. J. Stearoyl CoA desaturase 1 is elevated in obesity but protects against fatty acid-induced skeletal muscle insulin resistance in vitro. Diabetologia. 49, (12), 3027-3037 (2006).
  21. Gastebois, C., et al. Transition from physical activity to inactivity increases skeletal muscle miR-148b content and triggers insulin resistance. Physiol Rep. 4, (17), (2016).
  22. Naimi, M., Tsakiridis, T., Stamatatos, T. C., Alexandropoulos, D. I., Tsiani, E. Increased skeletal muscle glucose uptake by rosemary extract through AMPK activation. Appl Physiol Nutr Metab. 40, (4), 407-413 (2015).
  23. Feng, Y. Z., et al. PPARdelta activation in human myotubes increases mitochondrial fatty acid oxidative capacity and reduces glucose utilization by a switch in substrate preference. Arch Physiol Biochem. 120, (1), 12-21 (2014).
  24. Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4, (11), 834-845 (2015).
  25. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  26. Bouzakri, K., et al. Malonyl CoenzymeA decarboxylase regulates lipid and glucose metabolism in human skeletal muscle. Diabetes. 57, (6), 1508-1516 (2008).
  27. Shemyakin, A., et al. Endothelin-1 reduces glucose uptake in human skeletal muscle in vivo and in vitro. Diabetes. 60, (8), 2061-2067 (2011).
  28. Alkhateeb, H., Chabowski, A., Glatz, J. F., Luiken, J. F., Bonen, A. Two phases of palmitate-induced insulin resistance in skeletal muscle: impaired GLUT4 translocation is followed by a reduced GLUT4 intrinsic activity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293, (3), E783-E793 (2007).
  29. Coll, T., et al. Oleate reverses palmitate-induced insulin resistance and inflammation in skeletal muscle cells. J Biol Chem. 283, (17), 11107-11116 (2008).
  30. Gaster, M., Rustan, A. C., Beck-Nielsen, H. Differential utilization of saturated palmitate and unsaturated oleate: evidence from cultured myotubes. Diabetes. 54, (3), 648-656 (2005).
  31. Hage Hassan, R., et al. Endoplasmic reticulum stress does not mediate palmitate-induced insulin resistance in mouse and human muscle cells. Diabetologia. 55, (1), 204-214 (2012).
  32. Haghani, K., Pashaei, S., Vakili, S., Taheripak, G., Bakhtiyari, S. TNF-alpha knockdown alleviates palmitate-induced insulin resistance in C2C12 skeletal muscle cells. Biochem Biophys Res Commun. 460, (4), 977-982 (2015).
  33. Hommelberg, P. P., et al. Palmitate-induced skeletal muscle insulin resistance does not require NF-kappaB activation. Cell Mol Life Sci. 68, (7), 1215-1225 (2011).
  34. Yang, M., et al. Saturated fatty acid palmitate-induced insulin resistance is accompanied with myotube loss and the impaired expression of health benefit myokine genes in C2C12 myotubes. Lipids Health Dis. 12, 104 (2013).
  35. Peng, G., et al. Oleate blocks palmitate-induced abnormal lipid distribution, endoplasmic reticulum expansion and stress, and insulin resistance in skeletal muscle. Endocrinology. 152, (6), 2206-2218 (2011).
  36. Lambernd, S., et al. Contractile activity of human skeletal muscle cells prevents insulin resistance by inhibiting pro-inflammatory signalling pathways. Diabetologia. 55, (4), 1128-1139 (2012).
  37. Nikolic, N., et al. Electrical pulse stimulation of cultured human skeletal muscle cells as an in vitro model of exercise. PLoS One. 7, (3), e33203 (2012).
  38. Hsu, F. L., et al. Antidiabetic effects of pterosin A, a small-molecular-weight natural product, on diabetic mouse models. Diabetes. 62, (2), 628-638 (2013).
  39. Zou, C., Wang, Y., Shen, Z. 2-NBDG as a fluorescent indicator for direct glucose uptake measurement. J Biochem Biophys Methods. 64, (3), 207-215 (2005).
  40. Catalano, K. J., et al. Insulin resistance induced by hyperinsulinemia coincides with a persistent alteration at the insulin receptor tyrosine kinase domain. PLoS One. 9, (9), e108693 (2014).
  41. Liu, H. Y., et al. Insulin is a stronger inducer of insulin resistance than hyperglycemia in mice with type 1 diabetes mellitus (T1DM). J Biol Chem. 284, (40), 27090-27100 (2009).
  42. Renstrom, F., Buren, J., Svensson, M., Eriksson, J. W. Insulin resistance induced by high glucose and high insulin precedes insulin receptor substrate 1 protein depletion in human adipocytes. Metabolism. 56, (2), 190-198 (2007).
Måling af glukoseoptagelse og reaktion på insulinstimulering i<em&gt; In Vitro</em&gt; Cultured Human Primary Myotubes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chanon, S., Durand, C., Vieille-Marchiset, A., Robert, M., Dibner, C., Simon, C., Lefai, E. Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes. J. Vis. Exp. (124), e55743, doi:10.3791/55743 (2017).More

Chanon, S., Durand, C., Vieille-Marchiset, A., Robert, M., Dibner, C., Simon, C., Lefai, E. Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes. J. Vis. Exp. (124), e55743, doi:10.3791/55743 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter