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Biology

Glukoseaufnahme Messung und Response auf Insulin Stimulation in doi: 10.3791/55743 Published: June 25, 2017

Summary

Bei diesem Verfahren werden menschliche primäre Muskelzellen in vitro kultiviert, um differenzierte Myotubes zu erhalten, und Glucose-Aufnahmeraten werden gemessen. Wir liefern ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung von Raten in basalen und insulin-stimulierten Zuständen unter Verwendung von radioaktiv markiertem [ 3 H] 2-Desoxy-D-Glucose.

Abstract

Skelettmuskel ist die größte Glukoseablagerung bei Säugetieren und trägt wesentlich zur Glukose-Homöostase bei. Die Beurteilung der Insulinsensitivität von Muskelzellen ist für alle Studien, die der Erforschung des Muskelglukosestoffwechsels und der Charakterisierung von Stoffwechselveränderungen gewidmet sind, von großer Bedeutung. In den Muskelzellen bewegen sich Glukosetransporter Typ 4 (GLUT4) -Proteine ​​als Reaktion auf Insulin in die Plasmamembran, so dass ein massiver Eintritt von Glukose in die Zelle möglich ist. Die Fähigkeit der Muskelzellen, auf Insulin zu reagieren, indem sie die Rate der Glukoseaufnahme erhöht, ist eine der Standardauslesungen, um die Empfindlichkeit der Muskelzelle gegenüber Insulin zu quantifizieren. Menschliche primäre Myotubes sind ein geeignetes in vitro- Modell, da die Zellen viele Merkmale des Spender-Phänotyps beibehalten, einschließlich Insulinsensitivität. Dieses in vitro Modell eignet sich auch für den Test von Verbindungen, die die Insulinreaktion beeinflussen könnten. Messungen der Glukoseaufnahmerate in differenzierten Myotubes reflektierenInsulinsensitivität

Bei dieser Methode werden menschliche primäre Muskelzellen in vitro kultiviert, um differenzierte Myotubes zu erhalten, und Glukoseaufnahmeraten mit und ohne Insulinstimulation werden gemessen. Wir liefern ein detailliertes Protokoll zur quantitativen Bestimmung von passiven und aktiven Glukosetransportraten unter Verwendung von radioaktiv markiertem [ 3 H] 2-Desoxy-D-Glucose ([ 3 H] 2dG). Berechnungsmethoden werden zur Quantifizierung der aktiven basalen und insulin-stimulierten Raten sowie der Stimulationsfalte bereitgestellt.

Introduction

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Skelettmuskel ist die größte Glukoseablagerung bei Säugetieren und trägt wesentlich zur Glukose-Homöostase bei. Dieses Insulin reagierende Gewebe ist die primäre Stelle der Glukoseaufnahme, die durch Insulinstimulation ausgelöst wird 1 .

Bei Typ-2-Diabetes wird die Insulinresistenz in mehreren Geweben, einschließlich des Skelettmuskels, beobachtet und führt zu einer übermäßigen Blutglukosekonzentration. So ist es von großer Bedeutung, den Grad der Insulinsensitivität dieses Gewebes und seiner Zellen zu bestimmen, ob es darum geht, einen Defekt eines Subjekts zu charakterisieren oder die Effizienz einer Behandlung zu beurteilen, die beabsichtigt, sie zu verbessern. Bei menschlichen oder tierischen Probanden ist die Gold-Standard-Technik zur Beurteilung der Insulinsensitivität die hyperinsulinämisch-euglykämische Klammer. Eingeführt von DeFronzo im Jahr 1979 2 und seit 3 , 4 geändert , dann erlaubt die Methode, den ganzen Körper zu quantifizierenNd Gewebe Insulin-Reaktionsfähigkeit gemessen als die Rate der Glukose, um unter Insulin-Stimulation perfundiert werden, um die normale Blutglukose-Konzentration zu erhalten.

Insulin-Sensitivitäts-Exploration kann auch auf der Zellebene unter Verwendung von In-vitro- Muskelmodellen durchgeführt werden, und die Messung der Glukose-Aufnahmeraten bleibt ein effizientes und zuverlässiges Werkzeug, um die biologische Antwort der Zelle auf die Insulinstimulation 5 , 6 , 7 zu quantifizieren. In der Tat quantifiziert die Glukose-Aufnahme-Messung die zellbiologische Antwort auf Insulin-Stimulation, von der Bindung von Insulin an seinen Rezeptor an die Translokation von GLUT4 angereicherten Vesikeln und einschließlich intrazellulärer Signal- und Phosphorylierungskaskaden 8 .

Dies ist von großer Bedeutung für menschliche Proben, da differenzierte Myotubes viele Merkmale des Spender-Phänotyps beibehalten, einschließlich metabolischer EigenschaftenUnd Störungen, die bei Patienten 9 , 10 , 11 , 12 beobachtet wurden . Die Myotubes zeigen strukturelle, metabolische und phänotypische Ähnlichkeiten mit dem Skelettmuskel 13 , 14 , einschließlich der Expression von Glukosetransportern 15 und der zellulären Insulin-Signalisierungsmaschine 16 . So ist die Messung der Glukoseaufnahme in primären Myotubes für die Charakterisierung des Muskelphänotyps eines Spenders relevant oder untersucht die Wirkung einer Intervention (Arzneimittel, Ernährung oder körperliche Aktivität) auf die Insulinsensitivität in der Muskelzelle.

Die Messung der Glukoseaufnahme auf kultivierten Myotubes ist auch ein zuverlässiges Werkzeug bei der Durchführung von Experimenten, die die Insulinsensitivität modifizieren 17 , 18 . Die in vitro 19 , 20 , 21 , 22 , 23 verhindern oder umkehren könnten.

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Kultur und differenzieren menschliche Myotubes und zur Messung der Zellglukose-Aufnahmeraten. Die Methode gilt für jede Quelle von menschlichen Muskelvorläuferzellen, ob sie aus In-Labor-Präparaten, Collaboration oder kommerziell erhältlichen Lieferanten stammen. Immortalisierte Muskelzelllinien, wie C2C12 und L6, jeweils aus Maus- und Rattenursprung, können auch für die Glukoseaufnahme mit diesem Protokoll verwendet werden 7 .

Wir liefern ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung von Raten in basalen und Insulin-stimulierten Zuständen unter Verwendung von radioaktiv markiertem [ 3 H] 2dG. TDie Verwendung eines markierten Glukose-Analogons ermöglicht eine genaue Bestimmung des Glukoseeintritts mit reduziertem Ausgangsmaterial, ein gemeinsamer Zustand bei der Arbeit mit Primärzellen. Das modifizierte Glukosemolekül ist nicht in der Lage, metabolische Wege einzugehen und sich somit innerhalb der Zelle zu akkumulieren, was eine zuverlässige Quantifizierung über die gesamte Zellradioaktivität ermöglicht. Die experimentellen Bedingungen umfassen die Verwendung eines Glukose-Transport-Inhibitors (Cytochalasin B), und Messungen werden mit und ohne Insulin durchgeführt. Diese Kombination ermöglicht die Bestimmung der Glukose-Eintrittsraten sowie die Berechnung der Faltungsänderung für den Insulinreaktionsindex. Die Methode wird mit einer Dosis Insulin während einer einzigen Inkubationszeit präsentiert, aber das Protokoll kann leicht für Dosisreaktionen oder Zeitverlaufsexperimente modifiziert werden 12 .

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Protocol

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1. Vorbereitung von Zellkulturmedien und -lösungen

  1. Vorbereitung von Kulturmedien
    1. Bereiten Sie das Proliferationsmedium (PM) vor, indem Sie das F-10-Medium von Ham mit Glutamin (2 mM), Penicillin / Streptomycin (5 & mgr; g / ml Finale), 2% Fetal Calf Serum (FCS) und 2% Serumersatz ergänzen.
    2. Bereiten Sie das Differenzierungsmedium (DM) vor, indem Sie Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit Glutamin (2 mM), Penicillin / Streptomycin (5 μg / ml Finale) und 2% FCS ergänzen.
  2. Vorbereitung von Glukose-Aufnahmelösungen
    Achtung: Die Handhabung von radioaktivem Material ist nur in einem eingeschränkten und kontrollierten Bereich durch autorisiertes Personal zulässig. Material und Abfall müssen nach den entsprechenden Verfahren, Richtlinien und örtlichen Gesetzen behandelt werden.
    1. Zur Herstellung von X-Dulbecco-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (X-DPBS) eine Lösung von DPBS, enthaltend 0,2% (w / v) (Endkonzentration) RinderserumalbumUmin (BSA). Filtriere die Lösung durch einen 0,2 μm Filter. Bei 4 ° C aufbewahren.
    2. Zur Herstellung von kalter 2-Desoxy-D-glucose (2dG) -Lösung wiegen 16,4 mg 2dG und in 10 ml destilliertem Wasser solubilisieren, um eine 10 mM Lösung zu erhalten. Bei 4 ° C aufbewahren.
    3. Fügen Sie 600 μl kaltes 2dG und 6 μl radioaktiv markiertes [ 3 H] 2dG zu 5400 μl X-DPBS hinzu, um die radioaktiv markierte 2dG (2dG *) - Lösung zu erhalten.
      HINWEIS: Die Endkonzentration beträgt 1 mM 2dG und die Markierung beträgt 1 μCi / mL.
      1. Stellen Sie ein 20 μl Aliquot (TC20) der radioaktiv markierten 2dG * -Lösung auf.
  3. Herstellung von Inkubationsmischungen
    1. Für die Cytochalasin-B-Mischung werden 2 μl 20 mM Cytochalasin B zu 2 ml radioaktiv markierter 2dG * -Lösung gegeben.
      HINWEIS: Die Stammlösung von Cytochalasin B liegt bei 10 mg / ml in Dimethylsulfoxid (DMSO).
    2. Für die DMSO-Mischung werden 4 μl DMSO zu den restlichen 4 ml radioaktiv markierten 2dG * -Lösung gegeben.

    2. Kultur der menschlichen primären Muskelzellen

    1. Aussaat von 6-Well-Platten mit menschlichen Muskelsatellitenzellen
      HINWEIS: Im Haushalt (siehe Referenz 24 für Details) oder handelsübliche menschliche Muskelsatellitenzellen aus einer gefrorenen Durchstechflasche (mit 250.000 Zellen) verwenden. Das folgende Verfahren wird für 250.000 Zellen gegeben, um eine 6-Well-Platte zu erhalten, die für die Messung der Glukoseaufnahme in einem einzigen Zustand erforderlich ist.
      1. Schnelles Auffrischen von gefrorenen Durchstechflaschen von hauseigenen 24 oder kommerziellen Vorbereitungen von menschlichen Muskelsatellitenzellen in vorgewärmtem Wasser (37 ° C), bis nur ein kleiner Eisblock in der Durchstechflasche verbleibt.
      2. Gießen Sie direkt in ein 50 ml Plastikröhrchen, das 10 ml vorgewärmtes (37 ° C) PM enthält.
      3. 5 min bei 500 xg zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
      4. Das Zellpellet vorsichtig mit 18 ml vorgewärmtem PM (um 42.000 Zellen pro3 ml Medium). 3 ml in jeder Vertiefung einer 6-Well-Platte (9,6 cm 2 ) verteilen.
        HINWEIS: Die sechs einzelnen Vertiefungen einer Platte sind erforderlich, um eine doppelte Messung der Glukoseaufnahme für die folgenden Bedingungen durchzuführen: passive Transportinhibierung (Wells 1 und 2), Basalrate (Wells 3 und 4) und Insulin stimulierte Rate (Wells 5 und 6). Wiederholen Sie so viele Sechs-Well-Platten, wie verschiedene Behandlungen erforderlich sind.
      5. Inkubieren in Standardkulturbedingungen (37 ° C, 5% CO 2 ) bis Zellen 90% Konfluenz erreichen.
        HINWEIS: Dieser Schritt dauert je nach Zellcharge zwischen 48 - 72 Stunden. Ändern Sie während dieses Schrittes kein Medium.
    2. Differenzierung der muskelzellen
      1. PM (nach 48-72 h) entfernen und mit vorgewärmtem DM (3 ml pro Vertiefung) ersetzen. Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO 2 .
        HINWEIS: Die Differenzierung dauert fünf Tage, um einen stabilen Zustand zu erreichen, in dem die Zellen ausgerichtet und polynukleiert sind. In der Regel ist die primäreMyotubes werden in einem 1 g / l Glukosemedium kultiviert. Um die Glukoseverarmung während der Kultur zu vermeiden, füllen Sie die Platte mit 3 ml Medium, um sicherzustellen, dass genügend Glukosesubstrat für die Zellen zur Verfügung steht.
      2. Ersetzen Sie DM alle zwei Tage.
        HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt sind Myotubes für bis zu 7 Tage ohne signifikante Veränderung stabil und die Glukoseaufnahme kann jederzeit durchgeführt werden.
    3. Muskelzellenbehandlung (optional)
      HINWEIS: Primäre Myotubes können für mehrere Tage behandelt werden, um eine Modifikation (Arzneimitteltest, Inhibitoren / Aktivatoren des Signalweges usw. ) vor Insulinstimulation und Glukoseaufnahmemessungen zu induzieren. Muskelzellen können jeder Behandlung unterworfen werden, die einen Einfluss auf die Insulinsensitivität haben kann, und die Glukose-Aufnahmemessung wird diese Wirkung quantifizieren. Zum Beispiel fördert die Inkubation von Muskelzellen mit dem gesättigten Fettsäurepalmitat die Insulinresistenz und die Zellen, die reduziert werdenNsulin stimulierte die Glukoseaufnahme.
      1. 12 ml DM, ergänzt mit 10% BSA (fettsäurefrei) und 0,5 ml Palmitat (PALM), zubereiten. Vorbereitet 12 ml DM, ergänzt mit 10% BSA (nur fettsäurefrei).
      2. Bereiten Sie zwei 6-Well-Platten mit menschlichen primären Myotubes vor und kultivieren Sie sie wie in den Abschnitten 2.1 und 2.2 beschrieben (mit 5 Tagen Differenzierung).
      3. Am Tag 5, waschen Sie sich mit 2 ml PBS. Zu einer Platte fügen Sie 2 ml DM mit PALM hinzu. Auf die andere Platte füge 2 ml BSA nur DM hinzu.
      4. Inkubieren für 48 h bei 37 ° C, 5% CO 2 .

    3. Insulin-Stimulation

    1. Waschen Sie die differenzierten Muskelzellen zweimal mit 2 ml PBS.
    2. PBS sorgfältig entfernen und mit 3 mL DM ohne FCS für 3 h (37 ° C, 5% CO 2 ) zur Serumverarmung inkubieren.
    3. Ersetzen Sie das Medium in allen Brunnen mit 3 mL DM ohne FCS. Füge 100 nM Insulin zu den Brunnen 5 und 6 hinzu.
    4. Inkubieren Sie menschliche Myotubes Kultur für1 h (37 ° C, 5% CO 2 ).

    4. Glukoseaufnahme

    1. Nach 1 h Insulinstimulation, Wells zweimal mit X-DPBS (1 ml pro Waschgang) waschen.
    2. Füge 1 ml Cytochalasin-B-Gemisch zu den Vertiefungen 1 und 2 und 1 ml DMSO-Gemisch zu den Vertiefungen 3 - 6 hinzu. Inkubieren für 15 min (37 ° C, 5% CO 2 ). Am Ende der Inkubation sofort die Platte auf Eis legen.

    5. Zell-Lyse

    1. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 ml eiskaltem PBS.
    2. Lyse die Zellen in jeder Vertiefung mit 600 μl 50 mM NaOH. Inkubieren auf Eis für 5 min und mischen sanft mit langsamer orbital Rotation.
      HINWEIS: Wenn das Lysat zu viskos ist, mit bis zu 1,5 ml NaOH verdünnen.
    3. Verwenden Sie eine Pipette, resuspendieren und sammeln Sie das Zelllysat.

    6. Bestimmung von radioaktiv markiertem Glukose

    1. Setzen Sie 400 μl jedes Zelllysats in eine Flüssigkeitsszintillationszählung ein. Bereiten Sie eine Negativkontrolle mit 400 vorΜL 50 mM NaOH und ein positives Kontrollgefäß mit 20 μl TC20 (ab Schritt 1.2.3.1).
    2. Füge 4 ml Flüssigkeitsszintillationslösung zu jeder Durchstechflasche hinzu. Schließen Sie die Kappe und mischen Sie jede Durchstechflasche gründlich (1-2 s).
    3. Setzen Sie jede Durchstechflasche in einen Flüssigkeitsszintillationszähler ein und messen Sie die Radioaktivität gemäß der Anweisungen des Herstellers. Aufzeichnungszählungen pro Minute (CPM) für jede Szintillationsröhre für 10 min.
      HINWEIS: CPM = "Zerfall pro Minute" x "Zählwirkung".

    7. Rate der Glukoseaufnahme

    1. Verwenden Sie das restliche Lysat (200 μL, ab Schritt 5.2), um die Proteinkonzentration zu messen. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration jedes Zelllysats mit Bradford 25 oder einer äquivalenten Methode. Berechnen Sie die Gesamtproteinmenge (Q) in mg für jede Vertiefung.
    2. Um TC1 zu erhalten (der Wert für 1 μl radioaktiv markiertes 2dG *), teilen Sie den CPM-Wert von TC20 um 20.
    3. Für jede Durchstechflasche berechnen Sie tDie Rate der Glukoseaufnahme wie folgt:
      Gleichung
      HINWEIS: R wird in pmol / mg / min gemessen. Mittler von R für Brunnen 1 - 2 gibt passive Transportrate, R p . Mittler von R für Brunnen 3-4 ergibt basale Gesamttransportrate, R bt . Mittler von R für Brunnen 5-6 gibt Insulin stimulierte Gesamttransportrate, R it .
      1. Berechnen Sie die basale aktive Transportrate (R ba ) wie folgt:
        Gleichung
      2. Berechnen Sie die Insulin-stimulierte aktive Transportrate (R ia ) wie folgt:
        Gleichung
        HINWEIS: In Insulin-reaktionsfähigen Zellen wie Myotubes werden die Glukose-Aufnahmeraten üblicherweise durch drei Werte dargestellt: R ba , R ia und die fache Insulinstimulation als R ia / R ba .

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Representative Results

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Am Tag 3 erreichen Myoblasten Zusammenfluss ( Abbildung 1A ). Die Myoblasten sind in diesem Stadium typischerweise mononukleiert. Medium wurde geändert und am Tag 8 wurde die Differenzierung abgeschlossen ( Abbildung 1B ) (Protokollabschnitt 2). Nach 5 Tagen Differenzierung werden Myotubes ausgerichtet und typischerweise polynukleiert. Menschliche primäre Myotubes wurden einer Palmitat- oder einer BSA-Behandlung unterzogen, bevor die Glukose-Aufnahmegeschwindigkeitsmessung durchgeführt wurde. Die Zellen wurden für 48 h mit Palmitat 0,5 mM in BSA (PALM) oder BSA allein (BSA) inkubiert. Die Insulinstimulation wurde durchgeführt (Protokollabschnitt 3) und die Glukoseaufnahme wurde gemessen (Protokollabschnitt 4). Fig. 2 zeigt die Glucose-Aufnahmegeschwindigkeit in einer Kontrollbedingung (BSA) und eine Behandlungsbedingung (PALM). Die unspezifische Aufnahme wird in Myotubes, die mit Cytochalasin B inkubiert wurden, quantifiziert. Basale und Insulin stimulierte Glukoseaufnahmeraten können in BSA und PAL verglichen werden M-Bedingungen Insulin erhöht den Glukosetransport im BSA-Zustand signifikant (p <0,01). Die Insulin-stimulierte Glukose-Aufnahmegeschwindigkeit ist bei mit PALM behandelten Myotubes signifikant niedriger (p <0,05). Darüber hinaus kann die menschliche Myotubezellreaktion auf Insulin auch als Faltenwechsel ausgedrückt werden. Abbildung 3 zeigt, dass die Reaktion auf Insulin in Myotubes, die mit PALM behandelt wurden, im Vergleich zur Kontrolle (p <0,05) verringert wird.

Trotz der begrenzten Expression von GLUT4-Protein in kultivierten Myotubes können primäre Muskelzellen auf Insulin mit einer Erhöhung der Glukoseaufnahme reagieren ( Abbildung 2 ). Die beobachtete mittlere Faltungsänderung ist ~ 1,3, ähnlich wie bei anderen Gruppen mit menschlichen Muskelzellen 6 , 7 , 10 , 26 ,> 27 Die Induktion der Insulinresistenz in Muskelzellen mit gesättigter Fettsäure wird üblicherweise in Maus-, Ratten- und menschlichen Muskelzellen beschrieben und es wurde gezeigt, dass sie die Glukoseaufnahme der behandelten Muskelzellen 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 verringert. Wir führten eine Initubation von Palmitat (0,5 mM) für 48 h durch und beobachteten eine Abnahme der Rate der basalen und Insulin stimulierten Glukoseaufnahme und eine Abnahme der Insulinfaltungsänderung, was den Insulinresistentenzustand widerspiegelte. Die Inkubationszeit, die in diesem Manuskript verwendet wird, wurde gewählt, um die hemmende Wirkung auf die Glukoseaufnahme vollständig zu demonstrieren. Kürzere Inkubationszeiten können auch Insulinresistenz und reduzierte Glukoseaufnahme 31 , 32 , 33 erzeugen , 34 . Niedrigere und damit mehr physiologische Konzentrationen können in vitro , sowie Dosisreaktionen und / oder Zeitverlaufsexperimente und Vergleich mit der Wirkung von ungesättigten Fettsäuren wie Oleat 29 , 35 verwendet werden .

Abbildung 1
Abbildung 1: In vitro primäre menschliche Myotubes. Bilder von menschlichen Myotubes in 2 Stadien der Kultur, die unter Verwendung eines optischen Mikroskops erhalten wurden, werden gezeigt. ( A ) Tag 3 der Myoblastkultur am Zusammenfluss. ( B ) Am Tag 8 (5 Tage der Differenzierung) sind Myotubes ausgerichtet. Maßstab = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.


Abbildung 2: Einfluss der Insulin-Stimulation auf die Glukose-Aufnahmegeschwindigkeit in humanen Myotubes unter BSA- und PALM-Bedingungen. Myotubes wurden mit BSA allein oder 0,5 mM PALM für 48 h behandelt. Nach mittlerer Veränderung und 3 h Serumverarmung wurde die spezifische Glukoseaufnahmerate (in pmol / mg / min) in Abwesenheit (-) oder in Gegenwart (+) von Insulin (1 h, 100 nM) gemessen. Die Daten sind Mittelwert ± vier von vier unabhängigen Experimenten mit Myotubes von vier verschiedenen Spendern. #P <0,05 verglichen mit dem Basalwert; * P <0,05 verglichen mit BSA Insulin Stimulationswert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Falten INsulin Response in BSA und PALM Kulturbedingungen. Verhältnis von Insulin stimuliert auf basale Glukose Transportrate in BSA und PALM Bedingungen. Dieses Verhältnis ergibt die Faltungs-Glukose-Aufnahmegeschwindigkeit bei Insulin-Stimulation (100 nM). * P <0,05 im Vergleich zur BSA-Bedingung (n = 4). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Die Glukoseaufnahme ist eine wichtige biologische Messung zum Testen von Aktivatoren oder Inhibitoren auf die Zellkultur und deren Auswirkungen auf die Verwendung von Glukose und die Fähigkeit der Zelle, auf Insulin zu reagieren. Die hier beschriebene Methode hat sich als schnell und zuverlässig erwiesen und wurde in vielen Studien mit primären Myotubes von gesunden Probanden und / oder metabolisch betroffenen Patienten 6 , 7 , 10 , 12 , 21 , 26 , 27 , 36 , 37 weit verbreitet . Mit nur einer 6-Well-Platte können die Raten in Duplikaten für den gesamten Basaltransport, den basalen aktiven Transport und den Insulin-stimulierten aktiven Transport erhalten werden. Diese drei Werte beschreiben die Insulinsensitivität der in vitro- kultivierten Muskelzellen vollständig.

2dG-Mischung kann zu allen getesteten Brunnen hinzugefügt werden. Für die Zelllyse kann das Volumen an NaOH nach den Zellcharakteristiken modifiziert werden. Bei der Arbeit mit Zellen, die hohe Mengen an Fettsäuren enthalten, dh für sehr viskose Lysate, kann das Volumen an NaOH bis zu 1,5 ml erhöht werden.

Das Verfahren verwendet radioaktiv markiertes Material, das die Empfindlichkeit der Messung erhöht, erfordert jedoch, dass das Protokoll in kontrollierten Bereichen durchgeführt wird. Materialien und Abfälle müssen nach den örtlichen Sicherheitsrichtlinien behandelt werden. Für nicht ausgestattete Laboratorien stehen weitere Farbmetrik- und Fluoreszenzquantifizierungen zur Verfügung 38 Methoden zur Verfügung. Bei nicht-radioaktiven Assays kann die Fluoreszenzintensität nach Inkubation der Zellen mit einem fluoreszierenden D-Glucose-Analog-2- [ N- (7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino] - 2-Desoxy-D-glucose (2-NBDG). Mit diesem Analogon berichten einige Gruppen, dass Insulin seine physiologischen Effekte in L6-Zellen verloren hatAss = "xref"> 39, während andere Gruppen zeigten, dass Insulin die Glukoseaufnahme noch erhöht (in menschlichen primären Muskelzellen) 38 . Aufgrund der niedrigen GLUT4-Expression ist die Quantifizierung der Insulin-stimulierten Glukoseaufnahme in kultivierten Muskelzellen im Vergleich zu den in vivo- Bedingungen 6 , 16 reduziert. Es ist daher wichtig, die Insulinreaktionsfähigkeit der kultivierten Muskelzellen durch andere Ansätze weiter zu charakterisieren. Messungen des Phosphorylierungsstatus der Schlüsselproteine ​​des Insulin-Signalwegs (wie Akt / PKB und / oder GSK3) mittels Immuno-Detektion können verwendet werden 14 , 21 , 31 . Auf der enzymatischen Ebene können auch die Glykogensynthese, die Glukose und / oder die Lipidoxidation unter Bedingungen mit und ohne Insulin 14 , 26 , 31 beurteilt werden. Irgendeine andere cel L-Typ (ob es auf Insulin reagiert oder nicht) konnte theoretisch analysiert werden, da alle Zellen aktiv oder passiv Glukose aufnehmen können. Die Insulin-stimulierten Vertiefungen können somit durch eine andere geeignete Behandlung ersetzt werden.

Die Verwendung von humanem primärem Myotube impliziert, dass Muskelzellen einen Differenzierungszustand erreicht haben, der mit einer ausreichenden Expression von GLUT4-Protein übereinstimmt. Wenn die Präparation Nicht-Muskelzellen oder im Wesentlichen Myoblasten enthält, unterscheiden sich die Glukose-Aufnahme-Werte im Insulin-Stimulationszustand nicht von dem Basalzustand (R ia versus R ba ), hauptsächlich aufgrund der Vorherrschaft des GLUT1-Transporters.

Insulin kann dem primären Muskelzellkulturmedium hinzugefügt werden, um die Proliferation und Differenzierung der Muskelzellen zu fördern und zu verbessern. Trotzdem wurde auch gezeigt, dass Insulin die Insulinresistenz bei chronischer Stimulation 40 , 41 ,Class = "xref"> 42 In unseren Experimenten unterscheiden sich menschliche primäre Muskelzellen nur bei mittlerer Veränderung mit reduziertem Serum. Wir ziehen es daher vor, kein externes Insulin während der Kultur hinzuzufügen, um die Zellen vor einer chronischen Stimulation zu konservieren, bevor die Insulinreaktion beurteilt wird. Schließlich erfordert das Verfahren mehrere Waschschritte. Daher muss darauf geachtet werden, dass man keine Zellen von der Platte löst, wie es bei primären Zellen passieren kann.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die Autoren bestätigen Anne Charrié bei der Radiobiologie (Lyon-Sud Krankenhaus) und der Fond National Suisse (FNS) für ihre finanzielle Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human primary muscle cell In house preparation from human skeletal muscle biopsies In house preparation from human skeletal muscle biopsies If not available, use commercial source
Human primary muscle cell Promocell C-12530 Should be cultured with associated media C23060 and C23061
6-well plate Corning 356400 BioCoat Collagen I Multiwell Plates
Ham's F10 Dutscher L0145-500 1 g/L glucose
Glutamine Dutscher X0551-100
penicilin/streptomycin 100x Thermo fisher scientific 15140122
Serum substitute UltroserG Pall France 15950.017 serum substitute in text
DMEM low glucose Dutscher L0064-500 1 g/L glucose
Fetal Calf Serum Eurobio CVFSVF00-01
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Dutscher L0625-500 Contains Mg2+ (0.5 mM) and Ca2+ (0.9 mM)
Insulin solution human Sigma-Aldrich I9278
2-deoxy-D-glucose  Sigma-Aldrich D6134
Albumin bovine euromedex 04-100-812-E
fatty acid-free BSA Roche 10,775,835,001
palmitate Sigma-Aldrich P0500
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] PerkinElmer NET328A001MC Specific Activity: 5 - 10 Ci (185-370GBq)/mmol, 1 mCi (37MBq
Cytochalasin B Sigma-Aldrich c2743
PICO PRIAS VIAL 6 mL PerkinElmer 6000192
ultima gold MW CA  PerkinElmer 6013159 scintillation liquid
bêta counter  PerkinElmer 2900TR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Glukoseaufnahme Messung und Response auf Insulin Stimulation in<em&gt; In vitro</em&gt; Kultivierte menschliche primäre Myotubes
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Chanon, S., Durand, C., Vieille-Marchiset, A., Robert, M., Dibner, C., Simon, C., Lefai, E. Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes. J. Vis. Exp. (124), e55743, doi:10.3791/55743 (2017).More

Chanon, S., Durand, C., Vieille-Marchiset, A., Robert, M., Dibner, C., Simon, C., Lefai, E. Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes. J. Vis. Exp. (124), e55743, doi:10.3791/55743 (2017).

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